FISIOLOGÍA, TOXICOLOGÍA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

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EFECTO DEL CICLO CIRCADIANO SOBRE LA RESISTENCIA A PERMETRINA EN Aedes aegypti (L.)

Olga Karina Villanueva-Segura, Edna Karina Barragán-Camacho, Selene Marlen Gutiérrez-Rodríguez, Gustavo Ponce-García, Adriana Elizabeth Flores-Suárez. Universidad Autónoma de Nuevo León. Facultad de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Fisiología y Toxicología. Av. Universidad S/N, San Nicolás de los Garza, N.L. C.P. 66451. adriana.floressr@uanl.edu.mx, karinaypwm@gmail.com. RESUMEN. Los seres vivos han estado sometidos a ciclos de luz-oscuridad que han permitido incrementar sus aptitudes en diversos nichos ecológicos. Los ciclos circadianos están involucrados en la fisiología, como por ejemplo, liberación de hormonas ó el metabolismo. Estudios recientes, muestran que los insectos presentan susceptibilidad a agentes tóxicos de forma dependiente al ciclo circadiano, este efecto se sugiere porque los procesos bioquímicos que están implicados en el metabolismo de los agentes tóxicos, como la desintoxicación en respuesta al estrés oxidativo, se encuentran modulados por el ciclo circadiano. Se realizaron bioensayos para la evaluación del efecto del ciclo circadiano sobre la resistencia a permetrina en una población de Aedes aegypti (L). Los resultados muestran que al modificar el fotoperiodo 12:12 por el fotoperiodo 0:24 la susceptibilidad de la población de Ae. aegypti aumenta y hay una sobre-expresión de enzimas -esterasas y GST, involucradas en la resistencia metabólica a la permetrina. Palabras clave: ciclo circadiano, resistencia, permetrina, Aedes aegypti.

Circadian cycle effect on resistance to permethrin in Aedes aegypti (L) ABSTRACT. Living organisms have been exposed to light-dark cycles that allowed them to increase their skills in different ecological niches. Circadian cycles are involved in the physiology such as hormone release or metabolism. Current studies mentioned that insects have shown susceptibility to toxic agents of the circadian cycle-dependent manner, because the biochemical processes that are involved in metabolism of toxic agents, as detoxification in response to oxidative stress are modulated by the circadian cycle. These experiments were performed to evaluate the effect of circadian cycle on resistance to permethrin in Aedes aegypti (L) populations. The results showed that the population of Ae. aegypti is more susceptible at 0:24h compared to 12:12h light:dark cycle and enzymes - esterases and GST are altered. Key words: circadian cycle, resistance, permethrin, Aedes aegypti. Introducción

Los insectos y la mayoría de los organismos vivos presentan ritmos circardianos en diversas variables fisiológicas (Simonetta et al., 2008). Particularmente se han reportado que insectos y ácaros muestran un ritmo circadiano de susceptibilidad a agentes tóxicos (Beck, 1963; Cole y Adkisson, 1964; Polcik et al., 1964). Estudios recientes, obtenidos por la técnica de microarreglos, han sugerido que existen genes regulados por el ciclo circadiano y éstos se encuentran involucrados en el proceso de desintoxicación inducido por estrés oxidativo en Drosophila melanogaster (McDonald y Rosbash, 2001; Claridge-Chang et al., 2001; Fernanda-Ceriani et al., 2002).

Experimentos realizados por Yang et al. (2010), mostraron evidencias de la relación entre el ciclo circadiano y la resistencia a permetrina. La diferencia en el tiempo de derribo (knock-down) en la población susceptible de mosquitos expuestos a 0.02% de permetrina en diferentes tiempos del día mostraron que la susceptibilidad de Ae. aegypti a este insecticida fue sujeta al ciclo circadiano.

Los mosquitos mostraron una alta susceptibilidad durante la fase de oscuridad (escotofase) más que la fase de luz (fotofase); el tiempo knock-down fue más largo durante la hora 9 de la fotofase y fue consistentemente más bajo durante la escotofase. En constante

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oscuridad, el tiempo knock-down fue más corto durante la noche subjetiva (especialmente a la hora 17 y la hora 21) y más largo en el día subjetivo. Este descubrimiento implica que la cepa de Ae. aegypti incrementa la resistencia durante su fase activa, es decir, en la fase de luz durante el fotoperiodo. Este hallazgo fue mucho más profundo en la población resistente. El objetivo de este trabajo fue determinar el efecto de los fotoperiodos 0:24 y 12:12 en la resistencia a permetrina en dos poblaciones de Aedes aegypti (L.). Materiales y Método

Estadios inmaduros de Ae. aegypti fueron recolectados de criaderos naturales temporales de la localidad Vergel, Mérida, Yucatán que se encuentra ubicada entre los paralelos 20° 45' y 21° 15' de latitud norte y los meridianos 89° 30' y 89° 45' de longitud oeste.

El material fue colocado en charolas de plástico con agua declorada, a las larvas se les proporcionó como alimento proteína de hígado en polvo al 50% con base en agua. Al llegar al estadio de pupa, se colocaron en envases de 250 ml en jaulas (30x30 cm) hasta que emergieron los adultos. Los mosquitos machos fueron alimentados con solución azucarada al 10% y a las hembras se les proporcionó Rattus norvegicus para la producción de huevos. Se colocaron dentro de las jaulas envases con agua e internamente revestidos con papel filtro como superficie de ovoposición. Los huevos depositados correspondieron a la generación filial F1, con las cuales se llevaron a cabo los bioensayos. Se utilizó la población de referencia susceptible Rockefeller, suministrada por la CDC de Puerto Rico. Todas las poblaciones de Ae. aegypti se mantuvieron a temperatura de 25◦C±2◦C y 70% ±2 de humedad relativa.

Hembras de la F1 de 1 a 3 días de emergidas sin alimentación sanguínea fueron utilizadas para los bioensayos y fueron sometidas a cambio en el fotoperiodo 0 hrs luz: 24hrs oscuridad (0:24) sin modificación de alguna otra variable, se utilizaron como testigo mosquitos hembra, de características similares a los descritos previamente pero con el fotoperiodo 12:12, de acuerdo a lo descrito a Yang et al., (2010). Los bioensayos se llevaron a cabo siguiendo la metodología de botella impregnada propuesta por el Centro de Control y Prevención de Enfermedades (CDC) de Atlanta, USA (Brogdon y McAllister 1998a), usando el insecticida permetrina (Chem Service, 40.1% de pureza cis-58.7% trans). Se emplearon en promedio ocho dosis, y tres repeticiones por dosis colocando 20 mosquitos por repetición. El efecto de derribo (knock-down) fue registrado cada 10 minutos, hasta completar 1 hora de exposición al insecticida, finalizado este tiempo, los mosquitos se colocaron en cámaras de recuperación, donde se les proporcionaron algodones impregnados con solución azucarada al 10% como fuente de alimento .Se registró la mortalidad a las 24 horas. Los bioensayos se realizaron bajo las condiciones de temperatura y humedad descritas anteriormente.

Se determinó CK50 (concentración knock-down media) a la hora de exposición y CL50 (concentración letal media) a las 24 hrs. Además se calcularon TK50, TL50 (tiempo knock-down medio y tiempo letal medio). Los resultados se analizaron por medio del software QCal (Lozano-Fuentes et al., 2012). Se utilizó la fórmula de corrección de mortalidad de Abbott (1925) cuando hubo mortalidad en el testigo. Los intervalos de confianza fueron calculados con una α = 0.05 y se determinó la diferencia significativa entre los valores con base en el traslape de los mismos. Se calculó el factor de resistencia a la hora de exposición (FRCK50), y a las 24h (FRCL50), dividiendo los valores de CK50 de la población de campo entre los valores de CK50 de la cepa de referencia Rockefeller, e igualmente se hizo para los valores de CL50. Se consideró el criterio

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propuesto por Mazzarri y Georghiou (1995) para clasificar FR’s en resistente (>10X), tolerante (entre 5 y 10X) y susceptible (<5X).

Para la cuantificación de enzimas se prepararon homogenatos de 30 mosquitos por población de acuerdo a lo descrito Brogdon (1989) y el CDC (2002). Se cuantificaron enzimas alfa y beta esterasas, oxidasas, GST y acetilcolinesterasa insensible. Los resultados obtenidos se analizaron mediante ANOVA (α = 0.05) y comparación múltiple de medias utilizando el programa SPSS v17. Finalmente, la extracción de ADN se realizó según la técnica de Black y Munstermann (1996). La mutación kdr Ile 1,016 según lo descrito por Saavedra et al., (2007). Resultados y Discusión

En el cuadro 1 se muestran los valores de CK50 y CL50 de las poblaciones de Vergel y Rockefeller. En la población de Vergel, como se observa en la Tabla 1 en el fotoperiodo 12:12 se obtuvo una concentración CK50 de 9.90 g/botella; al someter a la población a la modificación de fotoperiodo a 0:24 hrs, el valor de CK50 aumentó a 11.8 g/botella, sin embargo el intervalo de confianza muestra un traslape en los límites de confianza indicando que no existe diferencia significativa entre los valores de CK50 para ambos fotoperiodos. Del mismo modo, para la población susceptible Rockefeller, se obtuvo un valor de CK50 de 0.42 g/botella. Al hacer la comparación con el período 0:24hrs en la misma población, se encontró un aumento en el valor de CK50 siendo 0.56 g/botella, sin presentarse un traslape en los intervalos de confianza, indicando diferencia significativa de estos valores en los dos fotoperiodos probados. Los valores de FRCK50 muestran que la población de Vergel presentó mayor resistencia knock-down a la permetrina en el fotoperíodo 12:12 con un valor de 23.7X con respecto al fotoperíodo 0:24 con un valor de 20.9X.

Para el caso de CL50 en el fotoperiodo 12:12hrs, se obtuvo para la población Vergel, la concentración de 6.93g/botella, y para el período 0:24hrs, fue de 7.08 g/botella, sin presentar diferencia significativa entre los valores en ambos fotoperíodos. Para la población de referencia Rockefeller, el valor de CL50 para el fotoperiodo 12:12hrs fue 0.24g/botella y para el período 0:24hrs fue 0.42g/botella, mostrando diferencia significativa entre los mismos. Los valores de FRCL50 indican que la población de Vergel fue más resistente a las 24h a la permetrina en el fotoperíodo 12:12 con un valor de 29.4X con respecto a 0:24 con un valor de 16.95X.

Los resultados de resistencia knock-down y post-recuperación a las 24h obtenidos en nuestro estudio concuerdan con lo reportado por Yang et al., (2010) quienes proponen que los mosquitos muestran mayor susceptibilidad durante la fase oscura del fotoperiodo y que durante la fase de luz del mismo, aumentan la resistencia, porque se considera esta fase como su estado activo.

El cuadro 2 muestra el tiempo de derribo TK50 a 1h de exposición a la permetrina y el tiempo letal medio TL50 después de 1h de exposición y 24h de recuperación en las poblaciones bajo estudio. No se encontró diferencia significativa en los valores TK50 y TL50 entre las poblaciones y los fotoperiodos analizados.

En el cuadro 3 se muestran los valores promedio de absorbancia para las enzimas -esterasas, -esterasas, oxidasas, GST y acetilcolinesterasa insensible analizadas en las poblaciones Vergel y Rockefeller en los fotoperiodos 12:12hrs y 0:24 hrs.

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Cuadro 1. Concentración knock-down (KC50), concentración letal (CL50) de permetrina y factores de resistencia (FR) de hembras de Ae. aegypti de las poblaciónes Vergel, Mérida, Yucatán y susceptible Rockefeller, expuestas a 12:12 hrs y 0:24 hrs, luz: oscuridad.

Población 2CK50 (95% CI)

4b+EE 3FRCK50

5CL50 (95% CI)

b+EE 6FRCL50

1N

Vergel 12:12 hrs

9.90 (8.950-10.950)

2.07 (0.1980)

23.7

6.93 (5.954-8.064)

1.46 (0.1543)

29.4

540

Rockefeller 12:12hrs

0.42 (0.387-0.450)

2.73 (0.2734)

-- 0.24 (0.199-0.279)

1.38 (0.1656)

-- 536

Vergel 0:24 hrs

11.8 (10.668-12.983)

2.20 (0.2230)

20.9

7.08 (6.243-8.029)

1.91 (0.1888)

16.95

479

Rockefeller 0:24hrs

0.56 (0.529-0.595)

3.76 (0.3616)

-- 0.42 (0.388-0.449)

3.23 (0.3670)

-- 462

1Número de hembras utilizadas en el bioensayo, 2CK50 concentración knock-down media a 1h de exposición en g/botella, 95% intervalos de confianza en paréntesis, 3FRCK50, Factor de Resistencia Knock-down: CK50 población Vergel/ CK50 población susceptible, 4pendiente de la regresión log-probit, error estandar (+ EE) en paréntesis. 5CL50 concentración letal media a 1h de exposición y 24h post-recuperación en g/botella, 63FRCL50, Factor de Resistencia Post-recuperación: CL50 población Vergel/ CL50 población susceptible Cuadro 2. TK50 y TL50 en minutos e intervalos de confianza (= 0.05) de hembras de Ae. aegypti de la población Vergel, Mérida, Yucatán y cepa susceptible, expuestas a permetrina en fotoperiodos 12:12 hrs y 0:24 hrs, luz:oscuridad

Población TK50

95% IC

TL50

95% IC

Vergel 12:12hrs 54:35 (47:15 – 63:18) 674:38 (384:09-1183:03) Rockfeller 12:12hrs 51:27 (47:21 - 55:27) 244:27 (159:35-375:44)

Vergel 0:24hrs 58:21 (49:25 – 69:21) 539:04 (281:12-1032:04) Rockfeller 0:24hrs 54:47 (49:45 – 60) 360:43 (228:18-570:32)

Cuadro 3. Valores promedio de absorbancia y desviación estándar (DE) para cada mecanismo enzimático en las poblaciones de Ae. aegypti resistentes y susceptibles a permetrina expuestas a dos fotoperiodos.

Población α- est DE β-est DE oxi DE gst DE iAche DE Vergel

12:12hrs 0.646 0.054 0.776 0.117 0.807* 0.054 0.052 0.029 0.009 0.001 Rockfeller 12:12hrs 0.586 0.042 0.758 0.095 0.198 0.041 0.059 0.025 0.0302 0.005 Vergel 0:24hrs 0.673 0.056 0.957* 0.115 0.238* 0.040 0.067* 0.038 0.020 0.007

Rockfeller 0:24hrs 0.699 0.054 0.747 0.093 0.179 0.044 0.057 0.0148 0.0007 0.023

*valores mayores significativamente (p<0.05) de la población resistente Vergel con respecto a la cepa susceptible para cada fotoperíodo idependientemente.

Los resultados muestran a las enzimas oxidasas sobre-expresadas significativamente en la población de Vergel en el fotoperíodo 12:12 con respecto a la población susceptible, este mecanismo se encontró también expresado cuando la población fue expuesta al fotoperíodo 0:24, luz: obscuridad. Sin embargo, existe una sobre-expresión de enzimas -esterasas y GST en la población de Vergel con respecto a la cepa susceptible en el fotoperíodo 0:24, luz: obscuridad.

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Esto puede sugerir que estas enzimas involucradas en la resistencia metabólica podrían estar siendo expresadas en relación con el ciclo circadiano (Ptitsyn et al., 2011).

En el cuadro 4 se observa el número total de individuos que presentan el alelo Ile 1,016, en el gen de kdr, el cual está asociado a la resistencia knock-down a piretroides en poblaciones de Ae. aegypti. La población de Vergel presentó el genotipo mutante en ambos fotoperíodos con resultados similares, lo que sugiere que este mecanismo de resistencia no parece estar mediado por el ciclo circadiano. Cuadro 4. Frecuencia del alelo Ile 1016 en las poblaciones de Ae. aegypti, expuestas a 12:12hrs y 0:24hrs luz:oscuridad

Población N A/A mutante A/G Heterocigoto G/G tipo silvestre Vergel 12:12 hrs 15 11 0 4 Vergel 0:24 hrs 15 14 0 1

Rockefeller 12:12hrs 15 0 0 15 Rockefeller 0:24hrs 15 0 0 15

Conclusiones

La población de Ae. aegypti muestra mayor susceptibilidad cuando es expuesta a fotoperíodo 0:24h, luz: obscuridad con respecto 12:12h.

Las enzimas -esterasas y GST se expresan en las poblaciones expuestas al fotoperiodo 0:24h en adición a las oxidasas las cuales se sobre-expresaron significativamente para ambos fotoperíodos. Esto puede sugerir que tanto -esterasas como GST podrían estar mediadas por el ciclo circadiano La mutación Ile 1,016 estuvo presente en la población de Vergel como mecanismo principal de resistencia knock-down, sin embargo no parece estar relacionado con el cambio en los fotoperíodos. Literatura Citada Abbott, W. S. 1925. A method of computing the effectiveness of an insecticide. J. Econ.

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EFECTO DE LA ELIMINACIÓN CON ANTIBIÓTICOS DE BACTERIAS SIMBIÓTICAS DEL INTESTINO MEDIO SOBRE PARÁMETROS

BIOLÓGICOS DE Aedes aegypti (L.)

Jesús Antonio Dávila-Barboza, Laura Mayela Montes-Rincón, Gustavo Ponce-García y Adriana Elizabeth-Flores Suárez. Universidad Autónoma de Nuevo León. Facultad de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Fisiología y Toxicología de Insectos. Pedro de Alba S/N. Cd. Universitaria, C.P. 66450, San Nicolás de los Garza, Nuevo León. México. adriana.floressr@uanl.edu.mx.com, jesusdavilaqbp@gmail.com.

RESUMEN. Se llevo a cabo la evaluación de los efectos sobre algunos parámetros biológicos de la eliminación de bacterias simbióticas de Aedes aegypti (L.) usando el antibiótico penicilina. La administración de penicilina (200ppm) incluida en solución de sacarosa al 10% posterior a 5 días de inanición mostro ser una técnica efectiva para el consumo por parte del mosquito y la eliminación de las bacterias simbióticas del intestino medio de hembras de Ae. aegypti hasta en un 100%. Esto se comprobó posteriormente en cultivos con medios BHI y LB. Dicha eliminación mostro tener efectos notorios en la fecundidad y la supervivencia de las hembras de la colonia tratada, así como su F1, mientras que en la fertilidad y longitud alar no se mostro alteración significativa. Palabras clave: Aedes aegypti, penicilina, simbiontes, fecundidad, fertilidad. Removal of symbiotic bacteria with antibiotics from the midgut of Aedes aegypti (L.) and it

effect on biological parameters

ABSTRACT. An experiment was carried out to assess the effect of symbiotic bacteria removal by penicillin from the midgut of Aedes aegypti. The administration of penicillin (200ppm) in sucrose solution at 10% after 5 days of starvation showed to be an effective technique removing symbiotic bacteria up to 100%. This was checked using culture bacteria media BHI and LB of the midgut of Ae. aegypti. The bacterias elimination showed noticeable effects on fertility and survival of females treated with the antibiotic as well as its F1 generation. Fertility and development (wing length) did not showed significant change. Key words: Aedes aegypti, penicillin, symbionts, fecundity, fertility. Introducción

Los insectos albergar muchos microorganismos que colonizan y crecen dentro de sus tejidos, principalmente en el sistema digestivo. Estos están involucrados en varios procesos fisiológicos, incluyendo la digestión de los alimentos, la nutrición, la fijación del nitrógeno y la reproducción. En particular, se ha demostrado el papel de las bacterias asociadas al intestino medio en la digestión de alimentos en varias especies de insectos (Dillon y Dillon, 2004).

Las bacterias asociadas con el intestino de varias especies de mosquitos han sido ampliamente estudiadas tanto en laboratorio como en campo (DeMaio et al., 1996; Gusmão et al., 2010), informes recientes han demostrado que estas bacterias parecen reforzar el sistema inmune del mosquito e indirectamente mejorar la protección contra parásitos de la malaria (Dong et al., 2009; Rodrigues et al., 2010). Sin embargo, poco se sabe sobre el papel funcional de estos microorganismos en la digestión de los alimentos. Un estudio (Gusmão et al., 2010) propuso que las bacterias presentes en el intestino de Aedes aegypti (L.) podrían desempeñar un papel en el metabolismo de azúcares. Su función en la digestión de la sangre no se ha determinado hasta la fecha, a pesar de que es bien sabido que la población bacteriana aumenta sustancialmente después de alimentarse de sangre (DeMaio et al., 1996: Pumpuni et al., 1996; Gusmão et al., 2010), lo que sugiere una posible contribución al proceso digestivo como se observa en otros insectos (Cazemier et al., 1997)

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Koga, et al. (2007) llevaron a cabo la eliminación selectiva de simbiontes por antibióticos como ampicilina y rifampicina para su eliminación en algunos áfidos para obtener una comprensión individual de las funciones biológicas de estos simbiontes. En hormigas del genero Camponotus, consideradas omnívoras, se ha estudiado el aporte de los simbiontes en la mejora nutricional, al determinar que en grupos aposimbioticos se llegaba a compensar con la proporción de dietas ricas en aminoácidos esenciales (Feldhaar, et al. 2007). Evans, et al. (2009) al incrementar la infección por Wolbachia pipientis simbionte de Ae. aegypti aumenta la actividad, refiriéndose a la ubicación de compañeros, hospederos humanos, lugares de descanso y sitios de ovoposición y su tasa metabólica (Evans, et al. 2009). En Ae. aegypti la ingestión de diversos antibióticos afectan la lisis de glóbulos rojos, retardo en la digestión de proteínas de la sangre y la reducción en la producción de huevos; esto último tomando en cuenta que la proteína de la sangre suple de aminoácidos necesarios para la síntesis de vitelogenina indispensable para la producción de huevos (Gaio, 2011). El enfoque de este estudio fue el de evaluar el efecto que tienen ciertos antibióticos sobre algunos factores fisiológicos mediante la eliminación de bacterias simbióticas del intestino medio de Ae. aegypti, basados en la hipótesis de que las bacterias simbióticas habitantes del intestino medio de Ae. aegypti, tienen un papel esencial en los factores fisiológicos del insecto como: la producción de huevos, su viabilidad y el desarrollo de su descendencia. Materiales y Método

Material biológico. Se utilizó una colonia de Ae. aegypti recolectada en la localidad de Motul de Carrillo Puerto, Yucatán, México. Los mosquitos (machos y hembras) fueron mantenidos en jaulas de 20x20x20 cm y se alimentaron con una solución azucarada al 10% y a las hembras se les proporcionó Rattus norvergicus (Berkenhout) como fuente de sangre. Se colocaron vasos de plástico con agua y tiras de papel filtro como superficie de ovoposición en cada jaula. Los huevos ovopositados se recolectaron cada semana; retirando y sustituyendo las papeletas las cuales se mantuvieron húmedas de 48 a 72 hrs, después fueron secadas a temperatura ambiente por dos días para asegurar el proceso de embrionación. Los huevos se colocaron en charolas plásticas con agua destilada y un poco de levadura para su eclosión. Las larvas se alimentaron con proteína de hígado, las pupas se transfirieron a vasos dentro de jaulas para la obtención de adultos.

Tratamiento con antibióticos. Inicialmente, las jaulas se limpiaron con etanol al 70% antes de la introducción de las pupas. Los mosquitos adultos (estos representan la generación parenteral) se sometieron a inanición por 5 días para posteriormente ser alimentados con una solución al 10% de sacarosa estéril mezclada con penicilina (200 ppm). Las hembras del grupo control se alimentaron solamente con solución de sacarosa al 10% estéril sin antibióticos. La alimentación se realizo durante nueve días consecutivos posteriores a los cuales recibieron una alimentación de sangre.

Recuento bacteriano. Veinticuatro horas después de la alimentación con el antibiótico, los mosquitos tratados con penicilina se esterilizaron superficialmente por inmersión durante un minuto en etanol al 70% por triplicado y se enjuagaron en un buffer fosfato salino (PBS). Del último lavado con etanol se tomaron 100 µl para ser sembrados como control en medio Brain Hear Infusion (BHI) y medio Luria Bertani (LB) (Icaza, 2009). Los mosquitos se disectaron bajo microscopio estereoscópico en un portaobjetos con PBS estéril. El intestino medio fue lavado en PBS estéril y transferido a un tubo de 2 ml con 100 µl de PBS. El contenido del tubo se mezclo a fondo con un vórtex y fue diluido en serie (10-1 hasta 10-7), una alícuota de 100 µl de cada tubo se

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transfirió a las placas Petri con medio BHI y con un duplicado en medio LB. Las placas se incubaron a 34 °C durante 24-48 h. Se realizo el conteo de colonias y se registraron como unidades formadoras de colonias (UFC/ml). Como control positivo se realizo el mismo procedimiento en mosquitos sin tratamiento con antibiótico (Gusmão, 2010; Ben-Yakir, 1987).

Evaluación de la fecundidad. Mosquitos hembra (generación parenteral) tratados con antibiótico (Colonia1, n=30) y controles (C. Control, n=19), se alimentaron con sangre, de manera que los huevos se pudieran desarrollar y así determinar la fecundidad; esperando una semana para llevar a cabo el conteo de los huevos. El número de huevos puestos por hembra en el papel filtro se registró semanalmente, siguiendo este proceso hasta la muerte de la última hembra y calculándose así la fecundidad dividiendo el total de huevos por semana sobre el total de hembras vivas. La fecundidad fue analizada estadísticamente utilizando una prueba de Kruskal-Wallis (P< 0.05).

Fertilidad. Después de la ovoposición, las tiras de papel de filtro se colocaron en charolas para su eclosión, proceso antes descrito. La fertilidad se determino por el número de larvas eclosionadas en función al número de huevos puestos por semana.

Supervivencia. Al momento de llegar al estado de pupa, estas se transfirieron a una jaula hasta la emergencia de los adultos. El cálculo del porcentaje de supervivencia se efectuó tomando en cuenta el número de adultos obtenidos en función del número de larvas vivas recuperadas por semana. De estas larvas se tomo una parte (Colonia α, n= 43) correspondiendo a la F1 y se midieron los parámetros antes descritos para la generación parenteral.

Longitud alar. Bajo el microscopio estereoscopio con ocular graduado se tomaron las medidas de las alas de los mosquitos como referencia del desarrollo de estos, de la Colonia Control, Colonia1 (generación parenteral tratada con antibióticos), Colonia α (F1) y los mosquitos de la F2. Resultados y Discusión

Eliminación de bacterias simbióticas del intestino medio por penicilina. Se realizo la recuperación de bacterias simbióticas del intestino medio (resultados no mostrados) de Ae.

aegypti en medios BHI y LB, los cuales resultaron ser muy efectivos como auxiliares para este objetivo (Gusmão, 2010). La administración de penicilina incluida en la solución de sacarosa al 10% posterior a los 5 días de inanición mostro ser una técnica efectiva para ser ingerida por el mosquito. La eliminación de bacterias mediante penicilina en una concentración de 200 ppm resulto ser eficiente para la eliminación de bacterias simbióticas, comparada con otros antibióticos como la ampicilina y rifampicina (Koga, et al., 2007), tetraciclina y carbenicilina (Gaio, 2011).

Fecundidad, fertilidad, supervivencia y longitud alar. Los resultados de los primeros tres parámetros se observan en el cuadro 1. Mosquitos hembra de la colonia control mostraron una fecundidad promedio semanal entre 28.92 y 45.29 huevos mostrando una diferencia significativa (P< 0.05) en comparación con los mosquitos tratados con el antibiótico (Colonia1) cuyos valores fueron de 6.8 a 32.65 huevos Estos resultados coinciden con los obtenidos por García-Mungía (2011) quien reporta una fecundidad de 27 – 48 huevos. La Colonia α resultó con valores más bajos de 6.5 a 14.4 huevos en promedio por semana. Al final del experimento (hasta la muerte de la última hembra) se calculo el promedio total de huevos/hembra durante toda su vida notando una diferencia mayor del 50% entre la C. Control (106.93 huevos) y la Colonia α (21.70 huevos).

1334

Tomando en cuenta que algunas bacterias simbióticas intervienen en la digestión de sangre (Gaio, 2011) y por lo tanto en el aprovechamiento las proteínas, esto pudo afectar directamente a los individuos de la Colonia 1 y su descendencia, la Colonia α. Dado que el numero de huevos que no llego a madurar fue superior en esta última con hasta un 31.58% (Fig. 1)

Figura 1. Huevo de Ae. aegypti de la colonia α (F1) derecha, al lado de un huevo de la misma colonia (izquierda) mostrando falta de maduración.

Cuadro 1. Fcundidad, fertilidad y supervivencia, registrados semanalmente en mosquitos hembras de Ae. aegypti tratados y sin tratar con antibiótico además de la F1 resultante de los mosquitos tratados.

Colonia Semana Hembras Total % de

huevos inmaduros

Fecundidad promedio /semana

Larvas % de fertilidad Adultos # de

hembras % de

supervivencia

Control

1 15 619 0% 41.27 249 38.29% 43 25 17.27% 2 13 376 0% 28.92 95 25.00% 94 - 98.95% 3 7 249 14.73% 41.71 - - - - - 4 7 317 0% 45.29 249 78.55% 5 2 2.01%

Total 15 1604 2.68% 106.93

1

1 26 849 0% 32.92 - - - - - 2 26 498 0% 19.15 316 63.45% 79 27 25% 3 22 578 0.52% 26.41 254 43.94% 160 90 59.04% 4 10 99 0% 9.90 - - - - - 5 5 34 0% 6.80 - - - - -

Total 26 2068 0.15% 79.54

Α 1 20 288 10.56% 16.10 10 3.47% 10 4 100% 2 6 39 31.58% 9.50 9 23.08% 9 7 100% 3 6 51 7.27% 9.17 39 76.47% 32 9 82.05%

Total 20 434 13.59% 21.70

El porcentaje de fertilidad también mostro un decremento en la Colonia α con valores mínimos de un 3.47%; sin embargo los porcentajes de supervivencia fueron los más altos para esta misma con hasta un 100% de adultos/larva.

La longitud alar de los mosquitos hembra entre las C. Control, Colonia 1 y Colonia α mostraron valores promedio similares (2.751, 2.663 y 2.530 mm, respectivamente) y en machos (1.57, 1.57 y 1.95 mm, respectivamente), sin embargo los mosquitos de la F2 mostraron un desarrollo alar comparativamente mayor (2.87 mm hembras y 2.56 mm machos).

1335

Conclusiones La administración de antibióticos incluidos en una solución de sacarosa al 10% posterior a

los 5 días de inanición mostro ser una técnica efectiva para la ingestión por parte del mosquito. Los medios de cultivo BHI y LB mostraron ser efectivos como auxiliares para el aislamiento de bacterias simbiontes. La penicilina a una concentración de 200 ppm mostro ser efectiva en la eliminación de las bacterias simbióticas del intestino medio de Ae. aegypti; la eliminación de estas mostro tener efectos significativos (p<0.05) en la fecundidad y la supervivencia en la Colonia α (F1); mientras que en la fertilidad y la longitud alar no se mostro alteración significativa. El porcentaje de huevos que no embrionaron pudo ser por causa de la eliminación de algunas bacterias simbióticas; las cuales podrían ser transmitidas transovaricamente. Para esto se propone un estudio de las bacterias simbióticas que estén estrechamente relacionadas con el aparato reproductivo o los túbulos de Malpighi de los mosquitos, así como la caracterización y evaluación de la contribución digestiva de las bacterias aisladas. Agradecimientos

A los profesores del curso de Fisiología de Insectos Dra. Adriana Elizabeth Flores Suárez y al Dr. Gustavo Ponce García de la Facultad de Ciencias Biológicas (UANL) por los apoyos necesarios para el desarrollo de este trabajo. Literatura Citada Ben-Yakir, D. 1987. Growth retardation of Rhodnius prolixus symbionts by immunizing host

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1336

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1337

EVALUACIÓN DEL ÉXITO COPULATIVO EN Aedes aegypti (L.)

Laura Mayela Montes–Rincón, Jesús Antonio Dávila–Barboza, Gustavo Ponce–García y Adriana Flores–Suárez. Laboratorio de Fisiología y Toxicología de Insectos, Facultad de Ciencias Biológicas, UANL, Pedro de Alba s/n Ciudad Universitaria, San Nicolás de los Garza, Nuevo León. CP 66451, México. maye_bio@hotmail.com. RESUMEN. Se determinó el éxito copulativo del macho de Aedes aegypti bajo condiciones de laboratorio. Los tratamientos (número de machos/número de hembras) consistieron en: 1/5, 1/10, 1/15 y 1/20; con 5 repeticiones por tratamiento y se contabilizó el número de ovoposiciones. Al analizar los datos por medio de Kruskal Wallis con α=0.05, se observa que el potencial de fecundación del macho es limitado debido a diversos factores. Se encontró una relación entre los tratamientos 1/15 y 1/20, al obtener un promedio de fecundación de 12 hembras por macho. Para determinar el efecto de la edad en relación a su potencial de fecundación, se realizó un segundo ensayo para los tratamientos relacionados siguiendo la misma metodología y utilizando el mismo macho después de 7 días de vida. Los resultados muestran que el grado de dependencia entre el potencial de fecundación del macho en relación a su edad es bajo. Palabras Clave: Aedes aegypti, ovoposición, cópula.

Evaluation of the copulative success in Aedes aegypti (L)

ABSTRACT. The present study was conducted to determine the copulative success of the Aedes aegypti male under laboratory conditions. Treatments consisted of (number of males/number of females) of: 1/5,1/10, 1/15 and 1/20, each treatment was replicated 5 times and the number of ovipositions was registered. Results showed that the male fertilization potential is limited by some different kind of factors. A relationship was found between treatments 1/15 and 1/20, to obtain an average of 12 fertilized females per male. The effect of age in relation to fertilization potential was determined by a second trial, which was performed for related treatments using the same male after 7 days of life. The same methodology was followed, the results showed that the degree of dependence between the male fertilization potential in relation to his age is low. Key words: Aedes aegypti, oviposition, copulation. Introducción

El siguiente trabajo tiene como objetivo determinar el éxito de inseminación del macho en Ae. aegypti por medio de variaciones en el número de hembras expuestas a un macho, ya que los mosquitos son los únicos vectores de patógenos que causan paludismo, fiebre amarilla, dengue, así como importantes filariais y encefalitis virales (Harwood y James, 1987). La distribución de Ae. aegypti se limitaba por las latitudes 45° N y 35° S, aunque también se ha reportado su presencia en lugares más altos y fríos de los reconocidos inicialmente (Nelson, 1986).

Los lugares más comunes para su cría están dados por recipientes artificiales; así como también aquellos que tienen la capacidad de retener agua de lluvia principalmente, en especial los de color oscuro, de boca ancha, y de preferencia que puedan encontrarse a nivel del suelo y estén cubiertos por sombra (Thirión, 2002). La ovipostura es principalmente vespertina, los huevos son puestos uno a uno, quedan adheridos en las paredes del receptáculo al ras del agua. Su vida acuática se inicia con el primero de cuatro estadios larvales; en los que su alimentación es omnívora, un estadio pupal y al final se da pie a la emergencia del mosquito adulto (Colvard, 1978).

El adulto, al emerger de la pupa es un mosquito oscuro, con un diseño característico de color blanco plateado en forma de lira sobre el mesonoto y con bandas blancas en las patas. Los machos se diferencian de las hembras por ser más pequeños y por tener antenas plumosas. Hembra y macho chupan néctar u otros carbohidratos de cualquier fuente accesible, sólo la hembra se alimenta de sangre, que le es necesaria para la maduración de los ovocitos, y aumentar

1338

la viabilidad de los huevos. El apareamiento ocurre a pocas horas de haber emergido y de haber levantado el vuelo, una vez inseminada la hembra no necesita volver a copular y podrá producir varias veces huevos fértiles si se alimenta con sangre antes de cada ovipostura. El apareamiento que por lo general se efectúa durante el vuelo, también ocurre sobre superficies verticales u horizontales; el macho sujeta el ápice del abdomen de la hembra con su terminalia e inserta su edeago en el receptáculo genital de la hembra. La bursa copulatrix de la hembra se llena de esperma que pasa de inmediato a la espermateca en menos de dos minutos (Jones y Wheeler, 1965). Una inseminación es suficiente para fecundar todos los huevos que la hembra produzca en toda su vida. El macho es atraído por el sonido emitido de las alas de la hembra durante el vuelo, una vez alimentada de sangre ocurren pocos apareamientos, debido en gran parte a los movimientos más rápidos de sus alas que compensan el aumento de peso, como consecuencia deja de estimular a los machos (Nelson, 1986).

Las hembras de Ae.aegypti constituyen un vector importante en la transmisión del dengue que esta considerada como la arbovirosis de mayor impacto en salud pública a nivel mundial (Pinheiro, 1989). Materiales y Método

Establecimiento de la colonia: Los huevos de Ae. aegypti correspondientes a la cepa Monterrey, N. L. México, se hicieron eclosionar colocando las papeletas dentro de charolas de 3000cm3, dentro de las cuales se agregó 1.2 L de agua declorada y 0.2 g de levadura, estas se mantuvieron a una temperatura controlada de 27 ± 2°C (Pérez et al., 2004); las larvas se alimentaron con proteína de hígado, manteniéndose un fotoperiodo de 12:12 (L: O) durante todo el experimento.

Tratamientos: Una vez que los mosquitos emergieron, estos fueron sexados y separados antes de que hubieran copulado. Se realizaron dos ensayos, machos de 24h de edad como primer ensayo y luego los mismos machos pero después de 7 días de haber emergido como segundo ensayo; para cada ensayo se realizaron cuatro tratamientos con cinco repeticiones cada uno; para el primer tratamiento se utilizó un mosquito macho y cinco hembras por jaula (1/5), para el segundo tratamiento se utilizó un mosquito macho y diez hembras por jaula (1/10), para el tercer tratamiento se utilizó un mosquito macho y quince hembras por jaula (1/15) y para el último tratamiento se utilizó un mosquito macho y veinte hembras por jaula (1/20). La exposición de los grupos formados para cada tratamiento fue por un total de 72h, proporcionando a los mosquitos una solución azucarada 10% como fuente de alimento durante las primeras 24 horas; después de la exposición de las hembras al contacto con el macho, se les suministro una primera alimentación sanguínea a las 48 horas y posteriormente a las 72 horas se les suministro una segunda alimentación sanguínea, utilizando para tal efecto una rata (Ratus norvergicus). Después de la segunda alimentación sanguínea, las hembras fueron aisladas individualmente en recipientes plásticos de 137.44cm3, los cuales contenían las condiciones propicias para que la hembra ovopositara, estas se siguieron alimentando con la solución azucarada al 10%, durante 5 días, manteniéndose bajo condiciones controladas 70% humedad y temperatura de 26 ± 2°C). Una vez contabilizadas las ovoposiciones, los huevos se preservaron en condiciones óptimas (70% humedad y temperatura de 26 ± 2°C) para posteriormente comprobar su viabilidad haciendo eclosionar los huevos siguiendo la metodología descrita por Pérez et al., 2004.

1339

Análisis estadístico: Los datos obtenidos se analizaron por medio de pruebas no paramétricas; Kruskal Wallis y Mann–Whitney, con esta última se determinó el efecto de la edad del macho sobre su potencial de fecundación, a ambas pruebas se les asignó un α=0.05. Resultados y Discusión En este estudio se determinó el efecto de la edad del macho de Ae. aegypti en relación al éxito de inseminación bajo condiciones de laboratorio. En estudios realizados con hembras de Ae.

aegypti, se ha encontrado que el apareamiento está acompañado por un cambio en el comportamiento causado por la transferencia de una hormona conocida como matrona, esta hormona pertenece al macho y hace que después del primer apareamiento la hembra rechace apareamientos posteriores (Craig, 1967); cabe mencionar que los mosquitos de Ae. aegypti pueden aparearse 24 horas después de haber emergido a la fase adulta (Schoof, 1967). Los machos se aparean frecuentemente de 10 a 15 veces, con repetidas copulaciones y un macho no siempre puede inseminar a una hembra; Roth (1948), encontró que por cada 17 copulaciones un macho transfiere su esperma en 6 casos solamente.

Para este análisis se trabajó con un total de 540 ejemplares, el porcentaje de hembras fecundadas en el primer ensayo se muestra en el cuadro 1.

Cuadro 1. Variaciones en el éxito de copulas del macho frente a diferentes poblaciones de hembras expresado en %.

Tratamientos (machos/hembras) Repeticiones 1/5 1/10 1/15 1/20

1 100 100 73.33 60 2 100 100 93.33 65 3 100 90 80 65 4 100 100 66.67 55 5 100 100 86.67 50

Los datos se analizaron por la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis, con la que se

muestra que el éxito de copulación es limitado al obtener H (0.05,5,5,5,5)=7.235; Hcal=17.31, esto puede deberse a la cantidad de esperma transferido, la edad del macho, su tamaño, condiciones de hacinamiento o factores ambientales que juegan un rol importante en el éxito de inseminación como lo mencionan Ponlawat y Harrington (2009).

La relación entre el número de copulas y la edad del macho se presenta en el cuadro 2. Con el análisis de Mann–Whitney se obtuvo: U (0.05,5,5) = 21; U’cal(1/15)= 20; U’cal(1/20)=16, lo cual no muestra una disminución estadísticamente significativa entre la edad del macho y el éxito de las copulas.

La influencia del apareamiento es importante para la sobrevivencia de la especie debido a que prolonga la supervivencia de la misma, hembras que se aparean viven ligeramente más en comparación con hembras no apareadas; sin embargo, machos que no se aparean muestran un alto potencial de sobrevivencia en comparación con machos que sí lo hacen; en ocasiones las hembras vírgenes pueden ovopositar, pero sus huevos no son viables (Schoof, 1967).

Se obtuvo un promedio de 197 ovoposiciones por hembra para el primer ensayo, mientras que para el segundo ensayo se obtuvo un promedio de 182; al hacer eclosionar los huevos para

1340

comprobar su viabilidad, se obtuvo un promedio del 90±2% de huevos viables para los dos ensayos.

Cuadro 2. Comparación del éxito de fecundación del macho en relación a su edad expresado en %. El primer ensayo muestra los resultados donde se utilizó un macho a las 24h de emergencia mientras que el segundo ensayo indica los resultados del macho a los 7 días de vida; T 1/5, T 1/10, T 1/15 y T1/20, indican los tratamientos utilizados, para los cuales se realizaron 5 repeticiones. Ensayo 1 2 Repeticiones T 1/5 T 1/10 T 1/15 T 1/20 T 1/5 T 1/10 T 1/15 T 1/20

1 100 100 73.33 60 100 100 66.67 60 2 100 100 93.33 65 100 100 80 55 3 100 90 80 65 100 90 60 50 4 100 100 66.67 55 100 100 73.33 65 5 100 100 86.67 50 100 100 66.67 50

A los machos no se les da la importancia necesaria ya que estos no fungen como vectores

de enfermedad alguna, sin embrago, como lo revela este estudio, tienen un alto potencial de fecundación durante su vida y esto a su vez crea las condiciones propicias para que la hembra busque una alimentación sanguínea y por lo tanto, la lleve a convertirse en vector de enfermedades virales tanto para animales como para el ser humano. Este estudio reveló que un macho joven de Aedes aegypti puede fecundar un promedio de 12 hembras, mientras que un macho de vida media puede fecundar en promedio 10 – 11 hembras bajo condiciones de laboratorio, con lo que se puede concluir que el potencial permanece constante por lo menos en la primera mitad de su vida. Con los resultados obtenidos en los análisis estadísticos, se concluye que el éxito de inseminación no está limitado por la edad del macho o por el número de cópulas, ya que los huevos, resultaron ser viables.

Los estudios sobre el comportamiento de la biología y el apareamiento de los mosquitos son de gran importancia, ya que al entender el efecto enjambre y utilizar la técnica del macho estéril, podría considerarse como un método eficaz de control del mosquito y con ello la transmisión de enfermedades virales. Agradecimientos

A Maricela Laguna Aguilar y Selene Alvarado Moreno por el apoyo brindado para la realización de este trabajo.

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Tesis UNAM Facultad de Ciencias: 134.

1342

IDENTIFICACIÓN DE ÁREAS SUSCEPTIBLES A LA DEPOSICIÓN DE PARATIÓN METÍLICO EN ZONAS GREGARÍGENAS DE Schistocerca piceifrons piceifrons Y SU

PROBABLE EFECTO EN LA APICULTURA

Beatriz Estrella Arreola-Martínez. Programas Multidisciplinarios de Posgrado en Ciencias Ambientales, Coordinación para la Innovación y la Aplicación de la Ciencia y la Tecnología, Universidad Autónoma de San Luis Potosí. Sierra Leona No. 550, Lomas II Sección, San Luis Potosí, S.L.P. CP 78210. beatrizarreola@hotmail.com RESUMEN. Se determinaron las áreas susceptibles a la deposición de paratión metílico en el Municipio de Tizimín, Yucatán. Se encontraron 13 áreas de intersección entre el punto de aplicación del plaguicida y el área de seguridad de los apiarios, cuatro con el área de seguridad de las localidades y dos con el área de seguridad de los cuerpos de agua. A pesar de que el paratión metílico puede depositarse dentro del área de seguridad de los apiarios, se considera que existen otros factores que pueden provocar un descenso en la producción apícola, como la pérdida de la diversidad florística para el establecimiento de pastizales y la expansión de la agricultura mecanizada. Palabras clave: paratión metílico, áreas susceptibles, apicultura Identification of capable areas to the deposition of methyl parathion in zones gregarigenas

of Schistocerca piceifrons piceifrons and his probable effect in the apiculture ABSTRACT. . Susceptible areas were determined to deposition of methyl parathion in the Municipality of Tizimin, Yucatan. We found 13 areas of intersection between the point of application of the pesticide and the security area of the apiaries, four with the security area of the localities and two security area water bodies. Although methyl parathion can be deposited within the security area of the apiaries, it is considered that there are other factors that can cause a drop in honey production, the loss of plant diversity on grassland establishment and expansion of mechanized agriculture. Key words: methyl parathion, areas susceptible, apiculture Introducción

México con gran parte de su territorio nacional utilizado para las actividades agropecuarias (INEGI, 2010) se ha tenido que enfrentar a amenazas en la agricultura, una de ellas es la presencia de otros seres que compiten por el producto de las cosechas (FAO, 2008), las denominadas plagas, consideradas como cualquier especie o raza o biotipo animal o vegetal o agente patógeno dañino para las plantas o productos vegetales (SENASICA, 2009). Los insectos plaga son los problemas fitosanitarios más importantes para México ya que afectan a más del 73% de los sistemas-producto (SAGARPA, 2010), desarrollándose algunos de ellos en áreas de alto impacto ambiental y cambio climático (SENASICA, 2009).

Las formas de combatir estas plagas y enfermedades agrícolas son muy variadas, a través del control cultural, biológico y químico. Sin embargo la manera más común de control o erradicación de estos organismos han sido, continúan y seguirán siendo los plaguicidas.

El paratión metílico es un insecticida organofosforado. Es uno de los compuestos químicos más usados en el Estado de Yucatán para el control de la langosta centroamericana (Schistocerca piceifrons piceifrons Walker). En algunos lugares donde se registra la presencia de langosta se suelen encontrar establecidos apiarios que se utilizan para la producción de miel como fuente de alimento o venta; por lo que existe la posibilidad de que el plaguicida tenga un efecto negativo en la producción de miel, pues al ser de amplio espectro podría disminuir la población de abejas y contaminar sus productos. Un agravante más a la problemática de la zona

1343

es que Yucatán es uno de los bastiones más importantes de miel alcanzando el 30 % de del total de la producción nacional. Materiales y Método

De acuerdo a la información proporcionada por el SINAVEF, de los meses de Enero a Diciembre de 2010 de los municipios de Yucatán reportados, Tizimín presentó continuamente alto riesgo por la presencia de Langosta, razón por la que se decidió hacer las determinación de paratión metílico en suelo mediante un método indirecto en este municipio. Con la ayuda del software ArcGis 90.3 se ubicaron los puntos de aplicación del plaguicida, la ubicación de las localidades y la ubicación de los apiarios, así como de los cuerpos de agua.

Por otro lado con ayuda del modelo Hysplit del Laboratorio de Recursos Atmosféricos (Air Resources Laboiratory – ARL) de la Administración Nacional Oceánica y Atmosférica (National Atmospheric and Oceanic Administration – NOAA) de Estados Unidos, se determinó la dispersión posible del plaguicida, específicamente bajo las condiciones meteorológicas de los días en que se realizaron las aplicaciones, las trayectorias obtenidas se sobrepusieron en el mapa donde se ubicaron los puntos de aplicación, localidades, apiarios y cuerpos de agua.

En otro mapa se sobrepusieron las capas con las localidades del municipio y la ubicación de los apiarios, a cada uno se le generó un área de influencia (buffer), esto a razón de que el Reglamento sobre aplicación de plaguicidas menciona que éstos no deben ser aplicados en un área menor de 200 m, por considerarse esta un área sensible (DOF, 2010). Solo para el caso de los apiarios se generaron tres buffer de 2 000 m, la primera distancia determinada por el Reglamento, la segunda y tercera porque las abejas realizan la búsqueda de alimento en un radio de 2 000 m. Una vez sobrepuestas las capas se realizó una intersección entre cada una de las áreas de influencia y las parcelas donde se llevó a cabo la aplicación de paratión metílico, con esto se obtuvo un mapa con las áreas susceptibles por deposición de paratión metílico.

Una vez ubicados los apiarios se visitaron siete de ellos durante el muestreo en suelo, esto permitió visualizar las características del ambiente en varios de los apiarios de cada apicultor. Sin embargo no se pudo encontrar ningún responsable de los apiarios. Se hizo una búsqueda bibliográfica de los datos reportados por SAGARPA sobre plaguicidas en miel y de los principales factores que afectan la producción apícola, en diferentes fuentes. Resultados y Discusión

En la figura 1 se observa que la dirección de los vientos predominante en los días que se realizaron las aplicaciones fueron Noroeste, Oeste y Suroeste. En esta área se encuentran un total de 99 apiarios y 130 localidades, además se ubicaron los centros de salud presentes en el Municipio. Cabe señalar que con el modelo Hysplit que se utilizó solo se hizo la determinación de la dirección de los vientos de acuerdo a las condiciones climatológicas específicas de cada día de la aplicación, esto es recomendable porque las condiciones tienden a variar de un día a otro sobre todo si hay algún evento o fenómeno climatológico. Además deben de considerase las características del equipo de aplicación (manual, con mochila o en avioneta).

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Figuras 1 y 2. Puntos de aplicación de paratión metílico y dirección de los vientos el día de aplicación. Los vientos dominantes fueron en dirección Noroeste, Oeste y Suroeste. Dentro del área, dentro de los límites del Municipio de Tizimín, se encuentran 99 apiarios, 130 localidades y 25 clínicas de salud (estas últimas dentro de la cabecera municipal). Figura 2. Áreas susceptibles a la deposición de paratión metílico en el municipio de Tizimín, Yucatán.

En la figura 2 se muestra la intersección entre localidades, apiarios y cuerpos de agua con los puntos de aplicación del plaguicida. Con un total de 25 aplicaciones el mayor número de áreas susceptibles la tienen los apiarios (13), seguido de localidades (4) y cuerpos de agua (2).

Figuras 3 y 4. Áreas de localidades susceptibles a la deposición de paratión metílico en Tizimín, Yucatán. Figura 4. Áreas de cuerpos de agua susceptibles a la deposición de paratión metílico en Tizimín, Yucatán.

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En el cado de las cuatro localidades que intersectan con puntos de aplicación del plaguicida tienes 81 habitantes (Kalax Yodzonot), 10 habitantes (Onichen) 2 habitantes (San Carlos) y 3 habitantes (San Miguel). En tres de ellas también se encontraban apiarios (Fig. 3).

Para el caso de las áreas de susceptibilidad de los cuerpos de agua se encontró que solo dos se interceptaban con las parcelas de aplicación, observándose directamente en una el cenote en la orto foto, esto resulta importante porque a pesar de que el plaguicida se degrada más fácilmente en agua y por acción de la luz, el hecho de que estos cuerpos de agua (los cenotes), se encuentren conectados entre sí, hace posible que el plaguicida se disperse hacia otros cuerpos de agua, para este caso también una de las áreas de influencia de un apiario intersecto a su vez la parcela de aplicación (Fig. 4).

Para las áreas susceptibles por deposición de paratión metílico en donde se encontraban los apíarios (Fig. 5) se observó que 6 de ellas eran en pastizales, 5 en pastizales combinado con selva, 1 en selva y otro no se pudo determinar el tipo de vegetación, en este se observa que si bien las abejas pueden ser afectadas por la aplicación de este plaguicida también pueden ser afectadas por la transformación de los ecosistemas naturales a pastizales, ya que el área de influencia que se determinó para las abejas es el área que ellas recorren en busca de alimento, y el hecho de que se encuentre ubicados en parcelas destinadas a pastizales hace más difícil el que ellas se alimenten.

Figura 5. Áreas de recolección de abejas susceptibles a la deposición de paratión metílico en Tizimín, Yucatán.

El contacto de las abejas con el plaguicida no solo ocasiona que se contamine la miel

también puede ocasionar que sus poblaciones se vean reducidas, al ingerir néctar contaminado; envenenarse por contacto, cuando vuelan a través de una nube de plaguicida, o al caminar sobre partes tratadas de una planta, ya que sobre todo los insecticidas en polvo se formulan para espolvorear en los cultivos de forma que tengan un amplio cubrimiento, pero al haber corrientes de aire el tóxico es arrastrado y puede alcanzar a las abejas en el campo o a la colmena en el apiario. Lo que se refleja en disminución de su producción de miel y posiblemente en pérdidas

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económicas para el apicultor. En el caso del paratión metílico se encuentra establecida una DL50, por exposición vía tópica que es de 0,04 μg/abeja y la DL50, por exposición vía orales que es de 0,013 μg/abeja.

A su vez otros factores también pudieran afectar la actividad apícola entre ellos la pérdida de la diversidad florística por el establecimiento de pastizales para ganado bovino, pues los pocos manchones de vegetación que aún persisten en la zona son cada día más escasos y se ven en la necesidad de estar cercanos a potreros en donde la presencia de langosta es más común y en algunos casos pierden acceso a estos espacios cuando se acercan los terrenos para uso ganadero como se observó en la Figura 5. Asimismo la expansión de la agricultura mecanizada tienen impactos directos sobre la apicultura, cuando se limpian los terrenos para el ganado se rompen las funciones de protección, alimentación y barrera que juega la vegetación dejando peligrosamente expuestas a las colmenas al tránsito de los animales, los coches y la gente. Conclusión Las áreas de muy alto riesgo para paratión metílico en el municipio de Tizimín son de diámetros muy pequeños, sin embargo el municipio presentó en su mayoría áreas de riesgo medio o bajo. Literatura Citada FAO. (20 de enero de 2011). Food and Agriculture Organization (FAO). FAOSTAT. Recuperado

el 12 de ABRIL de 2011, de FAOSTAT.FAO.org INEGI. (2010). Instituto Nacional de Estadística y Geografía. Recuperado el 11 de abril de 2012,

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ESTUDIO DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA DE CHAPULINES DE LA ESPECIE Melanoplus lakinus SCUDDER (ORTHOPTERA: ACRIDIDAE) EN EL ESTADO DE

DURANGO

1J. Natividad Gurrola-Reyes, 2Rene Torres-Ricario, 1Isaias Chairez-Hernández y 3J. Alberto Narváez-Zapata. 1Academia de Entomología del Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional Unidad Durango, México. 2Alumno del Doctorado en Ciencias en Biotecnología nodo CIIDIR Durango. 3Investigador del Centro de Biotecnología Genómica-IPN. BECARIOS DE COFAA. RESUMEN. En el Estado de Durango están reportadas 48 especies de chapulines, algunas de ellas de interés económico debido a los efectos que pueden ocasionar a ciertas localidades. Los chapulines de la especie Melanoplus lakinus son los de mayor presencia a lo largo de la entidad. Debido a los diferentes factores bióticos y abióticos de los sitios donde se puede localizar esta especie, la posibilidad de variación genética dentro y entre poblaciones está presente. Se usaron once microsatélites aislados de la especie Odealus decorus para realizar estudios de variabilidad genética de Melanoplus lakinus en el Estado de Durango, obteniéndose valores significativos de diversidad entre las poblaciones (Fst=0.2217), así mismo se identificaron poblaciones que no se encontraron en equilibrio de Hardy-Weinberg. Lo obtenido conlleva a la ampliación del conocimiento acerca de esta especie en el estado de Durango y de igual forma favorece el estudio de otras especies de interés. Palabras clave: Microsatélites, equilibrio, variabilidad.

Study of the genetic variability of Melanoplus lakinus Scudder (Ortoptera: Acrididae) in Durango State

ABSTRACT. In Durango State are reported 48 grasshopper species, some of them having economic importance due to the damage they can cause. The Melanoplus lakinus grasshopper is one of the most abundant species there. Due to the diversity of biotic and abiotic factors of the sites where these species are located, possibility of genetic variability within and between populations is present. Microsatellites isolated from Odealus decorus were used to study the genetic variability of Melanoplus

lakinus in Durango State, obtaining high values of genetic diversity among populations (Fst=0.2217), some of the populations weren´t in Hardy-Weinberg equilibrium. This study would help to understand better the behavior of this and other species in Durango State. Key words: Microsatellite, equilibrium, variability. Introducción Los chapulines son los mayores herbívoros presentes en pastizales a lo largo del planeta. La presencia de estos está influenciada principalmente por factores climáticos, favoreciendo la presencia de cierto tipo de vegetación los cuales proporcionan a estos individuos alimentación, microclimas y protección contra depredadores (Nath et al., 2010). Esta diferencia tanto de vegetación como de factores climáticos puede impactar en individuos de la misma especie, tener preferencias sobre algún tipo de plantas o sitios para alimentación, apareamiento y ovoposición, y de esta manera influir genéticamente en ellos (Brede et al., 2007; Li et al., 2010). En el Estado de Durango se tiene el registro de 48 especies de chapulines, siendo algunas de ellas de importancia económica debido a sus hábitos, como lo es Melanoplus lakinus perteneciente a la familia Acrididae (García-Gutiérrez et al., 2006). La diversidad vegetal de los sitios donde ésta especie puede localizarse, así como otros factores como los diversos patrones de alimentación y factores abióticos, puede existir la posibilidad de variaciones genéticas de los individuos entre las diferentes poblaciones (Brede et al., 2008; Li et al., 2010). Varias herramientas se han utilizado ampliamente para realizar estudios de variabilidad genética y evolutiva de chapulines. Uno de estos estudios determino la variabilidad genética de la especie Oxya japonica donde relaciona

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factores externos como el uso de plantas hospederas de diversos sitios usando AFLPs para su determinación (Branson, 2011). Otra técnica es el uso de microsatélites debido a que sus propiedades son codominantes, tienen alto polimorfismos y presentan comportamiento Mendeliano neutral, los cuales han sido utilizados en un gran número de estudios, siendo estos más económicos en su uso, más no en su síntesis (Contreras-Díaz et al., 2006; Teng y Kang 2007; Berthier et al., 2008). El conocimiento de la variabilidad genética de chapulines en México es escaso, por lo cual la información necesaria para realizar estos estudios en otras especies de insectos se dificulta. Con el objetivo de entender mejor el comportamiento poblacional de esta especie a lo largo del estado de Durango se analizaron once cebadores aislados de la especie Odealus decorus (Berthier et al., 2008) de la familia Acrididae, para su uso en estudios de variabilidad genética en la especie M. lakinus en el estado de Durango. Materiales y Método

Muestras y extracción de ADN. Los individuos de la especie M. lakinus fueron colectados de zonas de pastizal y agrícolas del estado de Durango. En siete sitios: Yerbaniz (Y)(-103.86, 24.699), Cuencame (C)(-103.699, 24.881), La Constancia (LC)(-104.258, 23.884), Carlos Real (CR)(-104.481, 24.329), Nicolás Bravo (NB)(104.696, 24.384), La Ermita (E)(-104.315, 23.886) y Villa Unión (VU)(-104.478, 24.759). Se colectaron veinte insectos de cada sexo por sitio, los chapulines colectados correspondieron a individuos del quinto estadio ninfal y adultos y fueron capturadas mediante red entomología de 40 cm de diámetro y posteriormente confinados y almacenados a una temperatura de congelación de -70 °C. La extracción del ADN fue realizada del tejido del fémur posterior de los insectos con el uso de pistilos estériles para su homogenización. La extracción se llevó a cabo mediante un kit de purificación de ADN genómico Wizard® (PROMEGA). Se analizaron once pares de cebadores polimórficos aislados de O. decorus (Berthier et al., 2008), con el propósito de utilizarlos como herramienta para estudios de variabilidad genética.

Amplificación y visualización de los microsatélites. El volumen final para la PCR fue de 25µL y se utilizó un protocolo modificado basado en el de Teng, (2007), que consistió en 0.2-0.4 µM de cada cebador, 20 ng de ADN genómico, 0.2mM de cada dNTPs, 1.5 mmol/L MgCl2, y una unidad de Taq Polimerasa. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un equipo GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) con una temperatura de desnaturalización de 94 °C por 5 min, 35 ciclos dividido en 1 min 30s a 94 °C, 1 min de la correspondiente temperatura de alineamiento de los cebadores de f 55 °C y 1 min a 72 °C, con un paso final a 72 °C durante 7 min. Los productos de PCR obtenidos de las muestras de ADN genómico de los saltamontes fueron reveladas en geles de poli-acrilamida al 6% para estimar el número de alelos, y el peso molecular estimado de cada uno de ellos usando como referencia marcadores de peso molecular de 100pb DNA ladder (PROMEGA). Los geles de poli-acrilamida fueron analizados con ayuda del programa GELANALIZER versión 2010a (Istvan, 2010) con el objetivo de identificar y medir los alelos presentes. Solo aquellos microsatélites que mostraron valores de amplificación positivos en todas las muestras se mantuvieron para el análisis posterior de variabilidad de la especie M. lakinus.

Análisis de la diversidad genética. Los análisis estadísticos descriptivos e informativos del estudio de variabilidad genética de M. lakinus como número observado y esperado de alelos, heterocigosidad esperada y observada, índice de Shannon, índice de diversidad genética de Nei

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así como los valores de identidad y distancia genética fueron obtenidos usando el programa popgene versión 1.32 (Yeh, et al., 1999), el equilibrio de Hardy-Weinberg fue analizado usando el método de Markov mencionado por Alacs en 2010 (Alacs et al., 2010), usando el programa genepop en su versión en línea (Rousset, 2008), de este mismo programa se utilizó el análisis de chi cuadrada para determinar el equilibrio de las poblaciones. El análisis de diversidad de las poblaciones mediante el método de Fisher fue obtenido con el programa genepop, utilizando estadísticos F de Wright como estimador de la estructura poblacional (Rousset, 2008). Resultados y Discusión

Los microsatélites aislados de O. decorus fueron de mucha utilidad para los estudios de diversidad genética de M. lakinus, tres de ellos presentaron amplificaciones positivas en todas las muestras de forma consistente y considerados para continuar con el estudio de variabilidad genética de la especie M. lakinus. Los microsatélites (B, C and D) utilizados fueron polimórficos, se observaron entre 18 y 23 alelos por locus, como se observa el ejemplo del primer B en la figura 1.

Figura 1. Gel de acrilamida 6 % de microsatélite B para muestras de M. lakinus

El análisis de estructura genética de las poblaciones mediante los estadísticos F de Wright (Cuadro 1) muestra un alto grado de diversidad genética entre poblaciones (FST=0.2217) así como un alto flujo genético promedio entre las poblaciones (Nm=0.877). El análisis de variabilidad en base al índice de diversidad de Nei, presentó valores desde 0.232 hasta 0.781 (VU siendo el más alto), se observó que la población C ubicada al norte del estado fue la que presento valores más bajos, pudiéndosele atribuir a que presento condiciones de clima, vegetación y suelo muy diferentes a las demás, ya que se localiza en la zona semidesértica del estado.

Cuadro 1. Estadísticos F (Wright) y flujo genético, calculado por Genepop usando tres marcadores de M. lakinus en Durango.

Locus Tamaño muestra Fis Fit Fst Nm*

B 112 0.4541 0.5926 0.2538 0.735

C 112 4.4389 0.5655 0.1721 1.203

D 112 0.4417 0.5736 0.2363 0.808

Media 112 0.4445 0.5676 0.2217 0.8778

*Nm = Flujo genético estimado desde Fst = 0.25(1 - Fst)/Fst.

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Un aspecto importante por considerar es que solamente dos de las poblaciones no se encontraron en equilibrio de Hardy-Weinberg (Cuadro 2), un factor que pudo influir fue el tamaño de muestra utilizado, aunque estudios como los realizados por Li (2011) y Alacs (2010), usaron un número de individuos parecido al utilizado en el presente estudio. Es importante mencionar a su vez que el trabajo realizado por Alacs fue con el uso de microsatélites para sus análisis de variabilidad (Alacs et al., 2010; Li et al., 2010; Li et al., 2011). El bajo tamaño de muestra puede deberse a la presencia de saltamontes en el estado de Durango durante el año 2011 y a la severa sequía registrada en gran parte del territorio mexicano.

Cuadro 2. Análisis Multi-locus para equilibrio de Hardy-Weinberg (EHW) calculados con GENPOP usando el método de Markov para siete poblaciones de M. lakinus

Pop ID n EHW df Chi-cuadrada Prob** Nei* CR 9 1 3 8.29 0.040 0.619±0.22 NB 4 0.488 3 1.56 0.668 0.302±0.27 VU 9 0.573 3 3.88 0.274 0.781±0.07 LC 11 0.741 3 6.99 0.072 0.717±0.14 Y 11 0.930 3 9.04 0.028 0.647±0.10 E 5 0.523 3 3.72 0.292 0.580±0.24 C 7 0.333 3 2.15 0.542 0.234± 0.40

**P<0.05 Los factores que han influido en la perdida de equilibrio poblacional como el presentado en

las poblaciones de CR y Y es el cambio de uso de suelo de los sitios donde esta especie se localiza, ya que la apertura de nuevas áreas agrícolas en zonas no aptas para este fin, como el sobre pastoreo de los pastizales, afectan de manera directa al hábitat de los saltamontes mediante el establecimiento de nuevas especies vegetales y a su vez la desaparición de las especies hospedantes y aquellas que utilizan como parte de su dieta para sobrevivir, sumándole a esto, la presencia de incendios, agroquímicos y agentes de control de plagas. Conclusiones

Uno de los resultados más importantes que se encontró es el uso de herramientas moleculares en especies de interés entomológico para el estado de Durango, favoreciendo así el uso de estas herramientas en estudios posteriores en otro tipo de especies, relacionando los efectos externos en la estructura poblacional de los insectos y así comprender de mejor manera la naturaleza de estas especies en la entidad. Agradecimientos

Este trabajo se derivó del proyecto “Análisis de la diversidad genética y perfil microbiano de insectos plaga del estado de Durango”. SIP-20120479 Literatura citada Alacs, A., Spencer, P. B. S., Tores, P. J. and Krauss, S. L. 2010. Population genetic structure of

island and mainland populations of the quokka, Setonix brachyurus (Macropodidae): a comparison of AFLP and microsatellite markers. Conservation Genetics. 12: 297-309.

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TOXICIDAD DE SPIROMESIFEN EN LOS ESTADOS BIOLÓGICOS DE Bactericera

cockerelli (SULC) (HEMIPTERA: TRIOZIDAE)

Jorge Ismael Tucuch-Haas1, Concepción Rodríguez-Maciel1, Ángel Lagunes-Tejeda1, Gonzalo Silva-Aguayo2, Agustín Robles-Bermudez3.1Entomología y Acarología, Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo, 56230, Montecillo, Texcoco, Estado de México. 2Departamento de Protección Vegetal. Facultad de Agronomía, Universidad de Concepción; Chillán, Chile. 3Facultad de Agronomía, Universidad Autónoma de Nayarit. leamsi182@hotmail.com RESUMEN. Spiromesifen se usa para el control de Bactericera cockerelli (Sulc). Por tanto, se investigó su toxicidad en los estadios biológicos, su efecto sobre la fertilidad y viabilidad de los huevos provenientes de hembras tratadas y la preferencia para ovipositar en plantas tratadas y no tratadas. La toxicidad relativa al 95% de mortalidad en huevo, ninfa 1, 2, 3, 4, y 5 fue de 17,5; 31316,2; 2950,1; 315,6; 18,2 y 1, respectivamente. Spiromesifen fue igualmente tóxico en machos y hembras. La oviposición se redujo a medida que se incrementó la concentración para tratar a las hembras y la eclosión disminuyó de manera similar en todas las dosis evaluadas. En la prueba de “no elección” la hembra depositó 0,3 ± 0,08 huevos/hoja tratado con 360 mg L-1. En la prueba de “elección” no hubo presencia de huevos en plantas tratadas con 2400 mg L-1 de spiromesifen. Palabras Clave: ácidos tetrónicos, psílido de la papa, toxicología.

Toxocity of spiromesifen to the developmental stages of Bactericera cockerelli (Sulc) (Hemiptera: Triozidae)

ABSTRACT. Spiromesifen, is used against Bactericera cockerelli. The aim of this research was to determine the toxicity of spiromesifen against each of the biological stages, its effect on fertility and viability of eggs deposited by treated females, as well as the female preference to lay eggs on treated and non-treated plants. The relative toxicity at 95% mortality in egg, nymph 1, 2, 3, 4, and 5 were 17.5; 31316.2; 2950.1; 315.6; 18.2 and 1-fold, respectively. There were no differences in the toxicity of spiromesifen between adult males and females. The number of laid eggs was reduced as the spiromesifen concentration used to treat female increased and egg hatching was reduced in all tested doses. In the “no choice” test, females deposited 0.3 ± 0.08 eggs by leaf treated with 360 mg L-1. In the “choice” test, there were no eggs on plants treated with 2400 mg L-1 of spiromesifen. Key words: tetronic acids, tomato-potato psyllid, toxicology. Introducción

En México, Bactericera cockerelli (Sulc), se documentó por primera vez en 1947 como plaga de la papa, Solanum tuberosum L. (Pletsch, 1947). Actualmente se encuentra ampliamente distribuido en el país y representa una seria limitación en la producción de cultivos de chile, Capsicum annum L., papa y jitomate, Solanum lycopersicum L. (Garzón et al., 2005). Esta plaga posee una amplia capacidad para elevar su densidad de población, dado que la hembra puede depositar hasta 1400 huevos durante su vida (Liu y Trumble, 2006) y se alimenta de una gran variedad de plantas silvestres y cultivadas (Pletsch, 1947; Wallis, 1955).

A pesar de los avances en el manejo integrado del psílido (Garzón et al., 2005), el combate químico sigue siendo una herramienta muy importante para mantener la densidad de población por debajo del umbral económico (Lawson et al., 1999). Dada la capacidad para desarrollar resistencia a insecticidas y la exigencia del mercado para reducir el uso de productos de elevado riesgo al ambiente y salud humana, la industria de agroquímicos se ha enfocado al desarrollo de insecticidas de alta eficacia biológica, bajo impacto sobre los agentes de control biológico y amplio margen de seguridad al ambiente. En 2005 se introdujo al mercado el insecticida spiromesifen, que pertenece al grupo de los ácidos tetrónicos y actúa inhibiendo la síntesis de lípidos (Liu, 2003). Sin embargo, se requiere más información sobre aspectos

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importantes de su toxicidad sobre esta plaga. Por tanto, el objetivo de esta investigación fue determinar la toxicidad diferencial de spiromesifen sobre cada uno de los estadios biológicos del psílido (huevo, ninfa 1, ninfa 2, ninfa 3, ninfa 4, ninfa 5, macho y hembra), el efecto en la oviposición y eclosión de huevos provenientes de hembras tratadas y la preferencia de las hembras para ovipositar en plantas tratadas y no tratadas. Materiales y Método

Población de insectos. Se utilizó una población de B. cockerelli susceptible a insecticidas. Los individuos se recolectaron de plantas silvestres y se han reproducido en invernadero, libres de presión de selección por insecticidas desde el año 2002 (aproximadamente 140 generaciones). La cría se realizó sobre plantas de chile Jalapeño de 100 d de edad.

Insecticida. Se utilizó el insecticida Oberón® 240 SC (Spiromesifen, suspensión concentrada, 240 g de i.a. L-1; Bayer CropScience de México S.A. de C.V.). Este se diluyó con agua destilada para preparar las concentraciones requeridas.

Ensayo. Se utilizó el ensayo de inmersión de hoja descrito para el psílido del peral (Psylla spp.) propuesto por el Comité de Acción de la Resistencia a Insecticidas con ligeras modificaciones. Se determinó el rango de concentraciones que produjeran de cero a 100% de mortalidad (ventana de respuesta biológica) en cada uno de los estadios de B. cockerelli. Posteriormente se incluyeron seis concentraciones intermedias que cubrieran dicho rango. En total se realizaron 10 repeticiones en días consecutivos y cada repetición incluyó un testigo sin tratar. Cada repetición tuvo en promedio 595 para huevos; de 153 a 223 para ninfas; 160 para machos y 143 para hembras. El máximo nivel de mortalidad aceptable para el testigo sin tratar fue 10% y se corrigió mediante la fórmula de Abbott (Abbott, 1925). En todos los casos, los individuos tratados se mantuvieron en condiciones controladas a 23°C ± 3, humedad relativa 50% ± 4 y foto-fase 16:8 h luz: oscuridad.

Ensayos en huevos. De las hojas del estrato medio de plantas de chile de 100 d de edad, se cortaron discos de 3,3 cm de diámetro y se colocaron con el envés hacia abajo en una caja Petri. Posteriormente, se introdujeron 10 parejas de B. cockerelli de 20 a 24 h de edad en cada caja Petri para que ovipositaran durante 24 h sobre los discos foliares. Se contaron los huevecillos y el disco infestado se sumergió en la concentración a evaluar de spiromesifen (0,001; 0,1; 1; 10; 100; 1000; 3000; y 10000 mg L-1) durante 15 s. Luego se dejó en campana de flujo laminar durante 30 min para eliminar el exceso de humedad y, para colocar los adultos en su posición normal, éste se colocó con el envés hacia arriba en cajas Petri de 4 cm de diámetro conteniendo 3 mL de agar (2%, p/v) en agua destilada. A las 72 h se determinó el porcentaje de mortalidad y se consideró muerto aquel huevecillo que presentaba color oscuro o que estuviera deshidratado.

Ensayo en ninfas. Las evaluaciones se realizaron sobre ninfa 1, ninfa 2, ninfa 3, ninfa 4 y ninfa 5. En cada disco de hoja se colocaron de 10 a 20 ninfas sanas del instar respectivo y a los 30 min se sumergió el disco foliar infestado en la concentración respectiva de spiromesifen siguiendo el procedimiento antes descrito. Se consideró ninfa muerta aquella que presentaba cuerpo flácido, los apéndices pegados al cuerpo o que no reaccionaba al estímulo de un toque de pincel.

Ensayo en adultos. En ensayos separados, grupos de 20 a 32 individuos sin sexar de 20 a 24 h de edad se anestesiaron con CO2 a 20 Psi de presión durante 2 min y la concentración requerida de spiromesifen se asperjó mediante el uso de una torre de Potter (Potter, 1952) que se calibró para aplicar de 2 mg cm-2 (Hassan, 1985). De cada concentración se aplicaron 15 mL a

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una presión de 0,703 kg cm-2 (10 lb pulgada-2) y después de 1 min, los adultos tratados se depositaron en discos foliares sin tratar, registrándose el porcentaje de mortalidad a las 72 h. Se consideró muerto aquel individuo que no saltaba o no respondía al toque del pincel. Además se registró el promedio de huevos depositados a los cuatro días en cada disco de hoja y el porcentaje de éstos que habían eclosionado a los 10 días.

Evaluación de la preferencia para ovipositar en plantas tratadas. Para evaluar la preferencia de las hembras para depositar sus huevos en plantas tratadas con spiromesifen, en comparación con las no tratadas, se realizaron dos tipos de evaluaciones: “no elección” y “elección”.

Evaluación de “no elección”. Con un aspersor manual de cinco litros de capacidad marca Swissmex® con boquilla de cono hueco se asperjaron hasta “punto de goteo” plantas de chile jalapeño de 100 d de edad. Se utilizó la dosis de campo de spiromesifen, 360 mg L-1. A los 45 min se introdujeron en una jaula entomológica (2,0 × 1,5 × 1,5 m) 10 plantas tratadas y 20 parejas de insectos de 20-24 h de edad para que ovipositaran libremente durante 5 d. Los insectos se mantuvieron bajo condiciones de invernadero, como lo sugiere Liu and Trumble (2006). El testigo se manejó de la misma manera, pero la jaula contenía 10 plantas sin tratar. Para evaluar la preferencia para ovipositar, se seleccionó al azar una hoja del tercio superior de cada planta y se contabilizó el número promedio de huevos depositados por hoja. Este experimento se repitió 10 veces en días consecutivos.

Evaluación de “elección”. En una jaula entomológica se colocaron ocho plantas al azar, cuidando que no hicieran contacto entre ellas. Cada planta había sido previamente tratada (45 min) con una concentración diferente de spiromesifen [cero (testigo sin tratar); 0,0024; 0,024; 0,24; 2,4; 24; 240 y 2400 mg L-1]. El resto del procedimiento fue como se explicó anteriormente. En total se realizaron 10 repeticiones en días consecutivos y el arreglo de las plantas dentro de la jaula fue aleatorio en cada repetición.

Análisis estadístico. Para estimar la concentración letal que elimina al 50% (CL50) ó 95% (CL95) de la población, se utilizó el procedimiento Proc Probit de SAS (SAS Institute, 2003). Se consideró que a un nivel determinado de mortalidad (CL50 o CL95), la respuesta entre estadios bajo comparación, era significativamente diferente si sus límites de confianza (LC) al 95% no se traslapaban, como lo indica Robertson and Preisler (1992). Para calcular la toxicidad relativa al 50% (TR50), se dividió el mayor valor de la CL50 observado entre el valor de la CL50 del estadío respectivo; el mismo procedimiento se aplicó para determinar TR95, pero usando valores de CL95. Las diferencias estadísticas de la tasa de oviposición entre plantas tratadas con spiromesifen y no tratadas de la prueba “no elección”, se estimaron mediante la prueba no pareada de t (p≤0,05). Los valores de número de huevos depositados y eclosionados provenientes de hembras tratadas con spiromesifen, así como los valores de oviposición que se observaron en la prueba de “elección” se transformaron a la función Log10 (x+1) y se sometieron a un análisis de varianza para determinar si al menos un tratamiento era diferente (ANOVA, = 0,05) y a una prueba de comparación múltiple (Tukey, = 0,05) para ordenar la eficacia de cada tratamiento. Resultados y Discusión

Todos los estadios biológicos de B. cockerelli fueron susceptibles a spiromesifen. A nivel de la CL95, la toxicidad relativa (TR95) de spiromesifen en huevecillo, ninfa 1, ninfa 2, ninfa 3, ninfa 4 y ninfa 5 fue 17,5; 31316,2; 2950,1; 315,6; 18,2 y 1, respectivamente. A nivel de 50%

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de mortalidad, la CL50 del huevo fue similar a la que se observó en ninfa 3 y 4; mientras que a nivel de CL95, la toxicidad de dicho insecticida en huevo fue similar a la observada en los instares ninfales 3 a 5. El efecto ovicida del spiromesifen también se ha observado en huevos de Bemisia

tabaci (Genn.) biotipo B, donde a dosis de 2960 mg L-1 empieza a causar mortalidad (Liu 2003); además, la eclosión de los huevos fue nula a 24000 mg L-1, ya sea por contacto directo (huevo tratado) o vía hembra tratada. Las ninfas que emergieron de los huevos tratados con las concentraciones de 0,0024; 0,024; 0,24; 2,4 y 24 mg L-1 no alcanzaron a mudar exitosamente, debido probablemente a que no existe suficiente disponibilidad de lípidos, como sugiere Liu and Trumble (2006).

En las ninfas, la toxicidad de spiromesifen tanto a nivel de CL50 como de CL95, fue mayor en el primer instar y decreció en cada uno de los instares siguientes. Estos resultados, coinciden con los documentados por Liu and Meister (2001) y Liu (2003) quien observaron que los primeros instares ninfales de B. tabaci biotipo B son más susceptibles a spiromesifen, en comparación con los últimos. Avilés et al. (2003). Evaluaron la toxicidad de spiromesifen en B.

cockerelli a 115,5 mL i.a. ha-1 y encontraron que las ninfas del cuarto instar, cuyo instar anterior se trató con las concentraciones de 0,0024; 0,024; 0,24; 2,4 y 24 mg L-1 son menos vigorosas, pequeñas y murieron en un periodo de 0-96 h. Probablemente, a medida que el individuo avanza en instares, requiere menor cantidad de lípidos. No hubo diferencias significativas en la toxicidad de spiromesifen entre machos y hembras.

A medida que se incrementó la concentración de spiromesifen que se aplicó a las hembras, éstas depositaron menos huevos [Y = 64.32(x+1)-0.376, R2=0.92, p<0.05] y el porcentaje de éstos que eclosionaron también se redujo [Y = 27.73(x+1)-0.457, R2=0.88, p<0.05. Las hembras no ovipositaron cuando fueron tratadas con concentraciones 24000 mg L-1 de spiromesifen; tampoco hubo eclosión a concentraciones 2400 mg L-1.

En la evaluación de “no elección” (no choice), hubo diferencias estadísticas significativas en la tasa de oviposición por hoja (p≤0,05). Las hembras depositaron en promedio 38,6 ± 2,0 huevecillos por hoja en las plantas no tratadas, mientras que en las tratadas a la dosis de 360 mg L-1 (dosis de campo) este valor fue de 0,3 ± 0,08 huevos por hoja. En lo que respecta al ensayo de “elección” (choice), al incrementarse la concentración de dicho insecticida que se aplicó a las plantas de chile, también se redujo la cantidad de huevos depositados por las hembras [Y = 34.75(x+1)-0.473, R2=0.94, p<0.05]; las oviposiciones se detectaron en el rango de concentraciones de 0,0024 a 240 mg L-1, pero no a la concentración de 2400 mg L-1. Se infiere que cuando las hembras entran en contacto con spiromesifen, ya sea porque son tratadas o por que se exponen a plantas tratadas, se reduce la oviposición y el porcentaje de eclosión de huevos.

Los efectos tóxicos de spiromesifen en cada uno de los estadios de B. cockerelli, así como su impacto en la reducción de la oviposición y eclosión de huevos provenientes de hembras tratadas y la preferencia por ovipositar en plantas no tratadas lo convierten como una herramienta química valiosa para el combate de esta plaga como lo sugieren Palumbo et al. (2001). Conclusiones

El insecticida spiromesifen es tóxico a todos los estadios biológicos de B. cockerelli. La hembra tratada deposita menor cantidad de huevos en comparación con la no tratada y la eclosión de éstos se reduce; además, la hembra prefiere ovipositar en plantas no tratadas con spiromesifen.

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PROPORCIÓN DE RESISTENCIA DE Bactericera cockerelli (Sulc) EN LA ZONA DE VILLA DE ARISTA, SAN LUIS POTOSÍ Y SALTILLO, COAHUILA

Omegar Hernández-Bautista, Ernesto Cerna-Chávez, Jerónimo Landeros-Flores, Yisa Ochoa-Fuentes, Julio Chacón-Hernández, Saúl Castillo-Arriaga. Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro. Calzada Antonio Narro, Buenavista, Saltillo, Coahuila. CP 25315. Tel y Fax: 844-411-0226. omegarhbautista@gmail.com. RESUMEN. Se recolectaron dos poblaciones de Bactericera cockerelli, una proveniente de Villa de Arista, San Luis Potosí., y una población de invernadero de Saltillo, Coahuila; Utilizando una línea susceptible de laboratorio como referencia. Una vez recolectadas las poblaciones de campo e invernadero se trasladaron al invernadero del Departamento de Parasitología para el establecimiento del pie de cría, una vez contando con el material suficiente se realizaron bioensayos mediante la técnica de inmersión en hoja. Los resultados registran que la población de invernadero presenta una proporción de resistencia de: 0.005, 2.03 y 1.9 para abamectina, endosulfan e imidacloprid, mientras que la población de campo de San Luis Potosí fueron: 10.72, 2.53 y 2.61, para los mismos insecticidas respectivamente. Palabras clave: Paratrioza, resistencia, dosis letal media, chile.

Resistance proportion of Bactericera cockerelli (Sulc) in regions from Villa de Arista, San Luis Potosí and Saltillo, Coahuila

ABSTRACT. Two populations of Bactericera cockerelli were collected, one population from Villa de Arista, San Luis Potosi, and another from Saltillo, Coahuila greenhouse; we used a susceptible line of laboratory as a reference line. Once collected populations of field and greenhouse were transferred to the Department of Parasitology for the establishment of breeding stock, once having enough material, bioassays were performed using the leaf dipping technique. The results reported that the population of greenhouse presents a resistance proportion: 0.005, 2.03 and 1.9 for abamectin, endosulphan and imidachloroprid, while the population from San Luis Potosi field was: 10.72, 2.53 and 2.61, respectively for the same insecticides. Key words: Paratrioza, resistance, Mean Lethal Rate, chili-pepper. Introducción

El estado de San Luis Potosí es uno de los principales productores de chile (Capsicum

annum L.) a nivel nacional, en donde se siembra una superficie aproximada de 14,538 ha bajo condiciones de riego con un rendimiento promedio de 12,032 ton/ha (SAGARPA-SIAP, 2011). En diferentes regiones del altiplano de este estado, Bactericera cockerelli es una plaga importante en el cultivo de solanáceas como chile y tomate (Díaz et al., 2005) este insecto está reportado como transmisor de organismos tipo bacteria denominado Candidatus Liberibacter solanacearum (Liefting et al., 2009), aunado a esto, también presenta daños mecánicos ocasionados al alimentarse (Munyaneza et al., 2007) succionando la savia de los conductos del floema de las plantas hospederas aprovechando azucares y aminoácidos (Percy, 2003), ambos tipos de daños han ocasionado la destrucción masiva de cultivos, mermando la producción en un 60% para regiones hortícolas del bajío (Garzón, 2003), en la región papera de Coahuila y Nuevo León los rendimiento se redujeron hasta en un 90% (Flores et al., 2004). Siendo el principal método de control para esta plaga el uso de insecticidas organosintéticos (Liu y Trumble, 2007), la disposición de las ninfas en el envés de las hojas es una de las dificultades en las aplicaciones (Pavlista, 2002), al respecto Almeyda et al. (2008) mencionan que los productores de solanáceas realizan de 5 hasta 30 aplicaciones de insecticida por temporada para el control de esta especie; provocando contaminación ambiental, desequilibrio ecológico y resistencia (Luna, 2010).

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En la región hortícola del altiplano de San Luis Potosí el Sureste de Coahuila se desconocen los niveles de resistencia de este triozido a insecticidas convencionales de mayor uso, debido a los pocos estudios dirigidos en dicha zona. Por lo que el objetivo de la presente investigación es determinar el nivel de resistencia de B. cockerelli en la región hortícola de Villa de Arista, San Luis Potosí y Saltillo, Coahuila, México. Materiales y Método

El presente trabajo fue realizado en el Laboratorio de Toxicología del Departamento de Parasitología Agrícola de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro (UAAAN). En muestreos realizados se recolectó mediante redazos entomológicos adultos de Bactericera

cockerelli en lotes de chile, viveros e invernaderos en Villa de Arista, San Luis Potosí (SLP), así como dos poblaciones recolectadas en el invernadero del departamento de suelos (INV) y una línea susceptible del invernadero del departamento de parasitología de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, sobre plantas de tomate y papa, respectivamente. Posteriormente se trasladaron al invernadero de Parasitología Agrícola de la UAAAN para la cría de B. cockerelli de las tres poblaciones, para ello cada una de ellas se establecieron en dos camas de siembra de 2.5 x 1 m, cubiertas con tela organza; cada cama contenía 50 plantas de chile morrón variedad “california wonder”. La cría de esta especie se realizó bajo condiciones de invernadero con 26 + 4 °C y una HR del 70% y 14:10 h luz: oscuridad en promedio.

Una vez teniendo la cantidad suficiente de insectos se realizaron bioensayos mediante la técnica de inmersión de hoja para el psílido del peral (Psylla spp) con ligeras modificaciones (IRAC, 2005), para ello se prepararon diferentes concentraciones, se utilizó agua destilada y el producto bionex® como dispersante, en una proporción 1mL: 1L de agua. El intervalo de concentraciones utilizadas fue de 0.01 a 2000 ppm y un testigo sin tratar; Las hojas tratadas se dejaron secar en papel absorbente, y posteriormente se colocaban en charolas de plástico con papel húmedo. Los insecticidas utilizados fueron: Abamectina (abamectina 1.8% C.E. ® 18 gr de i.a. L-1, lactona macrociclica), Imidacloprid (picador 70 PH® 350 gr i.a. L-1, neonicotinoide), Endosulfan (Agrosulfan 35 C.E. ® 350 gr de i.a. L-1, clorado).

Las lecturas de mortalidad se realizaron a las 24 h excepto para abamectina que se obtuvo a las 48 h. Se consideró ninfa muerta aquella que presentaba los apéndices pegados al cuerpo, estaba deshidratada o no reaccionaba al estímulo del pincel. El máximo nivel de mortalidad aceptable para el testigo absoluto fue 10% y se corrigió mediante la fórmula de Abbott (1925) cuando el testigo presentaba mortalidad y se determinaron sus niveles de CL50 para las líneas de campo y la línea susceptible, conociendo estos valores se determinó la proporción de resistencia dividiendo los valores de CL50 de las líneas de campo contra la CL50 de la línea susceptible (Georghiou, 1962). Por ultimo, a los datos obtenidos se analizaron mediante un análisis Probit, empleando el método de máxima verosimilitud (Finney, 1971), utilizando el programa SAS system para Windows ver 9.0 (SAS, 2002). Resultados y Discusión

Los valores de las CL50 para la línea susceptible, para abamectina, endosulfan e imidacloprid fueron: 0.06917, 55.54604 y 11.22921 respectivamente (Cuadro 1); estos valores son relativamente bajos comparados con los de la línea de invernadero y de campo, por su parte Vega et al. (2008) Reportan para una línea susceptible libre de presión de selección desde 2002, una CL50 con valores que van desde las 0.01 hasta las 76.5 ppm, para insecticidas con similar

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grupo toxicológico a los de esta investigación, por lo que podemos emplear a la línea susceptible en estudio como línea de referencia para la determinación de proporciones de resistencia.

Cuadro 1. Concentraciones letales medias y cinturones de confianza, de tres insecticidas aplicados en la línea susceptible de ninfas de cuarto estadio de Bactericera cockerelli (Sulc.).

Línea susceptible (LS)

Plaguicida n g.l. ppm

CL50 Lim. Fiduciales 95% CL05 CL95 Abamectina 180 6 0.06917 0.05306-0.08805 0.00276 1.73071 Endusulfan 180 6 55.54604 43.69395-68.88021 3.31022 932.07051

Imidacloprid 180 6 11.22921 2.36435-26.23809 0.57083 220.89788 n: Número de ninfas de cuarto estadio de B. cockerelli, g.l.: Grados de libertad y Límites fiduciales = cinturones de confianza. En el cuadro 2 se proyectan los resultados de la línea de invernadero de B. cockerelli,

como se puede observar la CL50 para los insecticidas abamectina, endosulfan e imidacloprid son de 0.06536, 112.8253, 21.41733 ppm, respectivamente. En el caso de abamectina presenta unos valores similares a los de la línea susceptible y presenta una proporción de resistencia de 0.0058X (tabla 2), de acuerdo con la acción translaminar que tiene abamectina es posible que su aplicación en campo seleccione un elevado porcentaje de los individuos, sin embargo su uso en invernadero es poco frecuente (no más de una aplicación por temporada) y la resistencia generalmente se desarrolla sólo con dosis altas y aplicaciones frecuentes, esto explica por qué en la respuesta de abamectina no se observaron diferencias entre la población susceptible y la línea de invernadero. Cuadro 2. Concentración letal y limites fiduciales de tres insecticidas aplicados a ninfas de cuarto estadio de Bactericera

cockerelli (Sulc.), de la línea de invernadero y su proporción de resistencia contra la línea susceptible. Línea de invernadero (INV)

Población n g.l. ppm X

CL50 Lim. Fiduciales 95% CL05 CL95 Ls Vs Inv Abamectina 180 6 0.06536 0.04912-0.08451 .00201 2.12167 0.00582 Endusulfan 180 6 112.8253 95.02803-132.84723 1.1551 890.65338 2.0312

Imidacloprid 180 6 21.41733 0.12142-87.93127 2.3058 198.9282 1.9072 n: Número de ninfas de cuarto estadio de B. cockerelli, g.l.: Grados de libertad y Límites fiduciales = cinturones de confianza

En el caso de endosulfan, presentó una proporción de resistencia de 2.03X, similarmente a

lo reportado para el insecticida imidacloprid, ya que su proporción de resistencia fue: 1.9X (Cuadro 2). En este caso se discriminan a estos insecticidas empleados en invernadero con problemas de resistencia, ya que ninguno supera el umbral establecido de 10X, resultado de comparar la línea en estudio y la línea susceptible, por su parte Vega et al. (2008) mencionan que la falta de control se puede deber a factores como deficiente calibración, equipo de aplicación en mal estado, la gran diversidad de manejo y uso irracional de productos contra esta plaga. Caso contrario en comparación con los resultados presentados en la tabla 3, se observa que en invernadero el manejo del insecticida abamectina es muy restringido ya que para la línea de campo si supera el factor 10X.

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En el cuadro 3 se muestran los resultados de la población de campo comparados con los de la línea susceptible, como se puede observar en el caso de abamectina muestra una marcada diferencia en las CL50, comparando los valores de la línea susceptible Ls: 0.06917 ppm y SLP: 0.74147 ppm, presentando una proporción de resistencia de 10.72X, esto se debe a su uso repetido de insecticida del mismo grupo toxicológico según Clark et al. (1995) mencionan que altas dosis o aplicaciones frecuentes de abamectinas, el incremento de la resistencia puede ser hasta en un 159%. Respecto a otros trabajos de investigación, (García, 2012) reporta una proporción de 2.56X para el mismo insecticida en poblaciones provenientes de la zona papera de Coahuila y Nuevo León, por lo que es preocupante el desarrollo de resistencia de abamectina en la región chilera en estudio. Comparando las proporciones de resistencia en el caso del endosulfan e imidacloprid, con los resultados del mismo autor en poblaciones de la zona papera antes mencionada, presentan poca diferencia entre estos valores, lo que nos permite pensar que el manejo de B. cockerelli en ambas zonas con este insecticida es muy similar. Cuadro 3. Concentración letal y limites fiduciales de tres insecticidas aplicados a ninfas de cuarto estadio de Bactericera

cockerelli (Sulc.), de la línea de campo y su proporción de resistencia contra la línea susceptible. Línea de campo (SLP)

Población n g.l. ppm X

CL50 Lim. Fiduciales 95% CL05 CL95 Ls Vs SLP Abamectina 180 6 0.74147 0.55414-1.00066 0.01500 36.67271 10.72 Endusulfan 180 6 140.77441 117.73996-167.32961 14.08991 1406 2.53

Imidacloprid 180 6 22.86530 1.69202-79.24765 1.95021 268.08481 2.61 n: Número de ninfas de cuarto estadio de B. cockerelli, g.l.: Grados de libertad y Límites fiduciales = cinturones de confianza

En particular para imidacloprid su proporción de resistencia fue 2.61X, según Cerna et al.,

(2010) reporta un línea susceptible con una CL50 de 3.65 ppm y comparando esta concentración con las CL50 de la línea de invernadero y de SLP nos da una proporción de resistencia de 5.86X y 6.26X en relación con las CL50 de nuestro trabajo se observa una tendencia al aumento de la resistencia. Sin embargo, la poca expresión de tolerancia a imidacloprid probablemente se deba al establecimiento de la colonia, ya que para obtener la suficiente cantidad de insectos, probablemente su reproducción llegó a un F4, ya que se ha documentados que la resistencia a dichos insecticidas es inestable (Gutiérrez et al., 2007) quienes reportan una disminución en la proporción de resistencia en mosquita blanca (Bemisia tabaci) con una CL50 de 29.8 ppm en F3 a 6.3 ppm en F6 para este insecticida. Conclusiones

La línea susceptible en el caso de endosulfan e imidacloprid, presenta los menores valores de CL50, y muy similares en abamectina, presentando susceptibilidad por lo que se puede utilizar como línea de referencia. Se confirma que la población de campo proveniente de la zona productora de chile de Villa de Arista, San Luis Potosí presenta resistencia para el insecticida abamectina, mientras que para endosulfan e imidacloprid presentan tendencia a tolerar dosis altas, para el caso de la población Saltillo la proporción de invernadero se mantiene estable.

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PRESENCIA DE METALES PESADOS EN GUSANO DE SEDA (Bombyx mori)

Alejandro Ventura-Maza1, Alejandro Rodríguez-Ortega1, Francisco Marcelo Lara-Viveros1, Jorge Vargas–Monter1, Muhammad Ehsan2.1Ingenieria en Agrotecnología, Universidad Politécnica de Francisco I. Madero, Hidalgo, México. 2King Abdulaziz Universisty, Jeddah, Saudi Arabia. aventura@upfim.edu.mx. RESUMEN. La presente investigación se realizó en la Universidad Politécnica de Francisco I Madero en el Valle de Mezquital, Hidalgo, México. Se analizó la cantidad de Pb y Cd en poblaciones de gusano de seda (Bombyx mori), morera (Morus alba) que es el alimento principal del gusano, y suelo. El método de digestión para la determinación de Cd y Pb fue el reportado por Landero-Figueroa, et al., (2008) mediante el uso de ácido nítrico y peróxido de hidrógeno. Se utilizó un espectrofotómetro de absorción atómica marca GBC®. La presencia de Cd y Pb en el suelo fue de 0.05333 y 0.59 mg/kg respectivamente. La concentración de Cd y Pb en la morera de la variedad Kanva fue de 0.04667 y 0.23 mg/kg respectivamente. En el gusano de seda en los estados de larva, capullo y crisálida se encontró bajas concentraciones de Cd y Pb. Los datos sugieren que la presencia de estos elementos en la morera son causas de enfermedades y muerte de las poblaciones de gusano de seda en la Universidad Politécnica de Francisco I Madero. Palabras Clave: Metales pesados, Gusano de seda, Morera, Valle del Mezquital, México.

Presence of Heavy Metals in Silkworm (Bombyx mori) ABSTRACT. The present study was worked in the University Polytechnic of Francisco I Madero in Tepatepec, Hidalgo, México. The objective was to know the concentration of lead (Pb) and cadmium (Cd) in Silkworm (Bombyx mori), mulberry (Morus alba) that is the principal food of silkworm and soil. The method of digestion to determination of lead and cadmium was the reported by Landero-Figueroa (2008) with nitric acid and hydrogen peroxide. It’s used a spectrophotometer of absorption atomic of mark GBC®. The presence of cadmium and lead in the soil was of 0.05333 and 0.59 mg/kg respectively. The concentration of cadmium and lead in the mulberry of variety Kanva was of 0.04667 y 0.23 mg/kg respectively. In the silkworm in the status of larva, cocoon and chrysalides found low concentration of cadmium and lead. The dates suggest that the presence of these metals in the mulberry is cause of disease and death of the population of silkworm in the University Polytechnic of Francisco I Madero. Key words: Heavy Metal, Silkworm, Mulberry, Valley of Mezquital, México Introducción

Los metales pesados se han utilizado en muchas áreas de la industria donde las primeras aplicaciones fueron materiales para la construcción, pigmentos y tubos para el transporte de agua (Jarup, 2003), por lo que los niveles de metales pesados se han incrementado desde la revolución industrial (Gisbert, et al., 2003). Los orígenes de los metales pesados en el ambiente incluyen desechos de la industria metalúrgica, química, minera, industrias relacionadas con la fabricación de baterías y producción de fertilizantes (Faisal y Hasnain, 2004). Estos desechos generalmente son depositados en los canales de aguas residuales que se conducen a las áreas de cultivos.

En el Valle del Mezquital en el estado de Hidalgo, México, utilizan agua residual para el riego de los cultivos desde hace más de 100 años. Es probable que estas aguas contengan metales pesados que se depositan en el suelo y posteriormente son absorbidos por las plantas.

En las plantas cultivadas, el proceso de acumulación de metales pesados es de especial interés debido a que podrían incorporar a la cadena alimenticia elementos potencialmente peligrosos para la salud humana y de animales domésticos, además de las especies silvestres (Grytsyuk, et al., 2006). Por ejemplo, el Cd se asocia a enfermedades de hueso, daño renal, además que es considerado cancerígeno. El plomo es considerado un metal con efectos en la salud de los niños como daño cerebral (Jarup, 2003).

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La sericicultura es una importante actividad agroindustrial, que abarca el cultivo de la morera, la cría del gusano de seda, la producción de huevecillo así como la obtención del hilo de seda para la industria textil. El aprovechamiento es de amplio espectro en diversas actividades de nuestra economía. Actualmente China, gracias a la abundancia de mano de obra, se ha convertido en el primer productor mundial de seda, siguiéndole en orden de importancia la India, Rusia y algunos otros países de Asia, Europa e incluso Brasil y Colombia (Rodríguez, et al., 2012).

En México se introdujo la sericicultura en el siglo XVI en tiempos de la colonia y en los últimos años ha incrementado la producción artesanal con base en productos de origen de gusano de seda. Actualmente la sericicultura se trabaja en los estados de San Luis Potosí, Oaxaca, Michoacán e Hidalgo (Rodríguez y Ojeda, 2012). En la Universidad Politécnica de Francisco I Madero en Hidalgo se trabaja con poblaciones de gusano de seda para su estudio y conocimiento de su proceso de producción y transformación.

En el proceso de crianza de gusano de seda y producción capullos presentan una serie de problemas que van desde el ambiente, las enfermedades, las plagas, el manejo y la alimentación. Este lepidóptero es un insecto estricto ya que se alimenta solo de plantas de morera. La calidad de la crianza de gusano de seda depende de la calidad de la hoja de morera, es decir de su alimento principal (Vargas, 2012). En la Universidad Politécnica de Francisco I Madero se evaluaron tres variedades de morera para la alimentación de gusano de seda. Las variedades fueron Kanva, SLP3 y SLP5. Por su parte, Rodríguez, et al., (2012) encontraron la variedad de morera que los gusanos más consumían fueron la SLP3 y la SLP5, mientras que la variedad kanva no es apetecible para los insectos. Así también presentaron un índice de mortalidad alto. Esto se debe probablemente a la toxicidad de la morera con elementos pesados como el cadmio y el plomo, ya que estas plantas son irrigadas con aguas residuales. El objetivo de este estudio fue conocer las concentraciones de Cd y Pb en el suelo irrigado con aguas residuales, las plantaciones de morera y en el gusano de seda. Materiales y Método

Se tomaron muestras de hoja de mora (Morus alba) y de suelo en el campo experimental de la Universidad Politécnica de Francisco I Madero ubicada en el Valle del Mezquital, Hidalgo, México. Las muestras se secaron en la estufa de aire forzado a una temperatura de 75 °C durante 72 horas. Las muestras de morera se trituraron con la ayuda de un mortero y se tomó una submuestra de un gramo para su análisis. Las muestras de suelo se secaron a una temperatura de 72 °C durante 72 horas. Las muestras se trituraron con un mortero y se tamizaron con una malla número 25. Posteriormente se tomó una submuestra de un gramo para su digestión.

Se tomaron muestras de una población de gusano de seda que se reprodujeron en el segundo semestre del 2012 en el laboratorio de la Universidad Politécnica de Francisco I Madero. Se tomaron muestras de larvas, pupas o crisálide y capullo. Las muestras se secaron en la estufa de aire forzado a una temperatura de 75 °C durante 72 horas. Posteriormente se trituraron con un mortero y se tomaron submuestras de un gramo para su digestión.

La digestión se realizó con el método utilizado por Landero-Figueroa, et al., (2008), el cual consiste en 1) Primeramente a las sub-muestras se le agregaron 8 ml de ácido nítrico y se calentó a 65 °C por 60 minutos, 2) Después se incrementó la temperatura a 120 °C por 30 minutos. 3) Posteriormente se agregó 3.2 ml de peróxido de hidrógeno y la mezcla se enfrió a temperatura ambiente (25+ 2 °C). 4) Se separaron los residuos sólidos de la muestra utilizando papel filtro watman 42 y, 5) finalmente se aforó a 50 ml con agua destilada.

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Se determinaron las curvas de calibración con soluciones estándar a 1000 ppm de Cd y Pb. Las curvas para Cd fueron las siguientes: 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, y 0.1 ppm. Para las curvas de Pb fueron; 0.2, 0.4, 0.6 y 0.8 ppm. Las muestras fueron analizadas con un espectrofotómetro de absorción atómica marca GBC®. Para el caso del Cd las muestras se analizaron utilizando una longitud de onda de 228 nm y para el caso de Pb con una longitud de 217 nm. Todas las muestras fueron analizadas en tres repeticiones

Los datos obtenidos fueron analizados mediante comparación de medias, análisis de varianza y pruebas de separación de medias (Tukey=0.05) con el programa estadístico SAS V. 9 para Windows® Resultados y Discusión

El análisis de varianza demostró que existe diferencia estadística significativa entre los componentes evaluados. Por los que la presencia de metales en el suelo, la planta de morera y el gusano de seda son diferentes. La concentración de plomo en el suelo fue de 0.59 mg/kg. El suelo presentó la mayor cantidad de plomo comparado con la morera y el gusano de seda. Las tres variedades de morera presentaron cantidades similares de plomo. En la comparación de medias en la variedad kanva fue la que presentó mayor concentración de plomo con 0.23 mg/kg. Esto sugiere que las plantas de morera y en especial la variedad de kanva, trasloca el Pb desde el suelo hasta las hojas de la morera (Cuadro 1). Prieto-Garcia, et al., (2007) reportó presencia de metales pesados (Cd, Cr, Pb, As y Hg) en los cultivos del Valle del Mezquital, Hidalgo, México. Estos resultados concuerdan con lo reportado en este estudio al encontrar en cultivos como las habas y el maíz concentraciones hasta de 22.8 mg/kg de Pb.

La concentración de plomo en el gusano de seda fue diferente comparado con el suelo y con las plantas de la morera, excepto en el capullo. En los estados de crisálida y larva no se reportó presencia de Pb, mientras que en el capullo se encontró una concentración de 0.07667 mg/kg. Sin embargo, la presencia de este elemento en el capullo sugiere que el plomo puede ser causa de intoxicación de los insectos que le puede causar la muerte.

Cuadro 1. Concentración de cadmio (Cd) y plomo (Pb) en suelo, morera y gusano de seda (mg/kg) Componentes Pb Cd Suelo 0.59000 a* 0.05333 a Morera (Kanva) 0.23000 b 0.04667 a b Morera (SLP3) 0.19667 b 0.03000 a b Morera (SLP5) 0.18000 b 0.03000 a b Gusano de Seda (Capullo) 0.07667 b 0.00467 b Gusano de seda (Pupa) 0.00000 c 0.00367 b Gusano de Seda (Larva) 0.00000 c 0.00267 b

*Letras diferentes demuestra diferencias estadísticas significativas

El análisis de varianza demostró diferencias altamente significativas en la concentración de cadmio en el suelo, morera y gusano de seda. En el suelo se presentó la mayor concentración de este elemento seguido por la morera en las tres variedades. La variedad kanva de morera registró concentraciones más altas con 0.04667 mg/kg comparada con las variedades SLP3 y SLP5.

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Figura 1. Gusano de seda (Bombyx mori) alimentándose de hojas de morera

En los tres estados (capullo, crisálida y larva) se encontró presencia del metal. La

presencia de Cd en el insecto indica que puede ser una de las causas de la muerte de los gusanos de seda en la Universidad Politécnica de Francisco I Madero. Conclusiones

Los suelos del Valle Mezquital presentan concentraciones de Pb y Cd. La morera tiene concentraciones similares al suelo de metales por lo que puede ser recomendada como planta Fitoremediadora de suelo. La planta puede resultar tóxica para el gusano de seda y otros animales que se alimentan de esta especie.

En cuanto a la alimentación del gusano de seda, y comparando la concentración de los metales en las diferentes variedades de morera, no se recomienda la alimentación del gusano de seda con la variedad Kanva ya que es la que presentó mayores concentraciones tanto de Pb como de Cd.

Hace falta la realización de estudios sobre la toxicidad de los metales pesados en otras especies como ganado que se alimentan de plantas forrajeras consideradas con gran capacidad de absorber grandes cantidades de metales pesados como la alfalfa. Por otro lado, hace falta realizar investigación estudios detallados in vitro del gusano de seda para el mejor entendimiento de la residualidad y toxicidad. Literatura Citada Faisal, M. and Hasnain, S. 2004. Microbia conversion of Cr (vi) into (iii) in industrial effluent.

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Prieto-Garcia, F. 2007. Presencia de metales pesados en cultivos del Valle de Mezquital, México. Revista Latinoamericana de Recursos Naturales. 3(2): 100-110.

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Rodriguez-Ortega, A. 2012. Tópicos selectos de sericicultura. Memoria de los talleres del Proyecto Fomix-Hidalgo. Pp. 89.

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DETECCIÓN DE Salmonella sp. MEDIANTE PCR EN CUCARACHA AMERICANA (Periplaneta americana L.)

Sarai Monserrat Cueto-Medina1 Sergio Hernández-Rodríguez1, Antonio Castillo-Martínez1, Javier López-Hernández1, Miguel Ángel Gallegos-Robles2. 1Departamento de Parasitología, Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro -Unidad Laguna. Periférico Raúl López Sánchez y Carretera a santa Fe S/N, Torreón, Coahuila, México. C. P. 27059. 2 Facultad de Agricultura y Zootecnia-UJED Carretera Gómez Palacio-Tlahualilo Km 35. Domicilio Conocido, Venecia, Durango, México. C. P. 35170. sary_cueto@hotmail.com; sergiohr39@hotmail.com; cebolla_55@hotmail.com; acm_sultan@hotmail.com; marjav61@hotmail.com; garoma64@hotmail.com. RESUMEN. El presente ensayo preliminar de extracción de ADN y PCR se realizó con la finalidad de comprobar que es posible obtener ADN de Salmonella sp., del tracto digestivo macerado de P. americana L. De 100 especímenes de P. americana colectados en casa-habitación, a 10 se les extrajo el tracto digestivo, el cual posteriormente fue sometido a un procedimiento de macerado, colocando dicho producto en viales de 1.5 ml. Se extrajo ADN puro del macerado proveniente de los 10 especímenes sometidos a análisis, adecuado para usarse en la reacción de la cadena de polimerasa (PCR). De estos se obtuvieron 6 resultados positivos a Salmonella sp., representando el 60% . Esto justifica el uso del método CTAB Fenyl-cloroformo para la extracción de ADN para este tipo de muestras, además de la utilidad de PCR en la detección patógenos como Salmonella sp. Palabras clave: Salmonella, Periplaneta americana, PCR, tracto digestivo

Detection of Salmonella sp. by PCR in American cockroach (Periplaneta americana L.)

ABSTRACT. This preliminary assay for DNA extraction and PCR was performed in order to verify that it is possible to obtain DNA from Salmonella sp. from P. americana L. digestive tract macerates. Ten digestive tracts extracted from 100 specimens of P. americana collected from houses, were macerated and placed in 1.5. Pure DNA was extracted from these macerates and was analyzed using chain reaction polymerase (PCR). From these samples 6 were positive for Salmonella sp. accounting for 60%. This justifies the use of CTAB Phenyl-chloroform method for extraction of DNA for these samples as well as the utility of PCR in detecting pathogens such as Salmonella sp. Key words: Salmonella, Periplaneta americana, PCR, digestive tract Introducción

Las cucarachas son insectos de ambientes húmedos, con geotropismo positivo y hábitos eusociales. La mayoría de las cucarachas son silvestres, aunque algunas especies se han adaptado a los ambientes construidos por el hombre (Arango et al., 2004).

Existen en el mundo aproximadamente 4000 especies de cucarachas de las cuales solo un pequeño grupo (menos del 1%) son consideradas plagas de ambientes urbanos (Gutiérrez, 2010). Algunas de las cucarachas que invaden los hogares, escuelas, hospitales, oficinas y que tienen importancia médica son la cucaracha americana, alemana, café ahumada, oriental y australiana (Ponce et al., 2005).

Las cucarachas afectan la calidad de algunos productos al contaminarlos con sus cuerpos y secreciones (Torres et al., 2006), además actúan como transmisores de patógenos, tales como bacterias (E. coli, Salmonella), hongos, helmintos, protozoarios y virus que ocasionan enfermedades en el hombre (Fathpour et al., 2003). Además, son capaces de ocasionar reacciones alérgicas a muchas personas (Smith y Whitman, 1992) y lesiones locales denominadas herpes blattae (Ponce et al., 2005).

El propósito del siguiente trabajo preliminar fue realizar una extracción de ADN del tracto digestivo de la cucaracha americana y someterlo a PCR con la finalidad de detectar la presencia de la bacteria Salmonella sp.

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Materiales y Método

Se colectaron 100 especímenes de cucaracha americana (Periplaneta americana L.) de los cuales 10 fueron llevados al Laboratorio de Parasitología de la UAAAN-UL donde se extrajeron los tractos digestivos, se maceraron y se colocaron en viales de 1.5 ml.

Las muestras se llevaron al laboratorio de Biología molecular de la FAZ-UJED donde se realizó la extracción de ADN siguiendo el método CTAB (cetyl trimethyl ammonium bromide), omitiendo el uso de polyvinylpyrrolidona y ß-mercaptoethanol (Doyle y Doyle 1987).

Inactivando la muestra, poniéndola a hervir por cinco minutos. Se adicionaron 50 µl de lisozima (10 mg/ml), se agitó e incubó a 37 ºC durante una hora. Posteriormente se agregaron 100 µl de SDS 10%, más 10 µl de proteinaza K (10 mg/ml) se agitó e incubó a 65 ºC durante 10 minutos, además de 100 µl de NaCl 5M y se agitó. Se adicionaron a la mezcla 100 µl de CTAB que después se agitó e incubó durante 10 minutos a 65 ºC. Se hirvió nuevamente la muestra durante 5 minutos, para inactivar las enzimas. Se agregaron 600 µl de SEVAG y se centrifugó a 13,000 rpm por 15 minutos, para transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Se adicionaron 0.6 volumenes de alcohol isopropilico frio, para precipitar los ácidos nucleicos. Se enfrió la mezcla a -20 ºC durante una hora. Nuevamente se centrifugaron los tubos a 13,000 rpm por 15 min y se descartó la mayoría del sobrenadante, dejando aproximadamente 20 µl por encima del botón de ADN. Se adicionó 1 ml de etanol frío y después se procedió a centrifugar a 13,000 rpm por 10 minutos, para descartar el sobrenadante dejando 20 µl por encima del botón de ADN. De nuevo se centrifugó a 10,000 rpm por 1.5 minutos y se descartó la mayoría del sobrenadante cuidadosamente. Se inviertió el tubo y se dejó secar a temperatura ambiente.

El ADN obtenido se resuspendió en 20 µl de buffer TE 1X y se almacenó a -20 ºC hasta su uso. Para comprobar que las muestras contenían ADN purificado se vació buffer de corrida TBE 0.5X en la cámara de electroforesis y se colocó el gel. Por cada muestra se mezclaron 2 µl de ADN en 1 µl de buffer de carga sobre papel parafilm y se cargaron en un pozo del gel. Se corrió el gel a 100 V durante 20 min.

En este estudio, se amplificó una región de 287 pb del gen invA mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Resultados y Discusión

En la figura 1 se puede observar ADN viable procedente del tracto digestivo de la cucaracha americana P. americana. Con el ADN obtenido del macerado del tracto digestivo de la cucaracha, este se sometió a la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la cual arrojo muestras positivas a Salmonella tal como se presenta en la figura 2.

De los 10 tractos digestivos (extraidos y macerados) de cucarachas fue posible obtener ADN viable para someterse a la técnica de PCR. La presencia de ADN en las muestras analizadas es suficiente para continuar con la detección de Salmonella sp., mediante PCR, puesto que el objetivo de este trabajo es sólo demostrar que este tipo de técnicas funcionan para la detección de patógenos en tracto digestivo de cucarachas como se muestra en la figura 2, donde se observa la presencia de la bacteria en una de las muestras en el carril 2.

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Figura 1. ADN procedente del tracto digestivo de P. americana

Figura 2. Productos de PCR del invA de Salmonella. Muestras 1-3 DNA extraído de tracto digestivo macerado. Muestra 4 control positivo. M= marcador molecular 100 pb.

Se usó tracto digestivo macerado para extraer ADN, al igual que Fathpour et al., (2004)

con la única diferencia que este usa solución salina, misma que se pone en medios de cultivo. Así mismo, hace mención que la incubación en medios de cultivo adecuados para el desarrollo de Salmonella sp., tiene la desventaja de obtener resultados hasta los 7 días. A esto se suma que es posible no obtener resultados en los cultivos lo cual no es sinónimo de garantía de la no presencia de bacterias, ya que lo anterior puede deberse a un estado de sobrevivencia programada o a daño subletal lo cual proporciona información engañosa sobre el estatus de viabilidad de bacterias estresadas.

Fernández (2004), menciona que las técnicas de tipificación molecular basadas en el ADN tienen entre otros objetivos, el identificar genéticamente organismos que son iguales de los que no lo son, identificar la presencia o ausencia de un gen de interés como indicador de la presencia de un patógeno en una muestra. De acuerdo a los datos preliminares obtenidos en el estudio se consigna lo comentado por Fernández (2004), ya que mediante uso de la técnica molecular fue posible determinar la presencia de la bacteria Salmonella procedente del tracto digestivo de la cucaracha americana.

Esta investigación utilizo PCR para detectar la presencia de la bacteria Salmonella. Sin embargo Kopanic et al. (1994) en su trabajo de investigación de Salmonella spp., usaron el método ELISA para la detección de la bacteria en cucarachas. Cabe mancionar que Tatfeng et al.

287 pb

1 2 3 4 M

1371

(2005), Al-Mayali y Al-Yaqoobi (2010) y Bala y Sule (2012) describen como técnica de detección de patógenos en cucarachas el método microbiológico.

Salomón (2005) indica que las cucarachas son reservorios naturales de patógenos transmisibles al hombre y a los animales domésticos. Estos microrganismos son transportados sobre la superficie del cuerpo o en el tracto digestivo. De acuerdo a los datos preliminares obtenidos en este estudio se puede afirmar que la bacteria Salmonella se encuentra alojada en el tracto digestivo y que las cucarachas pueden ser transmisores potenciales de esta bacteria. Conclusiones

Se obtiene ADN del tracto digestivo de la cucaracha americana Periplaneta americana L. y al someterse a PCR, el 60% dieron positivo a Salmonella sp. Tales resultados preliminares indican que la cucaracha americana que habita en los hogares de Torreón, Coahuila portan la bacteria Salmonella sp., y posiblemente es transmisor potencial de este patógeno que causa enfermedades gastrointestinales en la población humana. Agradecimientos

Al departamento de Parasitología de la UAAAN-UL por brindar el espacio necesario para realizar las disecciones y al Laboratorio de Biología Molecular de la FAZ-UJED por su apoyo para llevar a cabo la extracción de ADN y reacciones PCR. Literatura Citada Al-Mayali, H. and M. Al-Yaqoobi. 2010. Parasites of Cockroach Periplaneta americana (L.) in

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INHIBICIÓN DE LA ECLOSION EN LA GARRAPATA DEL GANADO Rhipicephalus

(Boophilus) microplus (ACARI: IXODIDAE) POR AGONISTAS Y ANTAGONISTAS ADRENÉRGICOS

Raquel Cossio-Bayugar1, Estefan Miranda-Miranda1, Manuel Fernández Ruvalcaba1, Verónica Narvaez-Padilla2 y Enrique Reynaud-Garza3. 1Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Parasitología Veterinaria INIFAP. Carr. Fed. Cuernavaca-Cuautla No. 8534, Jiutepec Morelos 62550, México. cossio.raquel@inifap.gob.mx, miranda.estefhan@inifap.gob.mx, ruvalcaba.manuel@inifap.gob.mx, 3Facultad de Ciencias Universidad Autónoma de Morelos Av. Universidad 1001, Col. Chamilpa, Cuernavaca, Morelos 62209, México. vnarvaez@uaem.mx, 3Instituto de Biotecnología de la UNAM, Universidad Nacional Autónoma de México, Avenida Universidad, 2001, Apartado Postal 510–3, Cuernavaca 62210, Mexico. enrique@ibt.unam.mx. RESUMEN. La garrapata del ganado Rhipicephalus microplus, es el ectoparásito bovino que más daño económico causa a la industria ganadera de México debido a que transmite graves enfermedades infecciosas como la babesiosis y la anaplasmosis bovina. El uso indiscriminado de acaricidas destinados a el control de esta plaga ha seleccionado poblaciones de garrapatas resistentes a la gran mayoría de los acaricidas comerciales disponibles en la actualidad, por lo que el descubrimiento de nuevas moléculas capaces controlar a las garrapatas del ganado es urgente. La octopamina, un agonista adrenérgico, interviene en la regulación de la ovoposición en varios artrópodos y actualmente es el blanco o diana hacia el que se dirigen los principales acaricidas comerciales, por esta razón se evaluó la capacidad de bloquear la eclosión bajo condiciones de laboratorio de 14 ligandos adrenérgicos que en experimentos previos demostraron su actividad biológica de bloquear la oviposición en R.

microplus. De estas moléculas se encontraron cuatro moléculas agonistas adrenérgicos alfa, dos beta agonistas, dos beta antagonistas que fueron capaces de inhibir parcialmente la eclosión en estas garrapatas, bajo concentraciones farmacológicas lo que podría ser usado en el diseño de nuevos acaricidas. Palabras clave: Rhipicephalus microplus, Boophilus, adrenérgicos, ovoposición, eclosión

Hatching inhibition by agonist and antagonist adrenergics in the cattle tick Rhipicephalus

(Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae) ABSTRACT. The cattle tick Rhipicephalus microplus, causes the most important economical losses to the livestock industry in Mexico, due to its ectoparasitic characteristics, and vector ability to transmit bovine babesiosis and anaplasmosis, two mayor tropical diseases in bovine exploitations around the world. This tick is usually controlled with chemical acaricides but their indiscriminate use has selected resistant tick populations against most commercial formulations available. For this reasons, the detection of new molecules that could be used for cattle tick control is urgent. Based on the knowledge that octopamine, an adrenergic agonist, is essential for the regulation of oviposition in several studied arthropods and currently used as target by several acaricides, 14 adrenergic ligands with the ability to block oviposition were screened for their ability to block hatching in Rhipicephalus microplus. Among these molecules, four alfa-agonists, two beta-adrenergic agonists, and two beta-antagonists were able to partially inhibit hatching at pharmacological concentrations in this tick. These results may be used for the design of a new line of acaricides. Key words: Rhipicephalus microplus, Boophilus microplus, adrenergics, oviposition, hatching. Introducción

Uno de los principales retos de ganadería de las zonas tropicales y subtropicales es el control de la garrapata del ganado Rhipicephalus (Boophilus) microplus ya que es vector de dos graves enfermedades de los bovinos: la anaplasmosis y la babesiosis y por sus características de ectoparásito (de Castro, 1997). El método de control más utilizado para este parásito es el control químico, lo cual ha ocasionado resistencia a diferentes familias de plaguicidas como los piretroides, organofosforados y amidinas (Li et al., 2007; Cossio-Bayugar et al., 2009).

La octopamina (OA) es el equivalente invertebrado de la adrenalina y por esta razón es un agonista de los receptores adrenérgicos, se ha demostrado que la OA es fundamental para el

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proceso de ovoposición en dípteros y ortópteros y que cambios en los niveles de octopamina pueden afectar de manera significativa la fertilidad de los artrópodos (Rodriguez-Valentin et al., 2006)

En el modelo de Drosophila melanogaster, la deficiencia en OA produce hembras estériles porque son incapaces de poner huevos. La deficiencia en la ovoposición en este organismo se debe principalmente por la desregulación de la habilidad contráctil del oviducto. (Osborne, 1996; Roeder, 1999; Roeder 2005; Rodriguez-Valentin et al., 2006). La ovoposición es particularmente sensible a cualquier desbalance del sistema octopaminérgico, cuando ocurre este desbalance se inhibe la ovoposición (Roeder et al., 2004). Se ha demostrado que algunos agonistas y antagonistas adrenérgicos tienen mayor afinidad por los receptores artrópodos que por su contraparte en mamíferos (Roeder et al., 1995; Roeder et al., 1998), esta afinidad diferencial nos da oportunidad de identificar nuevas moléculas que puedan ser usadas para el control de la garrapata. Una vez que estas moléculas sean identificadas, podrían servir como “semillas” para modificación química para así lograr mayor afinidad o actividades que deriven en nuevos acaricidas. En R. microplus se evaluaron 83 ligandos adrenérgicos para probar su habilidad de bloquear la ovoposición identificándose 26 moléculas que inhibían la ovoposición (Cossío-Bayugar et al., 2012). Como la OA es un neurotransmisor, neurohormona y neuromodulador que controla muchos procesos fisiológicos en artrópodos (Donini y Lange, 2004), y se ha observado que las acaricidas formamidinas que actúan en los receptores de OA interfieran con el desarrollo e inhiben la eclosión en Drosophila (Dudai et al., 1987), el objetivo de este trabajo fue evaluar si las moléculas identificadas con mayor capacidad para inhibir la ovoposición en R. microplus tenían efecto más allá de la ovoposición e inhibían la eclosión en la garrapata. Materiales y Método Se utilizó una cepa de garrapatas R. microplus de referencia susceptible a acaricidas comerciales; las garrapatas fueron mantenidas y cultivadas sobre bovinos en el Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Parasitología Veterinaria INIFAP en Jiutepec, Morelos, México. Se infestaron bovinos con 10,000 larvas de garrapatas de 15 días de edad y 21 días después de la infestación, se recolectaron las hembras ingurgitadas, estas se pusieron a ovopositar en cajas Petri y se incubaron a 28ºC y 80% de humedad relativa (Cossio-Bayugar et al., 2009), las cuales se inyectaron con las diferentes moléculas en el tercer día de iniciada la ovoposición, usando una jeringa calibre 30 de acuerdo a procedimiento previamente descrito (Booth, 1989; Cossio-Bayugar et al., 2012). Los controles se inyectaron con 2.5 µl de agua a la misma concentración del DMSO final de las moléculas probadas. Las garrapatas se colocaron en placas de cultivo celular de 24 pozos y se incubaron a 28ºC y 80% de humedad relativa hasta completar la ovoposición. Para la determinación del porcentaje de eclosión de huevos ovopositados por garrapatas tratadas y no tratadas, se incubaron los huevos en tubos de ensayo durante 45 días. Transcurrido este tiempo se procedió a contar el total de huevos y larvas en una cápsula reticulada y se estimó el porcentaje de eclosión acorde al procedimiento descrito por Bravo y Coronado (2004). La evaluación del efecto de la eclosión se hizo a las concentraciones (10 o 50 µM) en que se había observado inhibición significativa de la ovoposición Todas estas mediciones se compararon con las mediciones hechas con un grupo control de garrapatas no tratadas. Los resultados se compararon estadísticamente usando la prueba t de Student.

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Se evaluaron los siguientes 14 ligandos adrenérgicos para probar su habilidad de bloquear la eclosión: Isoproterenol HCl, ZD 7114 HCl, CGP 12177 HCl, Sotalol HCl, R-(+)-Propranolol, ICI 89406, Salbutamol sulfate, Xamoterol hemifumarate, y los siguientes alfa adrenérgicos: Clonidine HCl, Prazosin HCl, Dihydroergocristine mesylate, 3-[2-[4-(2-Methoxyphenyl)piperazin-1-yl]ethyl]-1,5-dimethylpyrimido[5,4-B]indole-2,4-dione, Chloroethylclonidine 2HCl (provenientes de la colección de moléculas con actividad adrenérgica de BIOMOL Internacional L.P. Plymouth Meeting, PA.), Resultados Se probaron 14 compuestos adrenérgicos que habían mostrado la habilidad de disminuir la ovoposición en las garrapata a concentraciones fisiológicas (Cossio-Bauigar et al., 2012). De estos, ocho son ligandos beta y seis ligandos alfa adrenérgicos. De los ligandos beta solo el Sotalol, ICI 89406, ZD 7114 HCl y el Xamoterol hemifumarate, dos bloqueadores y dos agonistas betas respectivamente son los que tuvieron un efecto en la disminución de la eclosión (P=< 0.05) (Cuadro 1), ICI 89406 inhibe la eclosión solo a 10 mM pero no a 50 mM. De los ligandos alfa cuatro agonistas adrenérgicos; Clonidine HCl, Dihydroergocristine mesylate, Prazosin HCl, y la L-(-)-Noradrenaline -(+)-bitartrate son los que tuvieron un efecto en la disminución de la eclosión (P=< 0.05) (Cuadro 2). En los cuadros 1 y 2 las concentraciones maracadas como NSH (no se hizo), no se hicieron ya que a esa concentraciónes no se habían observado efecto en la oviposicion. De estos datos se concluye que de las moléculas que se detectaron que inhibían la ovoposición ocho de ellas también inhiben la eclosión. Cuadro 1. Ligandos beta adrenérgicos probados para evaluar su efecto en la eclosión de R. microplus. El asterisco indica a la concentración a la cual fueron significativamente activas (P=< 0.05). NSH = no se hizo.

Beta-Adrenérgico

Substancia Efectiva a 10mM

Efectiva a 50mM Efecto

(±)-Isoproterenol HCl - NSH agonista beta-1, beta-2, incrementa ritmo cardiaco.

Salbutamol sulfate - NSH agonista beta-2, relajante de músculo liso. ICI 89406 * - Bloqueador beta

CGP 12177 HCl NSH - agonista beta-1, antagonista beta-2 selectivo

Sotalol HCl NSH * bloqueador beta no selectivo

R-(+)-Propranolol NSH - bloqueador beta no selectivo, agonista alfa parcial

ZD 7114 HCl NSH * agonista beta-3 Xamoterol hemifumarate NSH * agonista beta-1

Discusión y Conclusiones Este trabajo representa los primeros pasos para dilucidar el papel de la señalización adrenérgica en la fisiología de la ovoposición y eclosión en las garrapatas del ganado, que eventualmente ayude a encontrar alternativas de control químico para esta plaga de la ganadería.

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Muchas funciones fisiológicas de los artrópodos están reguladas por los receptores adrenérgicos alfas y betas. Los ligandos adrenérgicos se han establecidos reguladores de una variedad de funciones fisiológicas de los artrópodos (Rodriguez-Valentin et al., 2006) y que moléculas que interaccionan con los receptores dc la OA como las formamidinas han demostrado que entre sus efectos tóxicos en Drosophila se encuentra la disminución de la eclosión (Dudai et al., 1987). Cuadro 2. Ligandos alfa adrenérgicos probados para evaluar su efecto en la eclosión de R. microplus. El asterisco indica a la concentración a la cual fueron significativamente activas (P=< 0.05). NSH = no se hizo.

Alfa-Adrenérgico (Eclosíón)

Substancia Efectiva a 10mM

Efectiva a 50mM Efecto

Chloroethylclonidine 2HCl - NSH Agonista irreversible por adreno-receptores, en particular alfa 1B, D, C y subtipos alfa2A/D-

L-(-)-Noradrenaline -(+)-bitartrate * NSH Se une a todos los receptores adrenérgicos excepto beta-2

Clonidine HCl NSH * Agonista alfa-2 adrenérgico 3-[2-[4-(2-Methoxyphenyl)piperazin-1-yl]ethyl]pyrimido[5,4-B]indole-2,4-dione

NSH - Ligando alfa 1

Dihydroergocristine mesylate NSH * Receptor antagonista 5-HT; agonista parcial de receptores adrenérgicos y dopamingérgicos.

Prazosin HCl NSH * Agonista del receptor alfa-2/imidazoline Los resultados muestran una reducción en la eclosión con ligandos alfas y betas en la garrapata del ganado R. microplus sugiriendo que estos receptores tienen varias funciones en la en la fisiología de la garrapatas, algunos de ellas observadas previamente en otros artrópodos, y podrían ser la base de nuevos acaricidas que contrarresten la creciente resistencia de la garrapata del ganado a los actuales acaricidas comerciales. Agradecimientos

Este trabajo fue parcialmente financiado por SEP-CONACT (proyecto No. 103026) Literatura Citada Booth, T. F. 1989. Effects of biogenic amines and adrenergic drugs on oviposition in the cattle

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Cossio-Bayugar, R., Miranda-Miranda, E., Narváez-Padilla, V., Olvera-Valenca, F. and E. Reynaud. 2012. Perturbation of tyraminergic/octopaminergic function inhibits oviposition in the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Journal of Insect Physiology. 58: 628–633.

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EVALUACIÓN Y VALIDACIÓN DE SECUENCIAS DEL GEN CITOCROMO C OXIDASA I (COI), PARA SU USO MEDIANTE BARCODING EN Calvertius tuberosus

(FAIRMAIRE AND GERMAIN), (COLEOPTERA: CURCULIONIDAE)

Luis Lorenzo Huala-Jimenez1, 2, Marcos Orlando Paredes-Honorato1, 2 y Ramón Eduardo Rebolledo-Ranz1, 3. Doctorado en Ciencias Mención Biología Celular y Molecular Aplicada. Universidad de La Frontera. Facultad de Ciencias Agropecuarias y Forestales. Av. Francisco Salazar 01145. Casilla 54-D. Temuco, Chile1. Laboratorio de Investigación en Biotecnología Animal. Dpto. de Ciencias Básicas. Facultad de Medicina. Universidad de La Frontera. Temuco, Chile2. Laboratorio de Entomología Aplicada. Facultad de Ciencias Agropecuarias y Forestales. Universidad de La Frontera. Temuco, Chile 3. luishuala@gmail.com.; mparedes@ufro.cl.; ramonr@ufro.cl. RESUMEN. “Barcoding” es una técnica que permite identificar y clasificar de forma correcta organismos tan diversos como los insectos, los cuales debido a fenómenos como la plasticidad fenotípica y la variación intraespecífica hacen compleja su clasificación taxonómica. En el estudio se muestrearon tres zonas de la Región de La Araucanía, Chile en las cuales se colectaron ejemplares de Calvertius tuberosus. Estos se analizaron en el Laboratorio de Investigación en Biotecnología Animal perteneciente a la Universidad de La Frontera. Temuco. Chile. Una vez congelados los ejemplares fueron sometidos a la extracción del DNA y cuantificación por espectrofotometría. La amplificación por PCR con primers específicos para el gen Citocromo C Oxidasa I (COI) fue exitosa. La secuenciación de los amplicones para las tres poblaciones fue positiva para COI, los árboles filogenéticos informan que los ejemplares corresponden a la especie objetivo. Los resultados apoyan fuertemente el uso de COI para su uso como Barcoding. Palabras clave: Barcoding, Calvertius tuberosus, Citocromo C Oxidasa.

Evaluation and validation of gene sequences cytochrome c oxidase i (coi) barcoding through for use in Calvertius tuberosus (Fairmaire and Germain), (Coleoptera: Curculionidae)

ABSTRACT. "Barcoding" is a technique to identify and properly classify organisms as diverse as insects, which due to phenomena such as phenotypic plasticity and intraspecific variation make complex their taxonomic classification. The study sampled three areas of the Region de La Araucanía, Chile. Specimens were collected Calvertius tuberosus. These were analyzed in the Laboratory of Animal Biotechnology Research belonging to the Universidad de La Frontera. Temuco. Chile. Once frozen the samples were subjected to DNA extraction and spectrophotometric quantification. PCR amplification with primers specific for the gene cytochrome c oxidase I (COI) was successful. Sequencing of amplicones for the three populations was positive for COI, phylogenetic trees report that the copies are for the target species. The results strongly support the use of COI for use as Barcoding. Key words: Barcoding, Calvertius tuberosus, Cytochrome C Oxidase I. Introducción Una estrategia que presenta una amplia aceptación por parte de biólogos y científicos para la identificación de las distintas formas de vida en el planeta a nivel genético, es la técnica molecular denominada “Barcoding”. Científicos alrededor del mundo han propuesto el uso de secuencias de DNA para la identificación de organismos vivientes y así brindar soporte a los programas de investigación sobre biodiversidad. Investigadores canadienses propusieron usar una secuencia de unos 700 nucleótidos del gen mitocondrial de la enzima Citocromo C oxidasa I (COI) como “identificador universal” para animales (Hebert et al., 2003a), la puesta en marcha de esta iniciativa comprendía disponer de un sistema que relacionara cada “Barcode” (o secuencia de DNA diagnostica) con especímenes de referencia o “Vouchers” asignados a nombres de la clasificación Linneana, depositados en instituciones científicas. Este sistema significo un avance notable con respecto a los estándares taxonómicos empleados por el GenBank, dado que una parte de los 40 millones de secuencias

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acumuladas en dicha base de datos, no cuenta con “Vouchers” de los ejemplares estudiados. Los defensores del Barcoding, sostienen que facilitara la tarea de identificación de especies y contribuirá a revitalizar las colecciones biológicas, así como acelerar el inventario de la biodiversidad (Lanteri, 2007). En cuanto a los niveles de divergencia molecular entre linajes definidos en base a secuencias de COI, resultan de gran utilidad para formular hipótesis y orientar futuras investigaciones en el campo de la sistemática. Si la divergencia a nivel molecular no está acompañada por una diferenciación morfológica suficiente, pero se asocia con distintas preferencias de huéspedes u otros atributos biológicos, es posible que los linajes reconocidos correspondan a especies cripticas dentro de una misma morfoespecie, o a complejos de especies próximas con características biológicas distintivas (Hebert et al., 2003b). Las secuencias obtenidas de “DNA barcode” pueden analizarse mediante métodos de distancia, estableciendo valores máximos de variación intraespecífica (Lambert et al., 2005). Calvertius tuberosus habita en la zona sur de Chile entre las regiones del Bio- Bio y la Araucanía (Tobar, 2000), Los ecosistemas boscosos de estas regiones presentan abundante composición de especies caducifolias y perennes como es el caso de Araucaria araucana (Mol.) (Araucaria), especie arbórea sobre la cual habita principalmente C. tuberosus y que es parte exclusiva de la dieta de este coleóptero, siendo así muy fácil encontrarlos bajo la corteza de las araucarias caídas o caminando sobre estas, como lo demuestra un censo de especies de coleópteros de la familia Curculionidae en follaje de árboles del centro-sur de Chile (Elgueta et,

al. 2004). Materiales y Método Los ejemplares de C. tuberosus fueron colectados en tres zonas de la región de La Araucanía, Chile. Reserva Nacional Malacahuello (CTMAL), Villa Las Araucarias (CTVAR) y Parque Nacional Nahuelbuta (CTNAH) (Fig. 1), sectores con una presencia importante de la especie forestal Araucaria araucana. Los muestreos se realizaron durante los meses de noviembre y diciembre del año 2012. Los individuos en estado adulto fueron almacenados en tubos falcon y rotulados, para ser trasladados al Laboratorio de Investigación en Biotecnología Animal (LINBA), Temuco. Chile. Una vez en el laboratorio las muestras se almacenaron a -80° C, para su uso en los posteriores ensayos moleculares.

Para la extracción y purificación del DNA genómico de C. tuberosus se realizó la molienda individual de cinco individuos de cada sector, mediante mortero y pistilo estériles, enfriados a -80 ° C hasta alcanzar un peso entre 1-20 mg de tejido. Posteriormente la utilización del kit de extracción AxyPrep Multisource Genomic DNA Miniprep, permitió la obtención de DNA purificado para las muestras (CTMAL, CTVAR, CTNAH). La Cuantificación de DNA de todas las muestras fue realizada con espectrofotómetro (T80+UV/VIS Spectrometer) a 260 nm.

La amplificación del gen Citocromo C Oxidasa I (COI) se realizó a través de PCR convencional, utilizando los primers universales LCO1490-R: 5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3' y HCO2198-F: 5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3', descritos por Folmer, et al. (1994). Las cantidades de cada reactivo correspondieron: Dream Taq 2x (12,5 µl), Primers LCO1490-R y HCO2198-F (1 µl) DNA CTMAL, CTVAR, CTNAH (1 µl) H20 ultra purificada (9,5 µl) [Volumen total de la reacción 25 µl]. Condiciones del Termociclador (Multigene LabNet Inc): 95° C por 3 min (1 ciclo). 95° C por 40 seg, 50° C por 40 seg, 72° C por 1 min (35 ciclos). 72° C por 5 min (1 ciclo).

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Visualización por electroforesis en gel de agarosa al 1,5%. Gen Ruler 100pb. La secuenciación de los amplicones se realizó en el Departamento de Ecología perteneciente a la Facultad de Ciencias Biológicas de la Pontificia Universidad Católica. Santiago, Chile. El análisis bioinformático de las secuencias se realizó mediante los programas CHROMAS, BLAST y CLUSTALW2.

Figura 1. Zonas de recolección de individuos de C. Tuberosus. En círculos: Parque Nacional Nahuelbuta (arriba-izquierda), Villa las Araucarias (abajo-izquierda), Reserva Nacional Malalcahuello (Derecha). Resultados y Discusión La Amplificación por PCR del gen de Citocromo Oxidasa I (700 pb aproximadamente), muestra como fragmentos entre los cercanos a los 700 pb fueron amplificados con el uso de primers específicos (Fig. 2).

El programa bioinformático CHROMAS valido el buen estado de las secuencias del gen COI mediante los electroferogramas (datos no mostrados). A partir de estas se seleccionaron los fragmentos más íntegros y con menos ruido de fondo para ser analizados mediante BLAST (algoritmo para el alineamiento de secuencias que utiliza secuencias similares en las diferentes bases de datos del NCBI). Todos los resultados de los alineamientos de secuencias mediante

Figura 2. Amplificación por PCR del gen COI de CTMAL, CTVAR y CTNAH mediante primers específicos, y visualización en gel de agarosa al 2% con bromuro de etidio. Los fragmentos amplificados se encuentran en el tamaño esperado. MP) Marcador de peso, 100pb, 1-2-3-4-5) muestras de C. tuberosus, CN) Control negativo, C) Control positivo Aegorhinus superciliosus.

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BLAST demostraron que los fragmentos secuenciados pertenecen al gen COI de C. tuberosus (Fig. 3), los mapas de distribución de alineamientos para las tres poblaciones (A, B, C) muestran una secuencia que resultó ser muy similar a la secuencia de búsqueda (bandas), estos resultados son corroborados por las descripciones de los alineamientos (1, 2 ,3) con las especies coincidentes, reflejando su similitud por el porcentaje de identidad máxima. El cladograma (Fig.4) generado con el programa CLUSTALW2 representa las relaciones y distancias evolutivas entre C. tuberosus y grupos relacionados, demostrando que los ejemplares colectados en la Reserva Nacional Malalcahuello y Villa las Araucarias, presentan la misma distancia evolutiva y parentesco filogenético.

Figura 3. Mapa de distribución de alineamientos. A) R. Malalcahuello, B) V. las Araucarias, C) P. Nahuelbuta. Descripción de los alineamientos generados con BLAST; 1) R. Malalcahuello, 2) V. Araucarias, 3) P. Nahuelbuta.

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Figura 4. Cladograma generado con CLUSTALW, que representa las relaciones y distancias evolutivas entre C.

tuberosus, grupos relacionados y grupos menos emparentados. Conclusiones Los fragmentos secuenciados, procedentes de los homogeneizados de C. tuberosus

corresponden de forma inequívoca al gen COI, según el alineamiento de secuencias a través de BLAST. Con las secuencias obtenidas del gen COI para las muestras de Malalcahuello y Villa las Araucarias, será posible generar partidores homólogos para C. tuberosus. Al generar un alineamiento múltiple de secuencias para las poblaciones de Malalcahuello y Villa las Araucarias, contra grupos cercanos y lejanos, el cladograma muestra como la dos poblaciones de C. tuberosus mantienen una línea evolutiva común y se relacionan de forma cercana con especies de Argentina y Australia. No así con el grupo de arácnidos e himenópteros. Los resultados evidencian que COI puede ser utilizado como Barcoding. Sin embrago, es necesario un análisis más extensivo de secuencias para que este método sea preciso y confiable. Agradecimientos Proyecto FONDEF D10I1038: Red de información en biodiversidad para orientar las propiedades de investigación científica en apoyo a las políticas públicas ambientales. Proyecto DIUFRO DII2-002 Caracterización química y biológica del Maitén (Maytenus

boaria) como atrayente alimenticio de A. superciliosus (Coleoptera: Curculionidae). Literatura Citada Elgueta, M., Araia, E., Will, K. 2004. Contribuciones taxonómicas en ordenes de insectos

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ESTUDIO ANATÓMICO E HISTOLÓGICO DEL APARATO REPRODUCTOR FEMENINO DE LA COCHINILLA DE JARDÍN Armadillidium vulgare (LATREILLE,

1804) María de los Ángeles Mora-Villa y Hortensia Montellano-Rosales. Laboratorio de Embriología, Departamento de Morfología, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional., Prolongación de Carpio y Plan de Ayala, s/n. Colonia Casco de Santo Tomás, C.P. 11340 México, D.F. Tel. 57296300 Ext. 62390. angel_es_micamuso@hotmail.com. RESUMEN. Se estudió anatómica e histológicamente el aparato reproductor femenino de Armadillidium vulgare. Se trabajó con 18 hembras sacrificadas en julio, el material se fijó con formol al 10% durante 48 horas. Seis aparatos se tiñeron con la técnica verde luz para su estudio anatómico, en tanto que los 12 restantes se procesaron histológicamente con la técnica hematoxilina-eosina. Anatómicamente, los ovarios y oviductos dobles desembocan separadamente en su correspondiente gonoporo, los ovarios de forma sacular presentan tres cordones suspensorios; en su extremo posterior se comunican con el oviducto que continúa en una dilatación y finalmente cada oviducto desemboca en su gonoporo. Histológicamente los cordones suspensorios están constituidos por músculo estriado; los ovarios saculares presentan desarrollo folicular en la pared ovárica, observándose ovocitos esféricos con la vesícula germinal central, prominente nucléolo y los gránulos de vitelo están rodeados por una capa de células foliculares planas; la cámara incubadora cuenta con epitelio glandular. Palabras clave: Armadillidium vulgare, anatomía, histología, folículos. Anatomical and Histological Study of Female Reproductive Tract of Common Woodlouse

Armadillidium vulgare (Latreille, 1804)

ABSTRACT. We made anatomical and histological analysis of the female reproductive tract of common woodlouse Armadillidium vulgare. Eighteen females obtained in July were dissected. Reproductive tract was fixed in 10% formalin for 48 hours. Six tracts were stained with light green technique for anatomical study, while the remaining 12 were processed histologically with hematoxylin-eosin technique. Anatomical study shows that each ovary and their double oviduct lead to their corresponding gonopore separately. Saccular ovaries posesses three strands forming suspenders. At its posterior portion, ovaries communicate with the oviduct, which forms a dilatation; finally, each oviduct disembogues into a single gonopore. Histological analysis shows that suspensory cords are constituted of striated muscle; saccular ovaries present follicular development at level of ovarian wall. Spherical oocytes with central spherical germinal vesicle are shown. Oocytes have a prominent nucleolus. Yolk granules are surrounded by a layer of flat follicle cells; the incubator chamber shows glandular epithelium. Key words: Armadillidium vulgare, common woodlouse, anatomy, histology, follicles. Introducción

Armadillidium vulgare es un crustáceo muy común de la mayoría de los suelos. Se denominan “bichos bolita” dado que como método de defensa usan la conglobación y con ello forman una estructura esferoidal (Saluso, 2000). Son dependientes de la humedad para establecer la mayor parte de su ciclo de vida, destacando la reproductiva y respiratoria (Gunn, 1993).

La cochinilla de la humedad tiene reproducción sexual, son individuos dioicos. El macho tiene dos penes y la hembra tiene dos vaginas. El apareamiento de este invertebrado ocurre durante la noche, por lo que es difícil de ver. En algunas especies de cochinilla de la humedad, como Armadillidium vulgare el apareamiento está sincronizado entre los miembros de la colonia de modo que todos crían al mismo tiempo. La hembra coloca los huevos dentro de una estructura en forma de bolsillo llamada marsupio. Una hembra de A. vulgare puede depositar más de 200 huevos, la incubación dura entre tres y nueve semanas (Botanical, 2009).

Anatómicamente se describe que las gónadas se encuentran en pares como se mencionó con anterioridad, sin embargo los espermiductos se abren al exterior en el segundo par de

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pleópodos; las hembras carecen del primer par de pleópodos y el segundo forma un opérculo que cubre el marsupio. Los oviductos forman en su parte final un receptáculo seminal donde el macho deposita los espermatozoides durante la cópula (Asturnatura, 2013).

Estos crustáceos son muy útiles ya que son detritívoros, y de hecho mejoran la calidad del suelo, siempre que se les encuentre allí (Tripathi, 2006) citado en Phipps, E., (2009). Esta característica los hace útiles para la restauración de los suelos perturbados (Snyder, 2008) citado en Phipps, E., (2009), además recientemente han sido objeto para estudios genéticos y de metales pesados. Sin embargo suelen causar problemas en cultivos de interés comercial por lo que es importante conocer a profundidad el ciclo reproductivo de dichos organismos. Material y Método

Se colectaron las cochinillas al azar en un jardín cuyas coordenadas son 19°36´45.2´´ Lat N y 99°04´48´´ Lon O +/- 2357 msnm. Se llevaron al laboratorio donde fueron sacrificados con acetato de etilo. Se extrajeron las gónadas colocándolas en formol al 10% para ser tratadas anatómica e histológicamente.

Para la parte anatómica se realizó la técnica de Verde Luz para transparentar el tejido, para ello se coloca el reactivo con dicho nombre y posterior a ello el salicilato de metilo se fija seguido de cambios en xilol en una laminilla con capilares.

Histológicamente se inicia con la colocación en Buin. Se deshidrata en alcoholes de diferentes graduaciones, luego se cambia a benzoato de metilo seguido de tolueno fenicado y se incluye en parafinas. Al término de dicho tiempo se incluyen en cubos de parafina para realizar cortes seriados de 6 micras usando fijador de Ruiter en una platina caliente. Se aplicó la técnica H-E, que consistió en desparafinar los cortes en cambios de xilol, luego se hidrataron en alcoholes, se hizo un cambio a agua destilada y se tiñó con Hematoxilina de Harris, se enjuagaron los cortes y se tiñó con Eosina. Para montarlos se debe deshidratar nuevamente con alcoholes y añadir xilol para poderse montar en resina sintética y etiquetarse. Finalmente se revisaron las laminillas en el microscopio óptico. Resultados y Discusión

El estudio anatómico muestra que los ovarios y oviductos son estructuras pares e independientes las cuales desembocan separadamente en su correspondiente gonoporo, los ovarios de forma sacular poseen tres cordones suspensorios. En su extremo posterior, los ovarios se comunican con el oviducto que forma una dilatación; finalmente cada oviducto desemboca en su gonoporo (Fig. 1).

El análisis histológico muestra que los cordones suspensorios están constituidos por músculo estriado (Fig. 2); en tanto que los ovarios saculares presentan desarrollo folicular a nivel de la pared ovárica. Se observan ovocitos esféricos con la vesícula germinal central. Los oocitos poseen un nucléolo prominente, mientras que los gránulos de vitelo están rodeados por una capa de células foliculares planas; finalmente se apreció que la cámara incubadora cuenta con epitelio glandular, el cual se piensa ayuda en la secreción de fluidos para mantener a las larvas en el marsupio (Fig. 3, A-F).

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Figura 1. Anatomía del aparato reproductor femenino. O. Ovario, Ci. Cámara incubadora

Figura 2. Cortes histológicos de los cordones suspensorios. A. corte transversal de músculo estriado. Vista 100x. B Corte longitudinal de músculo estriado. Vista 100x. Figura. 3. Cortes histológicos de ovario. A. Corte transversal 40x. B. Desarrollo folicular 400x. C. Corte longitudinal 100x. D. Corte longitudinal de la pared ovárica. 400x. E. Corte longitudinal de la cámara incubadora 40x. F. Pared de la cámara incubadora 400x.

O

O

Ci

A

C

B

D

E F

A B

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Cabe aclarar que al tratarse de organismos con exoesqueleto, la copula sólo sucede durante el breve lapso de la intermuda de la hembra, por ello es probable la captura de solo individuos del sexo femenino (The Other Side, 2009).

Conclusiones

Anatómicamente se observó que las hembras de Armadillum vulgare, presentaron un par ovarios alargados que se continúan caudalmente con la cámara incubadora, las cuales se comunican al exterior independientemente. Histológicamente el ovario es sacular y el epitelio germinal constituye la pared ovárica, observándose que la maduración folicular es asincrónica por grupos y se lleva a cabo a lo largo del ovario. Literatura Citada Asturnatura, 2013. Isópodos. Sistemas corporales. Asturnatura DB, 204-2013:

http://www.asturnatura.com/articulos/artropodos/isopodos.php (Accesada) Botanical-online. 2009. Como criar cochinillas de humedad. Botanical SL. El mundo de la

naturaleza : http://www.botanical-online.com/animales/cochinilla.htm (Accesada) Gunn, D. 1993. The Humidity Reactions of the Woodlouse, Porcellio Scaber (Latreille). From

the Zoology Department, University of Birmingham. 178:186 pp. Phipps, E. 2009. Preferencias de hábitat de los isópodos terrestres: un estudio de comparación de

los sustratos húmedos y secos. Tennessee Technological University (TTU) Cookeville, Tennessee 38501

Saluso, M., Adriana. 2000. Bicho Bolita Plaga Emergente de Siembra. Laboratorio de Entomología Aplicada. Estación Experimental Paraná. Sitio de Producción Agropecuaria. Buenos Aires, Argentina. http://www.produccion-animal.com.ar/produccion_y_manejo_pasturas/pasturas_combate_de_plagas_y_malezas/75-bicho_bolita.pdf (Accesada)

The Other Side. 2009. Cochinillas de la humedad. Reproducción. http://unamiradaagaia.blogspot.mx/2009/05/cochinillas-de-la-humedad.html (Accesada)

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LÍNEAS BASE Y MONITOREO DE SUSCEPTIBILIDAD DE Spodoptera exigua HÜBNER A LAS TOXINAS Cry1Ac y Cry2Ab de Bacillus thuringiensis Kurstaki EN

MÉXICO

Sotero Aguilar-Medel1, J. Concepción Rodríguez-Maciel2 y José Luís Martínez-Carrillo3. 1Universidad Autónoma del Estado de México. Centro Universitario Tenancingo. 52400, Tenancingo, Estado de México. soteromex@hotmail.com; 2Colegio de Postgraduados. Montecillo, Edo de México. 3 Instituto Tecnológico de Sonora, 5 de febrero 818 sur. Cidudad Obregón, Sonora. RESUMEN. Se determinaron las líneas base de susceptibilidad del gusano soldado Spodoptera exigua Hübner a las toxinas Cry1Ac y Cry2Ab de Bacillus thuringiensis. Las poblaciones evaluadas fueron: Ojinaga (Chihuahua), La Laguna (Coahuila-Durango) y Valle del Yaqui (Sonora). Se usó una colonia de laboratorio como referencia de susceptibilidad. El método de bioensayo que se utilizó fue el de contaminación superficial de la dieta con concentraciones conocidas de las toxinas, y se usaron larvas neonatas, las cuales se expusieron durante cinco días en condiciones controladas: temperatura de 27±1oC, humedad relativa del 70% y fotoperiodo de 14:10 horas-luz. La respuesta de las poblaciones del gusano soldado a la toxina Cry1Ac fueron las siguientes: los porcentajes de mortalidad registrados en la dosis más alta (50 μg/mL) variaron del 8.8 al 18.8%; las concentraciones que inhibieron el desarrollo del 50% de las poblaciones (ID50), variaron de 0.009 a 0.07 μg/mL; las concentraciones que inhibieron el desarrollo al tercer instar del 95% de la población (ID95) fluctuaron de 15.5 a 71.9 μg/mL; las concentraciones que redujeron el 50% del peso de las larvas (RP50) fueron de 0.01 a 0.04 μg/mL. En el caso de la toxina Cry2Ab, la dosis más alta fue de 10 μg/mL, las mortalidades registradas variaron de 28.4 a 36.5%; las ID50 fluctuaron de 0.016 a 0.03 μg/mL; las RP50 variaron de 0.03 a 0.05 μg/mL. Las ID50 fueron similares para las dos toxinas, lo mismo ocurrió con las RP50. En general, la respuesta de las poblaciones de campo fue similar a la colonia susceptible para las dos toxinas. Por otra parte, se realizaron bioensayos de dosis diagnósticas para monitorear la susceptibilidad del gusano soldado a las dos toxinas en los años 2010 al 2012. Las dosis usadas fueron de 5 y 10 μg/ml de las toxinas Cry2Ab y Cry1Ac respectivamente. No se registraron diferencias significativas en los datos obtenidos en los años 2010 al 2012 en los parámetros evaluados (mortalidad, desarrollo al tercer instar y reducción del peso), estos datos indican que las poblaciones evaluadas siguen siendo susceptibles a las toxinas Cry1Ac y Cry2Ab de B. thuringiensis. Palabras Clave: Gusano soldado, Bioensayo, Dosis Diagnóstica

Base line and monitoring of susceptibility of Spodoptera exigua Hubner to Cry1Ac and Cry2Ab toxins of Bacillus thuringiensis kurstaki in Mexico

ABSTRACT. Susceptibility base lines were obtained on the beet armyworm Spodoptera exigua Hübner to Cry1Ac and Cry2Ab toxins of Bacillus thuringiensis kurstaki. Populations evaluated were from: Ojinaga (Chihuahua), La Laguna (Coahuila-Durango) and Valle del Yaqui (Sonora). A laboratory colony was used as reference for susceptibility. The bioassay was the overlay, where different toxin concentrations were disposed over the artificial diet. Neonate larvae were exposed during five days to the concentrations under controlled conditions of temperature 27°C, relative humidity 70% and photoperiod 14:10 (light-dark). Response of beet armyworm to Cry1Ac was as follows: The percent mortality ranged from 8.8 to 18.8% at the highest concentration (50 μg/mL). Concentrations that inhibited growth of third instar in 50% (ID50) of the populations ranged from 0.009 to 0.07 μg/ml; Concentrations that inhibited growth of third instar in 95% (ID95) of the populations ranged from 15.5 a 71.9 μg/ml. Concentrations that reducer in 50% the weight of larvae (RP50) were from 0.01 a 0.04 μg/mL In the case of Cry2Ab toxin the highest dosage was 10 μg/mL. Mortalities ranged from 28.4 to 36.5%; The ID50 fluctuated from 0.016 a 0.03 μg/mL; The RP50 ranged from 0.03 to 0.05 μg/mL. The ID50 were similar for both toxins, as it was the case for the RP50. In general response of field populations were similar to those of the susceptible colony for both toxins. On the other hand, there were performed bioassays with diagnostic dosages in order to monitor the susceptibility of beet armyworm to these toxins from years 2010 up to 2012. Diagnostic dosages used were 5 and 10 μg/ml of Cry2Ab and Cry1Ac respectively. There were no significant differences among data obtained on the years 2010 up to 2012 with respect to the parameters evaluated (mortality, development up to the third instar and weight reduction), these data indicate that the populations evaluated continue being susceptible to the toxins Cry1Ac and Cry2Ab of B. thuringiensis. Key Words: Beet armyworm, Bioassay, Diagnostic Dosage

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Introducción Los insectos tienen la capacidad de desarrollar resistencia a toxinas de B. thuringiensis

(Bt) tanto en condiciones de laboratorio como en condiciones de campo, y al usar las plantas que producen proteínas de B. thuringiensis (cultivos Bt), la presión de selección que se ejerce es alta, y el riesgo que se tiene al usar esta tecnología es el desarrollo de la resistencia.

Mc Gaughey (1985) reportó por primera vez la resistencia de la palomilla de la harina Plodia interpuntella Hübner a formulaciones de Bt. Posteriormente, muchos otros insectos desarrollaron resistencia a las toxinas de Bt en condiciones de laboratorio. Los primeros informes de la resistencia a Bt en condiciones de campo se reportaron en la palomilla de la col Plutella

xyllostella L. y en condiciones de invernadero en el falso medidor Trchoplusia ni Hübner. En los últimos años se han reportado casos de resistencia en campo de algunas plagas a cultivos Bt, por ejemplo, H. zea a la toxina Cry1Ac que produce el algodonero Bollgard en el sureste de los Estados Unidos (Luttrell 2004), S. frugiperda a la toxina Cry1F que produce el maíz Bt en Puerto Rico (Matten et al. 2008), Busseola fusca Fuller a la toxina Cry1Ab que también es producida por el maíz Bt en Sudáfrica (Van Rensburg 2007), H. armigera a la toxina Cry1Ac producida por el algodón Bt en China (Liu et al. 2010) y el gusano rosado Pectinophora gossypiella Saunders a la misma toxina y cultivo en la India (Sanyasi y Guajar 2011).

Con la finalidad de incrementar la eficacia, ampliar el rango de plagas y retrasar el desarrollo de la resistencia a las toxinas de Bt, se desarrollaron variedades de algodonero que producen más de una toxina, por ejemplo, el algodonero Bollgard II que está disponible para su uso comercialmente desde el 2003 y produce las toxinas Cry1Ac y Cry2Ab. Al producirse simultáneamente las dos proteínas en la misma planta, se incrementó el control del complejo bellotero y se aumentó el espectro de acción contra el gusano soldado Spodoptera exigua Hübner y el gusano cogollero S. frugiperda (Stewart et al. 2001); aunque con las dos toxinas, Bollagrd II es todavía susceptible a altas poblaciones de Spodotera spp y H. zea, especialmente después de la etapa de floración, por lo que se recomienda hacer aplicaciones de algunos insecticidas piretroides (Jackson et al. 2004).

En el presente documento se presentan las líneas bases de cuatro poblaciones de S. exigua a las toxinas Cry1Ac y Cry2Ab, y el monitoreo de la susceptibilidad de estas poblaciones durante tres años (2010-2012) a dichas toxinas. Materiales y Método

Poblaciones y cría del gusano soldado. Se colectaron larvas de S. exigua en cultivos del algodonero (temporada agrícola 2010-2012) en la Comarca Lagunera; Valle del Yaqui, Sonora y Ojinaga, Chihuahua. En cada población se colectaron al menos 300 larvas y se mantuvieron en condiciones de laboratorio hasta obtener adultos. Como población susceptible de referencia se utilizó una colonia de S. exigua que ha sido criada en el Colegio de Posgraduados, en Montecillo, Texcoco, Estado de México. Las larvas colectadas en campo fueron criadas en dieta artificial (Corn Earworm; Southland Products Inc.). Estos insectos se mantuvieron en una cámara de cría en condiciones controladas: temperatura de 271oC, humedad relativa del 705% y un fotoperiodo de 14 horas luz. Se obtuvieron larvas neonatas F1 con las cuales se realizaron los bioensayos.

Bioensayo de la línea base. El método de bioensayo usado fue el descrito por Sims et al. (1996). Este método consistió en colocar un ml de dieta artificial. Una vez que la dieta solidificó

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(30 minutos), en cada cavidad se colocaron 200 L de la toxina (Cry1Ac o Cry2Ab) de la concentración conocida de manera superficial en cada cavidad; 24 horas después se colocó una larva neonata (≤12 h de edad) la cual fue confinada con un papel plástica transparente autoadherible con microperforaciones que permite el intercambio gaseoso (Pull´n Peel Tab Bio-CV-16, C-D International, Inc., USA). Las charolas infestadas fueron colocadas en una cámara de cría bajo condiciones controladas previamente descritas.

En cada bioensayo se usaron por lo menos ocho concentraciones con cinco repeticiones y se incluyó un testigo. El testigo fue tratado con 200 L de agua-agar al 0.2%. El tamaño de cada muestra fue de 32 larvas por concentración y se realizaron cinco repeticiones en días diferentes. Los datos fueron tomados cinco días después de haber expuesto a las larvas a la toxina. Las larvas que no presentaron movimiento después de ser tocadas con un pincel, fueron consideradas larvas muertas. La mortalidad fue ajustada usando la fórmula de Abbott (Abbott 1925). También se registraron los porcentajes de larvas que se desarrollaron al tercer instar y los porcentajes de reducción del peso de las larvas respecto a las larvas testigo.

Monitoreo de la resistencia. La dosis diagnóstica usada para la toxina Cry1Ac fue de 10 µg/ml y para la Cry2Ab de 5 µg/ml (Sims et al. 2006) usando el mismo procedimiento descrito para los bioensayos de la línea base. Se realizaron cinco repeticiones en días diferentes. Cada repetición consistió de 96 larvas expuestas a la dosis diagnóstica y 32 larvas fueron testigos. Después de cinco días de exposición se registraron los porcentajes de mortalidad, porcentajes de larvas del tercer instar y los porcentajes de reducción del peso de las larva tratadas respecto al testigo.

Análisis Estadísticos. Para los estudios de líneas base, los datos fueron analizados asumiendo el modelo Probit (Finney, 1971). Los valores de respuesta de cada población se presentan con sus correspondientes límites de confianza al 95%. Las respuestas de dos poblaciones fueron consideradas significativamente diferentes cuando sus límites de confianza al 95% no se traslaparon. La proporción de Resistencia (RR) se obtuvo dividiendo la respuesta de la población de campo entre la respuesta población susceptible.

En los estudios de monitoreo, los porcentajes de mortalidad y porcentajes de reducción del peso, en relación al testigo, de las larvas expuestas se transformaron para su análisis a la función arcoseno de la raíz cuadrada del porcentaje de respuesta/100. Las variables transformadas se sometieron a un análisis de varianza para determinar las diferencias estadísticas entre los años de evaluación dentro de cada población (Anova =0.05) mediante el procedimiento PROC ANOVA de SAS. Posteriormente, los datos se sometieron a una comparación múltiple de medias para clasificar las diferentes temporadas evaluadas dentro de cada población (Tukey, =0.05).

Toxinas. Se utilizó el insecticida MVP II (Mycogen, Corp. San Diego, CA), formulación sólida que contiene a la proteína Cry1Ac a la concentración de 19.1%. Como fuente de la proteína Cry2Ab, se utilizó tejido liofilizado de la planta de maíz, Zea mays L., modificada genéticamente y que expresa dicha proteína a la concentración de 0.6%. Resultados y Discusión

Mortalidad. La concentración más alta de la toxina Cry1Ac que se evaluó fue de 50 μg/mL, y los porcentajes de mortalidad registrados en las poblaciones fueron de 8.8 a 18.8%, lo que significa, que casi 80% de las larvas sobrevivieron a esta dosis, y en consecuencia, no fue posible estimar las concentraciones que matarían el 50% (CL50) y 95% (CL95) de las larvas. En el

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caso de la toxina Cry2Ab, la mayor concentración que se evaluó fue de 10 μg/mL. Los porcentajes de mortalidad registrados fueron de 28.4 a 36.5%, por lo que más del 60% de las larvas sobrevivieron en esta dosis.

Inhibición de desarrollo al tercer instar. Las concentraciones de la toxina Cry1Ac que inhibieron el desarrollo al tercer instar del 50% de las larvas (ID50) de S. exigua, fueron de 0.009 a 0.07 ug/mL en las poblaciones de campo, y de 0.016 ug/mL en la Susceptible, y las que inhibieron el desarrollo al tercer instar del 95% (ID95) fueron de 15.5 a 71.9 ug/mL en las poblaciones de campo, y de 28.1 ug/mL en la Susceptible. Los límites de confianza se traslaparon a nivel de la ID50 e ID95, por lo que se considera que todas las poblaciones son igualmente susceptibles. En el caso de la toxina Cry2Ab, las concentraciones que inhibieron el desarrollo al tercer instar del 50% de las larvas (ID50) fueron de 0.016 a 0.03 ug/mL en las poblaciones de campo, y en la susceptible fue de 0.025 ug/mL. Las concentraciones que inhibieron el desarrollo al tercer instar del 95% de las larvas, fueron de 2.6 a 10.1 ug/mL en las poblaciones de campo, y en la susceptible de 4.1 ug/mL. Los límites de confianza se traslaparon a nivel de ID50 e ID95, por lo que se considera que todas poblaciones son igualmente susceptibles (Cuadro 1). Cuadro 1. Líneas base sobre Inhibición de desarrollo al tercer instar (ID) en larvas de S. exigua a las toxinas Cry1Ac y Cry2Ab de B. thuringiensis.

Población N Pendiente ± EE ID50† µg mL-1

(CL al 95%) ID95

† µg mL-1 (CL al 95%)

2 RR50¶ RR95

¶

Líneas base con la toxina Cry1Ac Ojinaga 1120 0.45 ± 0.02 0.02 (0.01-0.03) 71.9 (27.5-239.9) 5.0 1.2 2.5 Laguna 1120 0.58 ± 0.08 0.07 (0.02-0.30) 44.7 (4.9-4612.0) 23.9 4.3 1.6 Valle del Yaqui 1120 0.51 ± 0.06 0.009 (0.003-0.027) 15.5 (2.4-461.7) 14.4 0.6 0.6 Susceptible 1120 0.50 ± 0.03 0.016 (0.004-0.030) 28.1 (12.0-79.9) 2.7 Líneas base con la toxina Cry2Ab Ojinaga 960 0.65± 0.05 0.03 (0.02-0.04) 10.1 (4.1-34.8) 0.14 1.2 2.4 Laguna 960 0.74± 0.05 0.016 (0.011-0.022) 2.7 (1.5-5.5) 5.4 0.6 0.7 Valle del Yaqui 960 0.82±0.07 0.027 (0.012-0.053) 2.6 (0.9-16.5) 6.6 1.1 0.6 Susceptible 960 0.74±0.08 0.025 (0.009-0.057) 4.1 (1.0-54.1) 8.4 †Concentración de -endotoxina Cry1Ac de B. thuringiensis capaz de impedir que 50 (ID50) o 95% (ID95) de larvas expuestas lleguen al tercer ínstar después de cinco días de exposición ¶Respuesta relativa = ID50 (95) de la población de campo / ID50 (95) de la población susceptible.

Reducción del peso. Las concentraciones de la toxina Cry1Ac que redujeron el 50% del peso de las larvas (RP50) fueron de 0.01 a 0.04 ug/mL en las poblaciones de campo, y de 0.016 ug/mL en la susceptible, mientras que las concentraciones que redujeron el 95% del peso fueron de 23.9 a 70.3 ug/mL en las poblaciones de campo, y 37.0 ug/mL en la susceptible. Los límites de confianza se traslaparon a nivel de la RP50 y RP95, por lo que se considera que todas las poblaciones son igualmente susceptibles. En el caso de la toxina Cry2Ab las concentraciones que redujeron el 50% del peso de las larvas de fueron de 0.03 a 0.05 ug/mL en las poblaciones de campo, y en la susceptible fue de 0.04 ug/mL. Las concentraciones que redujeron el 95% del peso de las larvas fueron de 1.7 a 2.2 ug/mL en las poblaciones de campo, y de 2.0 ug/mL en la susceptible. Los límites de confianza se traslaparon a nivel de la RP50 y RP95, por lo que se considera que todas poblaciones son igualmente susceptibles (Cuadro 2).

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Cuadro 2. Líneas base sobre reducción del peso (RP) en larvas de S. exigua a las toxinas Cry1Ac y Cry2Ab de B.

thuringiensis.

Población N Pendiente ± EE RP50† µg mL-1

(CL al 95%) RP95

† µg mL-1 (CL al 95%)

2 RR50¶ RR95

¶

Líneas base con la toxina Cry1Ac Ojinaga 1440 0.46±0.05 0.010 (0.003-0.028) 33.7 (6.9-394.0) 14.5 0.6 0.9 Laguna 1440 0.50±0.03 0.04 (0.02-0.06) 70.3 (30.6-195.4) 5.9 2.5 1.9 Valle del Yaqui 1440 0.49±0.03 0.010 (0.006-0.018) 23.9 (10.5-65.8) 2.5 0.6 0.6 Susceptible 1440 0.49±0.03 0.016 (0.009-0.026) 37.0 (15.9-104.7) 7.4 Líneas base con la toxina Cry2Ab Ojinaga 960 0.95±0.12 0.04 (0.01-0.10) 2.1 (0.5-35.1) 9.6 1.0 1.0 Laguna 960 1.05±0.07 0.03 (0.02-0.04) 2.2 (0.7-2.2) 6.0 0.7 1.1 Valle del Yaqui 960 1.05±0.11 0.05 (0.02-0.10) 1.7 (0.6-11.8) 7.0 1.2 0.8 Susceptible 960 0.96±0.07 0.04 (0.03-0.05) 2.0 (1.2-3.9) 5.8 †Concentración de -endotoxina Cry1Ac de B. thuringiensis capaz de reducir el 50 (RP50) o el 95% (RP95) del peso de las larvas después de estar expuestas durante cinco días a la toxina. ¶Respuesta relativa = RP50 (95) de la población de campo/RP50(95) de la población susceptible

Monitoreo de la susceptibilidad de S. exigua a las toxinas Cry1Ac y Cry2Ab. Los porcentajes de mortalidad con la toxina Cry1Ac variaron de 11.8 (Ojinaga) a 14.3% (Valle del Yaqui), lo que significa que más del 85% de las larvas sobrevivieron a la dosis diagnóstica, pero ninguna de estas larvas se desarrollaron al tercer instar en cinco días bajo condiciones ambientales indicadas, mientras que en los respectivos testigos, más del 65% de las larvas alcanzaron este estado de desarrollo. Además, las larvas que sobrevivieron, su peso se redujo casi en 90%. Los resultados registrados en las tres variables evaluadas, indican que las respuestas de las poblaciones de campo fueron similares a la de la población susceptible (Cuadro 3). Cuadro 3. Porcentaje de mortalidad, desarrollo al tercer instar y porcentaje de reducción del peso promedio de larvas neonatas del gusano soldado S. exigua por exposición a la dosis diagnóstica de Cry1Ac y Cry2Ab.

Población Mortalidad 3er instar en la dosis

diagnóstica/3er instar en el Testigo

Reducción del peso

2010 2011 2012 2010 2011 2012 2010 2011 2012 Proteína Cry1Ac; Dosis Diagnóstica 10 µg/ml Laguna 13.6a 12.8a 13.7a 00.0/66 00.0/65 00.0/66 89.1±0.9a 89.4±0.9a 88.6±0.9a Ojinaga 11.8a 13.9a 13.1a 00.0/69 00.0/67 00.0/65 89.4±0.7a 89.9±1.1a 90.0±1.1a Valle del Yaqui

14.3a 12.3a 13.7a 00.0/66 00.0/68.1 00.0/66 89.3±1.6a 89.9±0.6a 89.3±1.0a

Susceptible 13.0a 13.6a 12.8a 00.0/68 00.0/71.3 00.0/66 89.8±1.3a 90.3±1.7a 89.9±0.9a Proteína Cry2Ab; Dosis Diagnóstica 5 µg/ml Laguna 30.0a 27.9a 30.7a 00.0/67 00.0/72.5 00.0/65 97.5±0.4a 96.7±0.6a 96.6±0.4a Ojinaga 28.3a 28.6a 31.0a 00.0/66 00.0/69.4 00.0/69 97.4±0.5a 97.3±0.5a 96.1±0.3a Valle del Yaqui

30.0a 29.6a 31.0a 00.0/69 00.0/68.1 00.0/66 97.6±0.4a 97.3±0.5a 97.2±0.2a

Susceptible 31.1a 28.5a 31.8a 00.0/68 00.0/65.0 00.0/65 97.2±0.7a 96.9±0.8a 97.0±0.6a Nota. En cada población, 480 larvas se expusieron a la dosis diagnóstica y 96 fueron testigos.

En el caso de la toxina Cry2Ab, los porcentajes de mortalidad registrados fueron del 28.3

(Ojinaga) al 31.1% (Susceptible), es decir, más del doble que la proteína Cry1Ac, lo que indica que esta segunda proteína es más efectiva contra esta especie de insecto; pero a pesar de esta efectividad, casi el 70% de las larvas sobrevivieron a la dosis diagnóstica, pero al igual que la

1392

Cry1Ac, ninguna larva se desarrolló al tercer, mientras que en los respectivos testigos, más del 65% alcanzaron este estado de desarrollo. Las larvas que sobrevivieron, su peso se redujo más del 96% (Cuadro 3). Literatura Citada Abbott, W. S. 1925. A method of computing the effectiveness of an insecticide. J. Econ.

Entomol. 18: 265-267. Finney, D. J. 1971. Probit analysis, Cambridge University Press., Cambridge. London.UK. Gould, F., A. Anderson, A. Reynolds, L. Bumgardner, and W. Moar. 1995. Selection and genetic

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1393

COMPARACIÓN DE DOS MÉTODOS DE BIOENSAYOS PARA DETERMINAR LA TOXICIDAD DE PLAGUICIDAS EN Apis mellifera L. (APIDAE: HYMENOPTERA)

Edgar Daniel Lara-Sánchez1, Álvaro González-Hernández1, Agustín Hernández-Juárez1, Rebeca González-Villegas1y Rafael Alejandro Casillas-Peñuelas21 Departamento de Parasitología, Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, Saltillo, Coahuila, México, C.P. 25315.2 Departamento de Tecnología de Alimentos, Universidad Autónoma de Aguascalientes. daniel01lara@hotmail.com. RESUMEN. Apis mellifera es la especie más importante como polinizador en cultivos hortícolas y frutales, al estar en ambientes agrícolas están expuestas a los plaguicidas, aplicados comúnmente en campo. Por lo que el objetivo del presente estudio fue: Evaluar dos métodos de bioensayo para determinar los valores de CL50 y CL95de dos insecticidas. Para estose utilizaron los insecticidas imidacloprid y abamectina a diferentes concentraciones, utilizando las técnicas de bioensayo de película residual y dieta envenenada. Las lecturas de mortalidad se tomaron a las 24 hrs después de aplicados los tratamientos.Los resultados se analizaron por el programaPc-Probit. Los resultados muestran que el productoimidacloprid presento los valores más altos de CL50 (0.1 y 1.7ppm), en relación a los métodos de bioensayo el de película residual presento los valores más altos tanto para imidacloprid (1.7ppm) como para abamectina(0.88ppm) en comparación con el método de dieta envenenada. Por lo anterior podemos mencionar que el producto imidacloprid presenta un mayor riesgo para A. mellifera. Palabras clave: imidacloprid, abamectina, película residual, dieta envenenada.

Comparison of two methods of bioassays to determine the pesticides toxicity on Apis

mellifera L. (Apidae: Hymenoptera) ABSTRACT. Apis mellifera is the most important pollinator specie of fruit and vegetable crops and it is generally exposed to pesticides that are applied to treat plagues on crops. The purpose of this study was to evaluate two methods for biotesting in order to determine the values of CL50 y CL95 in two pesticides. The pesticides analyzed were imidacloprid and abamectina in two different concentrations, utilizing biotesting techniques such as residual stress film and poisoned diet. The mortality readings were taken 24 hours after applying the treatments. Results were analyzed by the Pc-Probit. The results show that imidacloprid presents higher values of CL50 (0.1 y 1.7 ppm). According to biotesting methods, the residual stress film presented higher values for imidacloprid (1.7ppm) and for abamectina (0.88ppm) compared to the poisoned diet method. It was concluded that imidaclopid presents a greated risk for A. mellifera. Key words: imidacloprid, abamectin, residual film, poisoned diet. Introducción

En México la gran diversidad de especies y el cambio de los agricultores de producir a campo abierto por una agricultura protegida e intensiva; Coloca a las especies de abejas polinizadoras como una parte fundamental en el esquema de manejo delos cultivoscíclicos la polinización entomófila (Zozaya, 2004). Sin embargo dentro de este esquema de producción, la aplicación de pesticidas para el control de plagas y enfermedadeses fundamental. La exposición a pesticidas de las abejas produce efectos negativos a nivel individual y de sus colonias, afectándolas en sus procesos antes de que puedan completar muchos vuelos de recolección y polinización (Mussen y Brandi, 2010). Muchos investigadores están trabajando en el estudio del impacto de los plaguicidas sobre esta especie; para el estudio de la toxicidad de los plaguicidas en abejas melíferas, existen dos métodos de bioensayo muy utilizados, uno es el método de tipo oral, que es unaprueba de laboratorio diseñado para determinar la toxicidad oral aguda en abejas obreras adultas (Harrison, 1993). El segundo caso, es el bioensayo por contacto, basado en la metodología descrita por la Organización Europea de Protección Vegetal y del Mediterráneo (EPPO, 1992). La aplicación de estas técnicas de bioensayo son de gran utilidad, ya que el

1394

registro y la autorización para las formulaciones de plaguicidas, requierendel conocimiento del impacto de la sustancia activa, realizando bioensayos de toxicidad en abejas en a nivel laboratorio. Los valores de CL50 para toxicidad oral o por contacto son indicadores del impacto potencial sobre esta especie (Cluzeau, 2002), que permiten conocer las CL50, el índice de calidad ambiental y el límite de impregnación biológica (Menéndez, 2009).Por lo anterior este trabajo hace una comparación de los valores que arrojan dos tipos de bioensayo con dos ingredientes activos. Materiales y Método

El trabajo se realizó en la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, en la cámara bioclimática No. 3, del Departamento de Parasitología.Se adquirieron tres colmenas de Apis

mellifera en Xicotepec, Puebla., posteriormente se trasladaron a la universidad y se mantuvieron con polen y néctar de flores de temporada.Una vez teniendo cantidad de adultos suficientes, se realizaron los bioensayos mediante las técnicas de dieta envenenada y película residual, para ello se capturaron al azar saliendo de la piquera, colocando 20 insectos por bote, con un buen manejo para evitar mortalidad de los insectos por daño mecánico. Posteriormente se mantuvieron bajo condiciones de la cámara bioclimática, con una temperatura de 25-30°C, una humedad relativa entre 55 y 70 % y un fotoperiodo de 12:12 L:O. Ahí permanecieron en observación durante 24 horas. Una vez que las abejas se trasladaron a la cámara bioclimática, se preparó una dieta con una mezcla de sacarosa y agua 1:1 a la cual se le adiciono las concentraciones de los productos. El ensayo se realizó en cajas petri de plástico a las cuales se les deposito un trozo de algodón impregnado con cada una de las concentraciones de dieta. Con las mismas concentraciones, se realizó el método de película residual, para esto se sumergió un algodón en cada concentración y se procedió a frotar el algodón mojado en el fondo de botes de plástico con capacidad de 1 L, los cuales habían sido perforados alrededor con la finalidad de la respiración de los especímenes, colocando la tapa, para evitar el escape de las abejas. La toma de datos se realizó en 24 h, para ambos experimentos, las concentraciones empleadas fueron para abamectina (0,0.05, 0.1, 1, 3, 5 y 10 ppm) e Imidacloprid (0,0.05, 0.1, 1, 5, 10 y 20 ppm), los datos de mortalidad se analizaron estadísticamente por el programa PC-Probit, para obtener las DL50. Haciendo una corrección de la mortalidad. Resultados y Discusión La concentración letal media (CL50) en el método de dieta envenenada a 24 horas de ingestión de alimento, en el cuadro 1se puede observar que el producto abamectina obtuvo una CL50 de 0.007 ppm, mientras que el producto imidacloprid fue de 0.10 ppm.

La concentración letal media (CL50) en el método de película residual a 24 horas de exposición, en el cuadro 2se observa que el producto abamectina obtuvo una CL50 de 0.088 ppm, mientras que el producto imidacloprid fue de 1.73 ppm.

Líneas de Regresión Dosis Mortalidad. En la figura 1 se exponen las líneas de respuesta dosis-mortalidad, en referencia a la recta correspondiente para el producto Abamectina, bajo la metodología de película residual y dieta envenenada, podemos mencionar que se obtuvo una CL50 de 0.88 ppm (24 h) y una CL 95 de 6.0 ppm (24 h).

1395

Cuadro 1. CL50, CL95 y limites fiduciales de los productos evaluados contra abejas obreras adultas (Apis mellifera) a 24 horas de ingestión del alimento.

Plaguicida # CL50 Limites fiduciales CL95 Inferior Superior

Abamectina 420 0.007 0.000493 1.223 2.65 Imidacloprid 420 0.100 0.006010 2.290 39.28

#: Número de individuos de prueba

Cuadro 2. CL50, CL95 y limites fiduciales de los productos evaluados contra abejas obreras adultas (Apis mellifera) a 24 horas de exposición.

Plaguicida # CL50 Limites fiduciales CL95 Inferior Superior

Abamectina 420 0.008 0.0079 0.261 6.07 Imidacloprid 420 1.730 0.4600 3.160 209

#: Número de individuos de prueba Figura 1. Líneas de respuesta dosis-mortalidad, en referencia a la recta correspondiente para el producto Abamectina. En cuanto a los resultados obtenidos de CL50 por dieta envenenada, podemos mencionar que a las en el tratamiento de abamectina de nuestro experimento fue de 0.007 ppm, en comparación con los obtenidos por Yangyan-xia et al. (2008) que fueron de 0.668 ppm, siendo inferiores los resultados de nuestra investigación. Al respecto del producto imidacloprid nuestros resultados obtenidos fueron de 0.100 ppm, del mismo modo inferiores en comparación a los obtenidos por este mismo autor que fueron de 0.380 ppm. Por lo anterior podemos mencionar en base a la respuesta de las líneas dosis-mortalidad de abejas obreras adultas, el método de película residual presenta valores para CL50 y CL95 más altos que el de dieta envenenada, siendo el de película residual más aproximado a lo que se presenta en campo después de una aplicación a algún cultivo, y rara vez encontrándose alimento envenenado en las áreas de pecoreo de las abejas, algo importante a tomar en cuenta es que bajo condiciones de estrés, no todos los organismos se alimentan, pero inevitablemente tienen contacto con alguna de las superficies impregnadas con el xenobiótico, pudiendo alterar datos pues que abejas que no visitan el alimento no sufrieron ningún daño.

0.1 1 10

2.65 6.0

.088

95

50

CLABAMECTINA

__Dieta envenenada

___Película residual

ppm

0.007

.01.

1 10

0.01

290

1.7

95

50

CLIMIDACLOPRID

__ Dieta envenenada

__Película residual

100 ppm

39.2

1000

1396

El producto que presento los valores más altos de CL50 fue el imidacloprid; por lo tanto se le puede considerar menos toxico para las abejas. Sin envergo se debe de tener especial cuidado en su manejo ya que se reporta como un insecticida muy letal cuando las abejas lo transportan a la colmena. Por lo anterior el producto más toxico para las abejas fue la abamectina, ambos productos son moderadamente tóxicos para las abejas en función a las CL50 reportada y comparada con la CL50 de otros autores para insectos plaga. Agradecimientos.

Al MVZ Eduardo Valderrabano Ibarra, gerente de Comercializadora ‘Monte Grande’ por la donación del material biológico para la realización de este trabajo. Literatura Citada Cluzeau, S., 2002.Risk assessment of plant protection products on honey bee.Regulatory aspects.

En: Devillers, J.; Pham-Delegue, M.H. (Eds), Honey Bees: Estimating the Environmental Impact of Chemicals. Chemicals, Taylor and Francis, London, UK, pp 42-55.

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Menendez, F., 2009. Manual Para la Formación del Especialista, editorial LexAnova, general Salchaga NO. 3, 47008 Valladolid, España, 10 ma. Edición, p. 298.

Mussen E. y Brandi G., 2010. Interacciones Abejas-Pesticidas. (1) Dr. Eric C. Mussen, Extension Apiculturist, UC Davis, Gene Brandi, Commercial Beekeeper, Los Banos, CA. U.C Apiaries Newsletter, University of California Department of Entomology, p. 1Busqueda realizada, 25 de Septiembre, 2012 http://www.apiservices.com/articulos/pesticides_mussen.pdf.

Yang, Yan-Xia., Jin, Shao-Qiang., Li, Shao-Nan, Wei, Fang-Lin. and Zhu, Guo-Nian, 2008.Oral toxicity and risk of five insecticides for bees (Instituto de Pesticidas y Toxicología Ambiental, Universidad de Zhejiang, Hangzhou 310029, China).

Zozaya, R. J. Antonio 2004, Estimación de la importancia de Apis mellifera L. en los cultivos que requieren polinización entomófila en México. 11° Congreso Internacional de Actualización Apícola p. 111

1397

EVALUACIÓN HISTOLÓGICA DEL EFECTO DEL EXTRACTO DE Sedum praealtum DC EN LA ESPERMATOGÉNESIS DE Periplaneta americana

Hortensia Montellano-Rosales; Julio Cesar Rojas-Castillo; Oscar Daniel Avilés-Montellano. Laboratorio de Embriología, Departamento de Morfología, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional. Carpio y Plan de Ayala s/n, Col. Casco de Sto. Tomás, C.P. 11340. México, D.F Tel. 57296300 Ext. 62390. horten5000@hotmail.com,Chico_jcrc@hotmail.com, vegan1337@gmail.com. RESUMEN. El extracto de Sedum praealtum administrado oralmente, alteró la fase proliferativa de la espermatogénesis de ratones,debido a la presencia de metabolitos como alcaloides que inhiben la síntesis de ADN y proteínas; por lo que es importante conocer el efecto del extracto en la espermatogénesis de Periplaneta americana. Se trabajó con cucarachas adultas colectadas en la Delegación Xochimilco, D.F.,mantenidasa temperatura constante de 29°C, alimentándose durante 60 días con unamezcla de alimento procesado para aves y el extracto de Sedum praealtum en dosis de 50mg/g de alimento. Se sacrificaron para obtener los aparatos reproductores que se fijaron con Bouin durante 24 horas, se procesaron histológicamente y se tiñeron con la técnica Hematoxilina-Eosina. Histológicamente se observó que los testículos del grupo tratado con el extracto, presentaron vacuolas tanto en el germario como en los cistos correspondientes a las diferentes zonas (crecimiento, reduccional y transformación) de los folículos testiculares; lo que provocó la disminución de la producción de espermatozoides. Palabras clave: Sedum praealtum, espermatogénesis, Periplaneta americana.

Histological evaluation of the effect of the extract of Sedum praealtum DC in the spermatogenesis of Periplaneta americana

ABSTRACT. The extract of Sedum praealtum administered orally, altered the mice’s proliferative phase of spermatogenesis, due to the presence of metabolites like alkaloids that inhibit the synthesis of DNA and proteins. This is why it’s important to know the effect of the extract in the Periplaneta Americana’s spermatogenesis. Adult cockroaches were caught within Delegation Xochimilco, D.F. to work with. They were kept at a constant temperature of 29° C and fed for 60 days with a mix of bird’s processed food and the extract of Sedum praealtum in dose of 50 mg/g of food. The cockroaches were killed to extract their reproductive system, which was fixed with Bouin for 24 hours and then stained with the Hematoxylin-Eosin technique. Histologically it was observed that the testes of the group treated with the extract, presented vacuoles both in the germarium and the cysts corresponding to the different zones (growth, reduction and transformation) of testicular follicle, resulting in a decrease of the sperm production. Key words: Sedum praealtum, Spermatogenesis, Periplaneta americana. Introducción.

Plantas con propiedad espermicida como Tigonellafoenum, Clerodendrumserratum,

Sapindusmukorossi y diversas especies del genero Dioscorea, presentan efecto espermicida, debido a la presencia de saponinas que provocan la inmovilización de los espermatozoides, ya que alteran la integridad de la membrana espermática (Setty, et al., 1976; Carretero, 2001; Gupta et al., 2004).

Algunas plantas con actividad espermicida, carecen de saponinas, pero contienen diferentes tipos de alcaloides como quinina, emetina, cloroquina y quinacrina que provocan la inhibición de la viabilidad de los espermatozoides, así como la síntesis de ADN y proteínas (Trifunac y Bernstein, 1982).

Estudios fitoquímicos del extracto crudo de Sedum praealtum del estado de Hidalgo, demostraron la presencia de alcaloides, flavonoides, terpenos y azucares reductores (Macías, 2000).

El extracto de S. praealtum administrado oralmente cada 15 días durante un mes en las dosis de 25 y 50 mg/kg de peso, alteraron la espermatogénesis de ratones sacrificados 15 días

1398

después del tratamiento, ya que disminuyeron los diferentes tipos celulares de los túbulos seminíferos (Silva et al., 2003); en el caso de las hembras la administración intravaginal, alteró la proliferación del estrato basal del epitelio, provocando el adelgazamiento del epitelio vaginal (Méndez, 2006; Morales, 2006). Considerando la propiedad espermicida de Sedum praealtum, ya que el extracto provocó la inmovilización de los espermatozoides, disminuyendo la fertilidad en ratones, debido alcontenido de metabolitos como alcaloides que inhiben síntesis de proteínas y ADN; por loque es necesarioestudiar histológicamente el efecto del extracto de Sedum

praealtumen el proceso de espermatogénesis de Periplaneta americana, cuyas fases se caracterizan por la síntesis de proteínas y ADN. Materiales y Método

Se trabajó con cucarachas adultascolectadas en alcantarillas y basureros de la Delegación Xochimilco, D.F.,las cuales fueron transportadas al Laboratorio de Embriología para la formación de dos grupos de 15 machos que se mantuvieron en recipientes de plástico a temperatura constante de 29°C, alimentándose durante 60 días con una mezcla de alimento procesado para aves (purina) y el extracto de Sedum praealtum en la dosis de 50mg/g el grupo experimental, en tanto que el grupo testigo recibió la mezcla del alimento procesado para aves más1ml de solución salina. Se sacrificaron con Acetato de etilo, para la obtención de los aparatos reproductores que se fijaron con Bouin durante 24 horas, posteriormente se deshidrataron con Alcoholes de concentración creciente(70°, 85°. 96°I, II y III, Absoluto I, II y III), alcohol Isobutílico I y II, Celoidina y se transparentaron con Tolueno fenicado; posteriormente se incluyeron en parafina efectuando tres cambios de 24 h en parafina Merck de punto de fusión 56°-58°; finalmente se efectuaron cortes de 6 µ de espesor en un micrótomo, los cortes se montaron en portaobjetos utilizando líquido de Ruyter y una platina caliente para extenderlos; se tiñeron con la técnica Hematoxilina-Eosina y se montaron con resina sintética. Resultados y Discusión

Histológicamente se observó que los testículos de Periplaneta americana, se caracterizan por presentar numerosos folículos testiculares de forma globular que se conectan radialmente al conducto deferente correspondiente a la longitud del testículo, mediante cortos conductos eferentes (Fig. 1); lo que indica que los testículos de la cucaracha corresponden al tipo pinado (Bell, 1981).

Figura 1. Corte longitudinal de testículo Testigo de Periplaneta americana. Ft, folículos testiculares; Cd, Conducto deferente. Técnica Hematoxilina–Eosina. 100X.

Ft

Cd

1399

Cada folículo testicular se caracteriza por presentar el germario en la parte apical, en tanto que en la parte posterior se observa una serie de compartimentos delimitados por epitelio plano que corresponden a los cistos con los diferentes tipos celulares del proceso de espermatogénesis y característicamente en cada cisto se desarrolla sincrónicamente un sólo tipo celular (Fig. 2).

Figura 2. Corte histológico de testículo testigo de Periplaneta americana, mostrandola organización de un folículo testicular. G, Germario; CE1,Cisto de espermatocitos de primer orden; CE2, cisto de espermatocitos de Segundo orden, CEp, Cisto con Espermátides; CEz, Cisto de Espermatozoides; Cd, Conducto deferente.Técnica Hematoxilina-Eosina. 400X

Considerando la ubicación de los cistos con los diferentes tipos de células en el folículo

testicular, éste se puede dividir en las siguientes zonas que se caracterizan por la presencia de las células sexuales en diferente estado de desarrollo (Fig. 2).

La Zona de proliferación.- Corresponde al germario localizado en la parte apical del folículo testicular y se caracteriza por el contenido de espermatogonias, las cuales sufren divisiones mitóticas que incrementan el número, evento que corresponde a la fase proliferativa (Fig. 2).

La zona de crecimiento. Corresponde a la zona localizada inmediatamente inferior al germario y se caracteriza por la presencia de cistos que contienen espermatocitos de primer orden. Dichas células sufren la primera división meiótica, en cuya profase I llevan a cabo la actividad metabólica necesaria para el almacenamiento de información en el citoplasma, razón por la cual las células adquieren un volumen considerable (Fig. 2).

G

CE21

CE1

CEp

CEz

Cd

1400

La zona de División y Reducción. Se localiza inmediatamente después de la zona de crecimiento y está formada por cistos de espermatocitos primarios (después del diploteno), secundarios y espermátides, ya que en dicha zona se lleva a cabo las divisiones meióticas que originan a las espermátides (Fig. 2).

La zona de Transformación. Característicamente los cistos de espermátides (células haploides) se localizan en la base del folículo testicular, en los cuales se lleva a cabo el proceso de espermiogénesis mediante el cual las espermátides darán origen a los espermatozoides (Fig. 2). Lo que indica que la espermatogénesis se lleva a cabo de la parte apical a la basal del folículo testicular.

Característicamente los testículos de las cucarachas tratadas con el extracto de Sedum

praealtum, presentaron cistos con vacuolas y reducción del número de células correspondientes a las diferentes zonas (crecimiento, reduccional y transformación) de los folículos testiculares, ya que particularmente en la zona de crecimiento se observaron cistos con escasos espermatocitos de primer orden (Fig. 3); lo que indica que las células del germario sufrieron inhibición de la proliferación, evento que se manifestó en la reducción del número de las células correspondientes a las fases siguientes de la espermatogénesis; resultando como consecuencia la disminución de la producción de espermatozoides.

Figura 3. Corte histológico longitudinal. A) testículo, B) Folículo testicular de cucarachas Periplaneta americana, alimentadas con la mezcla de alimento y el extracto en la dosis de 50 mg/g. Cd, conducto deferente; G, germario; CE1, cistos con espermatocitos de primer orden; CE2, cistos con espermatocitos secundarios; CEp, Cistos con espermátides; CEz, cistos con espermatozoides. Técnica Hematoxilina–Eosina. 400X.

Observándose que tanto la cantidad como el diámetro de vacuolas, se incrementa paulatinamente en los cistos correspondientes a las zonas ubicadas de la parte apical a la basal del

Cd

Cd

GG G

CE2

CEz

1401

folículo; lo cual se pone de manifiesto en los cistos resultantes del proceso de transformación, en cuyos cistos característicamente se observan escasos espermatozoides (Fig. 3).

La disminución del número de espermatozoides en los cistos localizados en la base del folículo testicular, se manifestó además a nivel del conducto deferente, ya que se observa vacío o con escasos espermatozoides (Fig. 3); lo que indica que los metabolitos del extracto como alcaloides que inhiben la síntesis de ADN y proteínas, alteraron particularmente a las espermatogonias localizadas en el germario que se caracterizan por la serie de divisiones mitóticas que experimentan en la fase proliferativa , sin alterar las fases de crecimiento y maduración que sufren los espermatocitos de primero y segundo orden respectivamente.

La inhibición de la fase proliferativa de las espermatogonias en el germario de las cucarachas, coincide con los resultados obtenidos en la espermatogénesis en ratones tratados oralmente con la dosis de 50 mg/Kg de peso (Martínez-Ponce, 2011); lo que indica que el efecto del extracto se manifiesta en la fase proliferativa tanto de invertebrados, como de vertebrados. Conclusiones

El extracto de Sedum praealtum en la dosis de 50 mg/g de alimento, inhibió la espermatogénesis, ya que alteró particularmente el germario que corresponde a la zona de los folículos testiculares, en la cual se localizan las espermatogonias que sufren divisiones mitóticas (fase proliferativa); lo cual se manifiesta por la reducción considerable de dicha zona. Literatura Citada Carretero, M. E. 2001.Terpenos III. Triterpenos y esteroides. Plantas medicinales. 25: 124-130. Engelmann, F.1970. The physiology of insect reproduction.Pergamon Press, New York. 307

páginas. Gupta, R., Kachawa, J., and Chaudhary, R. 2004. Antifertility effects of methanolic pod extract

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Spermatozoa by various alkaloids. Contraception. 25(1): 69-87.

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CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE ARTRÓPODOS EN LA CUEVA: “BOCA DE RÍO APETLANCA”, GUERRERO, UTILIZANDO HERRAMIENTAS

BIOINFORMATICAS

Francisco García-Franco1, Ezel Jacome Galindo-Pérez1-2, Edson Mario Espinoza-Graciano2, María Teresa Castañeda-Briones1, María del Pilar Villeda-Callejas2, Blanca Estela Chávez-Sandoval1.1 Laboratorio de Microbiología Ambiental, Universidad Autónoma Metropolitana-Azcapotzalco (UAM-A). Av. San Pablo #180, Col. Reynosa Tamaulipas. C.P. 02200, México, D.F.2. Laboratorio de Zoología. Universidad Nacional Autónoma De México (FES-I, UNAM). Avenida De los Barrios S/N. Los Reyes Iztacala. C.P. 54090, Tlalnepantla, Estado de México. ez_gp553381@hotmail.com; fgf@correo.azc.uam.mx.

RESUMEN. Las nuevas herramientas moleculares, han permitido un gran avance para una más acertada determinación y caracterización taxonómica y filogenética de la gran variedad de especies que existen en nuestro país, sin embargo existen pocos estudios moleculares de los organismos presentes en las cuevas de México, por lo que su estudio es de gran ya que que tienen una historia evolutiva compleja, han tenido una adaptación a ambientes extremos y son altamente especializados. En el presente trabajo se realizó la caracterización molecular de las familias Lestidae (Genero: Archilestes), Coenagrionidae (Género: Argia), Colopterigidae (Genero: Heterina), Carabidae, Dysticidae, Heptageniidae (Género: Stenonema), Corydadidae, Noucoridae (Genero: Cyphocricos), Vellidae (Genero: Rhagovelia), Guerridae, Blatellidae, Hydrophilidae, Micropholcus, Leptonetidae, Pseudothelphusoidea (Genero: Pseudothelphusa), Parasitidae, Phalangodidae (Genero: Eurybunus), Gonyleptidae y Phalangiidae de la cueva de Boca de Río Apetlanca, Guerrero, México. Palabras clave: Artrópodos, Caracterización molecular, Análisis Microbiológico, GENBANK. Arthropod molecular characterization in the cave: "Boca de Rio Apetlanca" Guerrero, using

bioinformatics tools ABSTRACT. Newmolecular toolshave enableda breakthroughfor amore accuratedetermination, taxonomic and phylogeneticcharacterizationofthe varietyof speciesthat exist inour country. While there area fewmolecular studiesof organisms presentin the cavesof Mexico, which produces a great interest inits study, becausethey have acomplexevolutionary historyto adaptto the extreme environmentsand are highlyspecialized. In thiswork, we analized by biomolecularcharacterizationthe families:Lestidae(Gender: Archilestes) Coenagrionidae(Genre: Argia) Colopterigidae(Gender: Heterina), Carabidae, Dysticidae, Heptageniidae(Genre: Stenonema) Corydadidae, Noucoridae(Gender: Cyphocricos) Vellidae(Gender: Rhagovelia) Guerridae, Blatellidae, Hydrophilidae, Micropholcus, Leptonetidae, Pseudothelphusoidea(Gender: Pseudothelphusa) Parasitidae, Phalangodidae(Gender: Eurybunus), andPhalangiidaeGonyleptidae, which habit thecaveApetlancaBocaRio, Guerrero, Mexico. Key words: Arthropods, molecular characterization, microbiological, GENBANK Introducción.

México es uno de los lugares más interesantes del mundo en estudios de bioespeleología, teniendo diversas formaciones de cuevas que permiten albergar a nuevos géneros y especies de animales troglobias, trogofilas y trogloxenas (Hoffmann et al., 2004).

La clasificación de estos organismos, se ha basado en estudios anatómicos y morfológicos, sin embargo las nuevas herramientas y técnicas de la biología molecular han cambiado esencialmente la forma de estudiar la taxonomía y sistemática, permitiendo pasar de un estudio de taxonomía morfológica a una taxonomía molecular.

Actualmente con la ayuda de la Ecología Molecular se han obtenido marcadores genéticos para decidir si un organismo pertenece o no a una especie. Sin embargo no se debe de caer en un error al pensar que este tipo de técnicas son suficientes y definitivas, sino que se han convertido en un complemento indispensable de las técnicas empleadas, han abierto un gran campo para el estudio filogenético y evolutivo de las especies asociadas a las cuevas de México, éstos organismos constituyen un gran reto para la biología actual, dada la enorme variabilidad debida

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en parte a la evolución diferenciada que les ha permitido adquirir una serie de adaptaciones que les permiten vivir permanente mente en las cuevas, formando la principal fauna cavernícola; tal es el caso los artrópodos, los cuales representan la mayor diversidad de especies en comparación a otros grupos (Hoffmann et al., 1986). Es por lo anterior que es de gran relevancia la elaboración de estudios filogenéticos y taxonómicos que muestren la gran diversidad de esta cueva, considerando que los estudios que se han elaborado para organismos aislados, son pocos.

También es importante observar los diferentes cambios morfológicos y etológicos que los animales han adquirido a lo largo de su evolución, al irse adaptando paulatinamente a vivir en forma permanente en estos medios aislados y obscuros (Hoffmann et al., 2004).

En el presente trabajo se obtuvo la filogenia de los organismos encontrados en la cueva “Boca de Río Apetlanca”, Acahuizotla, Guerrero, México, colectados en el año 2011, obteniendo las secuencias genéticas del banco de datos GeneBank y alineándolos mediante análisis bioinformáticos.

Materiales y Métodos

Área de estudio. La zona del estado de Guerrero contiene una gran cantidad de cuevas, las cuales por su origen geológico, permitieron la diversificación de nuevas especies con adaptaciones particulares, Dentro del estado, el municipio de Acahuizotla, se encuentra ubicado al sur de Chilpancingo, Guerrero, en las coordenadas 17° 22' 60 latitud Norte, 99° 27' 0 de longitud Oeste (INEGI, 1995), está compuesta por una longitud de 2869 m.

Se encuentra un clima Aw2 (w), éste clima corresponde al tipo cálido subhúmedo con lluvias en verano, el más húmedo de los subhúmedos, con un porcentaje de lluvia invernal menor de 5 mm, se presenta una precipitación media anual de 1159.7 mm y una temperatura media máxima de 28.1 °C, una media anual de 22.5 °C y una media mínima de 16.9 °C (García, 1988).

De acuerdo a con el Atlas Forestal de México (SEMARNAP, 1999), Acahuizotla se encuentra en la región hidrológica número 20, denominada “Costa Chica de Guerrero”, donde reúne las aguas de los ríos Omitlán, Azul y Papagayo.

La estructura geológica que presenta esta zona se define claramente en imágenes de satélite y en fotografías aéreas (Fig. 1).

Figura 1. Localización de la localidad de Acahuizotla (Tomado de http://earth.google.es/).

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El tipo de vegetación en las partes más bajas está compuesta por selva baja caducifolia (Miranda y Hernández, 1963). En cuanto a la fauna de la zona, las especies más representativas son: Odocoileus virginianus (venado cola blanca), Didelphis marsupialis (tlacuache), Nasua

narica (tejón), Pecari tajacu (jabalí), Euterenia sp. (culebra de campo), Crotalus molossus

(culebra de cascabel), Cyrtonix sp. (codorniz) (Leopold, 1977). Muestreos. Se realizaron dos salidas a la cueva de Acahuizotla en los meses de febrero y

noviembre del 2011, se tomaron factores fisicoquímicos de las zonas en donde se recolectaron los organismos. Para el caso de la captura de los organismos acuáticos se realizo un barrido con un colador de mano, que permitió capturar la mayor cantidad de organismos, los cuales fueron tomados con ayuda de pinzas entomológicas y pinceles (Hoffmann et al., 1986).

Los crustáceos fueron fijados en Formol al 40%, los insectos y quelicerados fueron fijados en alcohol al 70% (Borror et al., 1989) y etiquetados para su posterior determinación morfológica en el Laboratorio de Entomología de la Facultad de Estudios Superiores Iztacala, UNAM.

Para la determinación morfológica de los ejemplares de odonatos tanto adultos como náyades e insectos acuáticos se utilizaron las claves taxonómicas de Needham y Westfall (1951), Usinger (1956), Westfall y May (1996), para la clase Crustácea, se utilizó la descripción de Álvarez y Villalobos (1996).

Posteriormente a la determinación morfológica se llevó a cabo el análisis bioinformático, las secuencias del gen mitocondrial para la Citocromo Oxidasa subunidad 1 (CO1) de cada Familia y Genero se obtuvieron de la base de datos GENBANK. Posteriormente las secuencias obtenidas, se alinearon y se compararon entre sí, utilizando el programa de alineamiento múltiple de secuencias Clustal W del EBI (European Bioinformatics Institute).

Resultados y Discusión

Se recolectaron un total de 47 organismos dentro de las tres estaciones de muestreo, agrupándose en 10 familias, 6 géneros. La gran mayoría de los organismos se encuentran representados principalmente por cuatro Clases, de los cuales la Clase Insecta representa el 78% del total de organismos, seguida de la Clase Acárida con el 11%, Arácnida con el 7% y finalmente el Clase Malacostráca con el 4% (Fig. 2).

Figura 2. Porcentaje de organismos por Clase de artrópodos encontrados en la Cueva de Acahuizotla, Guerrero, México.

1405

Se obtuvieron las secuencias mitocondriales de GENBANK de cada organismos determinado (Cuadro 1). Las secuencias utilizadas fueron de la Citocromo Oxidasa subunidad 1 (CO1) para cada Familia y Genero.

Cuadro 1. Secuencias utilizadas para el alineamiento y el análisis de agrupamiento.

ORGANISMO CLAVE GENBANK ORGANISMO CLAVE

GENBANK

Archilestes FJ010012 Blatellidae JN800512 Lestidae FJ592205 Stenonema JN197565 Argia FJ592227 Hydrophilidae KC135903 Hetaerina AY338675 Corydalidae HQ152779 Rhagovelia EU871240 Phalangiidae JQ746516 Cryphocricos AY585813 Parasitidae JX838772 Eurybunus JQ437102 Gonyleptidae JF786442 Leptonetidae JN575075 Dytiscidae HE599664 Gerridae JN565118 Micropholcus DQ667795 Pseudothelphusoidea AY803593

Se elaboró el cladograma para observar los parentescos más cercanos de los organismos

encontrados en el presente estudio (Fig. 3) por medio de las secuencias obtenidas anteriormente, el cual genero principalmente cuatros grupos independientes.

Figura 3. Muestra el agrupamiento de los organismos, con respecto a los clados obtenidos.

1406

En los cuales se puede observar que en el primer grupo se obtiene una filogenia cercana del orden Odonatos, sin embargo existe también una diferenciación significativa en cuanto a las secuencias encontradas para la familia Rhagovellia, debido a la falta de información disponible en el GENBANK, por lo cual fue agrupado con estos organismos más cercanos.

Para el grupo cuarto se obtuvo una filogenia más precisa relacionando al orden Hemíptera, agrupando a la familia Dysticidae con la Familia Gerridae, así como también en la agrupación del grupo tres para la clase Arachnida, sin embargo este tipo de estudios permite establecer un panorama más amplio adentro de la investigación taxonómica molecular, debido a que permite una la identificación taxonómica más precisa, en base a su características genotípicas de cada individuo, generando con esto información altamente confiable para el estudio de los marcadores moleculares más apropiados que permitan el análisis de manera más rápida. Literatura Citada Alvarez, F. and Villalobos, J. L. 1996. Two new species and one new combination of freshwater

crabs from Mexico (Crustacea: Brachyura: Pseudothelphusidae). Proceedings of the Biological Societyof Washington, Lawrence. 107(4): 729-737.

Borror, D. J, Triplehorn, C. A. and Johnson N. F. 1989. An Introduction to the Study of Insects, Sixth Edition. Saunders College Publishing, New York, Pp. 875.

García, G. A. 1988. Las cuevas de México: pasado presente y... ¿futuro? Laboratorio de Ecología y Sistemática de Microartrópodos. Departamento de Ecología y Recursos Naturales. Facultad de Ciencias, UNAM.

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