GENERACIÓN DE PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS

CLAUDIA MACHICADO RIVERO, Ph.D.

Asesora científica de F. Hoffmann-La Roche

peru.diagnostico_molecular@roche.com

RESUMEN

• Introducción

• Herramientas y métodos bioinformáticos

• Diseño de cavidades en el interior de proteínas

• Acoplamiento molecular proteína-ligando

• Screening masivo y automático de librerías de fármacos

RESUMEN

Creación de sitios de unión

+

-Estabilizar proteínas-Modular la actividad (interruptor)-Albergar y vehiculizar fármacos

INTRODUCCIÓN

Estrategia para el diseño de sitios de unión y vehiculización de ligandos in vivo

1) Construcción del sitio de unión de ligando

¿COMO METER UN LIGANDO EN UNA PROTEINA DETERMINADA?

• Elegimos una proteína modelo y creamos agujeros virtuales.• Seleccionamos los que no colapsan.• Hacemos acoplamiento masivo de bases de datos de ligandos a los agujeros.• Comprobamos que el ligando seleccionado se une al mutante con agujero.

2) Vehiculización

Diseño de proteínas terapéuticas

1. Elegir residuos grandes e hidrófobos enterrados en la proteína.

Diseño de proteínas terapéuticas

2. Mutaciones truncantes

Diseño de proteínas terapéuticas

3. Creación de una cavidad

Diseño de proteínas terapéuticas

4. Estudio de la unión de pequeñas moléculas

Proteína

Elegir residuos

Mutación in silico

Minimización/ Análisisde cavidades

Acoplamiento automático

Proteínas concavidad

Acoplamiento interactivo

Energíasinteracción Análisis de

dG de unión

Buscar residuosvoluminosos

Acoplamiento P-L

EnergéticaEnergías de

desolvatación

Proteínas huecudas

Creación de cavidades

Ligandos

Esquema general del trabajo

Flavodoxina de Anabæna como modelo de estudio

Dominio de unión a FMN

Estabilidad y plegamiento

Clonada

Cristalizada

FMN

Trp 57

Tyr 94

+

Holoproteína

FMNApoproteína

Ligando

Cavidad

2. Docking Flexible+Screening masivo y automático

Complejo modelado

3. Evaluación energética

Software Affinity + Catalyst (Accelrys Inc.)

Proteína

1. Diseño in silico de

cavidad

Herramientas y métodos bioinformáticos

Software InsightII (Accelrys Inc.)

Programas varios: Linux

Objetivos

• Diseñar proteínas con cavidad: analizar su estructura y estabilidad y evaluar su capacidad de unir moléculas específicas.

• Determinar teóricamente la afinidad y complementariedad de las cavidades creadas por pequeñas moléculas orgánicas.

• Seleccionar y evaluar automáticamente la energética de los ligandos más prometedores de unirse en una cavidad, partiendo de una librería de miles de compuestos.

• Comprobar experimentalmente la fiabilidad de los métodos bioinformáticos desarrollados.

Desarrollar un procedimiento teórico de diseño de proteínas portadoras que

eventualmente puedan emplearse en el campo de la Medicina.

PREDICCIÓN DE CAVIDADES EN EL INTERIOR DE PROTEÍNAS: DISEÑO Y OBTENCIÓN DE MUTANTES DE FLAVODOXINA CON CAVIDAD

PREDICCIÓN DE LA ESTRUCTURA Y ENERGÍA DE UNIÓN DE COMPLEJOS PROTEÍNA-LIGANDO

CRIBADO MASIVO DE LIGANDOS EN CAVIDADES DE PROTEÍNAS Y DETECCIÓN EXPERIMENTAL DE LA FORMACIÓN DE COMPLEJOS

Diseño de un método para predecir la formación de cavidades en proteínas

Modelos de estudio: Mutantes truncadas

Mutaciones truncantes in silico

Minimización de energía

Análisis de los modelos: dimensiones de la cavidad y estructura global

Lisozima T4 Barnasa Citocromo c peroxidasa

Modelización de proteínas con cavidad

Identificación dela mutante

Volúmenes y reducción de lacavidad teórica y cristal

Modelo deSteepest descents

Proteína Mutante Volumencavidadteórica

(Å3)

Volumencavidadcristal

(Å3)

Reducciónvolumencavidadcristal

(%)

Volumencavidadmodelo

(Å3)

Reducciónvolumencavidadmodelo

(%)

RMScadenaslaterales

superficiecavidad

T4L M102AM106A 0 0 Na 0 Na 0,48I29A 40 42 -5 31 23 0,23I17A 34 0 100 0 100 0,16L99A 155 174 -12 162 -5 0,24

M102A 121 94 22 105 13 0,44L133G 191 182 5 177 7 0,31L133A 171 150 12 147 14 0,34F153A 161 110 32 149 7 0,28

L99A/F153A 275 265 4 268 3 0,29L46A 51 32 37 43 16 0,23I100A 19 36 -89 31 -63 0,38V87A 32 45 -41 40 -25 0,22V111A 57 46 19 50 12 0,22V149A 40 47 -18 0 100 0,23M6A 74 58 22 52 30 0,23

V103A 14 14 0 0 100 0,23F67A 40 40 0 83 -108 0,39I58A 92 67 27 40 57 0,32

L121A 172 50 71 148 14 1,46Barnasa I76A 32 0 100 0 100 0,19

I88A 23 21 9 15 35 0,30I96A 39 40 -3 48 -23 0,32

Cit. c R48A 0 0 Na 0 Na 0,31perox. W191G 164 184 -12 204 -24 0,19

19 mutantes de lisozima T4

3 mutantes barnasa

2 mutantes cit. c perox.

Ampliación

Reducción

Predicción del porcentaje de reducción de la cavidad

Steepest descents reprodujo con mayor precisión el porcentaje de

reducción de las cavidades: ligeros cambios en la estructura

Steepest descents Conjugate gradients

Predicción de la estructura de las proteínas con cavidad

Bajos valores de rmsd entre la estructura cristalizada y modelada

Reducción

Teórico CristalModelo

Alta precisión en la predicción de la forma y tamaño de las cavidades y de la estructura

global de la proteína

ExpansiónTeórico Cristal

Modelo

Diseño de cavidades en el núcleo hidrófobo de la flavodoxina de Anabæna

Trp66

Leu44Ile52Ile109

Leu105

Mutaciones in silico truncantes a Ala (Phe)

Método de modelización

Análisis de los modelos de flavodoxina con

cavidad

Mutante* Estructurasecundaria

Accesibilidadsolvente

cadena lateral(%)

Volumencavidadteórica

Volumencavidadmodelo

Reduciónvolumencavidad

(%)

W66F/L44A Hélice 0 251 232 8

W66F/L105A Hélice 0 255 217 15

W66F/I109A Hélice 0 205 210 -2

W66F Hélice 0 173 140 19

L44A Hélice 0 151 137 9

L105A/L44A Hélice 0 151 137 9

I109A Hélice 0 111 116 -5

I52A Lámina 0 97 91 6

L105A Hélice 0 52 61 -17

* modelos sobre la holoflavodoxina

Mutantes modeladas de flavodoxina de Anabæna con cavidad

• Muy ligeros rearreglos en la estructura de la proteína

• Ningún colapso fue observado

Flexibilidad reducida del núcleo hidrófobo

Machicado C., Bueno M. & Sancho J. 2002. Predicting the structure of protein cavities created by mutation. Protein Engineering. 2002 Aug;15(8):669-75.

W66F/L44AW66F/L105A

Cavidad: 185 Å3 Cavidad: 204 Å3

Mutantes modeladas de flavodoxina de Anabæna con cavidad

Estudio experimental del plegamiento de las mutantes de flavodoxina con cavidad

Dicroísmo circular en el UV-lejano

Dicroísmo circular en el UV-cercano

La creación de cavidades fue crítica para 2 mutantes (I109A y

W66F/I109A): parcialmente desplegadas

Estudio experimental de la estabilidad térmica de las mutantes de flavodoxina con cavidad

La creación de cavidades generó una importante desestabilización térmica

en todas las mutantes:-Pérdida de contactos de vdw-Pérdida de la fuerza hidrófoba

Proteína Tm (K EE) Tm (K)

Silvestre W66F -3.7 W66F/L105A -10.6 W66F/L44A -9.3

I109A -15.3 W66F/I109A -21.3

FLUORESCENCIA

322.9 0.2319.2 0.3312.3 0.3313.6 0.1307.6 0.4301.6 0.8

329.1 0.1327.3 0.1318.9 0.1318.2 0.2306.8 0.6303.9 1.4

Tm (K EE) Tm (K)

CD EN EL UV-LEJANO

-1.8-10.2-10.9-22.3-25.2

Método de modelización de cavidades aplicadoa otras proteínas: anti-HBsAg scFv fragment

Pedroso I, Irun MP, Machicado C, Sancho J. Biochemistry. 2002 Aug 6;41(31):9873-84.

Método de modelización de cavidades aplicadoa otras proteínas: COX-I

Rebeca Acın-Perez, Marıa Pilar Bayona-Bafaluy{, Marta Bueno, Claudia Machicado, Patricio Fernandez-Silva, Acisclo Pe´rez-Martos, Julio Montoya, M.J. Lo´pez-Perez, Javier Sancho and Jose´ Antonio Enrıquez* Hum Mol Genet. 2003 Feb 1;12(3):329-39.

C. Machicado, S. Castillo, M. Bueno, M. Pocoví y J. Sancho. Clin Invest Arterioscl 2003;15(2):59-65

Método de modelización de cavidades aplicadoa otras proteínas: receptor de LDL

PREDICCIÓN DE CAVIDADES EN EL INTERIOR DE PROTEÍNAS: DISEÑO Y OBTENCIÓN DE MUTANTES DE FLAVODOXINA CON CAVIDAD

PREDICCIÓN DE LA ESTRUCTURA Y ENERGÍA DE UNIÓN DE COMPLEJOS PROTEÍNA-LIGANDO

CRIBADO MASIVO DE LIGANDOS A CAVIDADES DE PROTEÍNAS Y DETECCIÓN EXPERIMENTAL DE LA FORMACIÓN DE COMPLEJOS

Implementación de un método para modelar complejos proteína-ligando

Lisozima L99A

• Estructuras cristalizadas (9)

• Gunión experimentales (15)

+ 17 ligandos 23 moléculas no unidoras

Unión Proteína-Proteína Unión Proteína-Ligando

Efecto hidrofóbico

EntalpíaEntropía

Desolvatación

El método de docking moleculardebe reproducir la unión proteína-ligando

Simulaciones computacionales de la unión proteína-ligando

Proteína Ligando

3. Ordena conformaciones de acuerdo a la energía obtenida.

1. Explora conformaciones que favorezcan la interacción proteína-ligando

2. Minimiza la energía potencial de los complejos.

Algoritmo de acoplamiento

Etapas del acoplamiento molecular proteína-ligando

∆Gunión= ∆GPL + ∆GP + ∆GL + ∆Gdesol

2. Evaluación de la energía potencial de los complejos y elección del más estable

3. Energía libre de unión teórica de los ligandos

1. Acoplamiento flexible• Monte Carlo y minimización

de energía, en un campo de fuerza CVFF

• 30 conformaciones distintas

• Selección de complejos: Metropolis

Variables definidas

FLEXIBILIDAD DEL SITIOFLEXIBILIDAD DEL SITIO • Átomos flexibles: Sitio de unión (cavidad) y ligando

• Átomos rígidos: Resto de proteína

• Campo de fuerza: CVFF

• Dimensiones de la cuadrícula

CÁLCULOS ENERGÉTICOSCÁLCULOS ENERGÉTICOS

• Método de minimización y número de pasos

• Prueba de selección

• Temperatura de Metrópolis

Sitio de unión: residuos en la superficie de la cavidadSitio de unión: residuos en la superficie de la cavidad

CUADRÍCULAS DE DOCKING CUADRÍCULAS DE DOCKING

SIMULACIÓN (5-6 HORAS) SIMULACIÓN (5-6 HORAS)

30 CONFÓRMEROS PARA CADA LIGANDO

30 CONFÓRMEROS PARA CADA LIGANDO

ELECCIÓN DEL MEJOR CONFÓRMERO

ELECCIÓN DEL MEJOR CONFÓRMERO

Predicción de la estructura de complejos Lisozima L99A-ligandos

Complejos modelados son casi idénticos a los cristalizados Método de acoplamiento reproduce con alta precisión la estructura de los complejos proteína-ligando

CristalModelo

DESVIACIÓN CUADRÁTICA MEDIA

(RMSD) DE LOS COMPLEJOS

MODELADOS Y CRISTALIZADOS

PDB Ligando RMSD (Å)

181L benceno 0.22

182L benzofurano 0.34

183L indeno 0.35

184L iso-butilbenceno 0.45

185L indol 0.35

186L n-butilbenceno 0.31

187L p-xileno 0.29

188L o-xileno 0.39

1NHB etilbenceno 0.25

DISCRIMINACIÓN DE LIGANDOS QUE NO SE UNEN

Ácido benzoico (NO UNIÓN)

Benzofurano (UNIÓN)

Claudia Machicado, Jon López-Llano, Santiago Cuesta-Bueno & Javier Sancho. Journal of Computer-Aided Molecular Design (2005) 19 (6):

Predicción de la unión moléculas a la Lisozima L99A

2. Unión del 100% de los ligandos verdaderos de la cavidad: NO HUBIERON FALSOS NEGATIVOS

1. Éxito en el 74 % de casos de moléculas no afines a la cavidad: POCOS CASOS DE FALSOS POSITIVOS

• Las moléculas de agua aumentan su entropía (efecto hidrófobo)

• Aparecen interacciones entre la proteína y el ligando

• Proteína y ligando pierden grados de libertad

G = H -TSG = H -TS

Cambio de la energía libre durante la unión de una proteína y un ligando

Proteína

Ligando

Gu = Hsu + HI + HI:p - TSI - TSw - TSp - TSpl - Hl:w

GGuu = = HH -- TTSS

PARAMETRIZACIÓN DE LA ENERGÉTICA

∆Gunión = ∆Htotal - T∆Sconf - T∆SW

Implementación de una ecuación para calcular el cambio de energía libre de

unión de un complejo proteína-ligando

∆Gunión = ∆GP +∆GL+ ∆GPL+ ∆Gdesol

CAMBIO DE ENTROPÍA CONFORMACIONAL DEL LIGANDO (Sl) Y LA PROTEÍNA (dSp)

Novotny et al., 1987

Krystek et al., 1993

-TS = 0,52N * 298 kcal mol-1

CAMBIO DE ENTROPÍA DEL

AGUA (Sw)

-TSw = 0,45(ASAnp) * ln(T/384.15) - 0.26(ASAp) * ln(T/335.15) * 298

cal K-1 mol-1

Luque & Freire, 2000

ENTROPÍA TRASLACIONAL Y

ROTACIONAL (Spl)

-TSPL = 11 kcal mol-1

Krystek et al., 1993

Predicción del cambio de energía libre de unión de los complejos proteína-ligando

Ecuación 1

∆Gu = 0.18∆Htotal - 0.02T∆Sconf - 0.8T∆Sw

∆Gu = 0.07∆GP + 0.28∆GL + 0.19∆GPL + 1.64∆Gdesol

Ecuación 2

Parametrización del Gu experimental (15)

con datos teóricos

Grupo de entrenamientoOtros complejos

Grupo de entrenamientoOtros complejos

Grupo de entrenamiento: 6 complejos

RESULTADOS: CÁLCULO DE Gu EN LOS CONTROLES NEGATIVOS

RESULTADOS: CÁLCULO DE Gu EN LOS CONTROLES NEGATIVOS

LIGANDOS dHsu dHl Hl:p (-)TdSl (-)TdSw (-)TdSp (-)TdSpl Hl:w Predicted dG Actual dGp-cresol -16,56 2,00 -20,48 0 6,8576 - 2,08 11 -31,69 -3,827 N.d.

benzylalcohol -19,63 1,52 -21,20 0 6,6000 - 2,08 11 -34,83 -3,600 N.d.octanol -10,45 5,39 -11,38 3,12 9,9427 - 2,08 11 -28,34 -3,056 N.d.azulene -13,64 10,78 -19,89 0 10,8000 - 2,08 11 -30,64 -3,754 N.d.

t-buthylbenzene -7,61 5,17 0,80 0,52 10,1230 - 2,08 11 -24,82 -0,202 N.d.cyclohexane -15,39 -3,11 -6,54 0 7,7626 - 2,08 11 -15,17 -2,446 N.d.

1-phenylheptane -14 11,82 3,57 3,12 -13,8718 2,08 11 -37,34 1,151 N.d.fenol N.d.

metanol N.d.etanol N.d.

propanol N.d.heptanol N.d.quinolina N.d.aniline N.d.

benzaldehido N.d.acido benzoico N.d.

mesitileno N.d.camfeno N.d.camfor N.d.piridina N.d.

trans-cinmaldehido N.d.

LIGANDOS QUE QUEDAN FUERA DE LA PROTEÍNA DESPUÉS DEL

DOCKING MOLECULAR

PREDICCIÓN DE CAVIDADES EN EL INTERIOR DE PROTEÍNAS: DISEÑO Y OBTENCIÓN DE MUTANTES DE FLAVODOXINA CON CAVIDAD

PREDICCIÓN DE LA ESTRUCTURA Y ENERGÍA DE UNIÓN DE COMPLEJOS PROTEÍNA-LIGANDO

CRIBADO MASIVO DE LIGANDOS EN CAVIDADES DE PROTEÍNAS Y DETECCIÓN EXPERIMENTAL DE LA FORMACIÓN DE COMPLEJOS PREDICHOS

Método de cribado virtual de bibliotecas de ligandos en cavidades de proteínas

ACOPLAMIENTO INICIAL

Puntuación y lista de candidatos

Filtro de volumen

Ligandos potenciales

NCI-DB250251 moléculas

Filtros de polaridad

ACOPLAMIENTO FINO

(II) CERIUS2

(I) CATALYST y VEGA (Awk)

(III) AFFINITY

Evaluación del Gu

Cribado masivo de la NCI-DB frente a la lisozima L99A: Enriquecimiento de la lista de candidatos

1. Filtros iniciales• Volumen• SASp

• Lipolo

0

100

200

300

400

500

600

Vol/Polar ConsScore SumScore

Vol/PolarConsScoreSumScore

2. Consensus Score Ligandos que puntuan bien considerando 5 funciones de energía

3. Puntuación global Sumatoria de 8 funciones de energía (SumScore)

CRITERIO DE % DE LA NCI-DB Nº LIGANDOS TASA DE SELECCIÓN ENRIQUECIMIENTO*

1. Volumen/polaridad 2.0 4913 51

3. SumScore 0.17 469 534

-20

-10

0

10

20

30

40

50

Ligandos

Su

mS

core

SumScore = 0.1(vdW + LS2 + 0.3*BuryPol2 + 1.5*Cpol)

+ 0.2(PLP1 + PLP2 + Jain + PMF)

NO UNIDORES U NIDORES

2. Consensus score 1.5 3824 65

NºLigEnc*NºBD

NºLigTot*NºCandidatos*TE=

Búsqueda de ligandos de la flavodoxina mutante con cavidad W66F/L44A

Holoflavodoxina mutante W66F/L44A

Acoplamiento masivo y puntutación

Acoplamiento fino

y cálculo del Gu

2% de NCI-DB

9 ligandos con gran afinidad por la cavidad

3 moléculas poco afinesa la cavidad

CRITERIO DE % DE LA NCI-DB Nº LIGANDOS TASA DE SELECCIÓN ENRIQUECIMIENTO

1. Volumen/polaridad 2.0 4913 51 2. Consensus score 1.4 3690 68 3. SumScore 0.2 585 428

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

Vol/Polar ConsScore SumScore

Vol/PolarConsScoreSumScore

Complejos modelados flavodoxina W66F/L44A-ligando y energía de unión del complejo

LIGANDO PUESTO EN Gu (Kcal mol-1)

LA LISTA

UNIDORES

Bencilamina 66 -7.4

Piridina 324 -7.6

Benceno 355 -8.4

Furano 435 -6.6

Tolueno 585 -8.3

NO UNIDORES

Butanol 2312 -3.0

Colina 2803 N.a.ii

2-fenil-propanol N.a.i -3.5

N.a.i Fue excluido con el Consensus Scoring

N.a.ii Salió expelida de la cavidad luego del docking

Detección experimental de la unión flavodoxina-ligando: Medición de la Tm

UNIDORES PREDICHOS

NO UNIDORES PREDICHOS

COMPUESTOS Tm ± EE

Bencilamina 2,20 ± 0,82Benceno 2,20 ± 0,56Furano 1,90 ± 0,66Piridina 1,60 ± 0,47Tolueno 1,05 ± 0,60

COMPUESTOS Tm ± EE

Butanol 0,60 ± 0,48Colina -0,75 ± 0,422-fenilpropanol 0,60 ± 0,61

Detección experimental de la unión flavodoxina W66F/L44A-ligando: Titulaciones del ligando

BencilaminaG = -2.8 kcal mol-1

FuranoG = -1.8 kcal mol-1

BencenoG = -2.0 kcal mol-1

FUTUROS ESTUDIOS

GENÓMICA

• Identificación del blanco

• Validación del blanco

COLECCIONES DE COMPUESTOS

• Bibliotecas de compuestos existentes

• Química combinatorial

• Productos naturales

Cribado experimental a gran escala (HTS)

Selección y optimización de compuestos cabecera

Diseño del fármaco

Ensayos celulares

Candidato a pruebas clínicas

APLICACIÓN BIOMÉDICA: VEHICULIZACIÓN DE FÁRMACOS

Cribado virtual a gran escalaSelección compuestos candidatos

APLICACIÓN BIOMÉDICA: ENSAYOS CELULARES CON PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS

DE LIGANDOS

Especifidad

?

Liberación?

Ingreso?

Acción intracelular

?

Transporte plasmático?