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FUNDAMENTOS DE LA FUNDAMENTOS DE LA TÉCNICA PCRTÉCNICA PCR

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PCR ¿Qué es?

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

Técnica que nos permite amplificar selectivamente un segmento específico de DNA, hasta obtener una

cantidad suficiente para su posterior manipulación

FORMA DE CLONACIÓN “ IN VITRO”

FOTOCOPIADORA MOLECULAR

PCR ¿Qué es?

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

Técnica que nos permite amplificar selectivamente un segmento específico de DNA, hasta obtener una

cantidad suficiente para su posterior manipulación

FORMA DE CLONACIÓN “ IN VITRO”

FOTOCOPIADORA MOLECULAR

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¿Cuáles son los fundamentos?

EXTENSIÓN DEL CEBADOR: La DNA polimerasa realiza la extensión del primer utilizando la cadena complementaria como molde

DNA Polimerasa

3’ 5’

dNTPs dTTPdATPdGTPdCTP

+ Mg ++

5’ 3’

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EXTENSION DEL CEBADOR

DNA Polimerasa

3’ 5’

DNA polimerasa

5’ 3’

Utilizando dos cebadores que son complementarios a los extremos 3’ del fragmento de DNA de doble cadena que queremos amplificar

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¿Qué necesitamos?

DNA molde

Tampón de la reacción(tris,BSA, K…) Nucleotidos

(dNTPs, A, C, G y T)

Cebadores

DNA polimerasa

Mg++

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. Primer express•PrimerGen searches strings of amino acid residues in order to reverse-translate oligonucletide primers of a desired range of lengths and maximum number of degeneracies. •Primer (Stanford) Sun Sparcstations only •Primer (Whitehead) Unix, Vms (and DOS and Mac if you can compile it) •Amplify, Bill Engels (Macintosh only), is for use in designing, analyzing, and simulating experiments involving the polymerase chainreaction (PCR). You can obtain your copy of Amplify here•PrimerDesign 1.04, a DOS-program to choose primer for PCR or oligonucleotide probes. See also the PrimerDesign Welcome Page. •PC-Rare, a new software by R. Griffais, which uses a rare octamer at the 3' termini of the primer. This powerful (but user friendly) software is available for Macintosh and Windows environment. •Primer Design, a Java applet by Luca Ida Giovanni TOLDO. •CODEHOP, PCR primers designed from protein multiple sequence alignments (Local mirror site at WIS). •Primer3, an online service to pick PCR primers from nucleotide sequence. (Local mirror site at WIS). .NetPrimer (PREMIER Biosoft International). NetPrimer combines the latest primer design

algorithms with a web-based interface allowing the user to analyze primers over the internet

Programas de ordenadorELECCIÓN DE PRIMERS

Evitar G y C en el extremo 3’

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DNA polimerasas

Termoestables: Tª óptima de actuación de 72-74ºC- Taq DNA polimerasa- Tth polimerasa

Termolábiles: Tª óptima de actuación de 42ºC- DNA polimerasa I de E. Coli- Fragmento Klenow de DNA polimerasa- T4 DNA polimerasa

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Taq DNA Polimerasa es la polimerasa de elección

(no tienen actividad 3’-5’ exonucleásica)

PARA AUMENTAR LA FIDELIDAD

No aumentar mucho los ciclos

No añadir cantidades excesivas de Cl2Mg

Disminuir el tiempo de cada ciclo

Igual cantidad para los cuatro dNTPs y en la

mínima concentración posible

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Buffer de la reacción

La composición puede ser distinta según las casa comerciales.

- ClK- Tris-ClH- Gelatina- DMSO- Detergentes: tritón...- BSA- PEG

Cloruro de Magnesio (MgCl2)

Su concentración resulta fundamental para la optimización de la reacción

Contribuye a aumentar la temperatura de hibridación

[Mg] disminuyen la especificidad

[Mg] aumentan la especificidad

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COMPONENTE VOLUMEN CONCENTRACION FINAL

H2O esteril 20,7μL

Buffer PCR 10x 2,5μL 1X

dNTPs mix 0.2μL 200μM (cada uno)(25mM de cada uno)

Primer mix 0,4μL 0,4μM (cada primer)(25 pmoles/μL de cada primer)

Taq DNA polimerasa 0,2μL 1U/25μL

DNA (100ng/μL) 1,0 μL 100ng/25μL

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“n CICLOS”: ciclo 4

“n CICLOS”: ciclo 5

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Después de:- 2 ciclos tenemos 2 x 2 - 3 ciclos - 2 x 2 x 2 - 4 ciclos 2 x 2 x 2 x 2 Así, después de ciclos de N ciclos tendremos 2N.

La cantidad de DNA dobla teóricamente con cada ciclo de PCR, Después de cada ciclo, la cantidad de DNA es dos veces la del ciclo

anterior.

Pero la reacción no puede mantenerse indefinidamente, se alcanza una fase de meseta, según lo demostrado en las cifras que aparecen en rojo.

No se puede detectar la amplificación hasta el ciclo 25

Se observa una fase lineal a partir del 25

Al final existe una fase de meseta que se representa en rojo

REPRESENTACIÓN GRÁFICA DE LA AMPLIFICACIÓN POR PCR

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Si representamos los valores en una escala logarítmica, podemos ver las diferencias en ciclos anteriores.

Esto es porque la amplificación de PCR es una reacción exponencial.

Existe una relación directa entre el número de copias (cantidad de DNA) y el ciclo de amplificación

PCR en movimiento............

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1. RNA- PCR2. PCR con primers degenerados3. PCR “hot start”4. PCR touchdown5. RAPD PCR6. PCR en tiempo real

V. ALGUNOS TIPOS DE REACCIÓN PCR

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PCR “Hot start”

Produce generalmente productos más específicos

- Se someten los tubos a Tª de desnaturalización.- Se colocan en el tubo todos los componentes de la reacción a excepción de la Taq DNA polimerasa.- En ese momento se añade la polimerasa.- Se consigue que los primers no puedan unirse de forma inespecífica cuando se pasa por Tª bajas.

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Touchdown PCR

- Se basa en la utilización de una Tª de hibridación decreciente 1ºC en cada ciclo hasta alcanzar una Tª que se mantiene los últimos ciclos (10 ciclos)

RAPD PCR

(Rapid amplification polymorphism DNA)

-Se utilizan primers diseñados al azar.-Se obtienen patrones de bandas , que pueden ser utilizados por ejemplo para la diferenciación de especies.

RAPD-PCRPatés

C/C/PtPt PtPt O O PvPv PllPll C C PtPt

PCR en tiempo real

- Se llama así porque se detecta el progreso de la reacción de PCR tal y como va transcurriendo. Los

datos se van recogiendo a lo largo de todo el proceso y no solamente al final de la reacción (tal y como

ocurriría en una PCR estándar)

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1º.- Excitación de las 96 muestras de la placa mediante una lámpara halógena de tungsteno

2º.- La fluorescencia emitida es captada por unos filtros ópticos, cada uno de ellos capta de forma óptima determinados colorantes fluorescentes (SYBR Green, FAM, VIC, TAMRA, ROX...).

3º.- La emisión de fluorescencia se está midiendo de forma continua en cada momento de la reacción

PCR EN TIEMPO REAL PCR CUANTITATIVO

(Versus )

PCR punto final

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Dos estrategias de marcaje

SONDAS TaqManSYBR green

SONDAS TaqMan

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Polimerización

Desplazamiento de la cadena

Rotura de la sonda y separación del Reporter

SYBR GREEN

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AMPLIFICACIÓN EN TIEMPO REAL

[Transforma el ¿CUÁNTO? en ¿CUANDO?]

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En la primera fase , el crecimiento es geométrico. No hay ningún componente limitando y por tanto la cuantificación será más precisa.

Amplificación de un gen a partir de DNA genómico. 36 réplicas conteniendo 5000 o 10000 copias

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PCR a tiempo real Punto final

-Si se realiza una PCR estándar (punto final). La conclusión sería que existe una cantidad muy distinta entre muestras.- Si se realiza un real time PCR se ve que la concentración es la misma porque todas las muestra empiezan en el mismo ciclo.

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PCR Tiempo Real

- Cuantificación

Absoluta: Nº de copias de un virus, de un gen

Relativa: comparación de un tejido normal frente a otro tumoral

- Detección

Ensayo +/-: presencia o ausencia

Discriminación alélica (SNPs): análisis de mutaciones

DIVERSAS APLICACIONES

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PCR aplicada a la identificación genética

1% 5% 10% 25% 50% 75% 100%

PCR aplicada a la seguridad alimentaria

1.- Amplificación de fragmentos específicos de especie

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2.- Identificación genética mediante marcadores genéticos

Establecimiento de un sistema de trazabilidad (rastreabilidad) desde el animal vivo hasta sus partes en la carnicería

3.- Detección de patógenos en alimentos

Salmonella , Listeria , Toxoplasma, Campilobacter, E.coli O157 son los agentes màs frecuentes en las infecciones causadas por alimentos

Creación de plantas transgénicas

Detección de transgénicos en una mezcla con una sensibilidad 0,1%

Aplicación a la verificación de etiquetas, seguimiento y detección de fraudes

Mediante técnica PCR

4.- Alimentos transgénicos

Detección maíz trangénico

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