Fundamentos de Dot Blot

Utilizacin de Sondas ASO

Dra. Silvina Alvarez Dra. Silvia Varas

qbpatologica.unsl@gmail.com

Para que se usa?

Deteccin de Mutaciones puntuales (que no afectan sitios de cortes de una Enzima de

restriccin)

Equipo de DOT BLOT

Armado:

1. Tapa inferior

2. Membrana selladora de silicona

3. Papel de Filtro Whatman 3 MM

4. Membrana de Nitrocelulosa

5. Tapa superior con 96 well y reservorio de buffer

6. Ajuste de los tornillos

1

2

5

3

4

-Volumen Total PCR: 100 l

Para sembrar un punto del dot blot:

Producto de PCR: 10 l

EDTA 100 mM 50 l

NaOH 2N 40 l

Agua 100 l

Teniendo en cuenta cuntos sondas vamos a probar y cuntas muestras se van a analizar, hacer los clculos necesarios para TODOS los dot blots, multiplicando los volmenes anteriores por el nmero de sondas + 1. En este ejemplo, se usaron 7 sondas

x 8.

Producto de PCR: 80 l

EDTA 100 mM 400 l

NaOH 2N 320 l

Agua 800 l

X 8

1- Tomar tantos tubos eppendorf grandes como muestras.

7

2- Preparar las mezclas calculadas antes muestras listas para transferir a membranas.

Se utilizan membranas

de NITROCELULOSA

Cortar un rectngulo de 12 x 8 cmtrabajando siempre con guantes.

Hidratar 30 minutos con agua destilada y luego equilibrar durante 5 minutos en buffer SSPE 20X, pH 7,4.

HYBRI-DOT MANIFOLD, BRL (Gibco)

+

membrana

Colocar la plancha inferior del aparato, conectar a la bomba de vaco. Identificar un extremo de la membrana con un corte.

Utilizando guantes, colocar la membrana sobre la plancha inferior.

Colocar la plancha superior y ajustar perfectamente los tornillos en forma enfrentada. Encender la bomba de vaco y verificar que sta elimina el lquido remanente del lavado de la membrana.

En cada punto de siembra colocar sucesivamente 200 ml de dilucin de cada producto de amplificacin y 200 ml de SSPE 20X

Finalizada la siembra, y luego que la bomba elimin todo el lquido, colocar la membrana entre dos papeles Whatman y sellarlos con una cinta. Secar durante una hora a 80 C en estufa (o por cross linker)

1 2 3 4 5 6 7 8

Recordar: la mayora de las talasemias se producen por mutaciones puntuales, es decir CAMBIO EN UNA SOLA DE LAS BASES EN LA HEBRA DE ADN.

Por ejemplo, en la mutacin 39. En la cadena de ADN normalmente encontramos:

Mientras que cuando se presenta la mutacin 39:

Y la nica forma de identificar esas mutaciones es reconocindola con una sonda que se una especficamente a la zona mutada.

Sondas a utilizar para las 4 mutaciones ms frecuentes para -talasemias:

5 GCA GGT TGG TAT CAA 3N-1-6

5 GCA GAT TGG TAT CAA 3

5 GCA GGT TGG CAT CAA 3

M-1

M 6

5CTG CCT ATT GGT CTA 3N-110

5 TTG GAC CTA GAG GTT 3M-39

5 TTG GAC CCA GAG GTT 3N-39

5 CTG CCT ATT AGT CTA 3M-110

El marcado se puede realizar:

con radiactivo

con mtodos no radiactivos.

En el primer caso, se marca la sonda con P32. Hay dos mtodos para hacerlo:

1. en uno de ellos, la sonda queda marcada en varios sitios a lo largo de la misma, para ello se utiliza el fragmento Klenow de la DNA polimerasa. ---------------------* * * * *

2. en el segundo, slo se marca el extremo de la sonda y para ello se usa una kinasa. ------------------

El primer mtodo, para ello se colocan 250 ng de ADN de la sonda en un tubo Eppendorf (contenido en 20 l) y luego, trabajando detrs de una pantalla de acrlico y con doble guante, se adiciona 2 l de cada dNTP, el dNTP marcado (32P- dATP), random primers y la enzima Klenow. Se incuba dos horas a 25 C y luego se detiene la reaccin. La sonda marcada se purifica por columnas de Sephadex y se mide la actividad en un contador.

*

En el caso de mtodos no radiactivos, suelen comprarse las sondas ya marcadas, generalmente con una molcula de BIOTINA incorporada en uno de sus extremos.

De esta forma ya tenemos el ADN fijado a la membrana y las sondas marcadas. Podemos comenzar con las hibridaciones.

Con el objeto de poder analizar cada muestra con cada una de las sondas, se debe cortar la membrana en tantas tiras como sondas haya.

RECORDAR QUE TODO ESTO SE DEBE REALIZAR CON GUANTES PARA NO CONTAMINAR LAS MUESTRAS

Se deben colocar cada una de las tiras de la membrana en recipientes individuales, donde se van adicionando las distintas soluciones.

Se adiciona a las membranas el medio de pre hibridacin que contiene SDS y DNA de esperma de salmn previamente desnaturalizado en bao de agua hirviendo durante cinco minutos. Esto es para BLOQUEAR la membrana, es decir, para evitar las reacciones inespecficas.

Se tapan los recipientes para evitar evaporacin, y se los incuba con agitacin, durante dos horas a 37 C.

Para evitar confusiones, rotular cada recipiente con el nombre correspondiente a la sonda que se va a utilizar en l.

Se agrega a cada cubeta la dilucin de la respectiva sonda (normal y mutada, obviamente en distintas cubetas), se vuelve a cubrir y se lleva a una estufa de 37C, donde se incuba por lo menos durante 8 horas con agitacin.

Generalmente, cuando se trabaja con sondas radiactivas se prefiere hacer esto en bolsitas de nylon selladas con calor, esto evita contaminar con radiacin distintos recipientes y/o por salpicaduras y permite usar menos volumen de sondas.

Se van realizando los siguientes lavados en la misma cubeta:

1- Con SSPE 5X, SDS 0.1%, a temperatura ambiente.

2- Con SSPE 5X, SDS 0.1%, a temperatura ambiente.

3- Con SSPE 2X, SDS 0.1%, a 40 C.

3- Con SSPE 2X, SDS 0.1%, a 40 C

Naturalmente, este paso vara segn que tipo de sondas usamos, radiactivas o no radiactivas.

En caso de usar sondas radiactivas, es sencillo.

Se secan las membranas, se las coloca una al lado de otra sobre un papel de filtro y se las envuelve con nylon o bien se colocan dentro de una bolsa sellada. Se identifica uno de los extremos del papel de filtro con un corte.

Se coloca dentro del cassette de exposicin y DENTRO DEL CUARTO OSCURO, se abre la caja de placas radiogrficas, se corta una del mismo tamao que el papel de filtro y se la identifica con un corte en la esquina, coincidente con el del papel. Se pone la placa sobre las membranas y se cierra perfectamente el cassette.

Se realiza la exposicin de la autorradiografa durante toda la noche a 70 C (en caso de que el radiactivo ya est algo decado, dejar exponiendo ms tiempo).

Se revela como cualquier radiografa, en el cuarto oscuro, colocando la placa primero en solucin reveladora y posteriormente, en fijador.

En caso de haber usado sondas biotiniladas:

Hasta ahora tenemos la sonda biotinilada pegada al ADN, lo que esquemticamente sera:

MOLECULA

DE BIOTINASONDA

ADN del DOT

Luego, se le adiciona un complejo formado por Avidina (que se une a Biotina) y una enzima a su vez biotinilada, que puede ser una Peroxidasa.

SONDA

AVIDINA

COMPLEJO

ENZIMA

BIOTINILADA

BIOTINA

ADN del DOT

Y por ltimo el sustrato de la enzima, que generalmente dar una reaccin colorimtrica.

Tambin se puede utilizar un sustrato que genere una reaccin quimioluminiscente, en ese caso se debe proceder de igual manera que para revelar sondas radiactivas.

COLOR

Una vez que tenemos los dot blot revelados, identificamos cada una de las muestras sembradas y observamos el resultado correspondiente a cada sonda.

1 2 3 4 5 6 7 8

7: control negativo de la PCR

8: control negativo de hibridacin (gen de tiroglobulina)

1: portador de la mutacin 1 1

2: portador de la mutacin 1 1

3: portador de la mutacin 1 - 110

4: portador de la mutacin 39

5: portador de la mutacin 39

6: normal

Modelo de Informe Anlisis de Mutaciones en el gen de

- globina.

Metodologa: Amplificacin por PCR a partir de ADN purificado de leucocitos. Hibridizacin con sondas alelo especificas

PACIENTE MUTACIONES ANALIZADAS

Codn 39 (C-T) IVS-I-1 (G-A) IVS-I-6 (T-C) IVS-I-110 (G-A)

Inocente Gmez -/- -/- -/- -/-

Culpable Gmez -/- -/- -/- -/+

Interpretacin de los Resultados: +/-: Heterocigota para la mutacin

-/-: No presenta la mutacin

+/+: Homocigota para la mutacin

Preguntas?