Genómica Funcional en FarmacologíaGenómica Funcional en Farmacología

Genética MolecularCiencias BiológicasUniversidad de Jaén

Antonio Caruz ArcosDpto. Biología Experimental, Área de Genética

Universidad de Jaén

Dianas moleculares en descubrimiento de drogasDianas moleculares en descubrimiento de drogasDianas moleculares en descubrimiento de drogasCada tejido presenta un patrón específico

de expresión génicaLos niveles de expresión frecuentemente difieren en

situaciones patológicas

Genes estimulados Genes reprimidos

“ La identificación de la expresión diferencial es el paso cruci“ La identificación de la expresión diferencial es el paso crucial en al en la localización de importantes dianas moleculares para diseño dela localización de importantes dianas moleculares para diseño dedrogas”drogas”

Dianas moleculares en descubrimiento de drogasDianas moleculares en descubrimiento de drogas

De la función al genenzima/receptor

micropurificación ensayos funcionales

clonación gen

Del gen a la funcióngenotecas sustracción-específicas de tejido

microarrays identificación nuevas proteínas

knock-out ratónestructura proteína

diseño químico inhibidores

Principales etapas descubrimiento de fármacosPrincipales etapas descubrimiento de fármacos

•identificada nueva diana?• detectada la expresión génica?• gen clonado?• función biológica determinada?• relevancia terapéutica demostrada?

•ligandos naturales identificados?• producción proteína recombinante?• ensayos in vitro establecidos?• sistema de screening masivo?

•Diseño químico, química combinatoria• TERAPIA

Identificación dianas potencialesIdentificación dianas potenciales

Expresión diferencial I:Expresión diferencial I:con conocimiento previocon conocimiento previoMicroarrays de Microarrays de ADNADN

SAGESAGE

SSHSSH

DifferentialDifferential displaydisplay

Expresión Expresión diferencial II:diferencial II:sin conocimientosin conocimiento

previoprevio

Genotecas de Genotecas de ADNcADNcespecíficas de tejidoespecíficas de tejido

Tejido normal versus tejido patológico

OLigosOLigos

ADNcADNc

Validación de las dianas moleculares:Validación de las dianas moleculares:Identificación función génicaIdentificación función génica

Bloqueo función Bloqueo función génicagénica

KnockKnock--outsouts

siRNAsiRNA

IVET (in vivo IVET (in vivo expression technologyexpression technology))

STM (STM (signature tagged mutagenesissignature tagged mutagenesis))

Inmunohistoquímica

Doble híbrido/inmunoprecipitación

Phage display

Doble híbrido: identificación de parejas de interacciónDoble híbrido: identificación de parejas de interacción

Doble híbrido: mapas de interacción proteicaDoble híbrido: mapas de interacción proteica

Cada punto representa una proteína, las líneas indican interacciónentre ellas. Puntos rojos, proteínas esenciales (mutación letal)

InmunoprecipitaciónInmunoprecipitación: : Mapas de interacción proteicaMapas de interacción proteica

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PhagePhage displaydisplay

PhagePhagedisplaydisplay

CXCR4 -/-CXCR4 wt/wtSDF1 wt/wt SDF1 -/-

Cora

zón

Cora

zón

KnockKnock--outs: función génica y validación de dianasouts: función génica y validación de dianas

CXCR4 wt/wt CXCR4 -/-

E13,5

E15,5

Sist

ema

vasc

ular

Sist

ema

vasc

ular

RNA RNA interferenceinterference: nueva herramienta genómica: nueva herramienta genómica

1.1. RNAiRNAi: la introducción de ARN dc en una célula inhibe la : la introducción de ARN dc en una célula inhibe la expresión génica de forma específica de secuenciaexpresión génica de forma específica de secuencia

2.2. Fue primeramente descrito en C.Fue primeramente descrito en C.eleganselegans, , duplex duplex de de ARN de 20ARN de 20--30 30 pb pb producía el silenciamiento de los producía el silenciamiento de los genes homólogos.genes homólogos.

3.3. Sistemas similares han sido descritos en plantas y Sistemas similares han sido descritos en plantas y animales superiores.animales superiores.

4.4. Requiere: síntesis del ARN diana y su rotura específica Requiere: síntesis del ARN diana y su rotura específica que genera los ARN guías (19que genera los ARN guías (19--20 nucleótidos) con 2 20 nucleótidos) con 2 nucleótidos libres en el extremo 3´. Los nucleótidos libres en el extremo 3´. Los ARNi ARNi pueden pueden ser replicados por ser replicados por polimerasas polimerasas dependientes de ARN.dependientes de ARN.

5.5. ARNi ARNi se une a un complejo formando el RNAse une a un complejo formando el RNA--induced induced Silencing complex Silencing complex (RISC) que destruye el ARN diana(RISC) que destruye el ARN diana

Mecanismo de interferencia del ARNMecanismo de interferencia del ARN

cDNA ANDcpromotorpromotor terminador

Introducción Introducción plásmido plásmido en la en la célulacélula

cadena + cadena -ARN ARN transcrito transcrito en la célulaen la célula

Formación espontáneaFormación espontáneade bucle de ARN de bucle de ARN bcbc

Digestión por Digestión por ARNasaIIIARNasaIII RISC

complejo de complejo de interferencia interferencia de ARNde ARN

RISCAAAAAAAAAAAAAA

ARNm dianaARNm diana

AAAAAAAAAAAAAAARNm destruidoARNm destruido

SignatureSignature--taggedtaggedmutagénesis:mutagénesis:

Construcción de una Construcción de una colección de bacterias colección de bacterias mutantes por inserción de mutantes por inserción de un un transposóntransposón

Selección negativa genes Selección negativa genes esenciales durante la esenciales durante la infección: tuberculosis, infección: tuberculosis, identificados genes identificados genes metabolismo metabolismo lipídicolipídico

In vivo In vivo expressionexpression technologytechnology::Genes expresadosGenes expresadosdurante la infección.durante la infección.Selección positivaSelección positiva

•• Clonación aleatoria de Clonación aleatoria de fragmentos fragmentos genómicosgenómicos delante delante del gen GFP sin promotordel gen GFP sin promotor

•• Transformación bacteriana Transformación bacteriana con la genoteca aleatoriacon la genoteca aleatoria

•• Tratamiento similar inicio Tratamiento similar inicio infeccióninfección

•• Selección bacterias Selección bacterias fluorescentesfluorescentes

•• Eliminación falsos positivosEliminación falsos positivos

•• IDENTIFICACIÓN GENES IDENTIFICACIÓN GENES INDUCIDOS DURANTE LA INDUCIDOS DURANTE LA INFECCIÓNINFECCIÓN

Descubrimiento de dianas: cathepsina K como modeloDescubrimiento de dianas: cathepsina K como modelo

ratones knock-out

hibridación in situinmunohistoquímica

estructura proteínagenómica funcional:

hibridación sustractiva

Búsqueda dianas contra Búsqueda dianas contra la osteoporosis:la osteoporosis:

osteoclastososteoclastos

Difícil elección dianas molecularesDifícil elección dianas moleculares

Visión tradicionalalta eficacia dependiente baja expresión diana

fracaso: PALA-aspártico transcarbamilasaéxito: estatinas-HMG CoA reductasa

La abundancia de cathepsina K no reduce laeficacia de los inhibidores en modelos animales

Genómica y fármacos antiviralesGenómica y fármacos antivirales

Estrategias tradicionalesDianas virales: específicas, menos tóxicas

Dianas potenciales limitadas (VIH, VHC, HPV <10 proteínas)Funciones virales dificilmente atacables

Estrategias alternativasIdentificación funciones celulares necesarias para la replicación viral y descartar aquellas imprescindibles para la función celular,

similares obstáculos de toxicidad

Estudios de infección viral con microarrays (I)Estudios de infección viral con microarrays (I)

Virus Experimento Array Células Umbral Cambios

expresión

Comentarios

HCMV gB, 2–24 h 8942 (est.)humano

Fibroblastos 2.3× 441 Genes est. porinterferón

HCMV Infección 40min, 8 hy 24 h

6600 Oligoshumano

Affymetrix

Fibroblastos 4.0× 258 Genes est. porinterferón

HSV-1 Adenovirusexpresando

ICP0

>7500humanoIncyte

Fibroblastoshumanospulmón

2.0× 13

HSV-1d106

InfecciónICP0+

ICP27-

>7500humanoIncyte

HEL 2.0× 427

HSV-1tratadocon UV

Infección 24 h

19 000 (est.)humano

HEL 2.0× 32 Genes est. porinterferón

HSV-1KM110

InfecciónMutación enVP16/ICP0

19 000 (est.)humano

HEL 2.0× 33 Genes est. porinterferón

KSHV TransfecciónLANA

~6000 (est.)humano

Linfoma deBurkitt

2.0× 15 Genes est. porinterferón

Estudios de infección viral con microarrays (II)Estudios de infección viral con microarrays (II)

Virus Experimento Array Células Umbral Cambios

expresión

Comentarios

HIV-1 Infección2 y 3 días

1506 (est.)humano

CEM CD4 Tcélulas

1.5× 20 Tráfico intracelularFactores

transcripciónPolio Infección

3 días7000

humanoHeLa 1.7× 18 ++

12 --ARNs asociados a

polisomasHPV31 Transfección

genoma viral7075 (est.)UniGEMIncyte

Queratinocitoshumanos

2.3× 153 STAT1 repr.Genes est. por

interferónCVB3 Infección

ratóndías 3 y 9

7000 (est.)rata

Miocardiocitos 1.8× 619 Varias rutasintracelulares

MDV Infección48 h y 96 h

1126 (est.)pollo

Fibroblastospollo

2.0× 21, 22, 13 Genes est. porinterferón

HCV Transfección

region NSdías 5 y 10

6416 oligos

humanoAffymetrix

HepG2 2.0× 9 (día 5) 15

(día 10)

Varios genes

Influenza Infección24 h

15 000humano

HeLa 1.5×>750

4h = 618h=329

Citocinas (IL-6)Ubiquitina

Influenza Virusinactivados

24 h

15 000humano

HeLa 1.5×>750

4h = 848h = 13

MetalotioneinaCiclo celularUbiquitina

Patrones de respuesta celular frente Patrones de respuesta celular frente infección viralinfección viral

CMV: bloquea las células en G1 con incremento de cdk-2-ciclin E replicación inhibida por

antagonistas ruta p38-MAPK

HSV-I depende de cdk

Herpesvirus: CMV y HSVHerpesvirus: CMV y HSV--II

Adenovirus aviarAdenovirus aviar

dependiente de heat shock protein 40

inducción apoptosis células infectadas al inhibir NFκκκκB

Herpesvirus del Herpesvirus del sarcoma de Kaposisarcoma de Kaposi

Genómica y lucha antibacterianaGenómica y lucha antibacteriana

Mycoplasma genitalium

Neisseria meningitidis

Pseudomonas aeruginosa

Rickettsia prowazekii

Staphylococcus aureus

Streptococcus pneumoniae

Treponema pallidum

Vibrio cholerae

Borrelia burgdorferi

Campylobacter jejuni

Chlamydia pneumoniae

Chlamydia trachomatis

Escherichia coli

Helicobacter pylori

Mycobacterium leprae

Mycobacterium tuberculosis

Mycoplasma pneumoniae

Genomas de patógenos bacterianos secuenciados

TIGR Microbial Database

Identificación de factores de virulenciaIdentificación de factores de virulenciaalineamiento de secuencias,alineamiento de secuencias,

búsqueda de repeticiones en tandembúsqueda de repeticiones en tandemgenes corregulados con factores genes corregulados con factores

virulencia conocidos: mapeo operonesvirulencia conocidos: mapeo operones

Patrones de expresión:Patrones de expresión:identificación genes candidatos identificación genes candidatos

intervención terapéuticaintervención terapéutica

Farmacogenómica bacteriana

Patogénesis bacteriana:Respuesta hospedador

Patrones de expresión génicaen diagnóstico

Genómica y búsqueda de vacunasGenómica y búsqueda de vacunasCandidatos: proteínas de membrana o Candidatos: proteínas de membrana o

factores de virulenciafactores de virulencia

Identificación de proteínas con segmentos transmembrana(programa PHD), secuencias líder de secreción, aa aromáticos en

el extremo C-terminal o firma específica en N-terminal

Proteínas producidas en sistemas de expresión deE.coli mediante proceso robotizado

Antígenos innoculados en modelos experimentalesy evaluación nivel de inmunización frente a infección

natural

Genómica y búsqueda de vacunasGenómica y búsqueda de vacunas

Neisseria meningitidis

Fracaso desarrollo vacuna universal:polisacárido capsular con baja inmunogenicidad

proteínas superficie testadas con altísisma variabilidad genética

Estrategia genómica:identificación 600 potenciales proteínas de membranaexpresión in vitro de 350 e inmunización de ratones

actividad bactericida de 25 sueros de ratones: correlación protección humanos

algunas de las proteínas están altísimamente conservadas en todas las cepas

tiempo

activida

d

genómica genómica estructuralestructural

genómica genómica funcionalfuncional

diseño diseño químicoquímico

investiginvestigclínica: clínica: terapiaterapia

BIÓLOGOSQUÍMICOS

FARMACÉUTICOS MÉDICOS

Enfoque multidisciplinar: sucesión ecológicaEnfoque multidisciplinar: sucesión ecológica