La fluorescencia es un proceso de fotoluminiscencia en que los tomos y molculas se excitan con la absorcin de la radiacin electromagntica. Despus, la especie excitada se relaja al estado fundamental y emite su exceso de energa como fotones. La caracterstica mas atractiva de la fluorescencia molecular es su sensibilidad inherente, habitualmente de uno a tres ordenes de magnitud mayor que con la espectroscopia de absorcin. De hecho con este mtodo se ha detectado una sola molcula de especies seleccionada y en condiciones controladas. Otra ventaja de los mtodos de fluorescencia es su amplio intervalo de concentracin lineal, significativamente mayor que en la espectroscopia de absorcin .Sin embarg, los mtodos de la fluorescencia tiene menos ampliaciones que los mtodos de la absorcin, dado el numero relativamente limitado de sistemas qumicos que presentan fluorescencia apreciable. Adems, esta ltima se ve sujeta a muchos ms efectos de interferencia ambiental que los mtodos de absorcin. Aqu se consideran alguno de los aspectos ms importantes de los mtodos de fluorescencia molecular.

TEORIA DE LA FLUORESCENCIA MOLECULAR

La fluorescencia molecular se cuantifica al excitar la muestra a la longitud de onda de absorcin, tambin llamada longitud de onda mayor, denominada longitud de onda de emisin o fluorescencia.Generalmente, la emisin de fluorescencia se mide en ngulo recto haz incidente, para no medir la radiacin incidente. La emisin que tiene un tiempo de vida mas corto se denomina fluorescencia, mientras que la luminiscencia que permanece por ms tiempo se llama fosforescencia.

Procesos de relacin

La figura ilustra el proceso deseado: la fluorescencia Casi siempre implica una transicin desde el estado electrnico excitado ms bajo. E1 hasta el estado fundamental, E0. La fluorescencia tambin puede ocurrir nicamente desde el nivel vibracional mnimo de E1 hasta los distintos niveles vibracionales de E0. Esto se debe a que la conversacin interna y la relacin vibracional son procesos ms rpidos que la fluorescencia. Por lo tanto, un espectro de fluorescencia suele constar de una sola banda con muchas lneas estrechas, que representan transiciones desde el nivel vibracional mnimo de E1 hasta los distintos niveles vibrascionales de E0.La lnea de l figura con la que finaliza la banda de fluorescencia con la longitud de onda mas corta o mayor energa es idntica, en energa a la lnea denominada en el diagrama de absorcin de la figura. Puesto que las lneas de fluorescencia en esta banda se original en el estado vibracional mnimo de E1, todas de las dems lneas de la banda son de menor energa o mayor longitud de onda que la correspondencia a. Las bandas de fluorescencia molecular se componen principalmente de lneas de longitud de onda mas larga, frecuencia mas baja y, por tanto menor energa si se comparan con la banda de radiacin absorbida que origina su excitacin. Esta desviacin o desplazamiento a longitudes de onda mayores se denomina desplazamiento de Stokes.

Especies fluorescentes

La fluorescencia es uno de los distintos mecanismos por los que una molcula regresa al estado fundamental despus de ser excitada por la absorcin de radiacin. Todas las molculas absorbentes tienen potencial para ser fluorescentes; pero muchos compuestos no lo hacen porque su estructura permite otros mecanismos de relajacin sin radiacin que ocurre con mayor rapidez que la emisin de fluorescencia. El rendimiento cuntico de la fluorescencia molecular es simplemente el cociente o fraccin del nmero de molculas con fluorescencia sobre el nmero total de molculas excitadas, o bien la de fotones emitidos sobre fotones absorbidos. Las molculas muy fluorescentes, como la fluorescena, poseen una eficiencia cuntica cercana a la unidad en ciertas condiciones, mientras que en las especies no fluorescentes es cero.

Fluorescencia y estructura Los compuestos con anillos aromticos tienen la emisin de fluorescencia molecular ms intensa y til. Aunque tambin tienen fluorescencia ciertos compuestos de carbonilos alifticos y alicclicos, as como estructuras de doble enlace muy conjugados, son pocos en comparacin con el nmero de sustancias fluorescentes que contienen sistemas aromticos.Muchos hidrocarburos aromticos no sustituidos tienen fluorescencia en solucin, con eficiencia cuntica creciente a medida que aumenta el nmero de anillos y su grado de condensacin. Los heterocclicos ms sencillos, como la piridina, furano, tiofeno y pirrol, no presentan fluorescencia molecular: pero las estructuras de anillos fusionados que contienen estos anillos frecuentemente si la poseen .La sustitucin en un anillo aromtico produce desviacin en la longitud de onda de los mximos de absorcin y los cambios respectivos en los picos de fluorescencia. Adems, es frecuente que la sustitucin afecte a la eficiencia de fluorescencia.

Efecto de la rigidez estructuralLos expertos muestran que la fluorescencia resulta favorecida en particular por la rigidez molecular. Esta rigidez disminuye la relacin de relajacin no radiante hasta el punto en el que la relajacin por fluorescencia cuenta con tiempo suficiente para ocurrir. Existen muchos ejemplos similares de este tipo de comportamiento. Adems, la emisin frecuentemente ocurre cuando los colorantes fluorescentes se absorben en una superficie solida; una vez ms, la rigidez adicional explicara el efecto observado.La influencia de la rigidez tambin explica el aumento de la fluorescencia de ciertos agentes quelantes orgnicos cundo forman complejos con iones metlicos.

Efecto de la temperatura y de los disolventes En l mayor parte de las molculas, la eficiencia cuntico de fluorescencia disminuye al aumentar la temperatura, debido a que la mayor frecuencia de colisiones aumenta las probabilidades de relajacin por colisin.

INTRUMENTACION EN FLUORESCENCIA

En la figura se muestra los diagramas pticos de los instrumentos ms tpicos. Si los dos selectores de longitud de onda son filtros, el instrumento se llama fluorimetro, y si ambos son monocromadores, espectrofluorimetro .Algunos instrumentos son hbridos y utilizan un filtro de excitacin adems de un monocromador de emisin. Los instrumentos de fluorescencia puedes incluir un diseo de doble haz para compensar los cambios de la energa radiante de la fuente con el tiempo y de la longitud de onda. Se llama espectrofluorimetros rectificadores a los instrumentos que corrigen la distribucin espectral de la fuente.Las fuentes de fluorescencia suelen ser ms potentes que las que se utilizan en absorcin. En fluorescencia, la energa radiante emitida es directamente proporcional a la intensidad de la fuente.Las lmparas de arcos de mercurio, xenn-mercurio, as como los lseres, son fuertes de fluorescencia habituales. Los monocromadores y transductores suelen ser similares a los usados en espectrofotmetros de absorcin, salvo que los espectrofluorimetros de alta sensibilidad invariablemente utilizan fotomultiplicadores. Los fluorimetros y espectrofotmetros varan mucho en su grado de refinamiento, caractersticas de funcionamiento y coste, al igual que los espectrofotmetros de absorcin. En general, los instrumentos de fluorescencia son ms costosos que los de absorcin igual calidad.Aplicaciones de los mtodos de fluorescencia

La espectroscopia de fluorescencia no se considera una herramienta de anlisis cualitativo o estructural importante, ya que es frecuente que molculas con pequeas diferencias estructurales tengan espectros fluorescentes similares. Adems, las bandas de fluorescencia en solucin son relativamente amplias a la temperatura ambiental. Sin embargo, la fluorescencia ha resultado valiosa en la identificacin de derrames petroleros. La fuente de los hidrocarburos vestidos se puede conocer comparando el espectro de emisin de fluorescencia de la muestra derramada con el de la presunta fuente. La estructura de vibracin de los hidrocarburos policiclicos del petrleo posibilita tal identificacin.Los mtodos de fluorescencia se utilizan para el estudio de los equilibrios qumicos y de su cintica, al igual que la espectrofotometra de absorcin, siendo posible la evaluacin de reacciones qumicas en concentraciones ms bajas dada la mayor sensibilidad de los mtodos de fluorescencia. En muchos casos, en los que por lo general no es viable el estudio con la emisin de fluorescencia, pueden enlazarse sondas o marcadores fluorescentes de manera covalente en posiciones especficas de las molculas, como las protenas, lo que hace que se puedan detectar por fluorescencia. Estos marcadores pueden emplearse para obtener informacin relativa a los procesos de transferencia de energa, polaridad de la protena y distancias entre posiciones reactivas.

Mtodos para especies inorgnicas.Los reactivos fluorimetricos con ms xito en la determinacin de cationes son compuestos aromticos con dos o ms grupos funcionales donadores que forman quelatos con el ion metlico. Un ejemplo caracterstico es la 8 hidroxiquinoleina. En el caso de algunos reactivos, el catin se extrae en una disolucin del reactivo en un disolvente orgnico inmiscible, como el cloroformo, y as se mide la fluorescencia de la solucin orgnica.

Mtodos para especies orgnicas y bioqumicas El nmero de aplicaciones de los mtodos fluorimetricos a problemas orgnicos es muy elevado. Espectroscopia fluorescente de algunos compuestos orgnicos, entre ellos sustancias tan diversas como la adenina acido antranilico, hidrocarburos policiclicos aromticos, cistena, guanina , isoniazida , naftoles , los gases sarn y tabun, protenas ,acido saliclico, eskatol ,triptfano, acido rico y warfrina . Tambin se enumeran muchos agentes medicinales que pueden determinarse por fluorometria, como la adrenalina, morfina, penicilina, fenobarbital, procaina reserpina y dietelamida del acido lisrgico (LSD). Es indudable que la aplicacin mas importante de la fluorimetria corresponde al anlisis de productos alimenticios, sustancias farmacuticas, muestras clnicas y productos naturales.