FRACCIONAMIENTO CELULAR

Fraccionamiento Celular:Es un conjunto de métodos y técnicas que tienen como objetivo obtener fracciones puras o enriquecidas en un determinado componente celular, ya sea éste un orgánulo, una fracción de membrana, complejos multiproteicos u otros.

Todo proceso de fraccionamiento celular tiene dos etapas:

1. Rotura de las células o tejidos para obtener un lisado celular (o tisular) en el que la fracción deseada se encuentre en condiciones adecuadas para su purificación.

2. Separación de la fracción deseada del resto de componentes de la célula o del tejido mediante algún criterio como puede ser una diferencia de densidad (centrifugación en gradientes o centrifugación diferencial), la presencia de algún antígeno (cromatografía de inmunoafinidad, inmunoprecipitación).

Técnicas de rotura de células y tejidos:El primer paso en la purificación de la mayoría de las proteínas y estructuras subcelulares es la rotura de los tejidos o de las células para obtener un lisado celular en el que la proteína, el complejo multiproteico o la estructura subcelular se encuentre en condiciones que permitan su aislamiento. Esto se consigue empleando procedimientos mecánicos suaves conocidos generalmente como homogenización. Estos métodos producen la rotura de las membranas celulares, suavemente, con lo que se libera el contenido celular.

Los procedimientos de homogenización más comunes son: Sonicación: Consiste en la aplicación de ultrasonidos a una suspensión celular.

La intensa agitación producida destruye las membranas celulares. Dependiendo de la frecuencia, intensidad y energía aplicada se pueden destruir asimismo las estructuras subcelulares e incluso solubilizar complejos proteicos. Se suele aplicar en frío para evitar el sobrecalentamiento de las muestras que podría provocar la desnaturalización de las proteínas.

Uso de detergentes que solubilicen las membranas celulares. Pasar las células a través de orificios de diámetros reducidos que provocan la

rotura de las membranas celulares. Homogenizadores: Se trata de romper las células con la ayuda de un émbolo

rotatorio que se ajusta perfectamente a las gruesas paredes de un tubo de cristal especial, el homogenizador. Existen dispositivos de homogenización en los que está calibrada la separación entre el émbolo y la pared de cristal para producir homogenizados con un tamaño de partícula determinado.

Centrifugación:Una vez obtenido el lisado o homogenado celular se ha de proceder a su fraccionamiento. Una de las técnicas más empleadas es la centrifugación. Se basa en hacer girar el tubo a gran velocidad de forma que se produzca la acumulación en el fondo del mismo de las partículas que tienden a hundirse por tener una densidad mayor que la del medio en que se encuentran. Así, después de la centrifugación la muestra, homogénea, se habrá separado en dos fracciones: sobrenadante, fracción homogénea que no ha sedimentado, y el sedimento que ha quedado adherido al fondo del tubo.

CentrífugaLas centrífugas son instrumentos que permiten someter a las muestras a intensas fuerzas que producen la sedimentación en poco tiempo de las partículas que tienen una densidad mayor que la del medio que las rodea. En general se diferencian en función de los

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márgenes de aceleración a que someten a las muestras en: centrífugas (de pocas g a aprox. 3000xg), súper-centrífugas (o centrífugas de alta velocidad, rango de 2000xg a 20000xg) y ultracentrífugas (de 15000xg a 600000xg). En las centrífugas se suele controlar la temperatura de la cámara para evitar sobrecalentamiento de las muestras debido a la fricción. En las ultracentrífugas, la velocidad extrema (más de 100000 rpm), hace que sea necesario hacer un intenso vacío en la cámara de la centrífuga para evitar el calentamiento de rotor y muestra.En una centrífuga el elemento determinante es el rotor, dispositivo que gira y en el que se colocan los tubos. Existen varios tipos:

Rotor basculante. Los tubos se colocan en un dispositivo (cestilla) que, al girar el rotor, se coloca en disposición perpendicular al eje de giro. Así pues los tubos siempre giran situados perpendicularmente al eje de giro.

Rotor de ángulo fijo. Los tubos se insertan en orificios en el interior de rotores macizos. El caso extremo es el de los rotores verticales en los que el tubo se sitúa paralelo al eje de giro. Este tipo de rotores es típico de ultracentrífugas y se emplea en separaciones de moléculas en gradientes de densidad autogenerados (por ej. de cloruro de cesio).

Los parámetros a tener presentes en cualquier centrifugación, que determinarán las condiciones son:

Volumen de solución a centrifugar, que determinará el tipo de tubos y rotores a emplear.

Naturaleza química de la solución, que determinará la naturaleza del tubo a emplear.

Diferencial de densidad entre la partícula a sedimentar y la densidad del medio en el que se encuentra. En general cuanto mayor sea esa diferencia antes (menor tiempo y menor fuerza de aceleración) sedimentará. Cuando el diferencial es muy pequeño se pueden aplicar centrifugaciones de cientos de miles de g durante horas.

Todo rotor tiene unas propiedades que determinan las condiciones en que se podrá centrifugar la muestra. Son especialmente importantes el ángulo de giro, el radio mínimo, medio y máximo, y la velocidad máxima de giro. La relación entre la velocidad de giro, medida en revoluciones por minuto (rpm) y la fuerza de aceleración (fuerza centrífuga relativa, RCF: 'relative centrifuge force') a que se somete la muestra (xg) se recoge en la expresión siguiente:

Centrifugación diferencialLa centrifugación diferencial se basa en la existencia de diferentes partículas en la suspensión que difieren en su densidad de la del medio. Si se centrifuga en condiciones suaves (poco tiempo, poco fuerza de aceleración) sedimentarán las partículas mayores y/o más densas. Cuando el sobrenadante de la primera centrifugación es centrifugado de nuevo en condiciones de más tiempo y más fuerza de aceleración sedimenta de nuevo las partículas más densas presentes, y así sucesivamente. Se pueden aplicar condiciones crecientes de severidad en la centrifugación y obtener una colección de sedimentos que corresponden sucesivamente a fracciones de partículas de diferente tamaño y/o densidad.

Velocidad de sedimentaciónAlternativamente es posible aprovechar esa diferencia en la velocidad necesaria para sedimentar las partículas para realizar una centrifugación en un medio en el que exista un gradiente de densidad, siendo menor en la parte superior y mayor en la inferior. Después de un tiempo las diferentes poblaciones de partículas se sitúan en diferentes

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profundidades del tubo. Haciendo un pequeño orificio en el fondo del mismo se pueden recoger diferentes fracciones que contengan a las distintas poblaciones separadas.Este es el fundamente de la ultra-centrifugación preparativa, que permite determinar la velocidad de sedimentación de una partícula (medida en unidades Svedverg, S).

Equilibrio de sedimentación:Es un sistema que se suele realizar empleando la ultracentrífuga. Consiste en la separación de las partículas en función de su densidad de flotación. La muestra se dispone por encima o se mezcla con un gradiente de densidad más pronunciado que el del caso anterior, y que contiene una concentración muy elevada de sacarosa o de cloruro de cesio. Al centrifugar cada componente subcelular se desplazará hacia arriba o hacia abajo hasta que alcance una posición en la que su densidad sea igual a la de su entorno (situación de flotabilidad neutra) y ya no se desplazará más. Como consecuencia se producirán una serie de bandas discretas, las más próximas al fondo del tubo contendrán las partículas con mayor densidad de flotación. Este método también se conoce como equilibrio en gradiente de densidad.Se emplean diferentes sustancias para conseguir los gradientes de densidad, como son sacarosa, percol, cloruro de cesio, etc. Los gradientes pueden ser autogenerados como es el caso de los basados en cloruro de cesio en que se forman en el propio proceso de centrifugación, o preformados como es el caso de la sacarosa o del percol. En este último caso la preparación se realiza antes de la centrifugación mediante un formador de gradientes, dispositivo que consiste en dos cubetas conectadas por la base y con agitación en las que se colocan las soluciones con los dos extremos de concentración. A medida que se va sacando de una de ellas la otra reemplaza el líquido extraído y modifica linealmente la concentración.Una alternativa es la centrifugación en gradiente discontinuo, en la que se crea un gradiente por etapas en el interior de un tubo al apilar sucesivamente volúmenes homogéneos de soluciones de diferente densidad. En las interfaces de las diferentes capas se acumularán las partículas que flotan (son menos densas) en la capa inferior pero que se hunden (son más densas) en la capa superior