Introducción Las secciones de Inmunohematología y Banco de Sangre tienen bajo su responsabilidad el preparar los hemocomponentes y seleccionar el más indicado para el paciente, a quien el médico se lo prescribe. Para cumplir con esta labor se debe interaccionar con los donantes de sangre, realizar pruebas inmunohematológicas como la determinación de grupos sanguíneos, fenotipos y pruebas de compatibilidad dentro de otras. El buen desenvolvimiento dentro del Laboratorio y la utilización de medidas preventivas es un aspecto básico y fundamental para los cursos de Laboratorio de Inmunohematología y Banco de Sangre. A continuación le brindamos algunas de las recomendaciones importantes para la seguridad en el Banco de Sangre. En 1987 el CDC introduce el concepto que la sangre de todo paciente debe ser tratada como potencialmente infecciosa para el Virus de la Hepatitis B (HBV), Virus de la Inmunodeficiencia Humana (HIV) y otros patógenos transmitidos por vía parenteral. Toda persona que labore en un Banco de Sangre debe saber que el SIDA y la hepatitis se trasmiten por medio de fluidos corporales y que, por lo tanto, se deben guardar todas las normas de seguridad necesarias para evitar el contagio. La exposición ocupacional al HIV es menos frecuente que la del HBV, debido a que las concentraciones en que se puede encontrar el HBV, son mucho más altas, además de que este virus puede permanecer estable a 25ºC por más de siete días, lo que explica su mayor frecuencia e infección. La transmisión ocupacional de HBV y del HIV se relaciona con: • inoculación percutánea de sangre, plasma, suero u otros fluidos corporales, debido a accidentes con agujas. • Contaminación de la piel o mucosas, con sangre o fluidos corporales sin que medien punciones, debido al contacto directo de una lesión y el fluido contaminante, como resultado de pipetear con la boca, salpicaduras al momento de quitar un tapón de un tubo y/o centrifugación inadecuada que genere aerosoles con material infeccioso y que entren en contacto con lesiones en piel. Los estudiantes deberán cumplir con los siguientes puntos dentro del Laboratorio: 1- No correr. 2- Siempre que va a manipular o trasladar muestras dentro del Laboratorio estas deberán de estar en una gradilla, no las transporte en las manos, además utilice guantes durante la manipulación de las muestras.

3- Utilice zapatos cerrados, no utilice zapatillas abiertas o sandalias. Con el objetivo de proteger los pies. 4- Si se tiene el pelo largo amárrelo con una cola. 5- Es importante utilizar antejos de seguridad. 6- Si se ve afectado por alguna salpicadura lave con abundante agua y en casos de alguna lesión con algún vidrio debe acudir donde un médico que lo asista. 7- Siempre utilice gabacha dentro del Laboratorio. 8- Antes de empezar la práctica y hasta el final de la misma utilice guantes. Los guantes pueden estar hechos de látex o vinil. En ambos casos demuestran una buena barrera protectora; sin embargo, los de látex permiten conservar mayor sensibilidad táctil. 9- Queda prohibido el uso de teléfonos celulares durante el Laboratorio. 10- El frecuente lavado de manos es una de las medidas de precaución más útiles e importantes, éste se debe realizar posterior al contacto con pacientes y muestras de laboratorio, Las manos se deben lavar con agua y jabón: • después de completar el trabajo y antes de irse del laboratorio • después de quitarse los guantes • antes de cualquier otra actividad donde intervenga contacto entre manos y mucosas • inmediatamente después de un contacto accidental con sangre o fluidos corporales • antes de ir al servicio sanitario. 11- Limpieza de superficies de trabajo. Todas las superficies de trabajo deben limpiarse antes y después del trabajo con cloro casero diluido 1:10 o con alcohol yodado. Otros instrumentos a desinfectar son las tijeras y las centrífugas. La dilución de cloro recomendado inactiva al HBV en 10 minutos y al HIV en 2 minutos. Cuando ocurra un derrame de sangre o fluidos corporales se debe proceder de la siguiente manera: • absorber el líquido con una toalla o papel absorbente. El objetivo de este paso es eliminar la mayor cantidad de proteína, ya que las soluciones de cloro son menos efectivas en presencia de altas concentraciones proteínicas • limpiar la superficie con cloro diluido. • Colocar un papel absorbente empapado con cloro sobre la superficie sucia Limpiar de nuevo y descartar todo lo usado en un recipiente de bioseguridad 12- Precaución con agujas. Los accidentes con agujas se pueden prevenir de la siguiente manera: • No tapar las agujas después de haber sido utilizadas. • No separar las agujas de las jeringas. • No manipular las agujas con las manos.

• Poner las agujas una vez utilizadas en un recipiente rojo o naranja con el símbolo de bioseguridad. • Estos recipientes deben de estar colocados cerca del área utilizada para las flebotomías. 13- Descarte de material. • Todo material que resulta luego de realizar las pruebas en el Laboratorio debe ser descartado en recipientes de plástico que contengan solución de hipoclorito de sodio al 0.5%, aquí se incluyen tubos, pipetas, portaobjetos y frascos. • Mientras tanto, el material seco como gasas, aplicadores, papel debe ser depositado en bolsas de basura de material resistente, estas bolsas deben de ser de color naranja o rojo y portar el símbolo de bioseguridad. • Todos los residuos del Laboratorio que contengan fluidos corporales deben ser autoclavados previo descarte definitivo. 14- Otras medidas de seguridad. • No consumir comidas ni bebidas en el laboratorio. • No guardar alimentos en las refrigeradoras o congeladores que contengan muestras o bolsas de sangre. • Estos equipos deben de ser rotulados también como biopeligrosos. • Es totalmente prohibido fumar dentro del laboratorio. Procedimiento 1 La flebotomía o recolección de sangre. Principio: La recolección de sangre debe ser practicada mediante métodos asépticos, con un sistema cerrado, guantes y una punción venosa a primera intención. En caso de que la primera punción no fuera óptima, para la segunda punción se debe utilizar un equipo nuevo. Método: Antes de la flebotomía: - Revisar la identificación de los tubos que se van a utilizar. - Rotular el tubo con el nombre y apellidos de la persona que pertenece la muestra, número de identificación que puede ser el número de cédula. - Indicar la persona responsable de realizar el procedimiento, ya sea con las iniciales o un número designado por el Laboratorio. - Otra información importante de indicar es la ubicación, fecha y hora de la extracción. Preparación de la punción venosa: - Inspeccionar ambos brazos y seleccionar la mejor vena. - Limpiar con un algodón impregnado con alcohol al 70% un área de ocho centímetros alrededor del sitio seleccionado para la punción. - Realizar la limpieza de adentro hacia afuera en forma circular. - Limpiar en dos ocasiones cuando se amerite. - La zona debe de estar seca antes de la punción venosa.

Flebotomía: - Colocar el torniquete. - Introducir la aguja en la vena seleccionada en un ángulo de 45º y con el bisel hacia arriba. - Dejar que la sangre fluya libremente dentro del tubo. - Si se está recolectando sangre anticoagulada inmediatamente después de retirado el tubo del adaptador procesa a mezclar la sangre con suavidad. - Aflojar el torniquete cuando la extracción haya concluido. - Colocar un algodón sobre la vena. - Retirar la aguja y hacer presión con el algodón sobre la vena. - Indicar al paciente que doble el brazo y que lo mantenga en esa posición por 10 minutos. - Descartar el material con la aguja en el envase de desecho. - Colocar las muestras obtenidas en el espacio correspondiente dentro de la gradilla. Cuidados: La recolección de sangre es un procedimiento sencillo y seguro para las personas. No representa riesgo alguno, sin embargo, en muy pocas ocasiones se pueden presentar ciertos inconvenientes como: Desvanecimiento, lipotimia, síncope Estas reacciones pueden explicarse por una descarga vasovagal. Si esto se presenta se debe indicar a la persona que coloque la cabeza entre las piernas o coloque al paciente en posición de Trendelemburg. Si se presenta nauseas indicar al paciente que respire profundamente. Si hay hiperventilación el paciente debe respirar en una bolsa de papel. Si se observa una tendencia a perder el conocimiento, proteja la persona de un golpe colocando en una posición que evite las caídas. Tomar la presión y el pulso. Hematoma durante o después de la flebotomía Si este se presenta se debe de: Retirar inmediatamente el torniquete y la aguja del brazo. Colocar tres o cuatro gasas estériles sobre el sitio de venipunción y aplicar firmemente presión digital durante 7 – 10 minutos. Una alternativa  consiste en aplicar un apósito ajustado, que se puede retirar 7 – 10 minutos después para permitir la inspección. Si se desea, aplicar hielo, cubierto con una gasa, en el área durante 5 minutos. Si se sospecha una punción arterial, retirar la aguja de inmediato y aplicar presión firmemente durante 10 minutos. Aplicar un vendaje compresivo enseguida.  

Procedimiento 3 Lavado de muestras en Inmunohematología. Principio

- Los lavados de muestras sanguíneas para obtener sólo el paquete globular es un procedimiento de rutina, dentro de cualquier sección de Inmunohematología.

- El propósito es eliminar cualquier interferente proteico que pueda alterar la reacción de aglutinación. Este aspecto es tan importante que se pueden obtener reacciones falsas positivas o negativas a partir de muestras mal lavadas. Materiales y muestras: 1. Tubos 12x75 mm limpios y secos 2. Pipetas Pasteur o de transferencia 3. Solución salina 0.9% 4. Centrífuga serológica (3000 rpm ) 5. Guantes 6. Gabacha 7. Recipientes de descarte de material 8. Muestras de sangre total anticoagulada con EDTA Método: 1. Rotular adecuadamente un tubo de ensayo. 2. Transferir con una pipeta Pasteur y técnica apropiada de uso de material biopeligroso una muestra de sangre de 0.2 ml a un tubo de ensayo. 3. Añadir solución salina hasta alcanzar 1 centímetro antes de la boca del tubo. 4. Equilibrar y centrifugar por 1 minuto a 3500 rpm en una centrífuga serológica. 5. Una vez centrifugado debe de quedar un paquete globular. 6. Descartar el sobrenadante. 7. Resuspender los glóbulos rojos. 8. Añadir solución salina hasta 1 centímetro antes de la boca del tubo. 9. Repetir el mismo procedimiento dos veces más  10. En el último lavado debe de quedar un sobrenadante claro. 11. Descartar el sobrenadante y realizar una suspensión de trabajo al 3-5% 12. Descartar el material en los recipientes adecuados de la práctica.

Práctica: Realizar al menos cinco lavados de glóbulos rojos. Repetir el procedimiento tantas veces sea necesario hasta que domine la técnica  

Procedimiento 4 Lectura, interpretación y grado de las reacciones de aglutinación. Principio Cuando se presentan reacciones de aglutinación se pueden observar diferentes grados y fuerzas de reacción entre los antígenos y los anticuerpos. Esta observación es muy importante en Inmunohematología, pues se puede utilizar estas características distintivas para identificar situaciones donde se presentan casos de mezclas de anticuerpos, mezclas de sangre e incluso haciendo uso de un grado de aglutinación, determinar si los glóbulos rojos en estudio son homocigotas o heterocigotos para un determinado sistema de grupo sanguíneo. Materiales y Muestras: 1- Reactivo anti-A. 2- Glóbulos A al 3-5% 3- Tubos de ensayo 4- Pipetas volumétricas de 1 ml, 5ml y 10 ml 5- Pipetas automáticas 6- Centrífuga serológica (3500 rpm) 7- Solución salina 0.9% 8- Recipientes de descarte de material 9- Un marcador permanente 10- Guantes 11- Gabacha Método: Realizar a un volumen final de 100 ul diluciones dobles del antisuero (reactivo de anti-A) con solución salina hasta una dilución final de 1:512 de la siguiente manera.

 1- Rotular los tubos correspondientes. 2- Colocar 100 ul. de solución salina del tubo rotulado 1:2 hasta el tubo 1:512. 3- Dispensar 100 ul. del reactivo anti A al tubo rotulado 1:1 y al tubo rotulado 1:2. 4- Mezclar el tubo 1:2 5- Transferir 100 ul del tubo 1:2 al siguiente tubo 1:4. 6- Mezclar, continuar el procedimiento de forma repetitiva hasta llegar al tubo 1: 512. 7- Descartar los últimos 100 ul. 8- Añadir 50 ul de las células “A” a cada uno de los tubos. 9- Mezclar y centrifugar a 3500 rpm por 15 segundos.

10- Desprender el botón con suavidad frente a la luz para observar el grumo. 11- Anotar las características observadas en cada reacción de aglutinación y asignar el puntaje.

Característica del grumo, intensidad de reacción y puntaje obtenido.

Observación macroscópica

Designación en cruces Puntuación

Un solo grumo Fondo transparente

Hemólisis total

4+ 12

Un grumo grande con varios pequeños

Fondo transparente

3+ 10

Muchos grumos medianos y pequeños Fondo transparente

2+ 8

Muchos grumos pequeños

Fondo turbio

1+ 5

Reacción visible solo al microscopio

M 2

Procedimiento 5 Determinación en tubo del grupo sanguíneo ABO en adultos. Principio: El sistema de grupo sanguíneo ABO fue el primer sistema descubierto por el Dr. Karl Landsteiner en 1900 y que le valió el premio Nobel en Fisiología y Medicina del año 1930. (1) Este sistema involucra dos antígenos: A, B. Interactúa con el sistema H, que produce por la acción de una fucosiltransferasa, el antígeno H, capaz de añadir una fucosa a la sustancia precursora. La sustancia H puede ser convertida en el antígeno de grupo sanguíneo A por acción de la transferasa A, que añade una N-acetil galactosamina, a la cadena precursora o una galactosa en el caso de actuar la galactosil transferasa produciendo el antígeno B; el fenotipo O es el resultado de una mutación en la transferasa que produce un producto inactivo, la cual es incapaz de añadir

carbohidratos, dejando expuesto solo al antígeno H. Los seres humanos mayores de 3 a 6 meses de edad desarrollan a través de una respuesta T independiente anticuerpos antitéticos naturales del tipo IgM capaces de activar al complemento contra los antígenos ABO que no se posean. Se desarrollan a partir de la estimulación de sustancias tipo azúcares presentes en los alimentos y bacterias en el tracto intestinal. Este sistema es de gran importancia en el campo de la medicina transfusional y en la investigación clínica. Ha sido de gran ayuda en el ámbito antropológico donde lo han utilizado como marcador serológico en genética de poblaciones, desarrollo embrionario, diferenciación celular y en las neoplasias.(2,3) El siguiente procedimiento es el método de referencia, sin embargo, recuerde que existen diferentes casas comerciales y que cada una utiliza distintos componentes para fabricar reactivos, así como los tiempos de incubación y de reacción, por lo que nunca se debe de pasar por alto leer la especificación técnica que recomienda la casa comercial para el uso de reactivos. Materiales y muestras: Tubos de ensayo 12x75 mm Pipetas Pasteur Solución salina Centrífuga serológica Recipientes de descarte de material Guantes Gabacha Marcador permanente (pilot) Para realizar las determinaciones, generalmente se utilizan muestras de sangre total anticoagulada con EDTA (tubo tapón lila), sin embargo, también se pueden utilizar sangre sin anticoagunlante. (tubo tapón rojo). Los glóbulos rojos pueden ser suspendidos en el suero autólogo, plasma o solución salina, pueden ser lavados y resuspendidos en solución salina antes de la prueba. Reactivos 1- Anti-A (azul) 2- Anti-B (amarillo) 3- Células A1 y B. Estas células pueden ser obtenidas comercialmente o preparadas diariamente en el laboratorio en una suspensión entre el 3-5% Método: Grupo eritrocitario, (Prueba directa): 1- Rotular 2 tubos como A y B. 2- Homogenizar la muestra de sangre. 3- Realizar una suspensión de trabajo entre el 3-5%. 4- Agregar una gota de la suspensión de trabajo a los tubos rotulados como A y B. 5- Añadir al tubo rotulado como A dos gotas del anti A. 6- Añadir al tubo rotulado como B dos gotas del anti B.

7- Mezclar y centrifugar por 10 segundos a 3000 rpm. 8- Resuspender suavemente el botón. 9- Leer, anotar e interpretar las reacciones. Prueba sérica (grupo inverso) 1- Centrifugar la muestra a analizar por 5 minutos. 2- Rotular dos tubos como células A y células B. 3- Añadir al tubo rotulado como células A una gota de células A al 3%. 4- Añadir al tubo rotulado como células B una gota de células B al 3%. 5- Añadir a cada tubo dos gotas de plasma de la muestra centrifugada. 6- Mezclar y centrifugar 10 segundos a 3000 rpm. 7- Leer, anotar e interpretar las reacciones. 8- Comparar los resultados obtenidos con el grupo eritrocítico. Práctica: Determinar el grupo ABO eritrocítico y sérico de al menos 10 muestras sanguíneas y que en ellas vayan todas las posibles combinaciones de grupos ABO. Los antisueros anti A y anti B fueron designados internacionalmente con un color para evitar los errores de grupo, los cuales pueden inicdir en la vida de un paciente

Interpretación de grupo ABO

Anti A Anti B Células A Células B Interpretación + 0 0 + A 0 + + 0 B + + 0 0 AB 0 0 + + O

Procedimiento 6 Determinación en tubo del grupo sanguíneo ABO en recién nacidos Principio La determinación del grupo sanguíneo ABO en el recién nacido es de suma importancia en la detección y diagnóstico de la enfermedad hemolítica del recién nacido, así como en la terapia transfusional. En este tipo de paciente, debido a la inmadurez del sistema inmune al Nacimiento, no tiene la capacidad de producir anticuerpos hasta los primeros tres a seis meses de vida, razón por la cual la prueba sérica o inversa no debe ser aplicada. Las reacciones de aglutinación con el grupo eritrocítico en recién nacidos, pueden dar grados de aglutinación, más débil que en los pacientes adultos, debido a que los determinantes antigénicos ABO en los glóbulos rojos se

encuentran en poca cantidad, pobremente ramificados y expresados en comparación con los antígenos de glóbulos rojos de personas adultas. Es por lo anterior que en la determinación de grupo sanguíneo ABO del Recién Nacido se añade a la batería de reacción, un tubo adicional para el reactivo anti- AB que permita generar reacciones de mayor avidez, que permitan confirmar la reacción. Una de las ventajas de utilizar este reactivo adicional, es que va dirigido contra otros determinantes antigénicos que los reactivos anti-A o anti-B individuales, por lo que al utilizar los tres reactivos en conjunto aumenta las posibilidad de detección antigénica, en contraposición que si se utilizara sólo un medio de reacción, disminuyendo así las reacciones falsas negativas. Toda reacción negativa en un grupo de recién nacido debe ser observada al microscopio, acción que conlleva a aumentar la sensibilidad. (1,2) Materiales y muestras Tubos de 12 x75 mm Pipetas Pasteur Solución salina Centrífuga serológica Recipientes de descarte de material Guantes Gabacha Marcador permanente (pilot) Muestras de Sangre de cordón umbilical Reactivos 1- Anti-A 2- Anti-B 3- Anti-AB Método: Por lo general se utilizan muestras de sangre de cordón umbilical (tubo tapón rojo). A una alícuota de la muestra realizar tres lavados con solución salina fisiológica. Del paquete globular lavado hacer una suspensión de trabajo entre el 3-5%. Lo anterior debido a que este tipo de muestra posee muchos elementos adiciones interferentes como es la gelatina de Wharton que interfiere con las reacciones de aglutinación, produciendo falsos positivos 1- Rotular 3 tubos de prueba como A, B y AB. 2- Transferir una gota de la suspensión de eritrocitos del paciente, a los tubos rotulados como A, B y AB. 3- Añadir al tubo rotulado como A dos gotas del anti A. 4- Añadir al tubo rotulado como B dos gotas del anti B. 5- Añadir al tubo rotulado como AB dos gotas del anti AB. 6- Mezclar y centrifugar por 10 segundos a 3500 rpm.

7- Leer, anotar e interpretar las reacciones.

Interpretación grupo ABO recién nacido

Anti A Anti B Anti AB Interpretación + 0 + A 0 + + B + + + AB 0 0 0 O

Práctica: Realizar la determinación de al menos 5 muestras de recién nacido, tratar que no sean del mismo grupo ABO. Procedimiento 7 Determinación en tubo de subgrupos sanguíneos ABO. Principio El sistema de grupo sanguíneo ABO presenta dentro de sus características algunos fenotipos poco frecuentes clasificados como subgrupos, los cuales se hacen evidentes a nivel de laboratorio como reacciones de aglutinación más débil de lo esperado. Razones que justifican la presencia de estos subgrupos son: - Mutaciones en los genes A y B que provocan la expresión aberrante de los genes, codificando la producción de glicosiltransferasas con menor actividad enzimática para la conversión del antígeno H. - Expresión débil de un alelo alterno que se ubica en el locus ABO. - Efecto de genes modificadores o inhibidores que regulen la expresión de los genes ABO. La mayor frecuencia de subgrupos ABO es para el antígeno A. Los eritrocitos de los diferentes subgrupos de A varían ampliamente en la densidad antigénica. Se ha calculado que los eritrocitos que son A1 pueden expresar entre 1-1.5 millones de sitios antigénicos en contraposición con eritrocitos Am o Ael donde se ha podido determinar apenas expresan unos 2000 sitios antigénicos. Los subgrupos de A se clasifican en: A1, A2, A3, Ax, Aend, Am, Ay, Ael. Los subgrupos de B se clasifican en: B3, Bx, Bm, Bel. Los subgrupos de ABO pueden ser detectados a través de patrones de reacción incongruentes entre los resultados de la prueba directa con la prueba

inversa. La observación minuciosa de los siguientes aspectos es fundamental para determinar las características de los diferentes subgrupos: - Grado de aglutinación con anti-A y anti-A1.

- Grado de aglutinación con anti-AB. - Grado de aglutinación con anti-H. - Presencia de anticuerpos anti-A1 en el suero. - Presencia de sustancias A, B y H en secreciones de saliva. - Estudios de Absorción/Elución para antígenos ABH en eritrocitos. Método: Técnica en tubo para la detección del antígeno A1 utilizando la lectina Dolichos biflorus. A cada tubo adecuadamente rotulado añadir 1 gota suspensión entre el 3-5% de glóbulos rojos A o AB a analizar. A los tubos anteriores añadir 1 gota de la lectina anti-A1. Mezclar y centrifugar por 15 segundos a 3500 rpm. Leer, anotar e interpretar los resultados obtenidos. Interpretación: - Positivo: presencia de reacción de aglutinación de 1+ a 4+. - Negativo: Ausencia de reacción de aglutinación. Técnica en tubo para la detección del antígeno H utilizando la lectina Ulex europeaus: Añadir 1 gota suspensión de glóbulos rojos A o AB a analizar a los tubos debidamente rotulados. Añadir 1 gota de la lectina anti-H a cada tubo. Mezclar y centrifugar por 15 segundos a 3500 rpm. Leer por aglutinación y anotar los resultados. Interpretación: - Positivo: presencia de reacción de aglutinación de 1+ a 4+. - Negativo: Ausencia de reacción de aglutinación. 2) De las muestras clasificadas escoger las de grupo A y O para determinar la cantidad de sustancia A o H con las lectinas anti-A1 y anti-H. 3) Hacer las lecturas e interpretar los comentarios que considere necesarios. 4) Anotar en orden de fuerza de aglutinación las reacciones utilizando Lectina anti - A1 y Lectina anti H para células. 5) Realizar determinaciones en recién nacido.

Procedimiento 8 Determinación en tubo del antígeno Rh/ D. Principio La definición de Rh positivo o Rh negativo se refiere a la presencia o ausencia del antígeno Rh (D) en los eritrocitos humanos. El primer anticuerpo contra el antígeno D fue descrito en 1939 por Levine y Stetson, encontrado en el suero de una mujer cuyo hijo se obitó y además había presentado una reacción hemolítica después de haber sido transfundida con sangre de su esposo. En 1940, Landsteiner y Wiener describieron el anticuerpo obtenido por inmunización de cerdos y conejos con glóbulos rojos del mono Macacus rhesus. Estos aglutinaron aproximadamente el 85% de las pruebas con eritrocitos humanos y fueron denominados con el correspondiente factor Rh positivo y los que no reaccionaron como Rh negativo. El término Rh se nombra en honor a la especie en que se descubrió el antígeno Los antígenos del sistema Rh se encuentran en los seres humanos y en algunas especies de primates. El antígeno D está completamente desarrollado al nacer. Los reactivos anti-D pueden tener tres tipos de presentación, los de alto contenido proteico, los salinos a base de IgM y los químicamente modificados, que son IgG´s, tratadas químicamente para generar mayor capacidad aglutinante que los IgG nativos. Los de alto contenido proteico poseen una concentración entre el 20-24% más otros aditivos macromoleculares, dando un resultado más pronto y una lectura más fiable. El diluyente de elevado peso molecular puede producir aglutinación espontánea de los eritrocitos, si estos se encuentran recubiertos de inmunoglobulinas como son los casos de autoinmunidad y de la enfermedad hemolítica del recién nacido. Un aspecto a tomar en consideración es que estos sueros, debido a los aditivos que se le añaden para ayudar a la aglutinación pueden producir reacciones falsas positivas. Para detectar estos falsos positivos, es importante correr paralelamente con la prueba de Rh una prueba control, utilizando un reactivo inmunológicamente inerte, preparado por la misma casa comercial del reactivo anti-Rh. Este control posee los mismos aditivos que están en el reactivo anti-D, pero sin los anticuerpos. Si las células que están en estudio son aglutinadas por este control, el resultado de la prueba debe ser invalidado, siendo necesario analizarlo por otro método. En caso de ausencia del reactivo control se puede utilizar albúmina bovina al 22%, produciendo incluso menos falsos positivos que el

anterior, ya que la albúmina no contiene los potenciadores de alto peso molecular pero sí su alto contenido proteico. Reactivos 1- Anti-D, IgG de alta concentración proteica. 2- Reactivo para el control de Rh, manufacturado según la casa comercial o Albúmina al 22%. Materiales y muestras 1. Tubos de pruebas limpios y secos. 2. Pipetas Pasteur. 3. Solución salina 0.9%. 4. Centrífuga serológica (3000 rpm ). 5. Guantes. 6. Gabacha. 7. Recipientes de descarte de material. 8. Tubos de ensayo. 9. Muestras de sangre total anticoagulada con EDTA. Método: 1- Marcar dos tubos uno como D ó Rh y otro como control ó Ctrl. 2- Agregar al tubo rotulado como D, 1 gota del reactivo anti-D. 3- Agregar al tubo rotulado como control, 1 gota del reactivo control y en caso de no disponer de albúmina. 4- Añadir 1 gota de la suspensión entre el 3-5% de los glóbulos del paciente en estudio. 5- Mezclar y centrifugar por 30 segundos a 3500 rpm en una centrífuga serológica. 6- Resuspender cuidadosamente, leer, anotar e interpretar los resultados. Interpretación:

Interpretación de los resultados de Rh Anti D Control Interpretación 1-4+ 0 Rh positivo

0 0 Rh negativo 1-4+ 1-4+ No se puede interpretar

Si el control está positivo el resultado se considera inválido. Si esto ocurre, lave los eritrocitos con solución salina a 37ºC previo a preparar la suspensión de células y repita la prueba. Si prevalece el resultado positivo en el control, el resultado del Rh (D) se considera inválido y se requiere investigación adicional con la utilización de reactivos con anti-D salino o químicamente modificado Procedimiento 9

Detección del antígeno D débil Principio Algunos glóbulos rojos expresan más débilmente el antígeno D en la membrana, esta condición puede provocar que en la primera fase del análisis, cuando se trabaja con reactivos de alto contenido proteico se presenten resultados positivos y con otros una reacción negativa. Estas discrepancias se resuelven cuando las pruebas con resultados negativos se llevan a la fase de antiglobulina, detectando el antígeno con expresión débil que en la primera fase no se logró detectar. Debido a la trascendencia desde el punto de vista transfusional o en la prevención de la enfermedad hemolítica del recién nacido, todo estudio serológico con anti-D proveniente de un donante de sangre o un recién nacido con una lectura negativa en la primera fase, se debe continuar hasta la fase de antiglobulina para confirmar el resultado. Método: 1- Si la prueba de Rh da resultado negativo incubar el tubo estudio y el tubo control por 30 minutos a 37ºC. 2- Lavar 3 veces las muestras con solución salina 0.9% 3- Secar bien la última gota. 4- Añadir dos gotas del reactivo de antiglobulina humana. 5- Mezclar y centrifugar por 30 segundos a 3500 rpm. 6- Re suspender cuidadosamente, leer, anotar e interpretar los resultados 7- Confirmar reactividad de reactivo agregando una gota de “Células Control de Antiglobulina Humana” 8- Mezclar y volver a centrifugar los tubos por 30 segundos a 3500 rpm. 9- Re suspender cuidadosamente, leer, anotar e interpretar los resultados. Interpretación de resultados: La aglutinación en el tubo de anti-D y la ausencia de aglutinación en el tubo control indican un resultado positivo. La sangre debe de clasificarse como Rh positivo. La ausencia de aglutinación en ambos tubos, el estudio y control indican un resultado negativo y la sangre debe de clasificarse como Rh negativo. Presencia de aglutinación en el tubo control invalida la prueba y debe de repetirse. Si esta vuelve a dar positivo, se debe considerar un estudio para Anemia Hemolítica Autoinmune iniciando con una prueba de antiglobulina directa.

Interpretación de Rh débil Anti D Control Interpretación 1-4+ 0 Rh positivo

0 0 Rh negativo 1-4+ 1-4+ Anemia hemolítica

autoinmune

Procedimiento 10 Células Control de Antiglobulina Humana. Principio Las Células Control de Antiglobulina Humana, son glóbulos rojos sensibilizados con inmunoglobulina tipo IgG, son utilizadas para validar metodologías en tubo con resultados negativos en la fase de antiglobulina humana. La presencia de aglutinación después de ser añadidas al medio de reacción indica que los lavados fueron realizados adecuadamente y todos los restos proteicos fueron eliminados, no neutralizaron el reactivo de antiglobulina humana y el resultado de la prueba puede ser validado. Cuando una prueba de antiglobulina humana da un resultado negativo, quiere decir que no hubo reacción antígeno-anticuerpo, los glóbulos rojos en prueba no contienen el antígeno especifico para el antisuero que se está probando o el suero en estudio no tiene anticuerpos contra ninguno de los antígenos expresados en los eritrocitos utilizados, por tanto, en el tubo de reacción debe de quedar reactivo anti-IgG activo y funcional presente en el medio. Al adicionar las Células Control de Antiglobulina Humana las IgG activas libres reaccionan con las células provocando la aglutinación. Por otro lado, si se presenta un resultado negativo después de ser añadidas indica que los lavados fueron realizados incorrectamente, quedaron restos de inmunogloblinas que neutralizaron el reactivo de antiglobulina humana y la prueba debe ser invalidada y repetida. Materiales y Reactivos: Células Control de Antiglobulina Humana entre el 3 – 5 % obtenidas de casa comercial o preparadas en el laboratorio. Tubos de pruebas Gradillas Pipetas Centrífuga serológica Procedimiento: 1- Mezcle y resuspenda con suavidad las células del reactivo de Control de Antiglobulina Humana 2- Añada 1 gota de las Células Control de Antiglobulina Humana a cada tubo con resultado negativo en la prueba de inmunoglobulina humana incluyendo al control. 3- Mezcle y centrifugue 30 segundos a 3500 rpm 4- Resuspenda cuidadosamente, lea, anote e interprete los resultados.

Procedimiento 11 Conservación de Glóbulos Rojos. Preservación de la sangre: Los glóbulos rojos pueden ser preservados con diversos propósitos como por ejemplo: - Preservación de hemocomponentes para ser utilizados con fines terapéuticos. - Investigación. - Fuente de reactivos como las células rastreadoras, células control de Antiglobulina Humana, células A1, B. - Control de calidad de los antisueros utilizados de manera rutinaria en los Bancos de Sangre y servicios de Inmunohematología y demás. Existen diversas soluciones que ayudan a anticoagular y conservar los glóbulos rojos como son el: - ACD (adenina, citrato, dextrosa), - CPD (citrato, fosfato, dextrosa), - CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa, adenina). Otros pueden ser soluciones aditivas que lo que permiten es sólo su conservación brindando fuente de energía y sustancias precursoras para su biosíntesis normal, entre los que se encuentra el Alsever, Adsol, y el Alsever modificado. La parte más importante de las soluciones para la conservación de células rojas en estado líquido, es que deben proporcionar el mantenimiento intacto del fenotipo eritrocitario y reducir los riesgos de contaminación microbiana durante largo tiempo, lo cual posibilita su uso para pruebas diagnósticas in vitro y su comercialización. Soluciones sólo anticoagulantes como el EDTA, alteran a cabo de un tiempo la morfología normal del glóbulo rojo, por lo que no pueden ser utilizadas para este propósito. Método Obtener una muestra de su propia sangre siguiendo instrucciones del procedimiento 1 de este manual. Recolectar 10 ml y dividirla entre un tubo con EDTA (tapón lila) y un tubo con solución de Alsever. Rotular con sus datos personales el tubo con Alsever y colocarlo en la gradilla para ser guardado en refrigeración a 4ºC. Es muy importante guardar la muestra pues con ella se trabajará en prácticas posteriores. Procedimiento 12 Determinación del fenotipo Rh

Principio Aparte del antígeno D se han descrito otros antígenos pertenecientes al sistema Rh, específicamente más de 50 diferentes, sin embargo, de estos los principales por su capacidad de inducir una respuesta inmune y por ende implicados en reacciones transfusionales o en la enfermedad hemolítica del recién nacido son los antígenos C, E, c y e. Algunas asociaciones de antígenos incluyen al D y otras no. La composición de estas combinaciones antigénicas está determinada genéticamente. Dos genes homólogos y estrechamente ligados son los responsables de la producción de los cinco antígenos principales del sistema Rh. Uno llamado RHD determinará la producción o la no producción del antígeno D, mientras que el otro gen RHCE será el encargado de la producción de los antígenos C, c, E y e. Se han reconocido numerosas combinaciones y variantes de estos genes, pero los cinco antígenos indicados y sus anticuerpos los más frecuentes del sistema. De igual manera que para el antígeno D, se encuentran disponibles en el mercado reactivos pobres en proteínas (químicamente modificados o monoclonales) o ricos en proteínas con anticuerpos específicos para determinar la presencia de los antígenos C, E, c y e. Pueden producir reactividad variable con diferentes haplotipos en los eritrocitos (fenómeno de dosis), por lo que esta debe ser considerada dependiendo de los antígenos expresados en membrana a la hora de hacer un fenotipo de Rh, por ejemplo CDE o CE son los responsables de la mayoría de la expresión de C en los eritrocitos humanos. Se ha reportado antígenos variables E y c, pero son considerablemente menos comunes. Cualesquiera que sean los reactivos utilizados, las indicaciones del fabricante deben ser seguidas cuidadosamente. Los concentrados de sueros humanos usados para preparar reactivos, de los demás antígenos Rh; tienen riesgo significativo de contener especificidades contaminantes reactivas con la antiglobulina, anticuerpos irregulares e inducir poliaglutinación. Para evitar estas y otras situaciones, es recomendable correr en paralelo con la prueba controles positivo y negativo para los antígenos en estudio. Los eritrocitos seleccionados para el control positivo deben tener preferiblemente una sola dosis del antígeno implicado. La frecuencia de estos antígenos en población caucásica es de: C: 70%, c: 80%, E: 30% y e: 98% respectivamente. Materiales y Reactivos: Anti-C, Anti- c, Anti-E, Anti-e, Anti-D, anti-A, anti-B, anti-AB Células A1, células B, células control de antiglobulina humana Reactivo de antiglobulina humana Albúmina 22% Solución salina 0.9% Solución de Alsever

Tubos de ensayo para análisis Pizetas Pipetas pasteur Centrífuga serológica Guantes Gabacha Jeringas Agujas Tubos con EDTA Tubos con solución de Alsever Algodón Alcohol al 70% Recipientes de descarte de muestras y material Muestras: Se puede utilizar muestras de sangre con EDTA o sin anticoagular. Método: Preparar una suspensión de células al 3 – 5% en solución salina fisiológica. Rotular tubos como D, C, E, c, e y control. Añadir una gota del reactivo a cada tubo rotulado. Añadir una gota de la suspensión a analizar a todos los tubos. Mezclar y centrifugar 30 segundos a 3500 rpm. Resuspender, leer, anotar las reacciones Incubar los tubos que dieron reacción negativa a 37ºC por 15 minutos. Mezclar y centrifugar 30 segundos a 3500 rpm. Resuspender, leer, anotar e interpretar las reacciones. Interpretación de resultados: Una aglutinación de 1+ a 4+ indica que hubo reacción antígeno - anticuerpo, por lo que la prueba debe ser considerada positiva. La no presencia de aglutinación en el medio indica la ausencia del antígeno y por lo tanto la prueba es negativa. Muchos de estos antisueros son del tipo IgM, o IgG químicamente modificados por lo que no se debe de llevar hasta la fase de antiglobulina humana. Procedimiento 13 Determinación de la sustancia H en saliva Principio El gen Se es el responsable de la expresión del antígeno H en las secreciones. En las personas secretoras se puede encontrar sustancia H en saliva, orina, lágrimas, líquido amniótico, leche y fluidos digestivos. La cantidad encontrada en estas secreciones puede variar dependiendo del grupo ABO. Si las personas son del grupo A, B o AB y heredaron el gen Secretor, se pueden

detectar sustancias A y B en las secreciones. El gen Se es de carácter dominante sobre se. El 80% de la población es Secretora. El gen “se” no se ha asociado con la codificación de algún producto demostrable, por lo que se dice que es un gen amorfo y representa al 20% de la población. La técnica utilizada es la inhibición de la aglutinación. Reactivos y materiales Sets de reactivos anti A, anti B, anti AB, anti D, anti H, albúmina 22% y reactivo de antiglobulina humana Solución salina fisiológica Células al 3% de los grupos A1, B y O Muestras con sangre para analizar. Beacker de 10 ó 25 ml Tubos tipo Pirex Pipeteadores Pipetas de 10 ml Trípodes Mecheros de bunsen Chispas para mechero Cedazos Centrífugas serológica Centrífugas de tubos Pipetas Pasteur Goteros para pipetas pasteur Tubos de 12 x 75 mm Micropipetas de 100-200 ml (en este caso poner puntas de micropipetas) Pipetas de 1 ml Papel parafilm Material de descarte Gradillas metálicas Gradillas madera Puestos de descarte por mesa y material necesario para la limpieza de las mesas. Preparación de la muestra: Colectar aproximadamente 5 ml de saliva fresca en un beaker o frasco de vidrio de boca ancha. Transferir la saliva a un tubo 12x75 mm y centrifugue 5-10 minutos a 3000 rpm. Transferir el sobrenadante claro a un tubo de vidrio tipo pirex 13x100. Colocar el tubo en un baño de agua hirviendo por 10 minutos Transferir nuevamente la saliva a un tubo 12 x 75 mm Centrifugar la muestra por 5 minutos a 3500 rpm

Utilizar el sobrenadante claro y opalescente inmediatamente para su estudio. Si no lo va a procesar al momento se puede congelar a -20ºC para su posterior análisis. Preparar una suspensión al 3-5% de glóbulos O, A1 y B. Preparación de reactivos: El siguiente procedimiento se va a realizar por mesa de trabajo y de este van a realizar sus respectivas pruebas. Realizar diluciones dobles del reactivo anti-A, anti-B y anti-H hasta obtener una aglutinación de 2+. Método: Determinación de la sustancia A, B o H en saliva: Pipetear 100 ul. del sobrenadante de la saliva en cuatro tubos de ensayo limpios. Rotular como A, B, H. Añadir 50 ul de la lectina anti-H diluida al tubo rotulado como H. Añadir 50 ul de anti A diluido al tubo rotulado como A. Añadir 50 ul de anti B diluido al tubo rotulado como B. Mezclar e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. Posterior a la incubación Agregue 50 ul de eritrocitos A al tubo A Agregue 50 ul de eritrocitos B al tubo B Agregue 50 ul de eritrocitos O al tubo H A los tubos rotulados como control positivo añadir 50 ul de la lectina anti-H diluida. Rotular H+ 50 ul de anti A diluido. Rotular A + 50 ul de anti B diluido. Rotular B + y agregar 50 ul de eritrocitos O al tubo H+, 50 ul de eritrocitos A al tubo A+ 50 ul de eritrocitos B al tubo B+ Mezclar e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. A los tubos rotulados como control negativo añadir 50 ul de saliva. Rotular H+ 50 ul de saliva . Rotular A + 50 ul de saliva. Rotular B + y agregar 50 ul de eritrocitos O al tubo H+, 50 ul de eritrocitos A al tubo A+ 50 ul de eritrocitos B al tubo B+ Mezclar e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. Centrifugar 30 segundos a 3500 rpm. Resuspender, leer e interpretar lo resultados

Resultados de grupo secretor

Células O Células A Células B Interpretación 0 + + Secretor H + 0 + Secretor A + + 0 Secretor B

Control positivo

Células O Células A Células B Interpretación + + + Válido 0 0 0 Inválido

Control negativo

Células O Células A Células B Interpretación + + + Inválido 0 0 0 Válido

Práctica: Determinar estado secretor en saliva. Seguir realizando determinaciones de grupos sanguíneos Procedimiento 14 Determinación fenotípica del sistema MNSs Principio Los antígenos M y N fueron descubiertos en 1927, cuando Landsteiner y Levine obtuvieron los anticuerpos que los definían mediante la inmunización de conejos con glóbulos rojos humanos. Son dos genes estrechamente ligados uno que codifica para los antígenos MN y el otro para los antígenos Ss. En este sistema se agrupan 3 antígenos de alta frecuencia y al menos 30 de baja frecuencia. Los antígenos del sistema de grupo sanguíneo MNSs se encuentran ubicados en proteínas integrales de membrana del glóbulo rojo de 43 KDa. Los antígenos MN se localizan en la glicoforina A (GPA) y los Ss en la glicoforina (GPB), también se han ubicado los antígenos del sistema Gerbich en las glicoforinas C y D. Las glicoforinas además de interaccionar con el citoesqueleto del glóbulo rojo

poseen alta cantidad de ácido siálico, en su estructura lo que ayuda a brindar la carga negativa a la membrana. La diversidad antigénica está basada predominantemente en las recombinaciones genéticas, recombinaciones homólogas o conversiones génicas. Los eritrocitos que carecen de los antígenos S y s son también negativos para el antígeno del alta frecuencia U. Los antígenos M y N así como los S y s se comportan como productos de pares de genes alélicos, manteniendo una clara relación alélica. Los anticuerpos contra antígenos del sistema MNSs se han involucrado como causa de reacciones hemolíticas transfusionales, agudas o tardías, especialmente en pacientes politransfundidos. Los anticuerpos anti-M y anti-N pueden mostrar efecto de dosis dando reacciones significativas más intensas y con altos títulos en presencia de glóbulos rojos homocigotos para los antígenos que frente a glóbulos rojos heterocigotos. El anti-M se detecta en el suero humano como una aglutinina en solución salina a temperatura ambiente sin antecedentes de transfusión; condición que le permite su denominación de anticuerpo natural. El anti-M rara vez produce problemas clínicos, aunque cuando reacciona a 37ºC o en fase de antiglobulina se puede considerar como significativo, especialmente si este es del tipo IgG. El hallazgo de un anti-N es menos frecuente que el anti-M, es una IgM y típicamente se comporta como crioaglutinina, eventualmente puede presentarse como una IgG con expresión clínica significativa, como ocurre en los pacientes bajo hemodiálisis. En estos pacientes posteriormente se logró asociar la producción del anticuerpo anti-N con el uso de membranas de diálisis esterilizadas con formaldehido. Dado que las enzimas destruyen los antígenos, la reactividad anti-M y el anti-N puede ser eliminada por técnicas enzimáticas habituales. Los antisueros comerciales anti-M o anti-N debido a que han sido seleccionados y estandarizados para reaccionar adecuadamente con todos los glóbulos en estudio, en muy raras ocasiones presentan efecto de dosis a diferencia de los anticuerpos producidos por los pacientes. Frecuentemente se encuentran casos de anti-M que reaccionan sólo con glóbulos rojos homocigotos. Por el contrario, los sueros de anti-N rara vez producen este efecto. Los anticuerpos anti-S, anti-s y anti-U pueden aparecer posterior a una estimulación eritrocitaria, se detectan en la fase de antiglobulina e in vivo muestran una significativa actividad hemolítica. La frecuencia de fenotipos del sistema MN en poblaciones caucásicas es de: MM: 28%, MN: 50% y NN: 22% Reactivos Se dispone de reactivos comerciales para determinar los antígenos MNSs.

Estos se obtienen a partir de inmunización de animales, de origen humano, anticuerpos monoclonales y de lectinas. La lectina más ampliamente utilizada como reactivo análogo del anti-N es el extraído de las semillas de Vicia gramínea. Se debe conocer muy bien el tipo de reactivo que se esta utilizando, para obtener buenos resultados. Materiales y muestras: 1. Tubos de pruebas limpios y secos 2. Pipetas pasteur 3. Solución salina 0.9% 4. Centrífuga serológica (3000 rpm ) 5. Guantes 6. Gabacha 7. Recipientes de descarte de material 8. Tubos de ensayo 9. Muestras de sangre total anticoagulada con EDTA Procedimiento para la detección de los antígenos MN: 1- Preparar suspensiones de glóbulos rojos al 3-5% en solución salina. 2- Identificar los tubos a analizar como M y N. 3- Añadir 50ul del antisuero correspondiente. 4- Añadir 50ul de la suspensión de glóbulo a analizar. 5- Mezclar y centrifugar a 3500 rpm por 15 segundos. 6- Resuspender las células e interpretar las reacciones

Interpretación de resultados sistema MN Anti M Anti N Interpretación

+ 0 MM 0 + NN + + MN

Siempre incluya como control muestras de glóbulos rojos homocigotas para los antígenos a investigar tanto positivos como negativos. Procedimiento para la detección de los antígenos Ss: 1- Preparar suspensiones de glóbulos rojos al 3-5% en solución salina. 2- Identificar los tubos a analizar como S y s. 3- Añadir 50ul del antisuero correspondiente. 4- Añadir 50ul de la suspensión de glóbulo a analizar. 5- Mezclar e incubar por 30 minutos a 37ºC 6- Lavar tres veces con solución salina. 7- Añadir 100 ul gotas de reactivo de antiglobulina humana. 8- Mezclar y centrifugar a 3500 rpm por 15 segundos. 9- Resuspender las células e interpretar las reacciones.

10- Si el resultado es negativo, realizar la corroboración con células control. Procedimiento para la detección de los antígenos Ss: 1- Preparar suspensiones de glóbulos rojos al 3-5% en solución salina. 2- Identificar los tubos a analizar como S y s. 3- Añadir 50ul del antisuero correspondiente. 4- Añadir 50ul de la suspensión de glóbulo a analizar. 5- Mezclar e incubar por 30 minutos a 37ºC 6- Lavar tres veces con solución salina. 7- Añadir 100 ul gotas de reactivo de antiglobulina humana. 8- Mezclar y centrifugar a 3500 rpm por 30 segundos. 9- Resuspender las células e interpretar las reacciones. 10- Si el resultado es negativo, realizar la corroboración con células control.

Interpretación de los resultados sistema Ss Anti S Anti s Interpretación

+ 0 SS 0 + ss + + Ss

Práctica: Con técnica aséptica transfiera una alícuota de la sangre preservada en ALSEVER a un tubo adecuadamente rotulado. Guardar el resto de la muestra con solución de Alsever para próximas prácticas. De la muestra transferida, realizar tres lavados con solución salina fisiológica y preparar una suspensión al 3-5%. Determinar el fenotipo para los antígenos M N S y s. Procedimiento 15 Determinación fenotípica de los sistemas de grupo sanguíneo Kell, Duffy y Kidd. Principio: Los antígenos del sistema de grupo sanguíneo Kell se ubican en una proteína de un solo paso transmembrana de 93 KD; en ella se han podido identificar al menos 25 antígenos distintos. Este sistema se caracteriza por estar constituido por antígenos de alta y de baja incidencia dentro de la población. Se ha observado que 13 de estos antígenos son de alta frecuencia y al menos 5 de baja incidencia, algunos se encuentran organizados en cinco grupos alélicos, mientras que otros, principalmente los antígenos de alta frecuencia, pueden ser expresados independientemente. El antígeno Kell (K) sólo se expresa en la membrana del glóbulo rojo. El

promedio de sitios antigénicos varía de 2300 a 6100 en eritrocitos homocigotos para K y de 200 a 3500 en células heterocigotas Kk. El grupo sanguíneo Kell, es altamente inmunogénico y está completamente desarrollado al nacer. Al igual que con otros sistemas de grupo sanguíneo, el anti-K puede ser adquirido al exponerse a eritrocitos con presencia del antígeno, ya sea por una transfusión de sangre o por un embarazo donde el niña/o hereda el antígeno paterno. Con muy poca frecuencia se han descrito casos de anti-K y anti-k (Cellano) de presentación natural. Estos son del tipo IgM, reaccionan a temperatura ambiente y se presentan secundarios a infecciones agudas bacterianas, principalmente cuando el agente causal es una E. coli O125.b15. Desde el punto de vista inmune, los anti-K y anti-k son muy importantes, usualmente son anticuerpos del tipo IgG1 con fuerte actividad hemolítica in vivo El sistema Duffy está constituido por una glicoproteína de 35-43 kDa que se expresa en la membrana del glóbulo rojo. El número de sitios antigénicos en células Fy (a+b-) se ha estimado en 6900 y de 17000. Los antígenos del sistema Duffy están relacionados cuando menos con siete receptores diferentes de membrana, entre los que se incluyen al receptor de quimosinas y al receptor de los parásitos de la malaria. Un hecho importante y que se ha asociado mucho con procesos de evolución y adaptación de las especies, es que los glóbulos rojos con fenotipo Fy (a-b-), muy comunes en individuos de raza negra, son resistentes a la invasión de los parásitos de las especies de Plasmodium vivax y Plasmodium knowlesi. Los anticuerpos Duffy pueden causar reacción hemolítica severa, asimismo, su presencia en mujeres embarazadas debe de ser evaluada cuidadosamente monitoreando cambios constantes en el título de anti- Fy maternos. Se ha establecido que títulos de anticuerpos maternos de 1:64 o mayores deben de ser considerados de alto riesgo fetal y neonatal. En el sistema Kidd (Jk) se ha observado que sujetos Jk(a-b-) tienen resistencia a la lisis por la urea 2M, aunque conservan normal su función de permeabilidad al agua. Una característica del anticuerpo producido contra antígenos del sistema Kidd es que muestra destrucción mediada por complemento, dichos dichos anticuerpos se han observado en pacientes que son Jk(a-b-) en donde el 90% de las células Jk(a+b+) transfundidas son eliminadas en 30 minutos, mientras que se prolonga al triple cuando son células Jk(a+b-). Este anticuerpo también se encuentra asociado con la producción de cuadros de enfermedad hemolítica severa. Materiales 1. Tubos de pruebas limpios y secos 2. Pipetas pasteur 3. Solución salina 0.9% 4. Centrífuga serológica (3000 rpm )

5. Gradillas 6. Guantes 7. Gabacha 8. Recipientes de descarte de material 9. Tubos de ensayo Muestras: Muestras de sangre total anticoagulada con EDTA. Muestras preservadas con solución de Alsever. Reactivos: Anti-K, anti-k, anti-Fya, anti-Fyb, anti-Jka, anti-Jkb, albúmina al 22%, antiglobulina humana, Células Control de Antiglobulina Humana. Método:

1. Preparar suspensiones de glóbulos rojos al 3-5% en solución salina. 2. Identificar los tubos a analizar como K, k, Fya, Fyb, JKa, Jkb, control. 3. Añadir 50ul del antisuero correspondiente a cada tubo rotulado 4. Al tubo control añadir 50 ul de de albúmina al 22% 5. Añadir a todos los tubos 50ul de la suspensión de glóbulo a analizar. 6. Mezclar e incubar por 30 minutos a 37ºC 7. Lavar tres veces con solución salina. 8. Secar la ultima gota de salina con papel absorbente. 8. Añadir dos gotas de reactivo de antiglobulina humana 9. Mezclar y centrifugar a 3500 rpm por 15 segundos. 10. Resuspender las células, leer e interpretar las reacciones. 11. Si el resultado es negativo, realizar la corroboración con células control.

Interpretación de los resultados sistemas Kell, Duffy y Kidd. Anti K Anti k Anti Fya Anti Fyb Anti Jka Anti Jkb Interpretación

+ 0 - - - - KK 0 + - - - - kk + + - - - - Kk - - + 0 _ - Fya Fya - - 0 + - - Fyb Fyb - - + + - - FyaFyb - - 0 0 - - fyfy - - - - + 0 JkaJka - - - - 0 + JkbJkb - - - - + + JkaJkb - - - - 0 0 jkjk

Siempre incluya como control muestras de glóbulos rojos conocidos, tanto positivos como negativos, para los antígenos a investigar. Práctica: Tomar una alícuota de la sangre preservada en ALSEVER y transferir una muestra a un tubo adecuadamente rotulado. Realizar tres lavados con solución salina fisiológica y preparar una suspensión

al 3-5%. Determinar el fenotipo para los antígenos K, k, Fya, Fyb, Jka y Jkb. Procedimiento 16 Células rastreadoras o células pantalla Principio Parte de la rutina de un Banco de Sangre es la búsqueda constante de anticuerpos irregulares presentes en el suero de donadores o pacientes que puedan causar alguna reacción transfusional cuando se administra un hemocomponente. Se ha vuelto requisito obligatorio contar con células rastreadoras o pantalla que permitan establecer la presencia de alguno de estos anticuerpos. Estas células pueden ser obtenidas tanto comercialmente como realizadas en nuestro lugar de trabajo, deben ser del grupo O para evitar que los anticuerpos naturales interfieran en la detección de otros anticuerpos. Se obtienen a partir de donadores que son fenotipeados y que poseen los antígenos más comunes dentro de la población y que son reconocidos como de importancia clínica, es decir, capaces de causar una reacción transfusional o una enfermedad hemolítica del recién nacido. Las células seleccionadas deben contar con al menos en una de ellas uno de los siguientes antígenos: D, C, E, c, e, M, N, S, s, P1, Lea, Leb, K, k, Fya, Fyb, Jka y Jkb. Como el objetivo es detectar anticuerpos, la célula rastreadora ideal debe tener la mayor cantidad de expresión homocigota posible, ya que estas células poseen doble dosis de antígeno en contraposición con las células de individuos heterocigotas. Esto es importante pues hay mayor probabilidad de detectar anticuerpos que reaccionan débilmente o que presentan bajo título con células que expresan más cantidad de antígeno. Las células rastreadoras provenientes de tres donadores deberán ser homocigotas para antígenos del sistema Rh de la siguiente manera R1R1, R2R2 y rr. También en combinación deberán tener los antígenos homocigotas Kidd, Duffy y MNSs, los cuales se ha observado que muestran efecto de dosis. Otro punto importante que deben de cumplir las células rastreadoras es contar con al menos una célula Kell positivo ya que el antígeno Kell es altamente inmunogénico y de baja incidencia, con el objetivo de evitar severas reacciones transfusionales. Si un juego de reactivos no contiene un antígeno en particular, el correspondiente anticuerpo no podrá ser detectado cuando se realice la investigación Al interpretar un rastreo de anticuerpos se debe de contar con una tabla fenotípica en donde se indica cuáles antígenos están presentes en las células y que deben acompañar al juego de células según el lote del reactivo.

Las células rastreadoras pueden estar disponibles en diferentes presentaciones a modo de: - Un único vial, constituido por no menos de dos células de donantes que han sido mezcladas, a este se le conoce como pool, son menos sensibles y son utilizadas en el rastreo de anticuerpos en donantes de sangre. - Tres viales, proveniente de tres donantes diferentes, poseen una buena sensibilidad para la detección de anticuerpos y es la más utilizada en el país. - Seis viales, proveniente de 6 donantes diferentes son las que poseen la mayor capacidad de detección de anticuerpos. Para las pruebas pretransfusionales son requeridas la presencia de células Rastreadoras, de al menos tres viales para la detección de anticuerpos. La selección adecuada de as células permite la detección de niveles de anticuerpos muy bajos en el suero del receptor, lo cual es importante porque la ausencia de un antígeno, puede resultar en una respuesta inmune secundaria con una rápida producción de anticuerpo y destrucción del hemocomponente transfundido. Una vez confirmada la presencia de anticuerpo en un suero se tiene que investigar cual es el antígeno causante de la producción de este, por lo que se hace uso de paneles de identificación de anticuerpos que son un grupo de 11 a células con fenotipo completo y que en conjunto permiten establecer cuál es el antígeno causante. Método: Preparación de células pantalla • Preparar suspensiones de eritrocitos de donadores O al 3% en solución salina. • Las células escogidas de referencia son R1R1, R2R2, rr. • Hacer fenotipo para los grupos sanguíneos Duffy, MNSs, Kk, Kidd, Lewis y P. • Escoger las células del fenotipo adecuado. • Separar una cantidad de 150 cc de sangre, con el número de donador, fecha de extracción y de separación. • Agregar 150 cc de solución salina a la sangre separada. • Añadir 2 cc de gentamicina. • Añadir 1 cc de penicilina y agitar. • Guardar a 4 ºC en el espacio de sangre en cuarentena. • Las células se deben de cambiar cada mes. • Si se considera necesario se puede añadir soluciones preservantes como CPD o Alsever para mantener la calidad y viabilidad de las células Práctica: Proceder a anotar en la pizarra su fenotipo completo. Una vez anotados todos los integrantes, seleccionar los mejores perfiles para una célula rastreadora.