Genetica Rana Agil

Aislamiento y caracterización de microsatélites

a partir de la construcción de genotecas

enriquecidas de Rana dalmatina

Vanessa Sarasola

Diciembre de 2007

ÍNDICE

Introducción 2

Metodología 4

1. Extracción, purificación y estimación del ADN

2. Tamaño y pureza del ADN

3. Preparación del ADN genómico en un rango de tamaño de 300 a 700pb

4. Annealing y ligación de linkers

5. Amplificación por PCR del linker-DNA

6. Selección híbrida-enriquecimiento de la genoteca

7. PCR del ADN híbrido seleccionado

8. Eliminación de linkers

9. Ligación en el plásmido

10. Clonación y selección de plásmidos que contienen microsatélites

11. Rastreo (screening)

12. Secuenciación de los clones positivos

13. Análisis de los microsatélites obtenidos

4

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6

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7

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8

8

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11

11

Resultados y perspectivas 11

Bibliografía 13

Aislamiento de microsatélites a partir de genotecas enriquecidas de Rana dalmatina 1

Introducción

La genética molecular tiene múltiples aplicaciones en la biología de la

conservación, y de hecho la genética de la conservación ha emergido como una

disciplina en sí misma. Sus objetivos principales son la comprensión de la relación

entre la diversidad genética y la viabilidad de las poblaciones, y el conocimiento del

tamaño efectivo de la población, parámetro crítico para mantener la diversidad

genética. La habilidad de los organismos para adaptarse a los cambios ambientales

(cambio climático, nuevos patógenos), llamada potencial evolutivo, está muy

relacionada con la diversidad genética.

Los marcadores moleculares son secuencias polimórficas de proteínas o de

ADN que pueden ser utilizadas como indicadoras de la variación genética y nos

pueden ayudar a responder preguntas en ecología que son difíciles de resolver de otra

manera. Son fragmentos del genoma generalmente muy pequeños, que son tratados

como loci, aunque no codifiquen para proteínas. El nivel de polimorfismo puede variar

entre cero y cientos de alelos en una especie. La gran ventaja que tienen es que la

variación en los marcadores puede ser cuantificada, lo que permite utilizar la

estadística para hacer comparaciones. Hay distintos tipos de marcadores, cada uno

con ventajas e inconvenientes (alozimas, RFLP, RAPD, minisatélites,

microsatélites…), pero en los últimos años los microsatélites se han hecho muy

populares para resolver muchos aspectos de la ecología molecular (González, 2003;

Beebee & Rowe, 2004).

Los microsatélites o SSRs (simple sequence repeats) son motivos repetidos de

1 a 6 nucleótidos encontrados en todos los genomas, tanto procariotas como

eucariotas, analizados hasta el momento. Están presentes en regiones del genoma

tanto codificantes como no codificantes, con mayor presencia en estas últimas, y

presentan un alto grado de polimorfismo que los hace óptimos para utilizarlos como

marcadores moleculares en estudios de mapeo de genomas, estudios forenses, o

enfocados a la conservación, tales como: detección de posibles cuellos de botella,

medidas del flujo génico e hibridación entre poblaciones, asignación de individuos a su

población de origen o determinación de la estructura poblacional. Además son

selectivamente neutrales y co-dominantes, y se puede trabajar con reducidas

cantidades de ADN, sin que resulte necesario el sacrificio de los animales porque se

pueden amplificar con la técnica de la PCR (González, 2003; Zane et al., 2002).


El mayor inconveniente de los microsatélites es que necesitan ser aislados de

novo en cada especie, debido a que se encuentran habitualmente en regiones no

codificantes del genoma donde la tasa de sustitución de nucleótidos es muy alta, por lo

que no existen primers o cebadores universales como en el ADN mitocondrial, lo que

supone un elevado esfuerzo. Últimamente, y cada vez con mayor frecuencia, se

intenta la amplificación cruzada con cebadores de una especie en otra distinta,

obteniéndose en algunos casos resultados positivos (Schlötterer et al., 1991;

González, 2003; Strecker, 2006).

En el grupo de los anfibios su utilización es muy frecuente para realizar estudios

poblacionales enfocados a la conservación (Rowe et al., 2000; Beebee & Rowe, 2001;

Vos et al., 2001; González, 2003; Burns et al., 2004) y se han aislado en muchas

especies (Brede et al., 2001; Wieczorek et al., 2002; Julian & King, 2003; Chan, 2007).

Una genoteca, en sentido estricto, es una colección desordenada de clones de

un microorganismo huésped en el que se introduce el genoma del microorganismo de

interés en forma de trozos aleatorios. Cuando se habla de una genoteca enriquecida,

esos trozos han sido seleccionados por alguna característica. En este caso, de

búsqueda de microsatélites, se seleccionan determinadas secuencias de pares de

bases que suelen formar parte de estos marcadores.

Las poblaciones ibéricas de Rana dalmatina representan el límite de distribución

suroccidental de esta especie y se hallan separadas del resto de poblaciones

europeas por la frontera natural que suponen los Pirineos (Gosá, 2002). A nivel

genético esta situación geográfica implica que son poblaciones cuyo intercambio de

genes está dificultado por dicha barrera que restringe el flujo de animales, y por tanto

genético, además de que el intercambio es unilateral, por lo que es más lento y la

adaptación a condiciones locales (climáticas, de contaminación) puede quedar

retardada, como consecuencia de una baja heterocigosidad.

El estudio genético de las regiones SSR o microsatélites permitirá averiguar si el

aislamiento físico al que pueden haber estado sometidas las poblaciones ibéricas de la

especie ha desembocado en una diferenciación genética. Si el aislamiento es antiguo,

consecuencia de cambios climatológicos pretéritos, como se supone, se espera

encontrar una diferenciación genética elevada con respecto a las poblaciones

europeas, al otro lado de los Pirineos, y una baja heterocigosidad.

Dentro de la Península se repite el patrón de aislamiento de las poblaciones. A

dicha escala las barreras que impiden la dispersión entre poblaciones suelen estar


relacionadas con cambios de origen antrópico en los ecosistemas: infraestructuras

lineales, urbanización, campos de cultivo, etc. El análisis genético con microsatélites

permitirá conocer la estructura genética y el grado de fragmentación entre las

poblaciones ibéricas. También se podrá cuantificar la variabilidad genética de las

poblaciones. Estos parámetros poblacionales son decisivos para la supervivencia de

las poblaciones y proporcionan una importantísima información a la hora de tomar

medidas enfocadas a la conservación. Si la variabilidad genética de las poblaciones es

baja significa que el proceso de aislamiento, aunque reciente, es importante y que

puede existir una alta tasa de consanguinidad, pudiendo ser recomendables

programas de reintroducción y restauración genética.

La obtención de microsatélites, realizada entre abril y septiembre de 2007 en la

Universidad de Sussex (Inglaterra) bajo la tutela del Dr. T. J. C., Beebee, es el primer

paso, e ineludible, para desarrollar este proyecto enfocado a la conservación de la

especie en las poblaciones Ibéricas.

Metodología

Hay distintas estrategias para la obtención de genotecas enriquecidas en

microsatélites, documentadas por Zane et al. (2002). En la genoteca desarrollada para

Rana dalmatina se ha seguido una combinación de algunas de ellas. Los pasos han

sido:

1. Extracción, purificación y estimación del ADN

Se obtuvo ADN de alta calidad siguiendo el protocolo estándar de extracción y

purificación del fenol-cloroformo, a partir de cuatro larvas de Rana dalmatina

procedentes de la cría en cautividad de huevos de las poblaciones ibéricas en el año

2004, y conservadas en alcohol de 96º.

Se estimó la cantidad y pureza de los ácidos nucleicos en la preparación

mediante espectrofotometría. Éstos, en disolución acuosa, presentan máximos de

absorbancia en la región ultravioleta del espectro, a 260 nm, debido a la presencia de

las bases nitrogenadas. Para calcular su concentración, una unidad de absorbancia

(UA) corresponde aproximadamente a 50 μg/ml de ADN de cadena doble. Se utilizó el

espectrofotómetro de UV UNICAM HELIOS.


2. Tamaño y pureza del ADN

La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente

eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoléculas según su tamaño y carga

eléctrica, a través de una matriz gelatinosa.

Se utilizó la electroforesis en gel de agarosa para identificar y purificar los

fragmentos de ADN (figura 1). Como marcador se utilizó bromuro de etidio, sustancia

que emite una luz roja-anaranjada que se intensifica unas 20 veces después de

haberse unido al ADN, cuando se expone a la luz ultravioleta. Es una sustancia que se

debe manipular con mucha precaución, porque tiene importantes efectos mutágenos y

posiblemente cancerígenos.

Figura 1. Tamaño y pureza del ADN obtenido.

3. Preparación del ADN genómico en un rango de tamaño de 300 a 700pb

Las enzimas de restricción se han convertido en una herramienta básica de la

ingeniería genética. Son endonucleasas que reconocen y cortan secuencias

específicas en la doble hélice de ADN. Son extraídas de organismos procarióticos

(bacterias), donde actúan como un mecanismo de defensa, para degradar material

genético extraño que entra en la célula.


En este caso, se utilizaron para obtener fragmentos de ADN con tamaños entre

300 y 700 pb, suficientemente grandes como para albergar los microsatélites, y

suficientemente pequeños para manejarlos.

El ADN genómico de Rana dalmatina fue digerido con la enzima de restricción

Mbo I, que proviene de la bacteria Moraxela bovis, causante de conjuntivitis en el

ganado vacuno. Produce el corte en la siguiente secuencia:

5´…▼GATC..…3´

3´…..CTAG▲…5´

Y es isosquizómero de la enzima Sau 3A1 (procedente de Staphylococcus

aureus), es decir, reconoce y digiere la misma secuencia de ADN y además rompe en

el mismo sitio de la secuencia, por lo que ambas enzimas generan extremos

compatibles.

Los fragmentos de 300 a 700 pb fueron seleccionados y purificados a partir del

gel de agarosa en que se corrió la muestra junto con un marcador de 100 pb.

4. Annealing y ligación de linkers

Los linkers son oligonucleótidos sintéticos autocomplementarios, que tienen

secuencias de reconocimiento de las endonucleasas y para los que existen cebadores

para la PCR. Forman enlaces fosfodiéster fácilmente con las moléculas de ADN.

Se ligaron los linkers SaulA y SaulB a los fragmentos de ADN cortados,

utilizando para ello la enzima T4 DNA ligasa.

SaulA: 5′-GCGGTACCCGGGAAGCTTGG-3′

SaulB: 5′-GATCCCAAGCTTCCCGGGTACCGC-3′

5. Amplificación por PCR del linker-DNA

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de biología

molecular que ha permitido un gran avance en los estudios, ya que permite la

obtención de grandes cantidades de ADN a partir de una pequeña muestra. Emplea

ciclos de altas y bajas temperaturas para desnaturalizar las hebras de ADN y dejar que

las DNA polimerasas las repliquen a partir de los cebadores o primers. Para ello se

utiliza un aparato llamado termociclador.


Utilizando primers específicos para la secuencia de los linkers, se amplificaron

los fragmentos de ADN de Rana dalmatina obtenidos.

6. Selección híbrida-enriquecimiento de la genoteca

Consiste en dirigir la genoteca hacia la búsqueda de microsatélites. Se

realizaron dos genotecas enriquecidas siguiendo la misma metodología. En primer

lugar se buscaron microsatélites formados por una secuencia repetida de

dinucleótidos, que se ha comprobado en otras especies que es muy polimórfica. El

resultado de esta búsqueda no fue muy fructuoso y la cantidad de secuencias

obtenidas fue baja, por lo que se optó en buscar otro tipo de microsatélites

(dinucleótidos y tetranucleótidos) para obtener una cantidad adecuada y suficiente de

secuencias polimórficas.

Se utilizaron las propiedades de la estreptavidina y de las bolitas

paramagnéticas para separar secuencias de ADN de interés. La primera es una

proteína que presenta una extrema afinidad por la biotina y con la que se pueden

recubrir las bolitas paramagnéticas.

Se fabricaron oligonucleótidos con la secuencia de los microsatélites de interés

y se marcaron con una cola de biotina en el extremo 3´, para utilizarlos como sondas

de captura de los fragmentos de ADN de Rana dalmatina con la secuencia

complementaria. Estas sondas se unen fuertemente a la estreptavidina, que se

encuentra recubriendo bolitas paramagnéticas. Tras realizar la hibridación con el ADN

genómico y la captura de los microsatélites complementarios, se separaron las bolitas

utilizando un imán (vibrating simple magnetometer). De esta manera se recuperaron

los fragmentos de ADN que nos interesaban utilizando HCl y calor para separarlos de

las sondas.

Así, se buscaron los microsatélites con la secuencia GT/AC en la primera

genoteca y AG/CT, TATC/GATA y GACA/TGTC) en la segunda.

7. PCR del ADN híbrido seleccionado

Los fragmentos recuperados se usaron como molde para una nueva

amplificación, utilizando de nuevo la técnica de la reacción en cadena de las

polimerasas.


8. Eliminación de linkers

Para eliminar los linkers se utilizó de nuevo una enzima de restricción. Los

linkers tienen además de secuencias que posibilitan la amplificación en la PCR,

secuencias de reconocimiento para enzimas de restricción, en este caso para la

enzima Mbo 1.

De esta forma se recuperaron los fragmentos del ADN original, precipitándolo

con etanol y centrifugándolo.

9. Ligación en el plásmido

Los plásmidos son fragmentos de ADN extracromosómico presentes en

bacterias, que se utilizan en ingeniería genética por su capacidad de reproducirse de

manera independiente del ADN cromosomal, y porque es relativamente fácil

manipularlos e insertar en ellos nuevas secuencias genéticas.

Para ligar los fragmentos seleccionados en el plásmido, se digirieron los

plásmidos pUC19 con la enzima de restricción Sau 3A1, la cual genera extremos

cohesivos en el plásmido, compatibles con los extremos generados en los fragmentos

del ADN seleccionado tras la digestión con Mbo1.

Se incubaron ambos productos con la enzima T4 DNA ligasa en las

condiciones apropiadas y así se obtuvieron los plásmidos hibridados, relativamente

fáciles de replicar in vivo.

10. Clonación y selección de plásmidos que contienen microsatélites

La clonación permite una amplificación de los fragmentos de ADN in vivo y de

forma inespecífica. Se utilizó un plásmido que insertó los fragmentos de ADN y se

incluyó en células competentes que replican dichos fragmentos. Las células

competentes son bacterias tratadas con iones de calcio y choques de temperatura

para alterar las envueltas, sobre todo la membrana externa, y aumentar su

permeabilidad al ADN foráneo, como son los plásmidos, que entran en la célula como

moléculas de cadena doble.

El plásmido utilizado fue pUC19, un plásmido pequeño (tamaño 2686pb),

procedente de Escherichia coli (figura 2). En su secuencia destacan dos genes que

actúan como marcadores de selección. Un gen de resistencia al antibiótico ampicilina


(gen AmpR), que confiere a las bacterias que incorporan este plásmido resistencia a

dicho antibiótico. Y el gen LacZ, que codifica para la enzima β-galactosidasa, la cual

degrada la lactosa y otros β-galactósidos como el X-gal, permitiendo la selección por el

método White/Blue.

Se transformaron células de Escherichia coli competentes DH5α con el

plásmido pUC19, con los insertos de ADN de Rana dalmatina, para que los vectores

recombinantes se multiplicaran. Una vez transformado el cultivo bacteriano se

seleccionaron las bacterias que habían insertado el plásmido recombinante.

El método de White/Blue es usado a menudo en ingeniería genética; está

basado en la expresión del Operón Lac y sirve para reconocer las bacterias

recombinantes. Consiste en utilizar los reactivos IPTG (isopropil-β-D-tiogalactósido),

un inductor artificial del gen lacZ y X-gal, un galactósido artificial. Las colonias que han

insertado el plásmido sin inserto tienen un aspecto azul por la degradación del X-gal.

Si el gen lacZ es inactivado por la presencia del inserto, las colonias son de color

blanco.

Además el medio de cultivo tenía ampicilina (antibiótico de selección), por lo

que las células que no insertaron el plásmido no podían crecer.

Figura 2. Mapa de restricción del plásmido pUC 19 (obtenido de Fermentas Life

Science).


11. Rastreo (screening)

El conjunto de todos los clones, cada uno con un fragmento distinto del

genoma de Rana dalmatina, constituye la genoteca. El rastreo (screening) de ésta nos

permitió encontrar y aislar los clones de interés, que contienen los microsatélites.

Un elemento clave para identificar cualquier secuencia son las sondas:

fragmentos de ADN clonados que contienen parte de la secuencia que estamos

buscando. Éstas se marcan, usualmente con isótopos radioactivos, aunque también

existen procedimientos no radioactivos, para luego poder encontrarlas cuando hayan

hibridado con el fragmento de interés. Es una segunda selección de los microsatélites

utilizando sondas con las secuencias bi y tetranucleótidos antes seleccionadas

(GT/AC, AG/CT y TATC/GATA), y polimerasa.

A la hora de realizar la hibridación se escogieron condiciones más o menos

relajadas para que se formaran los heterodúplex aunque la homología no fuera

completa, que permitiera cierto porcentaje de malos emparejamientos entre la sonda y

el ADN diana.

Para ello, las colonias se incubaron en membranas neutras de nylon con

capacidad de fijación de los ácidos nucleicos (Hybond-N membrane), sobre medio de

cultivo sólido (LB, agar y ampicilina). Previamente, estas colonias habían sido

seleccionadas y recogidas una a una en placas de 96 celdillas. Las células de las

colonias se lisaron in situ con un tratamiento suave utilizando detergente, que disuelve

la membrana de las células y diluye las proteínas cubriéndolas de cargas negativas. El

ADN se desnaturaliza y se fija a las membranas mediante altas temperaturas.

En medio líquido (solución de hibridación) se mezclaron las membranas con el

ADN fragmentado y desnaturalizado de Rana dalmatina, y las sondas marcadas con

radioactividad y desnaturalizadas para que se produjera la hibridación. Si el ADN

sonda tiene algún grado de homología con el de algunos clones, se empareja para

generar la doble hélice. Luego se lavaron las membranas para eliminar el exceso de

sonda radioactiva y el resto de ADN no hibridado, y se secaron.

Finalmente, revelamos el resultado. Se pusieron los filtros en contacto con una

película de rayos X y al cabo de unas horas o días, la película se reveló. Las colonias

que habían hibridado quedaron marcadas como unos puntos negros que nos

indicaban su posición. Por último, se volvió a las placas matrices, donde estaban las


colonias con las células vivas, y se recuperaron los clones que habían insertado los

microsatélites.

12. Secuenciación de los clones positivos

Los clones positivos se mandaron a secuenciar en una empresa especializada.

Se diseñaron los primers con un programa informático llamado PRIMER3, que

también proporciona las condiciones óptimas de amplificación en el termociclador,

aunque había que revisarlas y algunas veces cambiarlas porque las temperaturas en

la PCR no eran las adecuadas.

13. Análisis de los microsatélites obtenidos

Utilizando el protocolo del fenol-cloroformo de nuevo, purificamos ADN de 10

individuos procedentes de tres poblaciones de la península Ibérica, aisladas entre

ellas: 4 de los robledales de la sierra de Izki (Álava), 3 del valle de Ultzama (Navarra) y

3 de Amurrio (Álava). Con estas muestras fueron probados los microsatélites aislados

y los primers diseñados para amplificarlos.

Después de la amplificación, utilizando nucleótidos sonda marcados con

radioactividad, las muestras se corrieron mediante electroforesis en geles de

poliacrilamida, donde se pudo comprobar si los microsatélites eran mono o

polimórficos en las poblaciones seleccionadas.

Estos primeros muestreos se hacen para determinar si los microsatélites son

polimórficos en las poblaciones ibéricas. Como únicamente utilizamos 10 individuos,

cuando había más de un alelo, definimos el microsatélite como polimórfico. Cuando se

estudia una población de 20-100 individuos, los microsatélites se consideran altamente

polimórficos cuando se encuentran 8 alelos.

Resultados y perspectivas

En total fueron secuenciados 20 microsatélites, y diseñados y construidos

primers para todos ellos. El ADN procedente de 10 animales de la península Ibérica

fue amplificado con todos ellos para comprobar su mono o heteromorfismo. Además

se testó un microsatélite de Rana latastei y tres de R. temporaria. En ocho ocasiones


se tuvo que repetir el diseño de los primers porque no amplificaron en el termociclador.

Los resultados obtenidos fueron (tabla I):

Microsatélite Monomórfico PolimórficoRtemp1 X Rtemp5 X Rtemp9 X

RlatCa17 X

Rdal-1 X

Rdal-2 X Rdal-3 X

Rdal-4 X Rdal-5 X

Rdal-6 X

Rdal-7 X

Rdal-8 X Rdal-9 X

Rdal-10 X Rdal-11 X Rdal-12 X

Rdal-13 X Rdal-14 X Rdal-15 X Rdal-16 X Rdal-17 X Rdal-18 X

Rdal-19 X Rdal-20 X

Tabla I. Carácter de los microsatélites obtenidos, en las poblaciones ibéricas.

Las poblaciones definidas como “grupo de individuos de la misma especie

aislados reproductivamente de otros grupos” están sujetas a cambios evolutivos, entre

los que se encuentran los cambios genéticos. Éstos pueden actuar disminuyendo la

variabilidad de las poblaciones (selección, deriva genética) o aumentándola (mutación,


migración). La pérdida de variabilidad genética disminuye la eficacia biológica de las

especies ante los cambios ambientales.

A pesar de que la mayor parte de los microsatélites obtenidos son

monomórficos en las poblaciones ibéricas, hay ocho que son polimórficos. Este

número se considera adecuado y suficiente para realizar los estudios poblacionales

previstos, describir la variabilidad y distribución biológica.

Los microsatélites se amplificarán en un gran número de individuos de

diferentes poblaciones para comprobar el número de alelos existente en cada uno de

ellos. Las frecuencias de los alelos de ocho microsatélites son suficientes para realizar

los análisis estadísticos y poblacionales propuestos: cuantificar la variabilidad genética

(heterocigosidad) de las poblaciones ibéricas, conocer su estructura genética y

comprobar si están siendo afectadas por problemas como la endogamia,

especialmente la de las más amenazadas, cuya gestión debe acometerse a corto

plazo, y valorar el flujo génico existente entre poblaciones y grupos de poblaciones,

parámetro muy importante en estudios enfocados a la conservación ya que en hábitats

fragmentados, como es el caso de la población ibérica, no se pueden producir las

recolonizaciones habituales, el flujo génico se ve interrumpido, los efectos genéticos

pueden afectar al precario estado de la especie y tal vez sea necesario diseñar

programas de restauración genética.

El conocimiento de todos estos parámetros es básico para acometer los planes

de conservación de la especie en la península Ibérica. Forman parte del estudio

multidisciplinar (biogeografía, hábitat, estado poblacional, etc.) al que deben

someterse las especies cuando se hacen planes de conservación.

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