Francisco A.P. CamposDepartamento de Bioquímica e Biologia Molecular,

Universidade Federal do Ceará

REGENERAÇÃO DO FEIJÃO-DE-CORDA

VIA EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA: PROGRESSOS E PROBLEMAS

Via de Regeneração

Explante Regulador de Crescimento

Freqüência de

Regeneração

Referência

Organogênese direta Folhas primárias 2,4,5-T Baixa Muthukumat et al. 1995) Organogênese direta Cotilédones e eixo

embrionários de sementes imaturas

Citocininas (BA, CIN, Zeatina

Baixa Pelegrineschi (1997

Organogênese direta Embriões imaturos BA Alta Choi et al. (2003) Organogênese direta Nó cotiledonar TDZ Baixa Van Lê et al. (2002) Organogênese direta Nó cotiledonar BA Baixa Brar et al. (1999) Organogênese indireta Cotilédones de sementes

imaturas BA e Cinetina Baixa Anand et al (2001)

Organogênese direta Eixo embrionário de sementes maduras

BA Baixa Popelka et al. (2006)

Embriogênese somática indireta

Folhas primárias 2,4-D Baixa Kulothungan (1995)

Embriogênese somática indireta

Protoplastos de cotilédones imaturos

2,4-D, NAA e BA Baixa Li et al. (1995)

Embriogênese somática indireta

Folhas primárias 2,4-D Baixa Anand et al. (2000)

Embriogênese somática indireta

Folhas primárias 2,4-D Ramakrhishnan et al. (2006)

Estabelecimento de um sistema de cultura in vitro para o feijão-de-corda (Popelka et al. Plant Cell Rep (2006) 25: 304–312). A Variação fenotípica em sementes de feijão-de-corda; B Explante cotiledonar de uma semente madura Após remoção dos ápices radicular e caulinar; C Formação de calos não embriogênicos em meio contendo picloram; D Inibição do crescimento dos ápices caulinares pela putrescina; E Efeito do TDZ na morfologia de partes aéreas; F Indução da formação de múltiplas partes aéreas em meio de cultura contendo BA; G Plantas enxertadas in vitro através do uso de anel de silicone: H-I Plantas aclimatadas

Regeneração de plantas de feijão-de-corda a partir de embriões somáticos induzidos em suspensões celulares (Ramakrishnan et al. Plant Cell Rep 2005, 24: 449–461)

0,0

0,5

0,1

0,0

2,5 37,57,50,50,12,4-D

mg/LKinmg/L

Efeitos de 2,4-D e cinetina na indução de calos embriogênicos friáveis a partir de eixos embrionários do feijão-de-corda.

Suspensão celular embriogênica do feijão-de-corda

Análise histológica da histo-diferenciação de embriões somáticos no feijão-de-corda (A e B) e na cenoura (C e D)

A

B

A B C

D

Análise histológica da embriogênese zigótica no feijão-de-corda. Embriões com 1 (A), 2 (B), 4 (C) e 5 (D) dias após a antese.

Análise histológica da indução de embriogênese somática em folhas primárias do feijão-de-corda. 1. Controle; 2. Explante foliar após 24 horas de incubação em meio de indução(sais MS, vitaminas B5, 3% sacarose, 150 mg/L hidrolisado de caseína, 100 mg/L L-Glutamina e 1,5 mg/L de 2,4-D); 3. Detalhe da região em volta do feixe vascular. Legendas: ead - epiderme adaxial; eab – epiderme abaxial; pp – parênquima paliçadiço; pe – parênquima esponjoso; f – floema; x – xilema.

Análise histológica da indução de embriogênese somática em folhas primárias do feijão-de-corda. 1 e 2. Explantes foliar após 3 dias de incubação em meio de indução; 3. Explante após 3 dias de incubação em meio de indução; 4 e 5. Detalhe das massas celulares formadas em volta dos feixes vasculares mostrados em 3.

1

2

Análise histológica da indução de embriogênese somática em folhas primárias do feijão-de-corda. 1. Explantes foliares após 15 dias de incubação em meio de indução; 2. Detalhe das massas pro-embriogênicas presentes em suspensões celulares.

Expressão do gene uidA em massas pro-embriogênicas do feijão-de-corda

Mapa de referência bi-dimensional das proteínas de suspensões celulares embriogênicas do feijão-de-corda

Spot name

Best matching TaxonomyAccess number

Mowse score

Number of

matched peptides

% Sequence coverage

MW/pI of the best match

MW/pI

MWM1. Chain B, Complex Porcine Pancreatic TrypsinSOYBEAN TRYPSIN Inhibitor, Orthorhombic Crystal Form

Glycine max 1AVW_B 69 6 49% 18.9/4.87 20.1

SC1 1. Class 1 Chitinase Vigna unguiculata AAG233965 80 6 25% 32.6/5.7 31.6/5.4SC2 1. Pathogenesis related protein Vigna unguiculata T11670 78 6 44% 16.3/4.7 15.6/4.8SC3 1. putative FPP syntase Taraxacum japonicum BAB20822 27 3 27% 15.8/6.58 47.1/5.5SC4 1. NADH ubiquinone oxidoreductase subunit 5 Zea mays AAA31953 35 5 36% 20.5/8.78 27.3/5.6SC5 1. vicilin Theobroma mammosum AAF13464 27 5 33% 26.8/7.16 20.1/5.9

SC61. RUBISCO small subunit 1/4 chloroplat 2. Phosphoenolpyruvate carboxylase housekeeping isozyme

Frutillaria agrestis Phaseolus vulgaris

O24634 AAL26863

42 24

6 6

46% 28%

19.6/8.7 44.4/7.9

17.2/6.2

SC7 1. AGAMOUS-like MADS-box transcription factor Ginko biloba AAM76208 32 5 40% 25.3/8.9 15.7/6.7SC8 1. putative AdoMet syntase 3 Hordeum vulgare s.vulgare CAJ01704 39 6 22% 42.7/5.5 14.7/6.1

SC91. RUBISCO small subunit 2. KAP-2

Pyrus pyrifolia var. culta Phaseolus vulgaris

BAA00450 AAL87544

36 29

5 9

36% 20%

20.5/9.04 77.28/5.7

14.4/5.4

SC10 1. photosystem 2 subunit H Heteroscyphus balneti AAP39896 40 3 54% 3.48/8.15 11.4/4.1

SC11 1. TnpD Hordeum vulgare AAM45961 32 4 62% 10.37/8.89 23.2/6.6SC12 1. MAP kinase phosphatase Lycopersicon esculentum AAK29384 61 9 59% 19.79/6.31 66.1/4.9

SC131. phosphoenolpyruvate carboxylase 2. endochitinase 1A 3. endochitinase 1B

Flaveria pringlei Arachis hypogea Arachis hypogea

CAA96509 Q06012 Q06013

33 30 30

4 3 3

58% 82% 82%

10.25/4.4 4.69/7.98 4.66/7.98

31.6/5.2

SC141. formate-tetrahydrofolate ligase 2. ribosomal protein L23

Lithospermum erithrohizon Vigna angularis

BAA77217 AAN04892

46 31

7 4

52% 54%26.01/8.99 10.9/11.04

24.0/4.5

Resultados obtidos por Peptide Mass Fingerprinting dos “spots” selecionados do gel 2D Suspensões Celulares Embriogênicas.

Espectros de massas dos peptídeos trípticos de SC1

Espectros de massas dos peptídeos trípticos de SC2

(B)

2 6 8 10 12 14 16

2 6 8 10 12 14 16Dias após a antese

14,4

20,1

30436794MW

(D)

c ec e

14,4

20,1

3043

6794MW r c fr c f

(C)14,4

20,1

30436794

MW

Detecção em suspensões celulares embriogênicas e diferentes tecidos do feijão-de-corda de proteínas que reagem com anticorpos preparados contra o peptídeo sintético HSKGDAPPNEDELK, derivado da sequência de aminoácidos predita para a PR-10 de feijão-de-corda.

EZM SCEZM SC

14,4

20,1

3043

67

94MW

(A)

66

29

2420

14

4 7

74 7pHMW

14,4

20,1

30

43

67

4pHMW

14,4

20,1

30

43

67

É possível demonstrar a expressão dos genes que codificam para a PR-10 e para a quitinase que foram identificadas em suspensões celulares embriogênicas do feijão-de-corda?

PR-10-F CAT ATG GCC GTT TTC ACA TTC GAGPR-10-R GGA TCC TCA AGC ATT GGC CAA AAG GTAQUI-F CAT ATG GCA GTG TGG AAG CCA AGC GQUI-R GGA TCC TCA GAC GAT GGG ATG GAG ATT AA

Análise da expressão em suspensões celulares embriogênicas de feijão-de-corda, dos genes que codificam para as proteínas PR-10 (A) e quitinase (B) por RT-PCR.

PR-10 QUI ACT

Seqüência de nucleotídeos de um cDNA que codifica a PR-10 que é acumulada em suspensões celulares embriogênicas do feijão-de-corda.

PERSPECTIVAS FUTURAS