GenGenéética bacteriana IItica bacteriana II

GenGenéética de bacteritica de bacteri óófagosfagos

Generalidades de Virus

Virus de la influenza (200 nm)

• Tamaño 24 – 300 nm

• DNA o RNA, de cadena simple o doble

• Cubierta de proteínas con o sin lípidos

• Forma icosaédrica, de varilla, o cabeza y cola

Clasificación de fagos por su estructura.

Icosahédricos sin cola (φX174) Icosahédricos con cola (λ)

Filamentosos (M13)

Están formados por un ácido nucleico (DNA/RNA) y una cápside de proteína

El genoma de los fagos

RNA simple cadena (MS2, Qß)

RNA doble cadena (phi 6)

DNA simple cadena (phi X174, fd, M13)

DNA doble cadena (T3, T7, lambda , T5, Mu, T2, T4)

Estos ácidos nucleicos pueden contener bases inusuales que son

sintetizadas por proteínas del fago. En los fagos T-pares, el

genoma no contiene citosina sino 5'- hidroximetilcitosina,

mientras que en otros tipos de fago alguna de las bases está

parcialmente sustituida.

Bacteriofago T4 virulento

Cabeza

Cuello y collar

Vaina

Centro

Placa Basal

Fibras

Fago libre

Fago infectando

Componentes del Fago

1. Adsorción del fago a receptores en la superficie de la bacteria (proteínas transportadoras de maltosa o de Fe2+)

2. Inyección del material genético viral

3. Transcripción del DNA del bacteriófago y producción de proteínas virales

4. Replicación del material genético viral

5. Empaquetamiento del DNA dentro de la envoltura proteica y ensamblaje de la envoltura

6. Lisis y liberación de las partículas virales

Ciclo LCiclo LííticoticoCiclo de Replicación del Bacteriofago T4

Halos ó placas de lisis de los fagos

1. Una molécula de DNA del fago es inyectada a la bacteria.

2. Transcripción de genes necesarios para la integración.

3. El DNA del fago se inserta en el cromosoma bacteriano. (Integración)

4. La bacteria replica su DNA (y el del fago) y se divide normalmente.

5. El fago insertado se denomina profago y a la bacteria lisógeno.

6. La bacteria es ahora inmune a la infección de otros fagos.

Ciclo Lisogénico(Fagos temperados)

Integración del DNA del fago al cromosoma bacteriano

El cromosoma del bacteriófago lambda (λ) en estado libre es circular. El sitio de integración λ es una región del cromosoma que se alinea en un

sitio del cromosoma bacteriano (entre los genes gal y bio).

Ocurre un entrecruzamiento recíproco entre el fago circular y el cromosoma

bacteriano resultando en la integración. Esta integración es

mediada por los genes del bacteriofago y no por el sistema de

recombinación de la bacteria.

Al DNA del fago integrado al cromosoma se le llama profago.

Bacteria lisogénica portadora de Profago

Molécula lineal de DNA del bacteriofago λλλλ

Integración de λλλλ al cromosoma bacteriano

Bacteriófago lambda (λλλλ) (fago temperado)

Ciclo lisogénico Ciclo lítico

TRANSDUCCITRANSDUCCIÓÓNNTransferencia de material genético entre bacterias a través de un

bacteriófago

Transducción

Transferencia de material genético bacteriano

por los virus de bacteria (fagos)

phe– trp– tyr– met–his–

WT

Inducción del ciclo lítico

La escición del DNA del fago acarrea DNA cromosomal

TRANSDUCCIÓN

Replicación del fago

Lisis celular y

liberación del fago

El fago infecta a la

célula receptoraIntegración del DNA del fago al cromosoma

La célula receptora

adquiere nuevos

genes

Cromosoma bacteriano

Profago

Transducción

Transducción generalizada

Transducción especializada

Transducción generalizada

Transducción especializada

Durante la transducción se pueden mapear genes

Células donadoras: arg+; met+, strs

Infección con el fago P1.

Ciclo lisogénico. Integración

Ciclo lítico y cosecha de fagos.

Mezclar los fagos con la bacteria receptora: arg-; met-; strr

Ciclo lisogénico del bacteriofago

Selección fenotípica de las bacterias receptoras.

TransposonesTransposones(Elementos gen(Elementos genééticos mticos móóviles)viles)

• La transposición es otro tipo de recombinación de DNA en el cual un elemento transponible o transposón se mueve de una molécula de DNA a otra (recombinación ilegítima).

Fueron descubiertos originalmente en maíz por Barbara Mc Clintock y su presencia se ha documentado también en otras especies, desde bacterias hasta humanos.

Descubrimiento de los transposones eucariontes

Barbara Mc Clintock, 1951

Elementos de ControlElementos de Control

Tipos de transposonesTipos de transposonesSecuencia de Inserción o Elemento de Inserción (IS): contiene una secuencia central con el gen de la transposasa y en

los extremos una secuencia repetida en

orden inverso no nesariamente idéntica,

aunque muy parecida. Cuando un

transposón simple se integra en un

determinado punto del DNA aparece una

repetición directa de la secuencia diana (5-

12 pb).

Transposón Compuesto (Tn):contiene un elemento de inserción (IS)

en cada extremo, en orden directo o

inverso y una región central que además

suele contener información de otro tipo.

Por ejemplo, los Factores de

transferencia de resistencia (RTF)

poseen información para resistencia a

antibióticos (cloranfenicol, kanamicina,

tetraciclina, etc.).

http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Mutacion/mutacion.htm

Elemento LongitudRepetición terminal invertida

Repetición directa de la diana

Selección de la diana

IS1 786 pb 23 pb 9 pb Regional

IS2 1327 pb 41 pb 5 pb Zona caliente

IS4 1428 pb 18 pb 11-12 pb AAAX20 .........XTTT

IS5 1195 pb 16 pb 4 pb Zona caliente

CaracterCaracteríísticas de algunos elementos ISsticas de algunos elementos IS

CaracterCaracteríísticas de algunos Transposones compuestos (Tn)sticas de algunos Transposones compuestos (Tn)

Elemento LongitudMarcador genético

(resistencia)

MÓDULOS TERMINALES

IS Orientación Relación entre ambos

Tn 10 9300 pb Tetraciclina IS 10 Invertida Divergencia 2.5%

Tn 5 5700 pb Kanamicina IS 5 Invertida Difieren en 1 pb

Tn 903 3100 pb Kanamicina IS 903 Invertida Idénticos

Tn 9 2500 pb Cloranfenicol IS 9 Directa Idénticos (?)

http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Mutacion/mutacion.htm

Tanto los elementos IS como los transposones (Tn) tienen que estTanto los elementos IS como los transposones (Tn) tienen que estar ar

integrados en una molintegrados en una moléécula de DNA, que contenga un origen de cula de DNA, que contenga un origen de

replicacireplicacióón, ya sea en el cromosoma principal bacteriano o en un n, ya sea en el cromosoma principal bacteriano o en un

plpláásmido, nunca se encuentran libres. smido, nunca se encuentran libres.

Algunos elementos Algunos elementos pueden estar en varias pueden estar en varias copiascopias

Cromosoma de

E. coli

http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Mutacion/mutacion.htm

Transposones en procariontes

Secuencias de inserción (IS)

Frecuencia global de transposición: 10-3 – 10-4

Frecuencia individual de transposición: 10-5 – 10-7

Reversión de la transposición: 10-6 – 10-10

Transposones

El tamaño de los transposones varía entre 103 a 104 pb dependiendo del tipo de transposón.

La secuencia íntegra del transposón se puede insertar en un sitio particular del cromosoma.

La transposición involucra recombinación entre secuencias no relacionadas (recombinación ilegítima) que son los extremos flanqueantes del transposón y el sitio del cromosoma donde se insertó.

Dos formas de transposición

Replicativa

Conservativa

Transposasa. Enzima que corta al DNA blanco en sitios al azar y une los extremos del transposón.

Secuencias repetidas invertidas. Funcionan como el sitio de reconocimiento de la transposasa. Como las secuencias son

invertidas, son idénticas.

Marcador de selección. La inserción del transposón confiere una ventaja ecológica a la célula, que puede ser la resistencia a algún

antibiótico. KanS � KanR

Tn5: 5,800 pb y regiones flanqueantes de 1,530 pb. Genes de resistencia a Kan, Bleo, Strp.

Tn7: 14,000 pb y regiones flanqueantes (secuencias repetidas invertidas de 30 pb). Resistencia a Strp, Spec.

Tn10: 9,300 pb y regiones flanqueantes de 1,300 pb. Genes de resistencia a Tet.

Mecanismo de transposiciMecanismo de transposici óónn(recombinaci(recombinaci óón ilegn ileg íítima)tima)

Repetidos directos (5-9 pb)

TransposiciTransposicióón conservativan conservativa

Unión de la transposasa a la región flanqueante

Formación del asa (complejo sináptico). Los extremos del transposón se acercan.

Corte del DNA y escición del transposón

Unión del transposón al DNA blanco

La transposasa cataliza la inserción del transposón al DNA blanco.

TransposiciTransposici óón replicativan replicativaTransposasa Resolvasa

Transposones de eucariontes

Retrotransposones Transposones de DNA

Los retrovirus se integran al DNALos retrovirus se integran al DNAprovirus

Los transposones pueden causar Los transposones pueden causar

reordenamientos y cambios en los genomasreordenamientos y cambios en los genomas

TransposonesTransposones

Transferencia de DNA

Evolución de genomas

Los Virus

Duplicación de DNA

Uso de los transposones para generar una colección de mutantes

1.Para introducir inserciones de Tn5 al azar en el cromosoma de E. coli, se usa un vector de fago lambda: λPam int-::Tn5

2.Cuando este fago infecta células KanS, el DNA del fago no se puede replicar ni integrar, así que la única manera de que E. coli se vuelva KanR es que el transposón Tn5 se inserte en algún sitio del cromosoma. Esto va a ocurrir en aprox. 1 de cada 100,000 células infectadas.

3. Si se infectan 2 x 109 células, se obtendrán aprox. 2 x 104colonias KanR. Cada una tendrá una inserción de Tn5 en un sitio distinto del cromosoma. Si en el genoma de E. coli hay unos 5,000 genes, es probable que se tenga una colección con inserción de Tn5 en casi todos los genes.

La transferencia horizontal de genes entre distintas especies, e incluso géneros de bacterias

Mecanismos de resistencia a antibiMecanismos de resistencia a antibióóticos y ticos y su transmisisu transmisióónn

1. Impermeabilidad y eflujo. Gram+ (peptidoglicano); Gram-(capa de LPS). Proteínas de eflujo. Los genes responsables pueden estar en plásmido o en cromosoma.

2. Modificación e inactivación del antibiótico. β-lactamasa, enzimas modificadoras de aminoglicósidos, cloramfenicol acetil transferasa.

3. Modificación del blanco. Dominios de transpeptidasa con menor afinidad por las β-lactamas.

4. Vías alternativas de síntesis. Síntesis de tetrahidrofolato insensible a sulfonamidas.

1. Cuatro cepas Hfr de E. coli procedentes de la misma cepa F+ transfieren los siguientes

marcadores en el orden:

Cepa 1: M Z X W C

Cepa 2: L A N C W

Cepa 3: A L B R U

Cepa 4: Z M U R B

¿Cuál es el orden de estos marcadores en la cepa F+ original?

2. Se realiza un cruzamiento entre una cepa Hfr arg+ bio+ leu+ y una cepa F– arg– bio–

leu–. Experimentos de conjugación interrumpida demuestran que arg+ entra en el

receptor en último lugar, de modo que se seleccionan recombinantes arg+ para

determinar la presencia de bio+ y leu+ encontrando los siguientes números:

arg+ bio+ leu+ 320

arg+ bio+ leu– 8

arg+ bio– leu+ 0

arg+ bio– leu– 48

¿Cuál es el orden de estos marcadores?

¿Cuáles son las distancias en unidades de mapa?