funfamento 34 SHR
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UNIVERSIDAD A U T ~ N O M AMETROPOLITANA IZTAPALAPA
POSGRADO EN BIOTECNOLOGA
EFECTO BACTERIOSTTICO ACEITES DE ESENCIALES DE AJO (Allium sativum) Y CEBOLLA (Allium cepa) SOBRE DOS MICROORGANISMOS PRESENTES EN CARNES.CrnRDlbJACIQN DE $Fr:by:.v Da;ilMEKTALES . BJ#;.J/:I Ii.L.,
TESIS QUE PRESENTA: El Ing. JAVIER MORALES LPEZ PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN BIOTECNOLOG~A DIRECTORAS:Dra. MARA ISABEL GUERRERO LEGARRETA
Dra. EDITH PONCE ALQUICIRA
MCxico D.F.
Julio de 1999
Dedico tesis esta a realizacindelpresentetrabajo
mi Madre Vivian Esquivo Rechy, quien posible hizo la
y tambinhizoposibleelsueodehacerrealidadlaun anticancergeno.Tambinami Madre Alba Zabeth
investigacin y eldesarrollode Lpez Forero por
suimpulso y amor,dondequieraqueests;Madre.
A lacompaa
INFOODS. A mi Famila, a ti Pap porque era tu sueo ser cientfico investigador enseaste que es &ente de luz
y me
un libro abierto. A m i s sobrinas Natalia Mara y Eileen
Jimena as como a sus Padres Eileen Rafico. A m i s hermanos. Pero muy especialmente al y ciclpeo pueblo de Mxico y su cultura milenaria; con mi eterna gratitud. Al pueblo de Colombia, porque en cada uno de
sus hijos y su trabajo hay una contribucin para que
mi cambien las cosasy construir un mejor pas; ste es aporte.
Deseo agradecer a la Doctora MaraIsabelGuerrero ascomodirigir
Legarreta, Directora del al Comit de
Grupo de Investigacin de Bioqumica de Macromolculas,en primer trmino, el escuchary disearmetodolgicamente la propuestapresentada
Admisin del posgrado en Biotecnologa de UAM-1; en segundo trmino su enseanza y la disciplinaparaaprendery conocer el mtodo cientfico. Tambin le
agradezco a la
Doctora Mercedes Guadalupe Lpez Prez su enseanza, su tiempo en el laboratorio de Qumica de Productos Naturales del Centro de Investigacin de Estudios Avanzados del Instituto Politcnico Nacional - Irapuato, Gto. (CINVESTAV-IPN) y los amplios aportes que heron hndamentales en el conocimiento de los constituyentes de los aceites as como la interpretacin y revisin de los resultados, a la Maestra Elsa Bsquez Molina por sus consejos y en especial por su interpretacin de la vida, a la Doctora Edith Ponce Alquicira por sus comentarios e ideas y al Maestro Rubn Moreno,Coordinador delPanel EvaluacinSensorial de laUniversidadIberoamericana,porsuapoyo evaluacin del chorizo tipo espaol. Un agradecimientomuy especial a Otto Klemperer por ensearmea conocer un ser humano de pensamiento atemporal, a Beethoven, en la magistral direccin de sus sinfonas dey tiempoenla
y en particular el segundo movimiento de la Herica. Tambin mi admiracin a SergeiRachmaninoff por sus cuatro conciertos sinfnicos. Al Caribe colombiano aquella tierra Chimila, Africana y Europea. A la tierra Vallenata!. Y en general, a los que con su trabajo han aportado al desarrollodelpensamientohumano,conideas combustible obtenidoy mtodos queson
el
resultado de la energa que requiere el cerebro para desarrollarlas y no son otra cosa que a partirlos de alimentos consumimos necesidad que como hndamental de la existencia.
Fue de casa en casa arrastrando dos lingotes metlicos, todo el mundo se espant y al verqueloscalderos, laspailas,lastenazasy los andes secaandesusitio,los clavos y los tornillos tratando de
y las
maderas crujan la por desesperacin de
desenclavarse, y aun los objetos perdidos desde haca mucho tiempo aparecan por donde ms se les haba buscado, y se arrastraban en desbandada turbulenta detrs de los fierros mgicos de Melquiades. -Pregonaba el gitano con spero acento- Las cosas tienen vida propia, todo escuestindedespertarleselnima.
Y tambindecaMelquiades,La
ciencia ha eliminado las distancias, dentro de poco, el hombre podr ver lo que ocurre en cualquier lugar de la tierra, sin moverse de su casa.....
Entonces dio otro salto para anticiparse a las predicciones averiguar la fechay las y circunstancias de su muerte. embargo, de al final haba Sin antes llegarverso ya comprendido que no saldra jams de ese cuarto, pues estaba previsto que la ciudad de los espejos (o los espejismos) sera arrastrada por el viento y desterrada de la memoria de los hombres en el instante que Aureliano Babilonia acabara de descifrar los pergaminos, y que todo lo escrito en ellos era irrepetible desde siemprey para siempre, porque las estirpes
condenadas acien aos de soledad no tenan una segunda oportunidad sobre la tierra.
Gabriel Garcia Mrquez, CienAos de Soledad
RESUMENSe determin el efecto antimicrobiano del aceite esencial de ajo (Allium sativum) y cebolla (Allium cepa) sobre dos cepas puras, una est vinculada con la descomposicin de alimentos Pseudomonasy Lactobacillus pentosus es utilizado en procesos de
bioconservacin de algunos alimentos fermentados. El propsito central
fue conocer las1: 1,
(Allium sativum) y de cebolla concentraciones de inhibicin de los aceites esenciales de ajo (Allium cepa) por separado as como el efecto sinrgico cuando se combinaron 2: 1, 1:2;entotalcincotratamientosconcinco nivelesdeconcentracinpropuestas,(0.03,
0.36, 3.69, 49.6 y 196 p de aceite(s) esencial(es)/ml de medio de cultivo), en la cual se 1 reduce el crecimiento celular. En ajo, el nivel de concentracin de 196 pVml inhibi hasta 17.76 % a P.Ragi y 33.19 % L. pentosus. La cebolla present menor mezclasnoinhibicin comparada con ajo y en las
se apreciefectosinrgicoquesuperaraacadaaceiteporseparado.La
inhibicin microorganismos en ambos disminuy en que la medida aument la concentracin del aceite esencial de cebolla.En las concentraciones de 0.039 y 0.39 pVml se favoreci mayor crecimiento de los microorganismos comparado con un blanco al que no se incluy ningun aceite. En los niveles de y 3.9 pl/ml no hubo diferencia entre siy 49.6 ambospresentaronvaloresdealrededorde12 respectivamente.Los aceites esenciales probados se obtuvieron mediante el mtodo de arrastre de
y 15 % en L. pentosus y P. fragi,
vapor en condiciones de vaco estndar y se report para cebolla un rendimiento de 42 % porarribadelasreferenciasbibliogficasy de misma la forma 35% paraajo.La
caracterizacin por cromatografia de gases acoplada a espectrometramasas indic que de los10compuestosalifticosidentificadosenajoscontienenazufre,mientrasqueen cebollasdelos20identificados,dosdelosms abundantessonaldehdoscarentesde
azufre, de los 18 restantes9soncclicosdeloscualesdoscontienennitrgeno,los9 restantes son alifticos. Tambin sobre los aceites se determin el contenido de grupos sulfhidrilo y se encontr que el de ajo contiene 25 % ms que el de cebolla y entre las
combinaciones de los aceites, la cantidad de grupos sulfhidrilo diminuy en forma que baj la concentracin de aceite esencial de ajo. Con el fin de conocer si las concentraciones inhibitorias de aceites esenciales eran aceptadas o rechazadas al ser incorporadas en chorizo tipo espaol como sazonadores, se probaronconcentracionesde49.6y 196 pVml, y conellos
se mejoranlosatributos
sensoriales del producto crnico, la mejor combinacin,
y segn el panel de evaluacin,
p fue la de ajoy cebolla en proporcin 1:2 en nivel de 196 LVml.
De lamismaforma,losobjetivosparticularesincluyeronademsdemontar adaptar metodologasmanera de secuencia], otros, entre establecer el mtodo de
y
extraccin, prueba analtica de cromatografia de gases acoplada a espectroscopa de masas (GC-MS) y qumica con el reactivo de Ellman; prueba especfica para caracterizar grupos se sulfhidrilo. Los bioensayosrealizaron en caldoscultivo de selectivos, los con tratamientos y niveles sealados, para medir la absorbancia a 560 nm respecto del tiempo, el cual es un mtodo indirecto de medir el crecimiento celular. Para evaluar las curvas de crecimiento y medir su modificacin de acuerdo con la concentracin
y combinacin de
los aceites se realizaron regresiones lineales y se calcul mediante integrales definidas, las reas bajo la curva en intervalos que llegan hasta el inicio de la fase estacionaria de cada microorganismo. cebolla La importancia de la tcnica de extraccin de los aceites esenciales de yajo mediante arrastre de vapor en condiciones de vaco estndar radica, adems del bajo costo al compararlo con otros mtodos como el de (COZ) en lquido estado (fluidos se
supercrticos) y laextraccinporsolventes,enqueconlametodologaempleada puedenobteneresenciaspuras, de pesticidas y restos solventes metodologa que lo aseguraba ya no arrastran que se oleorresinas otras ni grasas, en la muestra. Por estas razones, utiliz se esta la obtencin compuestos los se de con que podan
experimentar, analizar y comparar con especificaciones y trabajos publicados. El trabajo desarrollado, adems de aportar la metodologa de extraccin de aceites esenciales de ajoy cebolla, pilar sta tesis, deja la opcin de otras investigaciones de inters.
!Como nos
acordamos del pescado que comamos de de los pepinos y las sandas y los
balde Egipto, en
puerros y las cebollas y el ajo!
Nmeros 11:5
La Biblia.
NDICE GENERAL
NDICE GENERAL NDICE DE FOTOS Y AUTORES NDICE DE TABLAS NDICE DE FIGURAS 1.I.
RESUMENINTRODUCCI~N
1 6 78
11.
ANTECEDENTES Principales microorganismosde descomposicin Grupos bacterianos importantes en alimentos Principales microorganismos de descomposicin carnes rojas de Pseudomonasfiagi Lactobacillus plantarum Metabolismo celular Allium Mecanismos de accin de aceites esenciales del gnero sobre microorganismos Antecedentes histricos medicina folklrica y Antecedentes medicinales sistemticos ajos y cebollas de Generalidades qumicasde los aceites esencialesEl gnero Allium
11.1 11.1.1. 11.1.1.1.11.l . 1.2.
11 12 13 15 17
11.1.1.3. 11.2. 11.2.l .
11.3. 11.3.1. 11.4. 11.5. 11.6. 11.6.1.
20 22 25 26 26 30
Generacin y extraccin de los compuestos voltiles Allium en Principios del proceso de extraccidi por arrastre de vapor en condiciones de vaco estndar Anlisis de compuestos presentes en aceites esenciales ajo y de cebolla de Fundamento y determinacin por cromatografia gases acoplada a espectrometra de masas (GC-MS) Fundamento y determinacin qumica degrupos sulfhidrilo con el reactivo deEllman
11.7. 11.7.l . 11.7.2.
31
31 34
11.8.
Fundamento y determinacin del crecimiento bacteriano mediante 34 turbidimetra 3536
11.8.1.11.9.
El Crecimiento bacteriano Evaluacin sensorial Prueba de estmulo nico Prueba pareada Prueba do-tro Prueba triangular OBJETIVOS General Particulares
11.9.l . 11.9.2. 11.9.3. 11.9.4.11 1.
37 37 38 38 39 39 39 40 40 41 41 42 43 44 44 45 45 46 47
NB)IV. IV. 1* IV.1.1. IV.1.1.1. IV. l. 1.2. IV.1.1.3. IV.2. IV.2. l. IV.2.2. IV.2.3. IV.3. IV.3.1 IV.3.1.1. IV.3.1.1.1. IV.3.1.1.2. IV.4. IV.4. l. IV.4.2.
MATERIALES Y MTODOSDiagrama generalde la metodologa experimental la tesis de Extraccin de aceites esenciales Materiales y equipo Extraccin de voltiles Pruebas fisicas Anlisis de compuestos voltiles los aceites esenciales en Diagrama de flujo general de la caracterizacin cromatografia por de gases acoplada a espectrometra de masas Equipo y condiciones de operacin Anlisis de radicales sulfhidrilo Crecimiento de microorganismos en medios sintticos Diagrama de flujo general de los bioensayos Metodologa experimental Crecimiento de PseudomonasfiagiLactobacillus pentosus (3 103 5)
4748 48 49 49 50
Anlisis sensorial Formulacin del producto Muestras parael anlisis sensorial
IV.4.2. l . IV.4.3. IV.4.3. l. IV.4.3.2. IV.4.3.3. V.
Ingredientes utilizados Procedimiento en la elaboracin de la pasta Preparacin y presentacin de las muestras Panel de jueces Diseo experimental y anlisis estadstico
50 51 52 53 53 54 5455
RESULTADOS Y DISCUSI~NExtraccin de aceites Anlisis de compuestos voltiles en aceites esencialesde ajo y los cebolla
v.1.v.2.
v.2.1. v.2.2. V.2.3. v.3. V.3.1. V.3.2. v.3.3. v.3.4.
Ajo Cebolla Concentracin de grupos sulfhidrilo SH Crecimiento de microorganismos en medios sintticos
5669
939596
Lactobacillus pentosus PseudomonasfragiAlteracin del puentedisulhro -S-S- (-SH) Modificacin del potencial redox en la cadena del flujo de electrones
103
110111
v.3.5. V.3.6. v.3.7. v.4. VI
Alteracin de la permeabilidad celular, accin sobre la acetil CO-A Alteracin del potencial de oxidacin de la glutation reductasa
112 115115
Alteracin de la transferencia de electrones durante la sntesis del material gentico para la divisin celular Anlisis sensorial Conclusiones BIBLIOGRAFA
116
123 126
VI1
NDICE DE FOTOS Y AUTORES
Foto 1.
Bifacialhalladoen
el Shara.Coleccin I F A N , Dakar,Senegal.@os Millones de
1
Foto, MaximilienBruggmann,Yverdon,Suiza.
Aos de Industria Alimentaria. Toussaint-Samat, Renaud Alberny,
Ian Horman)
Foto 2.
Vendedor de pescado. Pintura mural, siglo Thera, Grecia. Museo Arqueolgico
XI11 a. de C., isla de
1
de Atenas. Foto, Erich
Lessing / Magnun @os Millones deAos de Industria Alimentaria. Toussaint-Samat, Renaud Alberny, Ian Horman)2
Foto 3.
Campesinos egipcios cribando
el grano palas con
de madera.
Detalle de pintura mural. Tumba de Mennah, Tebas, Egipto. Foto, Erich Lessing / Magnun @os Millones de Aos de Industria Alimentaria. Toussaint-Samat, Renaud Alberny, Ian Horman)
Foto 4.
Cal, tequezquite
y sal. Minerales utilizados como
mtodos de
2
conservar y procesar alimentos. La nixtamalizacin del maz con la cal (1 a 3 % y hervir durante 20 a 40 minutos con reposo de 10 a12 horas) es uno de los aportes de la cultura prehispnicade Meso
Amrica al consumo de alimentos en el mundo. Foto, Michel Zab (Presencia de laComidaPrehispnica.CastellYturbide,Zab Pia Lujn)y
Foto 5. Foto 6.
Pez alado, Cultura Agustn, San aos
100 a. C.
-
800 d. C.,
Colombia. Museo del Oro, Santaf Bogot, Colombia. de Una de las primeras latas de harina lacteada Henri Nestl, fin del siglo XIX. Foto, archivos Nestl Horman)
(Dos Millones de Aos deIan3
Industria Alimentaria. Toussaint-Samat, Renaud Alberny,
Foto 7.
Tienda de ultramarinos, Florencia, Italia.Foto, F. Sciana / Magnum
(Dos Millones de Aos de Industria Alimentaria. Toussaint-Samat,Renaud Alberny, Ian Horman)
Foto 8.
Tienda de especias, Estambul, Foto, Turqua.Maximilien Bruggmann, Yverdon, Suiza @os Millones de Aos de Industria Alimentaria. Toussaint-Samat, Renaud Alberny, Ian Horman)
4
Foto 9.
Ampliacin el con microscopio electrnico moho de filamentoso formando una capa blanca en ciertos quesos. Foto, Archivos Nestl (Dos Millones de Aos de Industria Alimentaria. Toussaint-Samat, Renaud Alberny, Ian Horman)
6
Foto 10.
Fotografia de barrido electrnico de Pseudomonasfiagi.
12 13
Foto 11. MicrografiadeescaneoelectrnicodeWSO. Escala bar=
Lactobacillus plantarum.
1 pm.21
Foto 12.
Ilustracin del siglo XIV da muestras de la profbsin de su uso con finesmedicinales,cuandonocomobulbocomestible,enaquella poca.
Foto 13.
Ajos despus de la operacin de limpieza.
41 42
el Foto 14. Equipo de destilacin de aceites esenciales ms densos que agua, con modificacin para termopozo recuperacin de voltiles.y mayor de volumen
Foto 15. Foto 16. Foto 17. Foto 18.
Acumulacin del aceite esencial de ajo durante el proceso. Aceitesesencialesdeajo vidrio. Chorizo tipo espaol Las muestras con tratamientos se presentaron individualmente cada sesin, los6 jueces degustaron 15 porciones de producto en
42 44
y cebollacontenidosenrecipientesde
50
51
grupos de 3, dos de las muestras son iguales y una es el blanco. En
Foto 19. Prueba triangular para detectar diferencias Foto 20. Foto 21.Una muestra Chorizo tipo espaol Microscopa de barrido electrnico de de extracto acuoso
52
52
C. albicuns KCCC 1417237 "C. (a) en ausencia
113
crecida en medio de cultivo con agitacin a
de(EAA); clulas ajo son elongadas
o
esfricas, (b) en presencia de ( Mse tienen clulas deformadas y E ) distorcionadas y en algunos casoscolapsadas;como de a) es de 4 p m. (Mahmoud y Ghannoum, 1988)
lo indicala
flecha; CD seala los restos citoplsmicos y la barra (parte inferior
NDICE DE TABLAS
Tabla 1.
Principales factores que afectan la ecologa microbiana de los alimentos.
8
alimentos. Grupos importantes en Tabla 2. bacterianos importantes Gnero 3. de Tablabacterias alimentos. en
9
10
Tabla 4.
Composicin promedio muscular 11 qumica del tejido de algunas especies.
Tabla 5. Tabla 6.
especies Divisin lasde de
Lactobacillus en grupos. (Allium
14
Algunasenzimasinhibidasporlaalicinaencontradaenelajosativum)
18
Tabla 7.
Espectrodeaccindelajo
(Allium sativum) y cebolla (Allium cepa)
19
reportados en microorganismos.
Tabla 8. Tabla 9.
Generacin de algunos compuestos voltiles azufiados ajo en Carta comercial de especificaciones fisicoqumicas de los aceites esenciales de ajo(Allium sativum) y cebolla (Alium cepa). Reineccius, (1994); Extract Mex, (1998).
27
43
Tabla 10. Tabla 11.
Concentracin de aceites esenciales aadidos a medios de cultivo Tratamientos y niveles de aceites esenciales de ajo cebolla en la y formulacin de chorizo espaol
4650
Tabla 12.
Compuestos identificados enel aceite esencial de ajo(Alliumsativum)
57
Tabla 13.
Patrones de fragmentacin de10 compuestos identificados enel
58
aceite esencialde ajo obtenido por el mtodo de arrastre vapor. de Metildi1sulfbro.1.69%,h 1.45 min, 88 g/mol
58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 71
Dimetil disulfbro. l. 11%, tr 2.37 min, 94g/mol 3-3"tiobis,1-propeno.4.8%,tr 3.40 min,114@mol
2 Propenil metil disulfbro. 11.35%, tr 6.22 min, 120 g/mol Dimetil trisulhro. 4.6%, tr 8.55 min,126g/mol 2-Propenilpropil disulhro. 0.24%, tr 9.7 min, 148g/mol 3-(alil tio),cidopropinico.0.86%,t, 10.64 min,146g/mol
Dialil disulhro. 35.59 %, tr 11.35 min,146g/mol Metil,2-propenil trisulhro. 16.36%, tr 13.78min,152g/mol di-2-propenil trisulhro. 18.39%, tr 18.45 min, 178g/molTabla 14.
Compuestos identificados en el aceite esencial de cebolla (Allium cepa)
Tabla 15.
Caracterizacin mediante espectrometra de masas de 20 compuestos voltiles encontrados en cebolla (Alliumcepa) Metanetiol.2.5%,t,0.86 Propanal.27%, min, 48g/mol
72
72 73 74 75 76 77 78
tr 0.95 min, 58 g/mol
Dimetil disulhro. 2.8%, tr 2.40 min, 94g/mol 2-pentenal, 2-metil(2-etil-t-butanal). 13.82%, tr 3.63 min, 98 g/mol Metilpropildisulfbro.1.52%,t,5.2 min, 122g/mol
Metiletil disulhro. 1.6%, tr 5.46 min, 1O8 @mol 2,Sdimetil-tiofeno. 5.7%, t, 5.805 min, 112g/mol
173-ditiano. 1.1%, tr 6.10 min, g/mol 120 1,3-propan ditiol. 1.1%, tr 6.34 min, 108g/mol 1,4-ditiano. l.8%,tr 6.91 min, 120 g/mol Tiazolidina. 8.4%, tr 8.13 min, 122g/mol Dimetiltrisulfbro.3.5%, tr 10.17 min,126g/mol
79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92
2-propenilpropil disulhro. 0.90%, tr 11.53 min, 148g/mol 1,3-Ditiolano.1.12%,& 12.69 min, 106 @mol
3,3-tienil- 2- cido propenico. 2.6%, t, Metiltirano.1.2%, t, 18.13 min, g/mol 74
16.30 min, 154 g/mol
Dipropiltrisulfbro.0.64%,
t, 24.07 min, 182g/mol
172,4-tritiolano,3,Sdietil. 1.65%, tr 29.10 min, 180g/mol trans-3,5-Dietil-1,2,4-tritiolano.2.09%, tr 30.40 min, 180 g/mol 2,5-dimetil-tiazolio.0.43%,t, 36.13 min, 113 g/mol
Tabla 16. Compuestos azufrados encontradosen los aceites esenciales de ajo ycebolla.
Tabla 17. Tabla 18. Tabla 19.
Ecuaciones que describen la concentracin de los grupos tiol (pmoledml) en los5 tratamientos probados microbiolgicamente Concentracin de grupos tiol (SH) pmoledml en Comparacin de las reas y porcentajes de inhibicin a 30 horas en
93
94 96
Lactobacillus pentosus. Calculados a partir de las ecuacionesy obtenidas con las regresiones con el aceite esencial de ajo a 196pVml como referencia de la mxima inhibicin.
Tabla 20.
Ecuaciones de cada curva de crecimiento de Lactobacilluspentosus en la que se encuentran los clculos del punto terico mximo, el
102
rea bajo la curvao integral a 30 horas y el porcentaje de inhibicin tomando como referencia el nmero menor (ajo a 196 pVml).
Tabla 21. Comparacinreas de
y porcentajes inhibicin de a
24 horas en
103
Pseudomonasfiagi. Calculados a partir de las ecuaciones obtenidas
con las regresiones y con el aceite esencial de ajo a 196 pVml como referencia de la mxima inhibicin.
Tabla 22.
Ecuaciones de curva crecimiento cada de de
Pseudomonasfiagi en
1 o9
la que se encuentran los clculos del punto terico mximo, el rea bajo la curvao integral a 24 horas y el porcentaje de inhibicin tomando como referencia el nmero menor (ajo a 196 pVml).
Tabla 23. Resultados la deevaluacin sensorialtratamiento
y la comparacin acuerdo de 117
con las pruebas de significancia por el mtodo triangular para cada
Tabla 24.
Planilladecontrol
119
NDICE DE FIGURAS
Figura 1. Figura 2.
Estructura del msculo estriado. Micrografia electrnica tres miofibrillas en seccin longitudinal
de partes de
Estructura qumica de la Acetil coenzima A. El enlace tioester de alta indica energa se con un segmento curvo; el grupo acetil es reemplazado por hidrgeno.
Figura 3.
Rutas catablicas. El ATP y NADPH son las hentes de energa libre de reaccionesbiosintticas.Ellassongeneradasentreladegradacin de
y hnciones biolgicas. metabolitos complejos utilizadas en las diversas Figura 4.Accin de un inhibidor enzimtico. Puede ser reversible o irreversible y depende del tipo de uniones establezca la que con enzima. irreversible cuando se genera electrostticas es reversible.un enlace covalente, con
Esherzas
Figura 5.
Dialil disulhro o alicina.Sustanciaazufi-ada,inhibidorenzimticodel metabolismocelular.Compuestomsabundante de ajo. enel aceiteesencial
Figura 6.
Ajoeno, estructura qumica, 2-vinil-4H1,3-ditina. No CAS 31 2-Propenil 3-(2-propenilsulfinil)-l-propenildisulhro
[92285-014,5,9-tritio-
1,6,11 dodecatrieno 9-xido [92284-99-6, 92285-00-21 Sintetizado por Block y col. en1986 a partir de alicina calentando en acetona-agua. Djerassi C. y col., 1994. Dialil trisulfuro. Estructura qumica H2CCHCH2SSSCH2CHCH2 Estructura qumica esenciales de aceites clasificacin de Reineccius 1994. en de cada grupo en la
Figura 7. Figura 8. Figura 9. Figura 10. Figurall.
Formacin de la alicina a partir de alina por la accin Reaccin estequiomtrica.
de la alinasa.
Compuestos azufiados extrados de ajo (Allium sativum) por diversos mtodos. Compuestos azufiados extradosde la cebolla, el factor lacrimgeno es
un ismero estructural de la alina.Figura 12.
Representacinesquemticadelosdestiladoresdeaceitesesenciales por arrastre de vapor en condiciones de vaco estndar. Consta de tres partes, dedo refrigerante enla parte superior, cuerpo del destilador matraz para contener muestra. lay
30
Figura 13. Figura 14. Figura 15.
Principio general deun espectrmetro de masas. Esquematizacin fbndamento del espectrmetro de masas. Representacin de un espectrmetro de masas en donde en la primera etapadeactivacin;lasmolculas,iones o tomossonactivados al
31 32
y principios operacin un de de
32
aumentar sunivelenergtico(energiapotencial,partesuperior
de la
rampa). Posteriormente se aceleran al descender y la energa potencial adquirida anteriormente se transforma energa cinticay es igual para en todas.Figura 16.
Espectro de masas, patrn del dialil disulfbro
comparado con el patrn
33
de la biblioteca NBS, parte inferior. Se puede apreciar que el fragmento ms abundante tiene 41 unidades de masa atmica.Figura 17. Figura 18. Figura 19.
Patrn de fragmentacin del dialil disulfbro. Reactivode Ellman 5,5-di-tio (cido bis 2-nitro benzico) DTNBc1a8N208S2 Reaccin del reactivo de Ellman en la formacin del pigmento
33 34
3435
Curvatpica de clulas bacterianas de Figura 20. crecimiento en cultivo por lote.Figura 21. Figura 22. Figura 23. Figura24.
Diagrama de flujo general de la extraccin de los aceites
41
Diagrama de flujo general de la caracterizacin mediante espectrometra 44 de masas Diagrama de flujo general de los bioensayos Las Curvas de destilacin por arrastre de vapor en la queaprecia la se disminucin de la temperatura respecto del tiempo, una vez que logrado las condiciones de vaco estndar se han47 54
" .
.
.
Figura 25. Figura 26. Figura 27. Figura 28.
Cromatograma de aceite esencialdeajo (Allium sativum) obtenido por arrastre de vaporen condiciones de vaco estndar Cromatogramadeaceite esencial de cebolla (Allium cepa) obtenido
56
70
por arrastre de vapor condiciones de vaco estndar en Prueba delreactivodeEllmanenloscincotratamientos Curvas de crecimiento de Lactobacillus pentosusy loscinco
93 97 97 98
niveles, mismos que se probaronen las cinticas microbianas
Lactobacilluspentosus en presencia de aceite esencial de ajo Lactobacilluspentosus en presencia de aceite esencial de ajo cebolla yen proporcin 2: 1
Lactobacilluspentosus en presencia de aceite esencial de ajo cebolla yen proporcin1: 1
99
Lactobacilluspentosus en presencia de aceite esencial de ajo cebolla yen proporcin 1:2
1O0
Lactobacilluspentosus en presencia de aceite esencial de cebolla Figura 29.Curvasdecrecimientode Pseudomonasfiagi
101 104
Pseudomonasfiagi en presencia de aceite esencial de ajo Pseudomonasfiag en presencia de aceite esencial de ajo cebolla en yproporcin 2: 1
104
105
Pseudomonasfiagi en presencia de aceite esencial de ajo cebolla en yproporcin 1: 1
106
Pseudomonasfiagi en presencia de aceite esencial de ajo cebolla en yproporcin 1:2
107 108 110
Pseudomonasfiag en presencia de aceite esencial de cebolla Figura 30.Un posible mecanismo de intercambio de grupos tiolo intercambio de disulfho es el catalizado por la glutation reductasa. La cinta prpura representa el esqueletopolipeptdicodeunaprotena.Elataquedel grupo ti01 o mercapto puede ser ionizado en forma de tiolato.
Figura 31.
Diagrama de
la cadena del
transporte electrones de mitocondriales,
111
indicando la ruta de la transferencia
(negro) y labomba de protones
(rojo).Los electrones son transferidos entre los Complejosy I11 por la I
coenzima Q, solubleenlamembrana;
y el Complejo I11 y IV por el
citocromo C entre la membrana y la protena perifrica.
Figura 32.
CitocromoC.Participa
en transportedeelectronesdelprocesode112 el
obtencin de energa desde el alimento hasta el oxgeno. El interior de cadaprotenaesungrupoprosteticollamadogrupohemo,decolor naranja en la ilustracin. Alterna entre los estados oxidados y reducidos de hierro y azufre, en contra de la prdida de electrones que pasan a lo largo de la cadena del transporte de electrones tiamina
Figura 33. de Figura 34. Figura 35.
Pirofosfto
GSH; y-glutamil-cisteinil-glicina, 115 glutationAlgunasreaccionesqueinvolucranalaglutation:(1)detoxificacincon115 la glutation peroxidasa (2) regeneracin de GSH a partir de GSSG por la glutation reductasa, (3) modulacin de la tiol transferasa; encargada del balance disulhro de las protenas y (4) biosntesis de leucotrienos mediante la glutation -S-transferasa
Figura 36.
Ruta detransferencia electrones la la de parareduccin del (Nuclesido de en el di fosfato)participa que en formacin la de
NDP
1 16
desoxiribonucletidos. El NADPH proporciona equivalentes reductores procesoentrelosintermediariosdelatioredoxinareductasa,
tiorredoxina, y reductasa ribonucletido
Figura 37.
Hojamaestradeevaluacin,paracadajuez,enlaqueseanotaronlos comentarios realizados en los grupos de muestras evaluadas
118
ACEITES ESENCIALES DE AJO Y CEBOLLA, EFECTO BACTERIOSTTICO, CARACTERIZ4ClON QUMICA Y ANALISIS SENSORIAL.
1
Nuestro universo sera cosa muy limitada si una
no ofreciera a cada poca algo investigar que
....
La naturaleza no revela sus misterios de una vez para siempre.SNECA, CUESTZONES N A T U M E S ,
libro 7, siglo primeroI.
INTRODUCCI~N
Una necesidad fundamental
de la humanidad es alimentaria
alimentarse, podra decirse que la industria apareci en el momento que'
se invent primera 'la
herramienta, hace ya unos dos millones de aos, la historia de nuestra
alimentacin es tan vieja como la historiaFoto 1. BifacialhalladoenelShara. Coleccin IFAN, Dakar, Senegal. (Toussaint y col., 1991).
de humanidad. la Desde millones hace
de aos compartimos con nuestros alimentos una evolucin comn. La adaptacin ha sido recproca, tratando de mantener el equilibrio biolgico, que desde siempre, es uno de los secretos kndamentales de la vida. La produccin de alimentos viene participando a travs del tiempo en la lucha por la sobrevivenciade la especie, an vigente hoy. Surgi,la industria alimentaria, de nuestra necesidad de disponer de recursos, de la historia de la domesticacin de nuestros comestibles y del control de nuestra alimentacin.Foto 2. Vendedor pescado. de Pintura mural, siglo XI11 a. de C., isla Grecia. de Thera, Museo Arqueolgico de Atenas. (Toussaint y col., 1991).
2
ACEITESESENCIALESDE AJO Y CEBOLLA,EFECTOBACTERIOSTTICO, CARACTERIZACI~N Q-CA
Y ANALISIS S E N W ~ .
Desde el momento que dieta nuestra se diversific y mejor, el ser humano se las ingeni para preservar los vveres del deterioro o la descomposicin microorganismos por mediante coccin, la la fro, acidificacin, la sal, las grasas, la miel, los azcaresy el alcohol.
tcnicas
de
conservacin, como son: la desecacin, el ahumado, el
El fuego, el fro y la sal permitido nos haban primeras hacer lasFoto 3. Campesinos egipcios cribando el grano conpalasdemadera. Detalle depinturamural. Tumba de Mennah, Tebas, Egipto. (Toussaint y col., 1991).
provisiones. El aceite, la miel, el vino y luego loscal, tequezquite y sal. ~. Mineralesutilizadoscomomtodosde y procesar alimentos, La
adcoholes enriquecieron
nuestros mtodos
y prolongaron el tiempoconservacin. deo
Foto 4.
Procedimientos que ancestrales slo seran sustituidos modificadosen elsiglo XTX por laqumica,labiologa,la diettica y la tecnologa que, en imaginacin eny resultados.
nixtamalizacin del maz con la cal (1 a % y hervir durante 2o a 4o minutos
la actualidad, compitenHoy, entre los mtodosde
con de lo a l 2 horas) es uno de los aportes de la cultura prehispnica de Meso Amrica alde alimentos consumo enelmundo. (Castell y col., 1991)
conservacintambinsedisponedeaditivos,quesegn de cinco fracciones de funciones primarias;estas: son mejoramiento en el valor nutricional, conservacin, mejoramientoen la textura,adicin de color y adicindej
su
usoen un comestible, generalmente se clasifica como parte
..
I:.
aroma y sabor. De las cinco, las ms fcilmente justificablessoh el mejoramiento nutricional en valor el' .
Foto 5. Pezalado, CultuA :San.Agustn, aos loo a. C. - 800 d. C., Colombia. (Museo del Oro, Santa F de Bogot, Colombia., 1994).
y la
conservacin; evitar proliferacin microorganismos al la de indeseables consumo impiden posterior. su que
ACEITES ESENCIALES DEAJO Y CEBOLLA. EPECFO BACTwrOSTTICO, CARACTERIZACldN Q m C A Y ANLISIS SENSORIAL
3
Materias primas son producidas en una regrny transportadas otra hasta paras proceso o u
industrializacin, posteriormente
se distribuyen en
diferentes lugares pueden meses donde pasar
o
incluso aos desde su produccin hasta el consumo. Para realizar manejo el
y soportar tiempo el de
conservacin se requiere de un sistema de mercadeo ascomo
un medioefectivodeconservacin.
Las
nuevas formas de preparacin de los alimentos
han
Foto 6. Una las de primeras latas de harina ladeada Henri Nestl, fin del siglo XIX.(Toussaint y col., 1991).
incrementado la necesidad de almacenarlos y por consipente conservarlos; ejemplos de nuestro tiempo son: la industria productos lcteos, crnicos,botanas, conservas, alimentos de alimentos sustitutos casos, para bajas calorias, de los
y otros. algunos En
lograr su conservacin, se
utilizancompuestosqumicos
o mtodosFoto 7. Tienda ultramarinos, de Florencia, Italia. (Toussaint y co1.,1991).
fisicos, pero fue en los umbrales del siglo
XX cuandoseusaronextensivamenteforma de aditivos, preferentemente origen natural.
ende
4
ACEITESESENCIALESDE AH)Y CEBOLL4. EFECTO BACTERIOST,hTCO,CARACl-ERQACIbNQUiMICA Y ANALISIS SENsoT(IAL.
Las fuentes naturales, como con usan gradualmente industrialmente con
las especias y
otros vegetales para el control antimicrobiano, se
m&las
frecuencia desplazando sustancias sintetizadas Un el mismo propbsito.
mtodo conservacidn de empirico
en el que
se
inhibi el crecimiento de microorganismos, siglos atrs, se relaciona con el principio aromhtico y de sabordealgunosvegetales,debido
a los aceites
u esenciales que son s principio activo y pueden ser
inhibidores y saborizmtes segn la concentracidn (Conner, 1993; Jeanflis y col., 1991; Farag y col.,Foto 8. Tienda de especias, Estambul, Turqua (Toussaint y col., 1991).
1989; Collins y Charles, 1987; Hitokoto y col., 1980; Hargreaves y col., 1975).
Los aceites esenciales y en general los aromas son de primordial importancia en la quimica del olor y sabor; en productos biolgicos proporcionan el aroma distintivo dela fuente de donde provieneny son los de principales atributos sensoriales de
los
alimentos de consumo humano @ m
y col., 1995; Reineccius, 1994; Maarse y Visscher,
1989; Pafumi, 1986; Zaika y Kissinger, 1981; Shelef y col., 1980).
Los voltitiles responsables del sabor y aroma, se sintetizan durante ciertas etapasdel desarrollo de plantas, animales y cultivos celulares. Segn Administration (FDA) de Estados los UnidosNorte de Amrica sustancias "son consideradas en el grupo de los aditivos alimentarios de origen natural, tienen comosaborizantesestatus
la Food and Drug
regulatorio GRAS o Generalmente Recomendados Como Seguros", se pueden etiquetar100 % naturales y su uso esth limitadoporbuenasprikticasdeSIN, no se enumeran y no
manufactura. En el Sistema Internacional de Nomenclatura
estn sujetas a dosis mximas legales, la cantidad de aceite esencial, se autolimita por
razones sensoriales. Esto significa que la cantidad de la sustancia afiadida al alimento en la fabricacin no exceded la necesariapara obtener aceptacin la
por del parte
consumidor(Leung y Foster, 1996; Davison y Branen, 1993; Tainter y Grenis, 1993;
ACEITES ESENCIALESDE AJO Y CEBotLA. EFECTO BACTERIOSTATICO,CARACTERDACINQUMICA Y ANALISIS SENSORIAL.
5
Smith, 1992). En vegetales,sucomposicinqumica,proporcin,cantidad depende,enprimertrmino,de abiticostalescomo laespeciebotnica-variedad,gentica-,el medioambiente,clima,condicionesdelsuelo
y calidad
y defactoresy defactores
socioculturales prcticas como culturales, estado desarrollo, de manejo poscosecha previoa laextraccin y mtodode extraccin(Sass-Kiss y col, 1998; Randle y col.,1994; Chieko y col., 1993; Tung y col., 1994; Mazza y col., 1992).
Los trabajos de investigacin sobre aceites esenciales de ajo {Allium sutzvum) y
cebolla {Allium cepu) en microbiologa y medicina, ser por inhibidores algunas de enzimas involucradas en las rutas metablicas celulares, han generado amplio inters en experimentar conocer para
y desarrollar potenciales sus como
f h a c o as como
antimicrobiano y sazonador(Dainty y MacKay, 1992; Talaat y col., 1989; El- Khateib,1987; A z z o u z , 1982; Danker y col., 1979). Milenariamente se han utilizado a
l o s ajos ylos
cebollas enmedicina la tradicional
o tambin llamada emprica
o folkl6rica, enla generacin de
tratamientosdiversos. Se han publicado estudios incluyen que microorganismos,tambinhayinvestigacioneseneltratamientode hasta como estimulador de la brotacin de yemas de ciruelo japons Lindl)enlugarescon baja acumulacindefro(Snchez
compuestos en el tejido vegetal as como rutas bioqumicas delos aromas producidos conalgunos tiposdey
cncer, como antitrombtico, insecticida, antimicrobiano alimentos, en samnador,
(Prunus sulicinu
y col. 1997; Singh y Singh,
1995; Kammerer, 1993; El-Shourbagy, 1993; Fenwick, 1985; Shelef y col. 1984).
Con presente la investigacin reporta se
el mtodo de
extraccin de aceitesy se
esenciales, por elmtododearrastredevaporencondicionesdevacoestndar, probaron inhibidores crecimiento como del celular; la dadatendencia uso del de sustancias de origen natural como mtodos de conservar problemasdesaludpblica
y sazonar alimentos as como
posibles principios activos en el desarrollo de medicamentos con
sus implicaciones en
y con la consecuente importancia econmica. Tambin se
realiz la caracterizacin cromatogrfica qumica mediante el reactivo de Ellman de los y compuestos voltiles de dos variedades vegetales cultivadas en Mxico de los que no se tenan reportes previos.
6
ACEITES ESENCIALES DE AJO Y CEBOLLA,EFECTOBACTWOSTTKO,
C A R A C T m C I b N QUIMICA Y ANLISIS SENSORIAL.
combustin lenta de carbono hidrgeno, lacual es e completamente similaral fenmeno que ocurre en una lmpara o un candil iluminado,y que desdeeste punto de vista, o animales que respiran combustible ls son verdadero quese encienden y consumen asi mismos."ANTOINE LAVOISIER ARMAND SEGUIN, 1789.
"...en general, la respiracin
no es otra cosa que una
-
IL
ANTECEDENTESlosmicroscopios fueron
Cuando
suficientemente poderosos,
Louis Pasteur, en
1860, demostrelprocesodeenvenenamiento
microbian0 de los alimentos al establecer que la fermentacinescausadapormicroorganismos. En la actualidad, la industria alimentaria domina tratamientos especficos capaces impedir de queamenazan ylo quepuedenproliferarenlos diversos grupos de alimentos;sonejemplos: vaco, aditivos, alimentos fermentados como quesos, aceitunas, etc. (Toussainty col. 1991)Foto 9. Microfotografia de barrido
o
favorecer el desarrollo de los millones de clulas la
pasteurizacin, productos enlatados, envasado al
de moho filamentoso formando una capa blanca en ciertos quesos (Toussaint y col., 1991)
Los
factores se microbiolgicos
consideran los ms importantes riesgos dentro de
la perspectiva devehculo. En la industriaalimentariaesbsico mtodosqueeviten Anlisisde
salud publica son porqueesel
capaces causar manera de de extensiva enfermedades las el en que alimento la proliferacindemicroorganismos,comosonlosprogramasde
asegurar lacalidaddelproductocon
Riesgos enPuntosCrticosdeControl(ARPCC)
o sus siglas eningls
HACCP. El sistema es de tipo preventivo y se encarga de la seguridad de los alimentos;
ACEITES ESENCIALESDE AJO Y CEBOLLA. EETCTU
BACTFXICJST+~CO, CARACTFZUZ~CI~N u i r u Y ANLISIS SENSORIAL ~ ~c~
7
est basadoenimpidiendo el
disefiar el procesodesde
la produccin hasta el consumidorfinal
crecimiento de microorganismos patgenos, mediante manejo el de alimento conprincipiostcnicos
factoresecolgicosdel
y cientficos(Multon, 1996;
Stevenson y Bernard, 1995; Middlekauff y Shubik, 1989).IL1.
Principalesmicroorganismos de descomposicin
Los alimentos, se pueden considerar como un medio ambiente selectivo para elcrecimiento celular en los que sus variables fisicas y composicin qumica seleccionan aquellosmicroorganismos que poseen los atributosbioqumicos
y fisiolgicospara
proliferar.Enotrostrminos,elquemejorse
adapta al ambiente, crece ms rbpido.
Cuando un comestible -de un ambiente definido- es colonizado por clulas, al ocurrir el crecimiento, cambia el ecosistema de tal forma que modifica las asociaciones que son capaces de desarrollarse. SegnRay (1996), Leistner y Gorris (1995) y Gould (1992), los cinco factores que afectan el metabolismocelular y corno consecuencia la ecologa microbiana de los alimentos se agrupan en la Tabla1, la combinacin y el manejo de
stos en la pdctica para evitaro inducir el desarrollo celular se conocen como tecnologa de barrera. Muchos microorganismos patgenos (bacterias, mohos contaminar el alimento durantelasetapas deSU
y virus) puedenmanejoentrelaproduccin
y elel
consumo. La ingestindealgunosmicroorganismosno sistemadigestivo los elimina antesdequepuedan
es peligrosaparalasalud;el causar elmenortrastorno.Por
contrario, su multiplicacin en los alimentos y la generacin de sustancias txicas es la causadelproblemacuandosoningeridos.Serequierecomomedidadecontrolpara evitarlaproliferacin
y comoconsecuencialageneracin
de toxinas, un proceso
adecuado e higiene rigurosa desde el inicio hasta el consumidor.
g
ACEITFS ESENCIALES DE M0 Y CEBOLLA,EFECTO
BACTERIOSTATICO,
CARACTERWACIdNQLkWCA Y A N h S I S SEIVSORIAL.
Tabla l.
Principales factores que afectan la ecologia microbia de los alimentos (Ray, 1996; Leitsner y Gorris, 1995; Gould, 1992).FfSIcoActividadde Agua aw Hielo y sus efectos de Concentracin por congelamiento
QufMICONutrientes presentes Naturaleza de los solutos pH y capacidad de amortiguacin
FACTORES DEPROCESO
FACTORES EXTR~NSECOSTemperatura Humedad relativa
FACTORES IMPL~CITOS Y
Cambios en los tipos de microorganismos Cambios en el nmero microorganismos Cambios en la composicin del alimento Cambios en la estructura del
MICROBIOL~GICOSMicroorganismos presentes
M 1 n parcial Crecimiento de oxgeno Presencia otros gases de
Fase microbiolgica lag y velocidad de
Efectos sinrgicosEfectos antagnicos
Potencial de xido Viscosidad reduccin Microestructura Presencia de aditivos y compartamentaliza cin sustanciasantimiCrObianas
alimento
II.l.l. Grupos bacterianos importantes en alimentos
De la cantidad de microorganismos y contaminantes encontrados en alimentos, las bacterias constituyenel grupo ms importante entre insectos, helmintos y desechos de aves y roedores. Factores que influyen o son relevantes en el desarrollo celular son: su rpida velocidad de crecimiento, facilidad de proliferar en los ms diversos ambientes, facilidad utilizar nutrientes, de sus habilidad crecer de en temperatms, aerobiosis, pH, actividad de agua
un intervalo amplio de(h), como a s el potencial de
sobrevivencia -como las esp.ras a temperaturas altas-. Los factores antes mencionados
son los criterios de decisin en la implementacin de programas de calidad, respecto de
los microorganismos en lugares donde manejan alimentos. seLas bacterias en alimentos se han dividido y agrupado sobre la base de algunas caractersticas similares, recopiladas en la Tabla 2.
ACEITES ESENCIALES DEAJO Y CEBOLLA EFECTO BACll?RIOZFFATICO,CARACTEUIZACI6N QUMICA ANLISIS SENSORIAL Y
9
Tabla 2.DIVISI~N1) A&ticas 2) Butricas
Grupos bacterianos importantes alimentos enCARA~ER~STICAS Produce cid0 dtico. Produce bid0 butrico.
(Ray, 1996).MICROORGANISMOS
Acetobacter aceti algunas Clostridium spp.como I Clostridium butiricum 3) Lcticas I Produce relativamente grandes cantidades de I Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, cid0 lctico a parti-de carbohidratos. Lactobacillus y Streptococcus thermophilus. 4) Propinicas Son usadas en fermentacin lctea. Propionibacteriumfreudenreichii 5) Acidrica Algunos Lactobacillus,Pediococcus, Capaz de sobrevivir a pH abajo de4. por Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus. PrincipalmenteEscherichia, Enterobacter, 6 ) Coliformes Son usados como ndice sanitizacin. de Citrobacter, Klebsiella. 7) Coliformes fecales Son usados como ndice de sanitizacin. Escherichia coli 8) Esporulados Bacillus, Clostridiumy Desulfotomaculum Habilidad de producir esporas spp. 9) Halotolerantes Algunos Bacillus, Micrococcus, Capaces de sobrevivir a altas Staphylococcus Pediococcus, Yibrio y concentraciones de sal (arribao iguales al 10 %) Corynebacterium. 1O ) Lipoliticas Capaz dehidrolizar trigli&ridos, debido a la Micrococcus, Staphylococcus, prodwxin de lipasas extracelulares Pseudomonas,Alteromonasy Flavobacterium relativamente 11) Osmofilica Staphylococcus. Leuconostoc, Pueden crecer en altas concentraciones Lactobacillus osmticas,son mucho menos osmofilicas que las levaduras y mohos. 12) Patgenos entriw Salmonella, Shigella, Campylobacter, Causan infecciones gastrointestinales Yersinia, Escherichia, Vibrio, Listeria, Hepatitis A 13) Productores de Debido a la sntesis polisacridos de Xanthomonas, Leuconostoc, Alcaligenes, gomosidad Enterobacter, Lactococcus y Lactobacillus. Leuconostoc, Lactobacillus, Producen COZ,Hz, HzS durante el 14) Productoras de gas Propionibacterium, Escherichia, metabolismo de nutrientes. Enterobacter, Clostridium y Desulfotomaculum. 15) Proteolticas Hidrolizan protenas, debido a la produccin Micrococcus, Staphylococcus, Bacillus, Clostridium, Pseudomonas, Alteromonas, de proteinasas extra-ceiulares Flavobacterium,Alcaligenes, algunas Enterobacteriaceaey Brevibacterium. 16) Psicrotrficas Pseudomonas, Alteromonas, Alcaligenes, Pueden crecer en temperaturasde Flavobacterium, Serratia, Bacillus, refrigeracin (menoreso iguales de 5 "C) Clostridium,Lactobacillus,Leuconostoc, Carnobacterium, Brochotrix, Listeria, Yersinia y Aeromonas Bacillus, Clostr?dium, Aeromonas, 17) Sacarolticas Hidrolizan carbohidratos complejos. Pseudomonas, Enterobacter 18) Termofilicas Capaz de crecer por arriba de50 "C Algunos Bacillus, Clostridium, pediococcus, Streptococcus, Lactobacillus 19) Tennduica Algunos Micrococcus, Enterococcus, Capaz de sobrevivir atemperaturas de Lactobacillus, Pediococcus, Bacillus pasteurizacin. (esporas)y Clostridium (esporas)
Con base a la clasificacin del manualde Bacteriologa Determinativa editado por Holt(1993) as como Ray por(1996) en al baseGneroy Familia, pors u
importancia, se tomanestos
grupos de bacterias porqueestnpresentesenalimentos.
Se encuentran ordenadas en secciones y se recopilan en la Tabla 3.
Tabla 3.
Gnerodebacteriasimportantesenalimentos(Ray, col., 1993)Familiano indicada Pseudomoneaceae Acefobacteraceae Nisseriaceaeno indicado
1996; Holt y
DescripcibnGram-negativos,aerbico/ microaerofllico, mviles, heticoides/ vibrioides
MneroCampilabacter Pseudomom, Xantomonas Acetobacter, Gluconobacter Acineiobacter,Morarella Alteromonas, Flavobacterium, Alcaligenes, Brucella, Psychbocter Citmbacter, Escherichia, Enterobacter, Edwarsiello, Ewinia, Hafiia, Klebsiella, Morganello, Proteus, Salmonella, Shigella, Serratia, Yersinia, Vibrio,Aeromonar,Plesiommarcome1la
Gram-negativos,aerbico,bastones y cocci
Gram-negativos,ana&bios facultativos, bastones
Enterobacteriaceae
VibrionoceaeRickettsias
Rickettsiaceaceoe Micrococcaceae no indido
Gram-positivos cocci
Micrococcus, Staphylococcus
Streptococats, Enterococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Sarcinia Bacillus, Spomlactobacillus,Clostridium, Desulfotomaculum"
Gram-positivos, fomador de endosporas,bastones cocci y
no indiada
Gram-positivos, no espulados, bastones regulares Gram-positivos, no espodados, bastones uregulares
no indicado
Lactobacillus, Carnobacierium, Brochotrix, Listeria,
no indicado
Corynebacterium, Brevibmterium, Pmpionibacterium.B~~dobactertum
'Las e6luias Desulfotmacuhm son gram negativas
ACEITES ESENCIALES DE AJO Y CEBOLLA, EFECTO BACTERIOSTTICO, CARACTERIZACI6NQ U h C A Y ANLISIS SENSORIAL.
11
II.l.l.l.
Principales microorganismos de descomposicin de carnes rojasEl msculo animal (Figura 1) es un
mediodecultivoricoennutrientes,est conformadomanojo por un de fibras contrctilesrodeadodeunacoberturade tejido conjuntivo, que constituye una proteccin contra efectiva contaminacin Qumicamente, externa. en promedio,lacarne de losmamferos la
contiene 18 % de protenas, 75 % de agua, el contenido de carbohidratos es bajo y el de grasas variable muy (Bourgeois y Leveau, 1995). Tabla La 4 presenta composicinpromedio qumica del msculo magro para varias especies.Figura 1. Estructura del msculo estriado. Micrografia electrnica de partes de tres miofibrillas seccin en longitudinal.Estanseparadasporaberturashorizontales.La la parte clara es la banda I, la cual contiene filamentos delgados arreglados hexagonalmente; la banda A, marcada en obscuro contiene solamente filamentos empacados hexagonalmente; aquellos obscuros la exterior segmentos de parte son que y filamentos delgados; contienen traslapamientos delgados como los discos Z que estn anclados; y eldisco M aparece como protuberancia el una encentro cada de filamento delgado. La unidad fincional de las miofibrillas, el sarcmero, Z es la regin entre dos discos sucesivos en el msculo (Voety Voet, 1995).
Tabla 4.
Composicin qumica promedio del tejido muscular de algunas especies (Dainty y Mackey, 1992; Fennema, 1984).
ESPECIESBacalao Cerdo Cordero Pollo Res Salmn~~
AGUA81.2 68 - 70 73 73.764
PROTENA
L ~ I D O S CENIZAS
1
17.6 19 - 20 9 - 11 20 5-6 20 - 23 4.7 20 - 22 70 -73 4 - 8 20 - 22 - 15
~ T R ~ ~ ~ O M ~ ~ S T O S (%, P N ) EN GENERAL 1.2 0.3 L (+) Acido lctico0.9 1.4 . 0.1 Glicgeno Nuclehtidos 0.3 1.6 Aaicares fosfatados O. 1 1.o Productos de ATP 0.3 1.o 0.4 Aminocidos 1.3 13
Tan pronto como se sacrifica un animal, el msculo asume el estado rgido-o de
rigor mortis, esta transformacin est acompaadade una cada progresiva del potencial
12
ACEITES ESENCIALESDE A O Y CEBOLLA, EFECTO BACTERIOSTTICO, CARACTElUZACI6NQUfMICA Y ANLISIS SENSORIAL, J
de xido-reduccin o potencial elctrico (Eh) del msculo; que en su estado normal es de 250 mVydesciendehasta -50 mV.Tambinocurre un descensoenel hasta 5.5 y se este produce cuando glucgeno convertido el es hasta cid0pH de 7.4
lctico.
Por otro lado, cesan los mecanismos de defensa del animal haciendo al tejido muscular ms vulnerable al crecimiento bacteriano, aunque microbiolgicamente, en el momento de la matanza,elmsculoestprcticamentelibredemicroorganismos,cuandode animales sanos se trata (Bourgeoisy Leveau, 1995; Voet y Voet, 1995). Las fuentes iniciales de contaminacin del tejido muscular, algunas veces, sonlos ganglioslinfticoscuandoestncontaminadosconmicroorganismos.Tambinpueden ser aquellos que se encuentran en el tracto dlgestivo, donde al cruzar la barrera intestinal son transportados por el flujo sanguneo con los que se pueden causar contaminaciones profundas (Bourgeois y Leveau, 1995; Dainty y MacKey, 1992). En la superficie de las canalessepuedeencontrar
un gran nmerodemicroorganismosdediversostipos;seun lugaranatmicoaotroy
puededesarrollarunafloracaractersticaquevarade1992). Tpicamente, las canales de carne
depende en gran medida dela temperatura, pH y la atmsfera gaseosa (Daintyy MacKey,y algunos productos crnicos tienen bacterias
mesofilas (entre
100 y 10 O00 por Una cm2). recopilacin principales de los
microorganismos encontrados incluyen: carne en laBacillus,
Acinetobacter, Brochotrix, Pseudomonas, Lactobacillus, Flavobacterium, Streptococcus, Aeromonas, Corynebacterium, Clostridium y Arthrobacter
(Bourgeois y Leveau, 1995; Dainty y MacKey,1992; Van der Zanty Splittstoesser, 1992).
II.1.1.2.
Pseudomnasfragi
El gnero Pseudomonas, pertenece a
los procariontes, clulas sus tienen formas rectas o bastonesligeramentecurvos,miden alrededorde 0.5-1.0 x 1.5-5.0 pm (Foto 10).Foto 10. Fotogrda de barrido electrnico de
Pseudomonasfragi (Campbell, 1993).
ACEITES ESENCIALES DE m Y CEBOLLA, EFECTO B A ~ ~ ~ O S T T I C CARACTERIZ~CI~N Q, QWCA Y ANALISISSENSORIAL
13
Se encuentran ampliamente distribuidas en naturaleza. Muchas especies de familia la esta acumulan f3-hidroxibutirato como material de reserva de carbono, las clulas se tifien de forma gram negativa. La mayora especies de de condicionesticidashasta pH=
Pseudomonas pueden crecer en
4.5, no requiere de
factores de crecimiento para su
desarrollo. Tienen metabolismo respiratorio estrictamente aerbico en el cual el oxgeno es el aceptorfinaldeelectrones. segn positivas o negativas
En pruebasbioqumicas,seconocequesonoxidasala cepa, soncatalasa positivas y adems quimio
organotrficas, son psicrotrficas y pueden crecer a 5 "C aunque su temperatura ptima es entre 10 y 25 "C. (Ray, 1996; Holt y col., 1993). Algunas cepas de Pseudomonas se han utilizado frecuentemente en reacciones de biotransformacin ya que tienenla habilidad de romper oxidativamente enlaces C-C y losC-O (Hui y Khachatourians, 1995). Son capaces de metabolizar una amplia variedad de
carbohidratos, protenas y lpidos en alimentos, pero principalmente en came
y pescadoy
producen proteinasas y lipasas extracelulares que son estables trmicamente; por lo que
l a s Pseudomonaceae sonrelevantesen
los procesosdeconservacindealimentos
constituyen puntos de riesgo en programas de calidad de acuerdo conHACCP. IL1.1.3.
Lactobacillus sp.
Varan ampliamente en cuanto a forma y tamaiio, algunos pueden ser cadenas cortasmuy largos otros
pueden ser cocobacilares, pueden estar solos o en
o largas (Foto
11).
Los
Lactobacillus se encuentran ubicados dentro del
grupo de los grampositivosnoesporuladoscon formadebastones.Sonanaerobiosfacultativos, la mayorade l a s especies noson general son psicrotrofas,homo pueden ser mviles,en o heteroFoto 11. Microfotografla de barrido de Lactobacillus pkmturum. WSO. Escala bar = lpm (Hui y Khachatourians, 1995)
mesoflicas aunque algunas son
fermentadores lcticos (Tabla 5). Pueden crecer
" .
.
a pH entre 3.5 hasta 5 (Ray, 1996; Hui y Khachatourians, 1995). Algunasespeciespueden crecer a bajas tambin forman de parte temperaturasproductos en almacenados temperatura a de leche, m e , heces y la flora de productos acucolas. Muchos usados son en refrigeracin (L. sake, L. curvatus). Se encuentran plantas, en
bioprocesos alimenticios (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, L. helveticus, L.plantarum) y algunos son usados como probiticos (L. acidophilus, L. reuteri, L. casei
subsp. casei). Diversas producen cepas bacteriocinas, se que pueden como usar bioconservadores alimentos impedir de al e1 crecimiento deotros microorganisrnos
(Lactobacilluspentosus) (Davison y Branen, 1993). Tabla 5.
Divisindelasespeciesde
Lactobacillus en grupos (Ray, 1996).
Designacin previa
carbohidratospatrn d fmentacin e
Obligado homofamentativoI
Fwultativo
obligado heterofmentativoI
Productos hales de la
I lactato, acetato,emlo4
heterofmenmivo
Lactato,acetato,etanol
famentacin deCarbOhidratoS
coz,formato
positivo positivo Fermentacin de las
negativo
Pa=Especies representativas
L. delbrueckii subsp.: delbrueckii:bulgaricus :lactis
L. casei subsp.: casei:rhamnosus : pseudopantarum
L. fermenturnL. divergens
L. kt$rL. conjuus
L.. leichmanniiL. acidophilus
L. plantarumL. curvatus
L. brevisL. sanj-rancisco
L. helveticus
L. saque
L. reuteri
ACEITES ESENCIALESDE AJO Y CEBOLLA. EFECTO BACTERIOSTTICO, CARACTERIZACION QUkWCA Y ANLISIS SENSORIAL.
15
II.2.
Metabolismo celular
El crecimiento rpido de los microorganismos, una vez que se han adaptado al alimento, debeacoplamiento reacciones se al de bioqumicas consecutivas transferencia de electronesejecutadas por las enzimas.Elmetabolismocelularesla globalidad de procesos dirigidos enzimticamente mediante los cuales las clulas utilizan la energa que ellas mismas generan en forma ATP. de Los organismosvivientesnoestnenequilibrio,parasurpidocrecimiento requierenpermanentementeelflujodelcompuestomsimportanteanivelbiolgico conocido como ATP para mantener funcionando en orden su sistema bioqumico. Este compuesto energtico es derivado del cido fosfrico y derivados de cidos carboxlicos. El ATP seformaapartirdeladenosinmonofosfato acopladas entre la fosforilacin oxidativa del sustrato o fuente de carbono y, tambinse puede generarpor otro proceso conocido
y de
(AMP),mediantereacciones
como la quimismosis. Una caracterstica metabolismo del degradativo es que convierte un gran nmero de sustancias diversas (carbohidratos, lpidosy protenas) a intermediarios comunes. Luego
estos intermediarios son metabolizados en una ruta oxidativa que pocos centralgenera productos finales y despus a unintermelario comn, acetil
- coenzima A (Figura 2);grupo acetilodeyFigura 2. Estructura qumica de la Acetil coenzima A. El enlacetioesterde "alta energa" se indica curvo; grupo acetil es con un segmento el reemplazado por hidrgeno (Voet y Voet, 1995).
seguido porlaoxidacindel
hasta C 0 2 y H 2 0 poraccionessecuenciales del ciclo del ctrico, cido cadena transporte electrones de oxidativa. En un sistema alimenticio los fosforilacin
sustratos metabolizables principalmente son
16
ACEITES ESENCIALES DEAJO Y CEBOLLA, EFECTO BACTERIOSTATICO, CARACIWZQACI6NQLdMICA Y ANALISIS SENSORIAL
los carbohdratos, protenas y lpidos. Los microorganismos en alimentos se consideran tambin quimio-organotrofos son usando compuestos heterotrofos y por otro lado, orgnicos como donadores electrones generar de para energa (Voet Campbell y col., 1993; Colby, 1987). Las rutas de reacciones las biolgicas agrupan dos se en categoras: de las degradacin o de catabolismo y las de biosntesis o anabolism0 (Figura 3). En las rutas catablicas, los metabolitos complejos desdoblados exergnicamente hasta productos son simples. Las enzimas son de importancia en central la desecuencia complicada conducen al que eventos crecimiento, maduracin, almacenamiento y procesos transformcin de materiales Cualquier alteracin el en comportamiento normal de enzimas delas tenerPro.ductwsimples
y Voet, 1995;
k
yi \
:;~~"-.0 -
Metabolitos complejos
\
\
Regradacin
biolgicos. Biosntesis
A_
P"\puede
un de el desarrollo
microorganismo consecuencias funcionamiento y por lo tanto afectar celular (voet Y voet, 1995; Campbell y col., 1993).
Figura 3. Rutas catablicas. El ATP y NADPH son las &entes de energa libre de reacciones biosintticas. Ellas son generadas entre la degradacindemetabolitoscomplejos y utilizadasenlasdiversas fbnciones biolgicas (Voet y Voet, 1995).
ACEITES ESENCIALES DE AJO Y CEBOLLA, EFECTO BACTERIOSTATICO, CARACTERIZACI6N QUMICA ANALISIS S E N S O W . Y
17
II.2.1.
Mecanismos de accin de aceites esenciales gnero Allium del sobre microorganismos
Figura 4. Accin deun inhibidor enzimtico. Puede ser reversible o irreversible y depende del tipo de uniones que establezca y con la enzima. Es irreversible cuando se genera un enlace covalente, con fierzas electrostticas es reversible (VoetVoet, 1995; Campbell, 1993).
Cualquier compuesto velocidad que la reduce
de reaccin del
metabolismo celular es un inhibidor de enzimas (Figura 4 . Se ha comprobado que la ) cebolla (Allium cepa) y elajo (Allium sativum) inhibenlaactividadmetablicaen microorganismos segn la concentracin (Whitaker, 1995; Rees y col., 1989; Shashikanty col., 1988; Vries y Klasen, 1979).
En los vegetales del gnero Allium los principales compuestos encontrados en sus aceites esenciales son de naturaleza azufrada. Por poseer estos compuestos dos pares de electroneslibresencadaunodelostomosdeazufrecuando (Figura 5), presentan un orbital hbrido de tipoforman enlacessigma
SP3(Pierce, 1986), adems pueden establecerpuentes de hidrgeno. Como inhibidores, son especficos a travs de sus grupos tiol o de xidoy
mercapto y modificanelbalance nivel a reduccin. Hay teoras celular mecanismos propuestos el enbloqueo del
metabolismo celular, en los que se tiene como comn denominador al azufrey s qumica. u
Figura 5. Dialildisuiiro o Alicina.Sustanciaazufiada, inhibidor enzimtitico del metabolismo celular. Compuesto ms abundante en el aceite esencial de ajo.
18
ACEITES ESENCIALES DE AJO Y CEBOLLA, EFECTO BACTERIOSTTICO, CARACTERIZACI6N Q-CA
Y ANALISIS SENSORIAL.
La Tabla 6 , recopilaalgunasdelasenzimascelularesinhibidasporlaalicina encontrada en ajo, as como las referencias donde se reporta.
Tabla 6.
Algunas enzimasinhibidaspor laalicinaencontradaen (Allium sativum)
el ajo
IAqetato kinasa
ENZIMA..
.,
,...
Zb
,... ....4b
.
.
I
.
6b
d l
.
I
.
.
-
1
.
.
.
I
"
I0
ld0
do
....
I
.
.
I
m . ?
140
180
P.M. 41 g/mol
~~
90
ACEITES ESENCIALES DE AJO Y CEBOLLA, EFECTO BACTERIOSTTICO, CARACTERIZACINQ W Y ANALISIS SENSORIAL. C A
COMPUESTO (CEBOLLA)
FRAGMENTOS
trans-3,SDietiE1,2,4-tritiolano. 2.09%, Rf30.40 min, 180 @mol
P.M. 180 d 0 m1 corresponde al ion padre
ESPECTRO
P.M. 73 @mol
P.M. 115 @mol
P.M. 41 @mol
ACEITES ESENCIALESDE AJO Y CEBOLLA, EFECTO BACTERIOSTATICO. CARACTERKUCIN m C A Y Q
ANALISIS
SEVSORIAL.
91
COMPUESTO (CEBOLLA) 2,5-dimetil-tiazolio.0.43%, Rf36.13min, 113 g/mol
FRAGMENTOS
P.M. 18 @mol
ESPECTRO
J8000 6000 -
99
lf3
4000
1I
1
P.M. 113glmol ion padre
1841
idd_ .39
8000
-
6000 -
iP.M. 99 @mol
40002000 I
La Tabla 16 resume a los compuestos identificados en los aceites esenciales deajo y cebolla extrados por arrastre de vapor en condiciones de vaco estndar, as como su abundancia relativa, tiempo retencin y peso molecular. deTabla 16.Compuestosazufradosencontradosenlos y cebolla.
aceites esenciales deajo
Familiade compuestosMonoazufrados
I
-1
Disulfuros
-
-
Trisulfuros
Sin azufre
Col?Apadmdclieos
Cempucstos comunes en los dos v q ~ t a l e s
ACEITES ESENCIALES DE AJO Y CEBOLLA, EFECTO BACTERIOSTTICO, CARACTERIZACI~NQU~MICA ANLISIS SENSOR~AL Y
93
V.2.3. Concentracin de grupos sulfhidrilo SH
Con la ecuacin general C,(pmol SH /ml) = (A / 13 600 * D), reportada por Ellman (1959), se obtienen las curvas para cada tratamiento (Figura calcular la concentracin de grupos tiol a cada valor de concentracin de aceites 27). Conellassepuede
Aceites esenciales de y cebolla en presencia ajo del reactivo de Ellman
esenciales(Tabla 17). Delasecuaciones,A es el valor de la absorbancia leda en la
A
solucin 420 problema a nanmetros (nm), 13 600 es el coeficiente de extincin, D eselfactordedilucin [(Volumeny secalcula:i
O
50de aceit+)
100
150
200
totalNolumen la
de
Concentracin/
ml de medio
muestra)*(Volumen de la solucin de fosfato + Volumen del reactivo de Ellman) Nolumen de la muestra)].Tabla 17.Figura 27. Pruebareactivo del de Ellman en los cinco tratamientos y los cinconiveles,mismosqueseprobaronen los bioensayos.
Ecuaciones que describen la concentracin de los grupos sulfhidnlo (pmoles/ml) en los5 tratamientos probados en los bioensayos.
[
TRATAMIENTOAjo Ajo+cebolla (2: 1) Ajo+cebolla (1 : 1) Ajo+cebolla (1 :2) Cebolla
1
ECUACI~N DEL TRATAMIENTO
R20.9987 0.9993 0.9989 O.9993 O.9994
[SH(pmoledml)] = 4E-O7*(pI de aceite) + 1E-06 [SH(pmoledml)] = 3E-O7*(pl de aceites) + 7E-O7 [SH(pmoledml)] = 3E-O7*(pl de aceites) + 6E-07 [SH(pmoledml)] = 3E-O7*(pl de aceites)+ 3E-07 [SH(pmoledml)] = 3E-O7*(p1 de aceites) + 8E-07
Los coeficientes de correlacin de cada una de las ecuaciones obtenidas con los datosexperimentalesestporarribadel0.99enloscincotratamientosprobados. tiene que considerar que el orden de magnitudentreelnivel Se
ms pequeo y elms
elevado de concentracin de los aceites es de
(5025) veces mayor por lo que los tres
primeros puntos se encuentran cercanos entre s comparados con los dos ltimos, (0.039, 0.39,3.99,49.6, 196) pl aceite(s)/ml.
94
ACEITES ESENCIALES DE AJO Y CEBOLLA.EFECTO BACTERIOSTATICO, CARACTERUACIbNQUfMICA Y AN.hlSlS SENSORIAL
Los resultados de la Tabla 18 indican una disminucin gradual de la concentracin
de grupos tiol a medida que aumenta el contenido del aceite esencial de cebolla. Con las ecuaciones obtenidas la concentracin de los grupos tiolen ajo y cebolla, al comparar los resultados, en un mismo nivel de concentracin se puede notar que en ajos es 25 % mayor respecto de la cebolla. De la misma forma, tambin se aprecia que entre las combinaciones hay en concentraciones grupo del fimcional. de los aceites no diferencia las constituyentes abundantes la ms encebolla contienen no tomos azufre de aldehdosquenogeneranelpigmentodetectadoconelreactivo,mientrasqueenLos dosy son
ajos
todos sus constituyentes si lo contienen. Aunque no se puede conocer cual o cuales de los constituyentes en cada aceite reaccionan, se debe sealar que el ajo se encuentra 25% por arriba en la concentracin de los grupos tiol detectados respecto de la cebolla mezclas no hay diferencia.Tabla 18.Concentraci6npl aceite@) / m 1
y entre las
Concentracindegrupostiol
(SH) en pmoledml
pmoledml de grupos tiolen cada tratamiento (lxlo-) ajo
I
ajoi-cebolla (2:1)
I
ajoi-cebolla (1:l)
I
ajo+cebolla (1:2)
I
cebolla5.96 1.55 O. 186 0.0817 0.0419 0.0711
196 49.6 3.99 0.39 0.039
2.08 0.259
5.95 7.94 1.55 O. 186
o. 101
5.94 5.91 1.5 18 1.548 O. 178 O. 1497 0.0717 0.0817 0.115 0.0611 0.0711 0.039
El nmero de compuestos azufrados en cebollas que tienen estructuras
cclicas son
9 y suman 18.99 % deabundanciarelativa(2,5-dimetil-tiofeno,tiazolidina,3,3-tienil-2cidopropenico,2,5-dimetiltiazolio,1,3-ditiano,1,3-ditiolano, 1,2,4-tritiolano-3,5-dietily el trans-3,5-dietil-l,2,4-tritiolano), demscompuestosalifticoscaracterizadosque los
contienen al anifre suman 15.76 % (metanetiol, metil propil disulhro, metil tirano, dimetil disulhro, metil disulhro, etil 1,3-propan 2-propenil disulhro, ditiol, propil dimetil trisulfbro, dipropil trisulhro); el restante 18.53 % corresponde a otros compuestos que no heron identificados y quedeformaindividualcadaunodeellostienenabundanciaspor
ACEITESESENCIALES DE AJO Y CEBOLLA,EFECTO BACTERIOSTATICO,CARACTERIZACIONQUtMlCA Y A N h I S I S SENSORIAL
95
abajo de 1 % segn las reas del cromatograma. Considerando que un compuesto cclico comolosqueseencuentran encebollasadquierenmayorestabilidadalpresentarun fenmeno conocido como resonancia, que no es otra cosa que el movimiento continuo de
los electrones al interior dela molcula, que proporciona mayor estabilidad al compuesto ypor consiguiente menor actividad en la formacin del pigmento detectado en la prueba si se compara conlos compuestos alifticos del aceite esencial de ajo.V.3.
Crecimientodemicroorganismos en mediossintticos
El anlisis de resultados de las curvas de crecimiento los bioensayos, se realiz a en travs de las ecuaciones de cada tratamientoy cada nivel obtenidas a partir de las lecturas de la absorbancia. Las fbnciones polinnicas (y(x)) de tercer orden, en estos bioensayos, describen al crecimientocelularconsiderandolosfactoresenlistadosenlaTabla1. La
variable independiente x representa al tiempo en horas, entre el inicio del crecimiento y lapentosus y 24 horas para culminacin de la fase exponencial, 30 horas para Lactobacillus Pseudomonas @a@. Elintervalodeinterssejustificaenconocercomorespondeel
crecimiento a lo largo del tiempo y(x) con cada uno de los tratamientos y niveles probados entre la inoculacin y el inicio de la fase estacionaria (Figura20). El polinomio o ecuacin que simula el crecimiento est influido por la variable de tiempo (x3, x). x2, Las ecuaciones lineales, enlistadas las Tablas 20 y 22 tienen la misma tendencia, en se localiza un punto mximoel en mismo intervalo seleccionado, coeficientes de correlacinsimilaresporloquepuedensercomparadasenunrangodelavariable independiente tiempo para conocer el comportamiento del crecimiento equivalenteal rea, calculadaporelvalordelaintegraldefinida.Elporcentajedeinhibicin se obtuvo al comparar los valores de cada de las reas bajo la curva respecto de la que present la una menor rea y por consiguiente el menor crecimiento.
96
ACEITE3 ESENCIALES DE AJO Y CEBOLLA, EFECTO BACTERIOSTATICO, CARACTEWClbN QUfMlCA Y ANhISlS SENSORIAL
V.3.1. Lactobacillus pentosus
Sugieren los resultados que como era de esperarse, la mxima inhibicin se alcanza a 196 pVml del aceite esencial ajo, tratamientoy nivel de referencia, respecto de las dems curvas. El porcentaje de inhibicin se calcul regresiones y conelaceiteesencialdeajoa inhibicin.Seguidoporlacombinacindeajo finalmentelamezclademayorproporcindeajo indican no que hay en base a las ecuaciones obtenidas con las196 pVml comoreferenciadelamximay cebolla (2: l), ajo y cebolla (1: 1) y y cebolla (1:2) en mximo el nivel
probado. La variacindelosresultadosdelasreascuandosecombinanlosaceites efectosinrgico.Paraelniveldeconcentracinde49.6 pl/ml, la
inhibicin est entre 27.98 % en la mezcla de ajo y cebolla (2:l)y 15.61% ajo y cebolla(1 :2) comparado con la referencia sugiere un posible efecto sinrgico en la combinacin2: 1 de ajo + cebolla (Tabla 1 y Figura 28). De igual forma para el nivel de 3.9 pVml no se 9
aprecia diferencia del porcentaje de inhibicin al compararlo con el nivel de49.6pVml. En elnivelde 0.39 pVml el efecto que presentan los aceites y sus combinacionesnosonde inhibidores y por contrario, evidente incremento el es el en los valores las de reas asociadas al crecimiento de L. pentosus, segn los datos los constituyentes de los aceites favorecen el desarrollo metablico cuando se probaron por abajo de 0.39pVml. La Figura28 recopila las curvas de crecimiento en L. pentosus, la comparacin de las curvas de los
resultados de las reas se encuentran en la Tabla 20.Tabla 19.
Comparacindelasreas y porcentajesdeinhibicina 30 horasen Lactobacilluspentosus. YO inhibicin a cada nivel de concentracin de los tratamientos de 196 3.9 49.6 0.39 I 0.039 I BlancoO
TRATAMIENTOConc.aceite esencial pVml Ajo Ajo+Cebolla (2:l) Ajo+Cebolla (1:l) Ajo+Cebolla (1:2) Cebolla
18.19 27.98
19.2
3
4.6
20.55 21.27 19.82 8.14 21.09 15.61 3 1.62 8.9 19.84 16.26
29.88 33.19 20.54 27.59 8.75 17.59 31 13.50 11.32 8.89 12
11.87
6.86
24.15
ACEITES ESENCIALES DE AJO Y CEBOLLA, EFECTO BACTERIOSTTICO, CARACTE3UZACI6N QuthlrCA ANLISIS SENSORIAL Y
97
Figura 28. Curvas ajustadas de crecimiento deLactobacilluspentosus
L a c t o b a c i l l u s p e n t o s u s en p r e s e n c i a d e aceite esencial de ajo i~
-Poly.
(Blanco)
A
.
I-Poly.
(0.039 m i c r o l i t r o s l m l )
"Poly.
(3.92 microlitros/mI) (49.7m icrolitroslm I)(1 96 m icrolitroslm I)(0.39 microlitroslml)
-Poly.
-Poly.
-Poly.
40
O
30 10
20
T i e m p o en b o r a sLactobscilhrrpentoaus en presencia de aceite esencial & ajo 49.6 p l l h
R2= 0.9847
O
10T"kr
20
30
40
peto oars en presencia deaceite awcial de ajo 3.9 flml
~
p
m
s
s
*BLANCO .
5T
98
ACEITES ESENCIALES DEAJO Y CEBOLLA, EFECTO BACTERIOSTTICO, CARACTERIZACI6NQUhiICA Y ~ L I S I SSENSORIAL
Figura 28. C r a ajustadas de crecimiento deLactobacilluspentosus (continuacin) uvsLactobacillus pentosus en presencia de aceites esenciales de ajo+cebolla (2:l)-Poly.
(0.39(Blanco)
microliroslml)
-Poly.
-Poly.
(0.039Poly. (196
microlitrodml) microlltroshl)
-Poly.
(3.9Poly. (49.7
mkrolitroslml) microlitroslml)
O5 15
10
20 40 2535
30
Tiempo en horas
LuetobaciUuspentmus en presencia de aceites esencides de ajo+cebotla ( 2 1 ) 0.039 pd U
L-aparonrs 5T
M pnseocia de aceites exndaks de ajo+cebolla ( 2 1) 49.6 p h l
y = -0.0004d 0.02152 0.0992%+ 0.038 + R2= 0.991~
eO10
y = -0.0001~~ . 0 0 2 + 0.1695~ o,2895 +0 ~~~
-
R = 0.9827 O 10
20
30
40
MTiempo en horas
30
40
Tiempo en horu
y = -0.0003d+ 0.0156~~. 4 -00% R2= 0.9829
- 0.0471
y = -0.0003$ + 0.01262 + 0.0113~ 0.1398 -
41020
R2= 0.9739O10
30
40
Tiempo en horn
20
30
40
Tkmpoenhoras
LectObeciNus pondDsus en presenciade aceltes l n l esenciales de ajo+cebolla (2:l) 3.S @
Lectobacllhrs pentorut BLANCO
,006~0.0143 1
-
Rz= 0.98051
41o b (O
4
O O10
-
y = -0.0003~~ + 0.0104xf + 0.087~ 0.2081
-
R2= 0.9772i
I
20
30
40
10
20
30
40
Tiempo en horn
Tiempo en horn
ACEkTE6 ESENCIALES DE AJOY CEBOLLA EFECTO BACTERIOSTTICO, CARAcTERIzACI6N QlJMICA Y ANLISIS S E N S O W
99
Figura 28. Curvas ajustadas de crecimiento de Lactobacillmpentosm (continuacin)Lactobacillus pentosus en presencia de (1:l) aceites esenciales de ajo+cebolla
-Poly. -Poly.
Poly. (0.39 microlitrodml)
1j
-Poly.(3.92microlitrodml)
(196 microlitrodml)(0.039 microlitrodml)
-Poly.
(49.7microlitrodml)
-Poly.
(Blanco)
O
30
10
20
40
Tiempo en horas
LacfobaciRwpentdPw en prosenda de aceitesesenciales de ajocCcbolb (1:l) 0.039 pUml5T5-
R 'O 1 0 2 0 3 0
= 0.9748
y = -O.ooOlx'+ 0 . 0 0 6 5 ~ ~ . 0 7 3 6 ~ 0.1668 +0 it2= 0.97655 0
-
4
0
Tiempo m boras
L & a i np &u en p-dn a bc sa s s U de aceites m e l de a]o+cebdh ( 1 9 ) 0.39 pUmi nh n
y = - 0 . W x 3+ 0 . 0 2 2 4 ~ 0.13%~+ 0.2462 ~
-
o o138O10
UO1020
R*= 0.99073040
mTiempo en horas
30
T p ea h o r a mo
Loctobaci&spad~ en prasemcia de aceites esenciales de oio+cebolla (1:l) 3.9 ~ U m l
y =. o
m&+ 0.01I& + o.M)41x R' = O 07491
O O10
20 Tkmpoenborns
30
40
O
10
20T i m po m Mras
30
4 9
ACEITES ESENCIALES DE AJO Y CEBOLLA, EFECTO BACTERIOSTTICO, CARACTERIZACI6NQLh4ICA Y ANhISIS SENSORIAL
Figura 28. Curvas ajustadas de crecimientode Lactobacillus pentosus (continuacin)Lactobacillus pentosus en presencia de aceites esenciales d e a j o y cebolla (1:2)5-Poly. (0.39 micro litroslml)
z4; 3
-Poly. (0.039 micro litoslml)
-Poly.
( 4 9 . 7 micro litroslml) (196 micro litroslm I)
4
-Poly.
es$
8 2-Poly. (Blanco)
1-Poly. (3.92 micro litroslml)
OO
10
20
30
40
T i e m p o en h o r a s
I
Lactobacillus pentosns e n p r e s e n c i a d e a c e i t e s esenciales de ajo y cebolla (1:2) 0.039 pllml d emedio
Lnctobacilluapmtosws en presencia de aceites esenciales de ajo y cebolla 49.7 (1:2) PUml de medio
*y=
!0.246 R = 0.9646 '2030
- 0 . 0 0 0 2 ~ ~0 . 0 0 8 2 ~ ~ . 0 8 3 3 ~ + +0
O 10
y
= -2E-05x' - 0.0035~'+ 0.2714~ O 7763 .2030
10
40
40
Tiempo en horns
Tiampo en horas
L a c t o b a c i l l u s p s en presencia de aceites esenciales de ajo y cebolla (1:2)0.39 w l / d de medio
L.aobacilhu pentoas en p-aa de .eeites esencides de ajoy ceboll. 1% (12) p d medio l de /
-2 2 515
.,
y = O W01x3 + 0.W33x' + 0.1877~. .O5837
R'
= 0.9554O
O O10
10
M
30
40
Tiempo en hornsLactobacillus pentosus en presencia de aceites esenciales de a p y cebolla (1:2) 3.9 Pllml de medio5 T
"2010
30
40
Lactobacillus pentosusBlanco
1' 4
. i 2
/jO
y = O 0004~' 0,01342 + O 08x - O 3127 + R ' = 0.9633
y = -5E-O&
- 0.0048~'+ O 3404x .11081R 2= O 986840
5
10
15
20
25
30
35
O
20
30
Tiempo en horns
Tiempo en horas
Figura 28. Curvas ajustadas de crecimiento de Lactobacillus pentosus (continuacin)Lactobecillus pentosus en presencia de aceite esencial de cebolla6 7S
"Poly. -Poly. -Poly. -Poly. (49.7 -Poly. -Poly.
(3.92 microlitroslml) ( 0 . 0 3 9 m icrolitroslm I
5-1
(1 96 m icrolitroslm I )m icrolitroslm I)
(Blanco)(0.39microlitroslml)
O
10
20 Tiempo en horas
30
40
LactobacilluFpentmus en presencia de aceite 0.039 mVml de medio esencial de cebolla
Ladobacillus penlasug en presmcia de aceite esencial de cebolla49.7 d m 1 de medio
O. 1 4 7 5 ~ .
0.4438 R= 0.9329 '
f I1O
y=-0wOlx3+00088x'+0.057~-000831 R' = O 9437
O
10
20
30
40
io
M
30
40
Tiempo en horn
Tiempo en h o w
LactobacHluspentosus en presencia de aceite esencial de cebolla0.399 r h lde medio Jn5T
Ladobacilluspenhw en presencia de aceite esenaal de cebolla1% N m l de medio
a
3
cO10
y=OWOix3+00051x2+00832x-01914 R2 L. O 9376
+o0408
20
30
40
O
io
MTiempo en horas
30
40
Tiempo enhoras
Ladobacilluspentows Blanco5;
0.2173
R2= 0.9667O1 0
20
3)
40
20
30
40
-1
Tiempo en horas
102
ACEITES ESENCIALES DE AJO Y CEBOLLA,EFECTO BACTERIOSTATICO, CAFL4CTEMZACl6N QUfMlCA Y ANALISIS SENSORIAL
Tabla 20.
Ecuaciones decrecimientode Lactobacillus pentosus,punto terico mximo, rea bajo la curva a horas y porcentaje de inhibicin tomando 30 como referencia la menor rea (ajo a 196 pVml).
..
.
" "
V.3.2. Pseudomonasfragi Tambin para lasPseudomonasfiagi la mxima inhibicin se alcanza conel mayor nivel probadode196pVml. Calculadopartir las a de ecuaciones obtenidas las con
regresiones y con el aceite esencial de ajo al mximo nivel probado como referencia de la mxima inhibicin. El intervalo seleccionado h e de 24 horas ya que a diferencia deL.
pentosus, P.@a@ tiene crecimiento ptimo en la temperatura de 19 "C por lo que llegams rpidamente al punto mximo y por consiguiente a la fase estacionaria en un intervalo ms corto de tiempo. Para el nivel mximo probado, el resultado indica que con cebolla se logra mayor rea, comparndola con o lo es es queigual,menos inhibidora crecimiento del celular el rea respecto ajo. de Aunque debe se sealar cuando que se
combinan los aceites en proporcin 1:l surge el efecto sinrgico en la inhibicin en ste nivel de concentracin. En el nivel de 49.6 y 3.9 pVml no hay diferencias considerables en cuanto a las reas nuevamente esel ajo el que tiene el mayor porcentaje de inhibicin conlo que se puede suponer que no
haydiferenciausarelnivel
de 3.9 a respecto de 49.6 0.39 y 0.039 pVml el
pVml. Finalmente, en el caso de las concentraciones menores de
fenmeno contrario a la inhibicin se presenta con lo que se favorece el desarrollo celular y es posible que ello se deba a la utilizacin de los compuestos presentes en los aceites durante los procesosmetablicos, al compararlosaceitesduranteestefenmeno,la cebolla induce an ms crecimiento que el ajo (Tablas 21 y 22, Figura 29). el
Tabla 21.
Comparacin de reas y porcentajes de inhibicin a 24 horas enPseudomonasJizrgi.
104
ACElTES ESENCIALES DEATO Y CEBOLLA, EFECTO BACTERIOSTTICO, CARACTERIZACI6NQ m C A Y ANLISIS SENSORIAL
Figura 29. Curvas ajustadas de crecimiento de Pseudomonasfragi
7 6 --
P s e u d o m o n a s fragi en presencia de aceite esencial de ajor-Poly. -Poly. -Poly. -Poly. -Poly.
(0.039m icrolitrosllml)(0.39microlitrosllml)(3.9 m icrolitrosllml)
O
5( I
5 " 4"
3
3
H ii 9
3 "
( 4 9 . 6 microlitrosllml) (1 96 m icrolitrosllm I)
2 "1"
O
O
10
20
30
i
-Poly.
(Blanco)
Tlern P O e n h o r a s
0
5
10
15
20
25
30
35
T l e m p o en horas
Pseudomonas tragt en presencla de aceite esencial de ajo 0.39 pllml7 T
Pseudomones
m en presencia de aceite esencial idb ajo 188 plhnl
'T
10
20
30
Ti.mpo .nuor..
Pseudomonas tragi en presencla de aceite eSenCial de ajo 3.9 pllml67
Psaudomonas tragi Blanco
*l
y = 4 O O O d + O 02072- O 0 2 4 6 ~ O 0412 R' = O 98730
-
y
= -0.0004x' 1 O 0155x'+ O 0545x - O 0478R ' = 0.9701
10
20Tlompo en home
"I " "
..
..
""
"
L
.
. "." . ." l
"
-..
Figura 29.
Curvas ajustadas de crecimiento de Pseudomonas fragi (continuacin)P s e u d o m o n a s tragi en presencia de aceltes esenciales de ajo-+cebolla ( 2 : l )
7
7
O
5
io
15
30 20
25
35
TIem p o o n h o r a s
Pseudomon8s fragi en P n s e n c h de acelte esenchl de ajo 0.039 pNml
PSWdOmOn8S fragi en presencla de aceite esencial de ajo+cebolla( M )4S.S pllml
Y = -0 0006~+ O 023% f O 0046~. 1234 O R 2 = 0.9622
,O
~/#10
~=-O0003~+0.0i23x+0.07115x-oi508 !?=O974 20
30
nempo m Horas
Pssudomona8 h
g / en presencia de aceite esencial de rp+ceboUa (2:l) 196 pUml
T
i 41y = -0 0005~+ O 02079 + O 005h O 0447 R2 = O 9876
E 4 1
-
0.0089
Pseudomonas fngi en presench de .celta esencial de ajo+cebolla( 2 1 ) 3.9 pllml
Pseudomonas f n g i Blanco
e
6T54
eTI35
4
y=-O.OOO4r+OOi7lr+I10$47r.00157R1
O
0059
O
o O10
20Tiempo en horas
30
106
ACEITES ESENCIALES DEAJO Y CEBOLLA, EFECTO BACTERIOSTTICO, CARACTERIzACI6NQUhICA Y ANALISIS SENSORIAL
Figura 29. Curvas ajustadas de crecimiento de Pseudomonasfrugi (continuacin)P s e u d o m o n a s fragi en presencia de aceite e s e n c i a l de ajo+cebolla ( 1 : l )
I
"Poly
(O 038 m ~ c r o I ~ t r o s l 1I) m (O 3 9 microlltrorilml)
-Poly
-Poly(3.9
m~crolitrorllmI)
-Poly.
( 4 9 6 m icrolitrosllmi)
-Poly
(196 mrcrolitrosllml)
-Poly30
(Blanco)
O
5
10
15
20
25
35
Tlem po e n horas
pseudomonas mgl en presencia de aeelta esencialde ajo+ceboAa (1:l) 0.039 pllmi
Pseudomonas h g l en praranch de acelte esenclal da ajo+CebOll8 (1:l) 49.6 pllml
e5
--
y = -0.0008x3 + O 0 2 4 ~O~0 0 8 9 ~ . OB05 O R' = O 9925
-
y * 4.00032+ O 012 + O 1157x - 0 2074 R' = O 9514
O
10
20
30
O
51 5
1 0
20T i p o en hon.
25
30
35
,
Tiempo en horas
I
Pseudotmnes f @ en p m i a de aceite s e n c i a l n e de ap+cebolla (1:l) 0.39 PUml65 --
plsudomne8 fmgi en presencis de aceite esencial de ajo+cebollp (1:l) 196 rJhnl57
.'
. I
y = - o c m & + O . d + O . ~ . .0.1724
y = -o
wmx' + 0.m332- 0.0258x - 0.0535R2=OS91i
R' = O.gs38I
O
10
20
30
O
5
1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5Tkmpo an H r s od
Tiempo enhoras
1I
Pseudomonas h g l e n pnsancia da acelte esencbl de
P s e u d o m o n a s fragl Blanco
a)o+cebolla (1:l) 3.9 pllml'T
6 T
y = -0.0006x3 + 0.0256~' 0 . 0 4 5 2 ~ 0.0681 . R' = 0.9688
-
y = -0 0 0 0 4 ~ + O 0 1 5 4 ~ O 0 5 6 2 - O ' +~ R ' = O 9777
0561
O
5
10
15
20
25
30
35
ACEITES ESENCIALES DEAJO Y CEBOLLA, EFECTO BACTERIOSTATICO,CARACTERJZ~CI~N QUhICAANLISIS SENSORIAL Y
107
Figura 29. C r a de crecimiento de uvs Pseudomonasfragi (continuacin)Pseudomonas fragi en presencia de aceites esenciales de ajo+cebolla (1:2)7 7
-Poly
(0.39 mrcrolitrosllml)
"-Polyt .
(O 0 3 9 m ~ c r o l i r r o r l l r n l
I
1
-Poly
(3 9 m Icrolltroallrn I)
-Poly
(49
E
rncroltrosllrnl)
-Poly
(196 mIcrolltrosllrnI)
-PolyO15
(Blanco)
5
10
20
25
30
35
Tlem
PO
en horas
PSeUdOmon8S ?rag/
en prerencla de acelte eaenclal de ajoccebolla (1:2) 0.034 pllml
Pseudomonas fragl en preseneh de .celta esanclal de ajo+cebolla (1:Z) 49.6 pllml
-
y~00005x'+001951?+0Dd2lx-01488 R' = 0.9767
O O510
i
15
20
25
30
35
Tiempo m h n e .
Pseudomonas fragl en prosoncia de rcelt. esencial da aio+cebolla (f:2) 0.39 MUml7 T
y
= -0 0 0 0 4 ~ ' 0 . 0 1 7 8 ~ ~ . 0 5 2 7 ~ O 1284 0 U= OS884 'f f
O
5
10
15
20
25
30
35
Tiempo an horas
5. liOO
f :f.10
a
7-
20 T l m m en horas
30
O
ACEITES ESENCIALES DE AJO Y C E B O L ~ EFECTO BACTERIOSTATICO,
CARACTERIZACI~N QWCA Y ANLISIS SENSORIAL
Figura 29. Curvas ajustadas de crecimiento de Pseudomonasfrugi (continuacin)Pseudomonas fragi en presencia de aceite esencial de cebolla
-Poly.
(0.039 rnlcrolitrosUml)
-Poly.
(3 9 rnlcrolltrosllrnl)
1
1-Poly -Poly
Poly. (49 6 microlitrosllrnl)
(196 rnlcrolltrosUrnI)
(Blanco)
O
5
10
15
20
25
30
35
Tiempo en horas
Pseudomonas fmgl en pnsench de aceita esencial de cebolla 0.039 pllml65 7
Pseudomonas fragl an presanola da aceite *rrnclal de cebolla 49.6 fillml
1:3'1
e
5
r2025
~=-OO004x~r00158x'+O.iilix-02037 R 2= 0.97430 ~
O
I
I
O
5
10
15
20
25
30
35
O
5
10
I5
30
35
TImpo m horas
Ti.rnP0 .nuor..
I
Pseudomonas fmgl en presencie de aceite esenclal de cebolla 0.39 pUml
Pseudomonaa h g l en presencla de aceite esenclal de cebollm la6 pllml
7T
'T
y=-O0003x'+0.0124~+OO.1l67x-O2542 = O 0862
I?'
y~-0.0003x1*0.0i~'+0.1191)x-02106 R=. o 9751
io
20
30
Pseudomonas fngi en prasench de aceite esenclal de cebolla 3.9 pllml
Pseudomonas fmgl Blanco
7 T
Tabla 22.
Ecuacionesdecadacurvadecrecimientode Pseudomonasfragi, punto 24 terico mximo, rea bajo la curva a horas y porcentaje de inhibicin tomando como referencia el nmero menor (ajo a 196 pVml).
Koningsberg(1992)indicqueuninhibidor
es una molculaqueinterviene
directamente sobre alguna parte de cadena oxidativa mitocondnalen dos mecanismos, la el primero; puede ser unindose a alguna subunidad especfica O al@ grupo prosttico, el segundo puede ser compitiendo con los donadores y aceptores naturales por 10s sitios especficos de oxido-reduccin. Para el caso especfico de las sustancias encontradas en 10s aceites esenciales es imposible determinar cual o cuales son las que tienen el mayor efecto en los mecanismos propuestos, aunque se atribuye a la alicina su mhximo efecto (Feldberg y col. 1988), pero si es un hecho que los resultados indmn que con el aceite esencial de ajo se logra mayor inhibicin del crecimiento celular y como consecuencia una disminucin en los sistemas metablicos celulares y enzimticos recopilados en la
un Tabla 6 de la presente tesis, aunque hay bacterias resistentes segn reporte de Kyung ycol. (1996). Hay varios mecanismos de accin de los compuestos azufrados de ajos
y
cebollas que incluyen entre otros, la alteracin de los puentes disulfuro en protenas, la modificacin del potencial redox en la cadena del flujo de electrones, alteracin