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Curso básico de bacteriología clínica

Clase 1

GENERALIDADES DE BACTERIOLOGÍA

-INTRODUCCIÓN

El estudio de los microorganismos comprende el conocimiento de su forma, estructura, reproducción, fisiología, metabolismo e identificación.

Los microorganismos están presentes en todas partes a nuestro alrededor y, a pesar de sus aspectos más negativos, son absolutamente necesarios para el desarrollo de la vida en el planeta.

Con el paso del tiempo, han evolucionado para adaptarse prácticamente a cualquier ambiente.

Por sus propias características, sus ciclos vitales son cortos y rápidos.

-BACTERIA

Las bacterias pertenecen al reino PROCARYOTAE.Son organismos unicelulares, microscópicos, sin núcleo definido ni

clorofila.La mayoría son de vida libre, a excepción de algunos que son de vida

intracelular obligada.(Chlamydias).Tienen mecanismos productores de energía y material genético

necesario para su desarrollo y crecimiento. El grupo de microorganismos procariotas se divide en :

ARQUEOBACTERIAS, que viven en condiciones extremas; y las EUBACTERIAS, entre las que se encuentran las bacterias de interés médico, ya que viven en aguas, suelo y organismos vivos.

Su tamaño oscila entre 0.5 a 3 micrones. Son visibles a través de microscopio óptico y electrónico.

Es la forma de vida más simple y abundante en la naturaleza.Están presentes en los ciclos naturales del Nitrógeno, Carbono, Fósforo,

etc.

Son también aprovechados por la industria en los procesos de fermentación y para la producción de antibióticos.

-ESTRUCTURA

.La célula bacteriana presenta 3 características principales:- No tiene núcleo que contenga el ADN, sino que este se encuentra

libre en el citoplasma.- El citoplasma contiene además moléculas de ARN en los

ribosomas, que sintetizan proteínas que luego tendrán diferentes funciones.

- No poseen compartimientos intracelulares delimitados por membranas.

COMPONENTES:

MEMBRANA PLASMÁTICA:- Es una estructura vital para la bacteria.- Tiene un espesor de 8 nm. - Está formada por fosfolípidos y proteínas.- Tiene permeabilidad selectiva y permite el ingreso de los nutrientes y la salida de los desechos por transporte activo y pasivo.- Sintetiza los componentes de la cápsula y de la pared celular.- Es el lugar de acción de detergentes y ATB polipeptídicos (polimixina).

PARED CELULAR:- Está ubicada por fuera de la membrana plasmática.- Es una estructura compleja y fundamental para la bacteria. - Está formada por peptidoglicanos.- Su espesor varía de 1 a 2 moléculas a 50-100 moléculas.- Le otorga rigidez a la bacteria y la protege de los cambios de

presión osmótica del medio.- En ella se localiza los componentes que determinan su

patogenicidad: endotoxinas.- Es el sitio de acción de algunos antibióticos: los betalactámicos.- Contiene antígenos que son usados en la clasificación e

identificación bacteriana.- Se manifiesta con la tinción de Gram, y permite dividir a las

bacterias en 2 grandes grupos: GRAM POSITIVAS y GRAM NEGATIVAS.

CITOPLASMA:- Está formado en un 85 % por agua.- Contiene ribosomas y cromosoma bacteriano.

RIBOSOMAS:- Están compuestos por ARN y proteínas. - Se encuentran libres en el citoplasma. También pueden

presentarse como polirribosomas (cadenas).- Interviene en la síntesis de proteínas.- Son el sitio de acción de numerosos ATB: Aminoglucósidos,

Tetraciclinas, Cloranfenicol, Macrólidos y Lincosamidas.

ADN CROMOSÓMICO:Las bacterias no poseen membrana nuclear, nucléolo ni aparato mitótico, por lo que se material genético está constituido por un filamento de ADN circular de doble cadena que se encuentra enrollado sobre sí mismo.

CÁPSULA:- Es una envoltura externa, ubicada por fuera de la pared celular.- Está formada por polisacáridos.- Es de consistencia mucosa, un gel que se adhiere a la célula.- Protege a la bacteria de la fagocitosis y facilita la invasión.- Permite la diferenciación en tipos serológicos en base a los

antígenos capsulares.- No es una estructura vital para la célula; su pérdida no produce la

muerte de la bacteria, pero sí afecta su virulencia.- Se hace visible al microscopio óptico usando la coloración con

tinta china.

FLAGELO:- Son filamentos largos y delgados, helicoidales.- Están formados por una proteína llamada flagelina.- Son los responsables de la movilidad de la bacteria.- Puede variar su cantidad de 1 a cientos.- No es una estructura vital para la célula.- Son demasiado pequeños para ser vistos en su estado natural con

el microscopio óptico, por eso existen coloraciones especiales que los dejan en evidencia.

PILI O FIMBRIAS:- Son estructuras filamentosas y proteicas.- No son vitales para la bacteria.- Cumplen funciones de adherencia a receptores específicos y

tienen u papel fundamental en la colonización de epitelios.- No cumplen función de movilidad.- Solo pueden ser vistos por microscopía electrónica.

- Los pilis sexuales intervienen en el intercambio genético entre bacterias, en donde una célula donadora transfiere Plásmidos a otra receptora en un proceso denominado conjugación.

PLÁSMIDOS:- Son secuencias cortas de ADN circular bacteriano que puede

existir y replicarse independientemente del ADN cromosómico.- No son esenciales para la vida de la bacteria, pero le dan algunas

ventajas: resistencia a los ATB, patogenicidad, etc. - Pueden transferirse de una bacteria a otra a través de la

conjugación.

- REPRODUCCIÓN

La reproducción se lleva a cabo asexualmente por división celular.- El ADN circular se empieza a replicar.- A los 20 min. el nuevo cromosoma esta completo y se fija a un

sitio de la célula.- Aparece una división en el centro de la célula.- A los 38 min. la división ya es una pared. - A los 45 min. la división ya se ha completado.

- CLASIFICACIÓN

Se puede decir que en el proceso de identificación de microorganismos se ponen en juego todos los conocimientos acumulados en Microbiología.La identificación de las bacterias es más precisa cuanto mayor es el número de criterios utilizados. Esta identificación basada en modelos, agrupados en familias y especies, forma la clasificación bacteriana.Algunos de los criterios en los que nos basamos son:- Morfología microscópica y microscópica.- Requerimiento de O2 para su desarrollo.- Capacidad para consumir glucosa.- Composición de su pared celular.

- REQUERIMIENTO DE O2.

- AEROBIAS ESTRICTAS : bacterias que crecen en presencia de O2 y lo requieren para su continuo crecimiento. (20% de O2.).

- ANAEROBIAS ESTRICTAS : No se desarrollan en presencia de O2. Utilizan CO2, H2, N2.

- ANAEROBIAS FACULTATIVAS : prefieren crecer en presencia de O2, aunque pueden hacerlo sin él.

- MICROAERÓFILAS : crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias: menos de 12 % de O2 y aumento en la concentración de CO2.

-FORMA Y AGRUPACIÓN:

El examen microscópico de las bacterias nos permite reconocer su morfología.Así podemos reconocer:

- COCOS : tiene forma esférica u ovalada. Pueden presentarse: - aislados -de a pares: diplococos. - en cadenas: estreptococos. - en racimos: estafilococos.

- BACILOS: tienen forma cilíndrica, recta o curva. Sus extremos pueden ser rectos o redondeados. Pueden estar aislados, en cadenas o formando letras chinas y empalizadas.

- ESPIRILOS: tienen forma de espiral. Varían en el número de vueltas.

- VIBRIOS: tiene forma de coma.

-COMPOSICION DE LA PARED CELULAR:

Para evidenciar la pared celular, se utiliza la coloración de GramSegún la composición de su pared celular, las bacterias pueden clasificarse en:Gram +.Gram -. Pared de las bacterias Gram Positivas: .

La pared de la célula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la célula gram-positiva es peptidoglicano.

Pared de las bacterias Gram Negativa:

La pared de la célula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la célula gram-negativa es peptidoglicano.

Tipos de coloraciones:

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas, proceso llamado fijación. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más corriente, aunque también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido, ácidos y alcoholes. Después de la fijación, si se añade el colorante, no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma. La fijación se realiza habitualmente en células que han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando después éste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción.

Los métodos de tinción son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaución, ya que pueden conducir a errores. Las moléculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares auténticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente.

Las tinciones pueden clasificarse en:

-DIFERENCIALES-SIMPLES-ESPECÍFICAS

- FLUOROCROMOS

TINCIÓN DIFERENCIAL

-Se utilizan 2 ó más colorantes.-Permite distinguir entre distintos tipos de microorganismos.-Tiene al menos 2 etapas: colorante 1rio. y colorante de contraste.-Ej: Gram, Zielh-Neelsen, Giemsa.

TINCIÓN SIMPLE

- Se utiliza 1 solo colorante.- Mejora el contraste.- Ej: Azul de metileno.

TINCIÓN ESPECÍFICA:

-Revelan estructuras particulares.-Aumenta el contraste.-Ej: flagelos, esporas.

TINCIÓN NEGATIVA

-Tiñe el medio que rodea al microorganismo.-Realza el contraste.-Ej: Tinta china.

TINCIÓN FLUORESCENTE

-Aumenta el contraste por medio de fluorescencia.-Se utilizan colorantes llamados fluorocromos.-Ej: Naranja de acridina, auramina.

- TINCIÓN DE GRAM:

Es el método de coloración más importante en el laboratorio de bacteriología, ya que permite iniciar el reconocimiento de los microorganismos.Se llama así por el bacteriólogo danés Christian Gram, quien la desarrolló en 1884.En base a los resultados de la tinción, las bacterias pueden dividirse en Positivas y Negativas.Las bacterias se tiñen de forma diferente debido a las diferencias constitutivas de su pared celular.

Procedimiento: Preparación y secado del frotis. Fijación: calor / metanol. Colorante 1rio: Cristal violeta: 1 min. Enjuague. Mordiente: Lugol: 1 min. (Es una solución de Iodo y Ioduro de potasio). Enjuague. Decolorante: alcohol acetona. (30% de acetona y 70% de etanol). Enjuague. Colorante 2rio: Safranina: 1 min. Enjuague y secado.

Explicación:

- El primer paso en cualquier tinción debe ser la fijación.

- El cristal violeta penetra en todas las células bacterianas, + y -.

- El Iodo entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta.

- La mezcla de alcohol-acetona sirve para hacer la decoloración, ya que en la misma es soluble el complejo I/ cristal violeta: los Gram + no se decolora, mientras que los Gram – sí lo hacen.

- Para poner de manifiesto las células Gram- se usa una coloración de contraste, como la safranina o la fucsina básica.

-MICROSCOPÍA:

La tinción de Gram nos permite observar dos características de las bacterias: forma y agrupación y la diferenciación en Gram + o -.Para observar al microscopio los preparados coloreados, le agregamos una gota de aceite de inmersión.Usamos el microscopio óptico con la lente de 100X.

-TINCION DE ZIEHL- NEELSEN

Los BAAR poseen una pared celular rica en lípidos y acido micólico, que tienen la propiedad de unirse fuertemente al colorante primario cuando se usa el calor como mordiente. Una vez formado este complejo colorante-pared, ni siquiera la acción conjunta del ácido y el alcohol pueden deshacerlo, ya que la pared retiene el colorante en forma resistente.Pasos:

Preparación y secado del frotis. Fijación: calor / metanol. Colorante 1rio: Fucsina. Mordiente: Calor: Flamear hasta que se desprenda vapor blanco. Repetir 3 veces. Enjuague. Decolorante: alcohol ácido. 1-2 min. Enjuague. Colorante 2rio: Azul de metileno.20 min.

Enjuague y secado.

Los BAAR se observan teñidos de rojo y el resto aparece en azul celeste.Son BAAR las micobacterias, nocardias y algunos hongos.

-OTRAS COLORACIONES:

-GIEMSA:

En microbiología se usa para visualizar parásitos, hongos, levaduras y espiroquetas.Reactivos: 1. Metanol o etanol → fijador. 2. Colorante de Giemsa + Agua tamponada (pH 7.2).El colorante de Giemsa es un colorante compuesto ya que es una mezcla de varios colorantes. Por esto se dice que la coloración de Giemsa es una coloración compuesta o diferencial (ya que emplea más de un colorante).

-AZUL DE METILENO:

Azul de metileno (Tinción simple). Permite teñir el interior celular. Tiñe microorganismos.

-TINTA CHINA:

Es una tinción negativa ya que deja las bacterias sin teñir y colorea el medio que las rodea.Su máxima utilidad es revelar la cápsula de algunas bacterias.

-AURAMINA Y NARANJA DE ACRIDINA:

Son tinciones realizadas con diferentes fluorocromos.Se necesita un microscopio de fluorescencia para observarlas.Auramina: se usa para teñir bacilos BAAR. Las bacterias aparecen anaranjadas brillantes contra un fondo verde.Naranja de acridina: es muy usado en hemocultivos. Se usa para detectar la presencia de bacterias. Lo interesante de estas coloraciones, es que luego, el frotis se puede teñir con Gram o Ziehl-Neelsen (según el caso) y confirmar el resultado con la coloración tradicional que, además, permite ver la morfología.

- OBSERVACIÓN EN FRESCO:

No es el método más usado para observar la morfología ya que el citoplasma es incoloro. Sí se utiliza para ver la movilidad de las bacterias, para observar parásitos y hongos.

-CAMPO OSCURO:

Es una variante del examen en fresco y permite observar el movimiento característico y la morfología de las espiroquetas.

Resumiendo…

BACTERIA

-Organismo unicelular.-Procariota.-Microscópico (Uso de coloraciones).-Reproducción asexual.

CLASIFICACIÓN:

-Morfología: cocos, bacilos, vibrios y espirilos.-Composición de su pared celular: Gram + y -, AAR.

-Requerimiento de O2.

Preparación de colorantes:

Preparación de los colorantes para Gram:CRISTAL VIOLETA

Cristal violeta 10 g. Oxalato de amonio 4 g. Etanol 100 ml. Agua destilada 900 ml.

Dejar reposar a 37°C 24 hs.Filtrar con papel de filtro antes usar

LUGOL

Iodo 10 g.

Ioduro de potasio 20 g. Etanol 250 ml. Agua destilada 750 ml.

Dejar reposar a 37°C 24 hs.Filtrar con papel de filtro antes de usar.

ALCOHOL ACETONA (70/30):

Acetona 300 ml. Alcohol etílico 700 ml.SAFRANINA

Safranina 2,5 g. Etanol 100 ml. Agua destilada 900 ml.

Dejar reposar a 37°C 24 hs.Filtrar con papel de filtro antes de usar.

Preparación de los colorantes para Ziehl-Neelsen:

FUCSINA FENICADA

-Fucsina básica 10 g.- Etanol 100 ml.- Fenol 50 ml.- Agua destilada 1000 ml.

Dejar reposar a 37°C 24 hs.Filtrar con papel de filtro antes usar.

ALCOHOL ÁCIDO

-Etanol 970 ml.- Ácido clorhídrico 30 ml.

Manipular con precaución el HCl. AZUL DE METILENO

Azul de Metileno 1 g. Etanol 100 ml. Agua destilada 900 ml.

Dejar reposar a 37°C 24 hs.Filtrar con papel de filtro antes usar.

Ante cualquier duda, no dudes en hacer consultas.

Adriana Núñez Técnica de laboratorio del Servicio de Microbiología del Hospital de pediatría Juan P. Garrahan.

Contacto: adng@live.com.ar

cursodebacteriogarrahan@yahoo.com.ar