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La espectroscopa de fluorescencia en el anlisis estructural

de protenas y de agregados amiloides

Introduccin

La luz puede ser absorbida y emitida por ciertos compuestos y a este proceso se lo

denomina luminiscencia. Existen dos tipos de luminiscencia: la fluorescencia y la

fosforescencia. En la fluorescencia el tiempo entre la absorcin y emisin de la luz es del orden

de 10-8 segundos, mientras que el proceso de fosforescencia es mucho ms lento y toma

alrededor de 10-3 a 1 segundo en ocurrir. As, la fluorescencia dura nicamente mientras dura el

estmulo, es un fenmeno virtualmente instantneo, mientras que la fosforescencia puede durar

hasta minutos luego de desaparecido el estmulo.

La espectroscopa de fluorescencia es un mtodo muy utilizado en mediciones analticas

y en la investigacin cientfica, especialmente en bioqumica y biomedicina. Las dos razones

principales por las que se masific el uso de esta tcnica espectroscpica son: 1) su gran

sensibilidad y 2) el alto nivel de evolucin alcanzado tanto por los instrumentos requeridos,

como por los fluorforos diseados para aplicaciones especficas. An cuando una de las

aplicaciones ms utilizadas de la fluorescencia es el marcaje de macromolculas (como una

alternativa al marcaje con istopos radiactivos), puede ser usada por ejemplo para realizar

estudios de dinmica molecular, anlisis estructural de protenas, cuantificacin de iones en

compartimentos celulares, microscopa, anlisis de potencial de membrana, interacciones entre

macromolculas, etc.

Comparada con los mtodos de absorcin, la sensibilidad de los mtodos basados en

fluorescencia es 10 a 10.000 veces mayor, esto significa que se pueden analizar nanogramos a

picogramos de diversos analitos con muy buenos resultados. Otra ventaja de la fluorescencia es

su especificidad, que permite identificar molculas especficas en matrices complejas. Como

desventaja se puede distinguir que tiene menos aplicaciones que la espectroscopa de absorcin,

ya que es relativamente limitada la cantidad de sistemas qumicos que exhiben fluorescencia. Sin

embargo, an cuando el analito no exhiba fluorescencia natural, se pueden usar sondas

fluorescentes que se unen a grupos funcionales especficos en la molcula en estudio.

Fluorforos

La fluorescencia es el resultado de una serie de procesos que ocurren en ciertas

molculas llamadas fluorforos. Dichas molculas son generalmente orgnicas poliaromticas o

heterociclos. Los tomos son generalmente no fluorescentes, pero una notable excepcin son los

La Fluorescencia es un fenmeno fsico mediante el cual ciertas sustancias absorben

energa en forma de radiacin electromagntica emitindola en una longitud de onda

mayor en un perodo de tiempo muy corto.

2

lantnidos, por ejemplo europio o terbio, cuya fluorescencia resulta de la transnicin electrnica

entre orbitales .

Los fluorforos se pueden dividir en dos clases generales: extrnsecos e intrnsecos. Se

denomina fluorforo intrnseco a aquel que por si mismo presenta fluorescencia. Por ejemplo el

grupo indol del triptofano en las protenas. Fluorforo extrnseco es aquel que se agrega a una

muestra que no presenta fluorescencia. Por ejemplo el 1,6-difenil- 1,3,5 hexatrieno (DPH) que se

utiliza para medir fluidez de membranas, las cuales no presentan fluorescencia.

Fundamento

Cuando el fluorforo absorbe luz uno de sus electrones pasa a un estado excitado (de

mayor energa) que es inestable y al retornar a su estado basal, el exceso de energa se libera en

forma de luz pero de una longitud de onda mayor (menor energa) a la de excitacin. Este

proceso es representado por el diagrama de Perrin-Jablonski (Figura 1).

Figura 1. Diagrama de Perrin-Jablonski

Un fluorforo absorbe energa electromagntica pasando de un estado electrnico basal

(S0) a un estado electrnico excitado (S1) luego de absorber un fotn (es decir, luz) de energa:

E = h .ex

donde E es la energa, h es la constante de Planck y ex es la frecuencia de excitacin. Esta

energa es suministrada por una fuente de luz externa. La absorcin de luz produce una transicin

electrnica en el fluorforo: un electrn es promovido desde el orbital molecular ocupado ms

externo al orbital molecular desocupado ms cercano al mismo (Figura 1). Este proceso est

dirigido por distintas reglas de seleccin y la probabilidad de que la transicin se produzca est

reflejada por el coeficiente de absortibidad molar, (M-1. cm-1) que est determinado por la ley

de Lambert y Beer para cada longitud de onda:

Decaimiento

vibracional

Decaimiento

vibracionalActivacin

trmica

Fosforescencia

Fluorescencia

Excitacin

Cruce

intersistema

Decaimiento

vibracional

Decaimiento

vibracionalActivacin

trmica

Fosforescencia

Fluorescencia

Excitacin

Cruce

intersistema

S0 + hexc S1 Excitacin

S1 S0 + hem Fluorescencia

S1 T1 Cruce intersistema

T1 S0 + hem Fosforescencia

3

A = . l. c

donde A es la absorbancia, l es el paso ptico y c la concentracin del fluorforo.

En fosforescencia el electrn excitado sufre una transicin a un estado ms estable (T1), y

la emisin con energa hem resulta mantenida por un tiempo prolongado. En fluorescencia el

estado excitado dura un tiempo finito, normalmente entre 10-9 a 10-8 segundos. En este tiempo el

fluorforo sufre cambios conformacionales y esta sujeto a mltiples interacciones con el medio

ambiente molecular. Estos procesos tienen dos consecuencias importantes (Figura 1): 1) debido a

la energa que se disipa durante el tiempo de vida del estado excitado, el fotn de energa emitido

hem, es de menor energa que el fotn que el fluorforo absorbi previamente, por lo tanto la

longitud de onda de emisin es mayor que la de excitacin; 2) no todas las molculas que se

excitaron inicialmente por absorcin retornan al estado basal de energa por emisin de

fluorescencia. Otros procesos como por ejemplo: quenching colisional, transferencia de

energa de fluorescencia por resonancia (RET), conversin interna o desactivacin no radiativa y

formacin de un fotoproducto pueden disminuir la cantidad de molculas en el estado excitado y

por lo tanto disminuyen el rendimiento cuntico de fluorescencia (Figura 2).

El rendimiento cuntico de fluorescencia, F es la razn entre la cantidad de fotones

emitidos y la cantidad de fotones absorbidos por una molcula:

F = cantidad de fotones emitidos / cantidad total de fotones absorbidos

Figura 2: Esquema del paso al estado excitado y de los posibles procesos de disipacin de energa

Espectro de fluorescencia

En espectroscopa de fluorescencia se registran espectros de excitacin y de emisin. El

espectro de excitacin se corresponde con el espectro de absorbancia. Ambos espectros son una

representacin de la intensidad de fluorescencia en unidades arbitrarias en funcin de la longitud

de onda en nm. Para registrar el espectro de emisin se fija una longitud de onda de excitacin y

para el de excitacin se fija una longitud de onda de emisin. Una caracterstica llamativa de los

10-8 segundos

Quenching o transferencia de energa de fluorescencia por resonancia

Estado

basal

Estado

excitado*

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espectros de excitacin y emisin de fluorescencia es que para algunas molculas estos son

imgenes especulares uno del otro, a esto se llama regla del espejo (Figura 3). Alteraciones de

esta regla se pueden deber a impurezas fluorescentes de la muestra o, en muestras muy diluidas,

a una banda Raman que es la banda de vibracin del agua. Adems existen muchas sustancias

que no siguen esta regla (Figura 4) y esto se debe a una diferencia de arreglos geomtricos del

ncleo en el estado excitado si se compara con el estado basal.

Figura 3. Imgenes especulares de los espectros de excitacin y emisin de fluorescencia del

isotiosianato de fluorescena (FITC)

Figura 4. Espectros de excitacin y emisin de fluorescencia del p-terfenilo

Otra caracterstica de los espectros de fluorescencia es que el espectro de emisin es

independiente de la longitud de onda de excitacin (exc), debido a la disipacin parcial de

energa de excitacin que ocurre durante la duracin del estado excitado (Figura 5).

Intensidad de flu

orescencia

Intensidad de fluorescencia

Intensidad de flu

orescencia

Intensidad de fluorescencia

5

El espectro de emisin de fluorescencia vara marcadamente con la estructura qumica

del fluorforo y del solvente en el que esta disuelto.

Intensidad de fluorescencia

Intensidad de fluorescencia

Figura 5. Independencia del pico de mxima emisin y la longitud de onda de excitacin.

Espectro de excitacin de un compuesto y sus diversos espectros de emisin excitando a las longitudes

de onda EX1, EX2 y EX3.

Procesos de disipacin de energa

Quenching

El quenching o atenuacin de fluorescencia puede ser definido como cualquier proceso

que disminuye la intensidad de fluorescencia de un determinado fluorforo sin cambiar el

espectro de emisin. Puede ser el resultado de interacciones del estado excitado con otras

molculas, por ejemplo el solvente (quenching colisional) o por la formacin de complejos del

estado basal no fluorescentes. El auto quenching (self-quenching) es la disminucin de la

fluorescencia debida a la alta concentracin del fluorforo, el cual al disminuir su concentracin

aumenta la fluorescencia, por ejemplo: calceina o carboxifluoresceina, los cuales se los emplea

para medir perdida de contenido de liposomas o de organelas. Cuando el fluorforo se ha

incorporado en el interior de vesculas en altas concentraciones, no fluoresce, pero si por alguna

razn, se altera la permeabilidad de la membrana, sale al medio, se diluye y fluoresce.

Transferencia de energa de fluorescencia por resonancia (RET)

La transferencia de energa de fluorescencia por resonancia (RET) se basa en la

transferencia de energa entre un grupo donante y un aceptor. Deriva de la capacidad del donante

fluorescente de excitar al aceptor, si ambos se encuentran a una distancia apropiada (entre 1 y 10

nm). La excitacin de molculas de aceptor puede ocurrir por transferencia directa de energa de

las molculas donor excitadas y sta se manifiesta como una reduccin en la intensidad de

emisin de la fluorescencia del donor y un correspondiente incremento en la intensidad de

emisin del aceptor de fluorescencia (Figura 6). El fluorforo donante excitado presenta

fluorescencia a una determinada longitud de onda. La aproximacin estrecha de un segundo fluorforo

con una banda de absorcin que se superpone con la banda de emisin del donante, conduce a la

excitacin del aceptor por el donante y la fluorescencia resultante es de mayor longitud de onda.

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Fuente luminosa

Longitud de onda

de exitacion del

donante

Fluorescencia del donante

Fluorescencia del aceptorRET

Donante

excitado

Donante

excitado

Aceptor

excitado

Fuente luminosa

Longitud de onda

de exitacion del

donante

Fluorescencia del donante

Fluorescencia del aceptorRET

Donante

excitado

Donante

excitado

Aceptor

excitado

Longitud de onda

de exitacion del

donante

Fluorescencia del donante

Fluorescencia del aceptorRET

Donante

excitado

Donante

excitado

Aceptor

excitado

Figura 6. Transferencia de energa de fluorescencia por resonancia

Anlisis estructural de las protenas

Hay slo tres aminocidos aromticos que absorben luz en la regin del ultravioleta

cercano ( > 240 nm) y son: fenilalanina (Phe), tirosina (Tyr) y triptfano (Trp). El espectro de

emisin de fluorescencia de las protenas est determinado por la presencia en la cadena proteica

de dichos aminocidos. Adems existen cofactores como FMN, FAD, NAD y porfirinas que

tambin presentan fluorescencia cuando estn presentes en las protenas. Los cambios de la

fluorescencia intrnseca pueden ser usados para monitorear cambios estructurales en la protena.

Los tres aminocidos aromticos tienen distinta absorcin y emisin de fluorescencia,

como se resume en la tabla 1.

ex (nm) em (nm) F Trp 295 353 0,20

Tyr 275 304 0,14

Phe 260 282 0,02

Tabla 1. Caractersticas de fluorescencia de los aminocidos aromticos

La fluorescencia de una protena es una sumatoria de las fluorescencias de los distintos

residuos aromticos que posee, pero generalmente se estudia entre 280-295 nm siguiendo la

fluorescencia del triptfano. Generalmente, se mide la emisin de fluorescencia del triptfano

por su mayor rendimiento cuntico y su vida media ms prolongada. Adems, la proximidad de

estos tres aminocidos en la estructura de una protena permite que ocurra transferencia de

energa por resonancia (RET) entre Phe y Tyr y entre Tyr y Trp, siendo la fluorescencia del Trp

la nica que no se transfiere. Las protenas usualmente tienen un nmero limitado de Trp y ste

est generalmente en el sitio activo de las protenas.

La tirosina, como el triptfano, tiene una fuerte banda de absorcin a 280 nm. Es un

emisor ms dbil que el triptfano, pero puede contribuir significativamente a la fluorescencia de

7

la proteena, ya que normalmente est en un nmero mayor. La fluorescencia de la tirosina puede

ser fcilmente transferida si se encuentra cerca del triptfano.

La fenilalanina, con slo un anillo bencnico y un grupo de metileno es dbilmente

fluorescente. La sensibilidad experimental (el producto de rendimiento cuntico y absortividad

molar) es especialmente baja para este residuo. La fluorescencia de la fenilalanina se observa

slo en ausencia de tirosina y triptfano.

Los espectros de fluorescencia y el rendimiento cuntico son generalmente ms

dependientes del medio ambiente que los espectros de absorcin y los coeficientes de extincin

molar. En las protenas los residuos de Trp se encuentran generalmente formando parte del

ncleo hidrofbico de las mismas y por lo tanto est en regiones donde las molculas de agua

tienen poco acceso, el espectro de emisin del mismo, se corre hacia el ultravioleta (corrimiento

hacia el azul) con el mximo de emisin generalmente en 330 nm. Esto se debe a que la energa

emitida es mayor que cuando la cadena lateral se encuentra en contacto con el solvente, donde

parte de la energa absorbida es transferida a las molculas de agua y por lo tanto la longitud de

onda del mximo de emisin es mayor (340-350). Esto tambin sucede cuando una protena se

desnaturaliza. Por ejemplo, cuando al pptido MccJ25-Trp se lo resuspende en concentraciones

crecientes de dioxano, se ve un corrimiento hacia menores longitudes de onda y un aumento de

la fluorescencia (Figura 7).

Figura 7. Efecto del solvente en la fluorescencia del triptofano de la MccJ25-Trp.

Los rendimientos qunticos de los tres aminocidos aromticos decaen cuando se

incorporan a una protena. En la Tabla 2 se comparan las caractersticas de la fluorescencia de

los aminocidos libres e insertos en una protena. Tambin contiene datos que muestran la

sensibilidad de la fluorescencia de estos residuos a la polaridad de su entorno.

100 %

80 %

20 %

40 %

0 %

351 nm 333 nm

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Aminocido) Protena

Solvente em (nm F em (nm) F

H2O 340 0,12 333 0,02 Trp

DMSO 340 0,81 333 0,67

H2O 303 0,21 --- --- Tyr

DMSO 306 0,27 309 0,06

Phe DMSO 282 0,02 284 0,006

Tabla 2. Caractersticas de la fluorescencia de los aminocidos libres e insertos en una protena.

DMSO = dimetil sulfxido, un solvente orgnico.

La fluorescencia de los residuos aromticos vara en forma un tanto impredecible entre

las diversas protenas. Si se compara el estado plegado con el desplegado, el rendimiento

quntico puede aumentar o disminuir. La intensidad de fluorescencia no tiene mucho valor en s

misma, pero la magnitud de la intensidad, sin embargo, puede servir como una sonda de

perturbacin del estado plegado. La longitud de onda de emisin es un mejor indicador del

medio ambiente del fluorforo.

Por otro lado la fluorescencia del triptfano es quencheada por iodo, acrilamida, grupos

disulfuros, aminos y carboxilos y residuos de histidina cercanos.

Proceso patolgico de formacin de Amiloides

Se conoce como amiloidosis a una serie de patologas que se caracterizan por la

formacin irreversible de agregados insolubles, denominados fibras amiloides. Como ejemplos

de estas patologas podemos mencionar: la amiloidosis sistmica, la enfermedad de Alzheimer, la

enfermedad de Parkinson, enfermedad de Creutzfeld-Jakob, la Encefalopata Espongiforme,

Amiloidosis familiar, Tumor de clulas C de la Tiroides, las enfermedades prinicas y en algunas

Diabetes tipo II.

Los agregados se pueden forman a partir de pptidos no estructurados o de protenas

globulares y se caracterizan por ser irreversibles, presentar estructura tipo cross y estructura

fibrilar, cuando se los observa al microscopio electrnico.

El modelo vigente sostiene que cada fibra presenta un dimetro entre 75-80 y se

encuentra formada por protofibras de 25-35 (Figura 8). En esta estructura la cadena peptdica

forma hojas cruzadas (paralelas o antiparalelas) que se disponen de forma perpendicular al eje

fibrilar.

Figura 8. Modelo de una fibra amiloide.

9

La formacin de fibras amiloides pueden tambin ser inducidas in vitro bajo

condiciones fisicoqumicas adecuadas, permitiendo el estudio de los mecanismos que gobiernan

el proceso. Se sabe que ciertas protenas solubles a pH cido y en un entorno hidrofbico pueden

formar rpidamente estos agregados. Tambin pueden ser formados en presencia de fosfolpidos

cidos como fosfatidil serina (PS), cardiolipina (CL) o fosfatidil glicerol (PG). Estudios

realizados in vitro demostraron que protenas como albmina, lisozima, insulina,

gliceraldehido- 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), mioglobina, transtiretina, citocromo c,

histona H1, y R-lactoalbumina forman fibras amiloides.

La inhibicin o reversin de la formacin de fibrillas amiloides se insina como un

posible mecanismo preventivo de las enfermedades amiloides y a la fecha, distintos compuestos

orgnicos pequeos han demostrado capacidad de inhibicin del proceso in vitro.

Figura 9. Cintica de formacin de la fibra amiloide.

Los mecanismos moleculares relacionados con la formacin de los agregados amiloides

no han sido an dilucidados, pero se acepta la existencia de un mecanismo general de formacin.

La fibrilogenesis es dependiente de un proceso de nucleacin, ya que por diversos estudios se

puso de manifiesto que generalmente presenta una cintica de tipo sigmoidal (Figura 9). La

protena en estado monomrico establece un equilibrio lento con estructuras oligomricas

(tiempo de induccin), las cules, una vez formadas, dan lugar rpidamente a fibras amiloides, ya

sea mediante asociacin de unidades de monmeros o bien por fusin de oligmeros. Adems, el

agregado de fibras preformadas provoca una disminucin del tiempo de induccin.

La capacidad de la albmina de suero bovino (BSA) de formar fibrillas amiloides bajo

ciertas condiciones experimentales, ha sido recientemente demostrada. Este proceso de

fibrilacin ocurre minutos luego de la incubacin de la protena a pH fisiolgico y a temperaturas

mayores de 60C. La cintica de formacin de agregados por la BSA sigue un patrn de tipo

hiperblico en lugar de sigmoidal.

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Instrumentos utilizados para detectar fluorescencia

Los elementos esenciales en los sistemas de deteccin de fluorescencia son cuatro: 1) una

fuente de excitacin (luz blanca), 2) un lugar apropiado para poner la muestra, 3)

monocromadores o filtros para discriminar entre los fotones de emisin de los fotones de

excitacin y 4) un detector para registrar la emisin de los fotones, el cual produce una seal

generalmente elctrica. Para mejorar la visualizacin de los resultados generalmente est

acoplado al equipo un amplificador de la seal.

Existen distintos tipos de equipos que utilizan los aspectos bsicos de la fluorescencia,

entre ellos:

Espectrofluormetro y detectores de microplacas: miden el promedio de la

fluorescencia de la muestra (el volumen de muestra que mide ronda entre los L a mL).

Microscopio de Fluorescencia: determina la fluorescencia como una funcin de las

coordenadas espaciales en dos o tres dimensiones para objetos microscpicos (por debajo

de ~ 0,1 mm de dimetro).

Scanner de Fluorescencia: determina la fluorescencia en funcin de coordenadas en dos

dimensiones de objetos macroscpicos como ser geles de electroforesis, blotting y

cromatografas.

Citometra de Flujo: incorpora un detector de fluorescencia para determinar la

fluorescencia de clulas, en un flujo a travs de un capilar. Permite identificar y

cuantificar subpoblaciones de clulas en una muestra compleja.

Otros tipos de instrumentos que usan la deteccin por fluorescencia son los sistemas de

electroforesis capilar, de HPLC y los equipos de secuenciacin de DNA.

Espectrofluormetro

Un espectrofluormetro (Figura 10) consta de una lmpara de arco de Xenn la cual emite

luz blanca en un amplio rango de longitudes de onda que abarcan desde el UV, ~ 240 nm, hasta

el infrarrojo, ~ 900 nm. Este rayo de luz es colectado por el monocromador primario o de

excitacin (M1) el cual selecciona la longitud de onda (ex) que va a incidir sobre la muestra y es

determinada por el espectro de absorcin de cada fluorforo. El rayo de luz con la longitud de

onda ex incide sobre la cubeta que contiene a la muestra, la cual puede estar termostatizada. Las

cubetas pueden ser de diferentes tipos (cuarzo, vidrio, etc.) dependiendo de la longitud de onda

en la cual leamos. La emisin de fluorescencia generalmente es detectada a 90 del rayo de luz

de excitacin. Es colectada por un sistema de lentes y pasa a travs de un Monocromador

secundario o de emisin (M2) el cual separa la fluorescencia emitida por la muestra de la luz de

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excitacin, con una longitud de onda determinada (em). La luz incide en un fotodetector que

convierte los fotones de fluorescencia en una seal elctrica.

Otro componente muy importante es el canal de referencia que es un sistema que crea una

seal electrnica proporcional a la intensidad de luz incidente en la muestra. En el

espectrofluormetro se pueden colocar filtros en los trayectos pticos que impiden el paso de la

luz de ciertas longitudes onda que interfieran con la medicin.

Figura 10. Representacin esquemtica de un espectrofluormetro.

Lmpara de arco

de Xenn

Monocromador

primario de excitacin

Monocromador secundario

de excitacin

Cubeta de

muestra

ex

em

Detector /

amplificadorFotomultiplicador

Lmpara de arco

de Xenn

Monocromador

primario de excitacin

Monocromador secundario

de excitacin

Cubeta de

muestra

ex

em

Detector /

amplificadorFotomultiplicador

de emisin

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Parte experimental

Objetivo del Trabajo Prctico:

*Determinar la fluorescencia intrnseca de distintas protenas y como dicha fluorescencia

vara segn el medio en que se encuentran.

*Estudiar in vitro la capacidad de formacin de fibras amiloides de la albmina.

Determinacin de la fluorescencia intrnseca de protenas

1) Determinacin del espectro de excitacin y de emisin de albmina,

gammaglobulina, tripsina, lisozima, insulina y mioglobina: a) en buffer Tris-HCl 20 mM

pH 7,4, b) en dioxano al 50% y c) en urea 8M y d) en cloruro de guanidina 6M. A partir

de soluciones madres de la protena (2mg/ml) se realizaran diluciones 1/10 en los

distintos medios con un volumen final de 1,5 ml. Se incuban durante 30 min a

temperatura ambiente.

2) Determinacin de RET entre tirosina y triptfano. A partir de una solucin madre

de 2mg/ml de TYR se realiza una dilucin 1/10, se mide la intensidad de fluorescencia

cuando se la excita a 280 nm y fijando la longitud de onda de emisin en: a) 300 nm y b)

350 nm. Luego se le agregan 50 l de TRP (2mg/ml) y se repiten las lecturas de

intensidad de fluorescencia.

3) Quenching de la fluorescencia intrnseca del triptfano de la albmina con el

agregado de KI y hormonas tirodeas (T4). La albmina es la protena ms abundante del

plasma sanguneo, y es un transportador inespecfico de una gran cantidad de sustancias,

por ejemplo: hormonas. La albmina tiene un solo triptfano, el cual se encuentra en su

sitio de unin a la hormona. Cuando sta se une a la BSA se quenchea la fluorescencia

del triptfano. A partir de una solucin madre de 2mg/ml de albumina se realiza una

dilucin 1/10, se mide la intensidad de fluorescencia cuando se excita a 300 nm y emite a

350 nm. Luego se le agregan 50 l de T4 (4mg/ml) y se repite la lectura de intensidad de

fluorescencia.

Estudio in vitro de la capacidad de formacin de fibras amiloides de la albmina.

La albmina forma fibrillas amiloides cuando se la incuba a temperaturas mayores de

60C y a pH fisiolgico. La formacin de estos agregados se pondr en evidencia con la sonda

fluorescente Thioflavina T.

La Thioflavina T (ThT) (Figura 11), es un fluorforo que cuando se encuentra libre se

caracteriza por presentar una exc 415 nm y de em 482 nm. Sin embargo, al unirse a las fibras

amiloides, su espectro de excitacin se modifica apareciendo un pico a exc 450 nm, sin

modificar la longitud de onda de emisin.

Figura 11. Thioflavina T

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Determinacin: Se inducir la formacin de fibras amiloides de la albmina por calentamiento a 65C. Se estudiar la cintica de formacin de agregados de la albmina (2mg/ml) en buffer Tris-HCl 20 mM pH 7,4. Se tomarn alcuotas a distintos tiempos: 0, 10, 30, 60 y 90 min. Para detener la agregacin se pondrn los tubos en bao de hielo. Para la lectura se diluye las protenas a una concentracin final de 0.1 mg/ml y se les agrega ThT a una concentracin final de 25 M.

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1) Protena: exc em Dioxano 100% Urea 8M Guanidina 6M

200

220

240

260

270

280

290

300

310

320

330

340

350

360

370

380

390

400

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

260 280 300 320 340 360 380 400

2) RET: Tyr Trp y 3) Quenching

exc 275

em 300 em 350 KI

Tyr -----

Tyr-Trp

4)

Fluorescencia (UA)

0

10

30

60

90

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 20 40 60 80 100