APUNTES DE CLASES 2012

FIJACION

PROF. TM. PATRICIA TOLEDO RODRIGUEZ

Definición

Fijación: proceso mediante el cual los elementos constitutivos de las células y por tanto de los

tejidos, son mantenidos en su estado físico y parcialmente en su estado químico lo más similar al

vivo, lo que les permite resistir tratamientos posteriores sin que ocurra pérdida, distorsión o

descomposición de las muestras de manera significativa. En realidad nunca se alcanza a mantener

igual al estado en vivo

Objetivo: detener el proceso autolítico de las células y conservarlas, en la medida de lo

posible, en el estado en que se encontraban durante la vida. Por lo tanto, es un método

histológico destinado a facilitar la obtención de preparaciones duraderas que conserven su

estructura morfológica y química y, que permita realizar posteriormente los procedimientos de

coloración, identificación e interpretación, que contribuyen al conocimiento profundo de su

morfología, función y alteraciones en los diversos procesos patológicos.

Principios Generales.

1. No existe un método universal de fijación, un fijador adecuado para un tejido puede no

serlo para otro.

2. No todos los fijadores conservan indefinidamente un tejido.

3. Un defecto de fijación jamás podrá ser corregido

4. Es inútil realizar un estudio histológico sobre una muestra mal fijada.

Condiciones ideales de los fijadores.

1. Actuar con rapidez; detener los procesos de degradación que ocurren durante o

tras la muerte celular: autolisis ( liberación de enzimas lisosómicas) y putrefacción

(presencia de microorganismos que liberan enzimas líticas), la velocidad de

degradación depende de la naturaleza de la muestra.

2. Poseer un alto poder de penetración para asegurar la correcta fijación de toda la

muestra. Es importante diferenciar capacidad de penetración de la solución y

fijación de la muestra, no son necesariamente dos procesos simultáneos.

3. Insolubilizar los componentes celulares, principalmente proteínas, de modo de

evitar la pérdida de elementos solubles durante o después de la fijación

4. Conservar en la medida de lo posible los detalles estructurales en un patrón

morfológico similar al que presentaban in vivo.

5. Entregar al tejido una consistencia que permita y facilite los procesamientos

posteriores.

6. Impedir la formación de estructuras artificiales (vacuolas y espacios)

7. Permitir y facilitar la aplicación de procedimientos posteriores.

8. Ser económico, estable, fácil manejo y baja toxicidad.

No existe el fijador que reúna todas las condiciones anteriores, de manera que es

necesario sopesar de acuerdo a los objetivos del estudio cual de todos los fijadores es el

más apropiado.

Tipos de fijación.

Según mecanismo:

A. fijación histológica o citológica: conservar la arquitectura y estructura de los tejidos

y células sin considerar los cambios moleculares, busca morfología.

B. Fijación histoquímica: busca preservar la composición molecular y bioquímica

Según Forma:

A. Perfusión: penetra el fijador por los vasos sanguíneos, se utiliza solo en modelos de

experimentación animal.

B. Instilación: gotas del fijador sobre el tejido

C. Inmersión: sumergir la muestra entera en el líquido fijador, debe ser 10 a 30 veces

el volumen del fijador en relación a la muestra.

Según mecanismo de acción de los fijadores:

A. Físicos

B. Químicos

Fijación física

Son de dos tipos principales: frio y calor.

FISICOS

Calor húmedo

Desecación

Ultrasonido

Microondas

Frio

Calor seco

Liofilización

CRIODESECACIÓN O LIOFILIZACION: son dos manipulaciones complementarias de carácter

físico: una congelación instantánea y luego desecación por sublimación directa del agua

congelada a vapor en una bomba de vacío. Procedimiento: congelar el tejido fresco, con

lo que se detienen procesos celulares de autolisis y putrefacción . Lo ideal es congelar a -

170°c ( con nitrógeno líquido) con Isopentano previamente enfriado hasta su punto de

congelación a -170°c, éste permite que la congelación de la muestra sea más homogénea

e instantánea. Pueden usarse crioprotectores (glicerol, sacarosa) que minimizan la

formación de cristales de hielo. Luego de congelada la muestra, se seca por evaporación

lenta en una cámara de vacio (sublimación del agua).

CRIOSUSTITUCION: se fundamenta en la sustitución lenta y progresiva del agua congelada

por una mezcla de alcohol etílico, acetona y propilenglicol a muy baja temperatura (-40°).

El principal problema de esta técnica es la reversibilidad.

Fijación por calor: método muy antiguo, se calienta la muestra hasta punto de ebullición,

antes a la llama, hoy con el calor generado por microondas (clases posteriores)

Fijación química

Empleo de agentes químicos que detienen la putrefacción y la autolisis de las muestras

Los agentes químicos tienen capacidad de interactuar con los componentes del tejido,

tales como proteínas, glicoproteínas, proteoglicanos, lípidos, glicolípidos, lipoproteínas,

pigmentos, ácidos pécticos y nucléicos; como así también, la capacidad de preservar la

composición y localización de carbohidratos: celulosa y almidón en vegetales, quitina en

insectos o glucógeno en tejidos animales y depósitos metálicos (Fe+2, Cu+2, Al+3, Cd+2,

Pb+2, As-3, Cr+2.

Los agentes químicos se clasifican de acuerdo a sus características en :

1. Fijadores coagulantes y no coagulantes.

Coagulantes: provocan coagulación de las proteínas del citoplasma, destruyen y

distorsionan los organélos como las mitocondrias y gránulos secretores, pero no provocan

serias alteraciones en el material de soporte extracelular que son sólidos antes de

comenzar la fijación. La unión esponjosa del retículo compuesto por las proteínas y el

fijador es fácilmente disuelta por los medios de inclusión e impregnación.

No Coagulantes: reaccionan con los diferentes sitios químicos de las macromoléculas

tisulares estableciendo a modo de puente uniones que originan una malla que entrelaza,

convierten el citoplasma en un gel insoluble y cada organelo es bien preservado pero no

es realmente penetrado por los medios de inclusión. Es un artefacto de contracción de

espacios . Algunas mezclas de fijadores tienen fijadores coagulantes y no coagulantes

combinando las ventajas de ambos.

COAGULANTES NO COAGULANTES ETANOL FORMALDEHIDO METANOL GLUTARALDEHIDO ACETONA GLIOXAL ACIDO PICRICO HIDRATO DE CLORAL ACIDO TRICLOROACETICO SALES DE MERCURIO PROPANOL TETROXIDO DE OSMIO

2. Fijadores aditivos y no aditivos

3. Fijadores reductores y oxidantes

QUIMICOS

OXIDANTES REDUCTORES FISICOS

Tetroxido de osmio formaldehido Calor húmedo

Acido crómico glutaraldehído Desecación

Acido pícrico Glioxal Ultrasonido

Bicloruro de mercurio Acreoleína Microondas

Dicromato de potasio Metanol Frio

Acetona Paraldehído Calor seco

Acido acético Etanol Liofilización

4. Según mecanismo de fijación: de acuerdo a este criterio, los agruparemos en 4 categorías.

Se conocen cuatro mecanismos de acción principales:

1. DESHIDRATANTES

2. CAMBIO DEL ESTADO COLOIDAL DE LAS PROTEINAS

3. FORMACION DE SALES

4. RETICULARIZACION DE LAS PROTEINASDESHIDRATANTES

1.- DESHIDRATANTES.

Por ser sustancias HIGROSCOPICAS, actúan desplazando agua de las proteínas y la libre, rompen

los puentes de hidrógeno, destruyen la estructura terciaria de las proteínas por denaturación. Las

proteínas solubles coagulan y destruyen los organélos, no precipitan ácidos nucléicos. Se establece

una COMPETENCIA por las moléculas de agua entre las proteínas y el agente deshidratante, éstos

agentes higroscópicos se estabilizan formando puentes de H con los iones bipolares del agua

sustraída a las proteínas. Fijan y deshidratan al mismo tiempo. Carecen de efecto mordiente. Se

usan principalmente para citología

A. ALCOHOL ETILICO. CH3-CH2OH

Características: Inflamable, transparente, volátil, utilizado en concentración 70-90%

Usos: preserva bien glicógeno y enzimas, además de pigmentos. Uso en citología.

VENTAJAS DESVENTAJAS

fija y deshidrata alta velocidad de penetración Precipita rápido proteínas y el glicógeno, poco tiempo de fijación CONTROLAR, bactericida. Preserva glucógeno, pigmentos y algunas enzimas. Uso en extensiones citológicas. (lacas fijadoras)

fuerte reductor (incompatible con dicromato y osmio), no fija bien cromatina (disuelve ácidos nucléicos y extrae lípidos), endurece y contrae, pierde actividad al deshidratar (pues se va hidratando), carece de efecto mordiente, desplaza sustancias al fijar por la velocidad de penetración, extrae lípidos

B. ACETONA CH3-CO-CH3

Características: transparente, inflamable y volátil. Uso sin diluir a 4º

Usos: limitado a HQ e IHQ.

VENTAJAS DESVENTAJAS

Rápido Gran retracción tisular. Artefactos Alta velocidad de penetración que obliga a controlar tiempos de uso Nunca más de 2 hrs a 4ºc sobre 40º disuelve grasas y lípidos complejos

2.- CAMBIOS EN ESTADO COLOIDAL DE LAS PROTEINAS

Las proteínas son moléculas anfóteras (que actúan como base y acido dependiendo del pH),

cuyo punto isoeléctrico (máxima disociación y mínima estabilidad) es cercano a 5.8 – pierden

estabilidad pues a ese pH las proteínas desprenden el agua ligada (endógena) porque no

mantiene la disociación electroestática que fija los iones bipolares del agua a su estructura

molecular. Por este motivo las soluciones coloidales precipitan en presencia de determinados

ácidos que bajan el pH hasta alcanzar el Punto Isoeléctrico.

a. ACIDO ACETICO CH3-COOH

Actúa rompiendo los puentes entre proteínas, exponiendo los grupos hidrofílicos,

atrayendo agua, siendo absorbido, produciendo expansión. Su uso se basa en la capacidad

de precipitar la cromatina.

Características transparente, con olor a vinagre. 1 al 5% en mezclas, 5-35% Kiernan

VENTAJAS DESVENTAJAS

ideal para nucleoproteínas y ácidos nucléicos coagulante descalcificador de elección para ácidos nucleicos y nucleoproteínas pues los pp precipita proteínas sin sustraer agua provoca edema penetra rápido

mal fijador de membranas y citoplasma destruye mitocondrias no fija H de C ni lípidos deja el tejido blando

B.- ACIDO TRICLOROACETICO CCL3COOH

La coagulación de las proteínas es probablemente por la interacción electroestática de

aniones del TCA cargados + con los grupos NH3 de proteínas. Además el grupo no polar CL3C

del TCA penetra dominios hidrofóbicos de la proteína, esta interacción rompe los puentes de

H de la proteína alterando la normal estructura de la proteína.

Características: cristales incoloros anhídrido crómico solubles en agua. 2,5 al 5%

VENTAJAS DESVENTAJAS

excelente descalcificador fija bien estructuras nerviosas excelente fijador estructural

disuelve ácidos nucléicos y nucleoproteínas provoca demasiado edema

C.- ACIDO CROMICO H2Cr04

Características: cristales de anhídrido crómico al 2% en soluciones fijadoras

VENTAJAS DESVENTAJAS

buen fijador estructural fuerte oxidante, actúa como mordiente

: incompatible con reductores como formol y alcoholes baja velocidad de penetración da tinte verdoso a los tejidos que obliga a un lavado intenso

3.- FORMACION DE SALES

Formación de sales: el agente es un catión metálico (HG++, K++) susceptible de formar

proteínatos o picratos con los tejidos. Tienen gran velocidad de fijación, la formación de la sal

es casi instantánea, la cual va impidiendo la fijación en el centro de la muestra –obstáculo

mecánico/ efecto barrera-. Además la pp va provocando un gran endurecimiento de la

muestra.

A.- CLORURO DE MERCURIO O SUBLIMADO DE MERCURIO

HgCl2

La química de la fijación es pobremente entendida, aunque se supone una interacción de los

componentes de las sales y los grupos ACIDOS como son: sulfidrilos SH, carboxilo COOH Y

hidroxilo OH y los residuos fosfóricos de las nucleoproteínas.

Algunas mezclas más acidificadas, con lo que los grupos amino también participan en la

reacción

Características: polvo tóxico, se prepara una ss. Acuosa saturada (3-6%) la que es corrosiva.

Aditiva y coagulante.

Usos: el Hg++ forma sales con los carboxilos, hidroxilos y sulfhidrilos y residuos fosfóricos de

nucleoproteínas (grupos ácidos) Se usa en mezclas

VENTAJAS DESVENTAJAS

excelente para morfología De elección para tejidos hematopoyéticos y renales Excelente mordiente En ss ácida es aditivo formando enlaces cruzados con los grupos sulfhidrilos de las proteínas y nucleoproteínas (disulfuro). Reacción Plasmal con los lípidos

no es bactericida Baja velocidad de penetración por lo que las muestras deben ser pequeñas/ Kiernan rápido Contrae y endurece (no + de 4 horas) Pp color metálico pardo requiere desenkerizar Provoca mucha eosinofilia lo que dificulta identificar zonas de necrosis

B DICROMATO DE POTASIO K2Cr2O7

Fijador oxidante, se desconoce el mecanismo completo de fijación, pero se estima que además

de oxidar interactúa con los fosfolípidos haciéndolos insolubles, hecho que necesita 1 o 2 días

de fijación, propiedad utilizada por los neurohistólogos para preservar tejido nervioso.

Características: polvo rojo amarillento de gran poder oxidante. Que interactúa con las

proteínas para formar cromatos- sales de ácido crómico-

Usos: Forma cromatos y quelatos. 1-2% acuoso en mezclas. Reacciona con grupos aminos y

carboxilos

VENTAJAS DESVENTAJAS

Efecto mordiente (ox. Grupos alcohólicos de grasas y polisacáridos de aldehídos) De elección para lípidos complejos (golgi, mitocondrias y mielina) Indispensable para demostrar la reacción cromafín y realizar téc. De Golgi.

incompatible con agentes reductores, OH y formalina Baja velocidad de penetración, endurece poco Artefactos titulares: vacuolas y retracciones Disuelve cromatina cuando no es acidificado, por lo tanto debe usarse en Mezclas con acido acético o TCA. Se debe lavar post fijación con ss salina o tamponada.

Reacciona tanto con carboxilos e hidroxilos rompiendo enlaces internos de proteínas

aumentando el número de aminos, produciendo un aumento en su afinidad a eosina.

C. ACIDO PICRICO

Es un trinitrofenol, ácido fuerte. El anión causa coagulación y

forma las sales de picrato con los grupos básicos de las proteínas.

Después de la fijación las muestras deben ser lavadas, se

recomienda OH70, pero algunos autores no indican diferencias de

hacerlo con agua destilada. Es un ácido lo suficientemente fuerte

para hidrolizar DNA y RNA. Si se dejara una muestra un tiempo

excesivo en éste fijador, la muestra se macera. Se usa en mezclas,

las más usadas son las de Bouin`s y Gendre`s

Características: agujas cristalizadas amarillas.

Usos: forma picratos. Se uso en mezclas saturado al 2%, 0.5-5% Kiernan

VENTAJAS DESVENTAJAS

efecto mordiente Excelente estructural Óptimo contracción de tejidos Buena penetración/lenta kiernan No disuelve glucógeno ni lípidos Leve efecto descalcificante Estable Coagulante, aditivo Efecto mordiente

explosivo Endurece y pp si se excede los tiempos de fijación Endurece y hace quebradizos los tejidos Requiere lavar post fijación OH 70%/ agua Incompatible con celoidina Disminuye volumen

D. ACETATO DE URANILO (CH3-COO)2UO2+·H2O

Características: cristales amarillos muy solubles en agua y que se descomponen a la luz

Usos: se utiliza en la tinción para microscopía electrónica

4.- RETICULARIZACION DE LAS PROTEINAS

La denaturación de las proteínas no es por precipitación, si no que por ruptura masiva de los

puentes de hidrógeno que determinan la estructura helicoidal de la molécula de proteína,

formando una malla reticular polipeptídica por asociación química entre los grupos activos

desenmascarados por el líquido fijador. Los grupos químicos con características de generar enlaces

entrecruzantes son los aldehídos, los que reaccionan sobre residuos básicos de los aminoácidos y

cambian ligeramente el punto isoeléctrico de las proteínas. El formaldehido, hidrato de cloral,

glioxal, acroleína y el glutaraldehído son los principales representantes de este grupo.

FORMALDEHIDO

Es un gas soluble en medio acuoso, sus moléculas pequeñas (HCHO, de los cuales el CHO-es el

grupo aldehído) se disuelven rápidamente en agua, con el que se combinan químicamente para

formar hidrato de metileno, HO-CH 2-OH. El líquido conocido como formalina contiene 37-40%

de formaldehido y 60-63% de agua (en peso), la mayor parte del formaldehido existe como

polímeros (n = 2 a 8 ). Mayores polímeros (N hasta 100), son insolubles, se venden como un

polvo blanco paraformaldehído, también corresponde al precipitado blanco sólido en fondo de

botellas antiguas.

El formaldehído preserva estructuras asociadas a grupos amino primarias (principalmente

aminoácido básico lisina), reacciona muy poco frente a lípidos y por tanto membranas. Si se lava

abundantemente antes de 24 horas de la muestra sumergida en le fijador, la fijación puede ser

reversible. La solución comercial contiene impurezas: metanol y ácido fórmico. Para obtener una

solución libre de impurezas se obtiene a partir del paraformaldehído OH (CH2O)NH donde N va de

6 a 100, el paraformaldehído va liberando monómeros de formaldehido al disolver lentamente en

soluciones tamponadas y a alta temperatura. La concentración de uso es al 4%, debe prepararse a

pH y osmoralidad controlados.

El formaldehido debe almacenarse a temperatura ambiente, se debe almacenar herméticamente sellado, ya que la exposición al aire favorece la oxidación de formaldehido en ácido fórmico. Para ser útil como fijador, una solución debe contener formaldehido monomérico (llamados

hidrato de metileno o metilenglicol) como su principal soluto. La dilución con agua se rompe los

polímeros pequeños en formalina. Este proceso demora un par de días si se utiliza agua pura,

pero es casi instantáneo cuando la formalina se diluye con una solución tampón a pH fisiológico.

La hidrólisis de los polímeros es catalizada por los iones de hidróxido presentes en la solución

ligeramente alcalina.

Al hacer soluble el gas, se forma rápidamente METELINGLICOL y polímeros, hasta alcanzar el

equilibrio entre metilenglicol/polímero antes que con formalina, la que alcanza apenas un 0,1% de

concentración. Por lo tanto lo primero en penetrar la muestra en metilenglicol (que NO fija),

cuando penetra formaldehido fija las estructuras, disminuye la concentración del formaldehido, y

se desplaza el equilibrio desde metilenglicol a formaldehido.

H2C=O +H20 ↔ OHCH2OH

El formaldehído reacciona con diversas regiones de las proteínas, para formar enlaces hemiacetales y otros. Por ejemplo, con las aminas primarias, aminoácidos N terminales y cadenas laterales de lisina, con los grupos guanidilo de las cadenas laterales de arginina, grupos sulfhidrilos de cisteína y grupos hidroxilo alifáticos de serina y treonina. La unión de la formalina a todos estos grupos, inhibe la actividad de muchas enzimas, previniendo la autolisis, pero no estabilizando estructuralmente el tejido, que es otra de las funciones de la fijación. De hecho, los grupos hidroximetileno (-CH2OH) que se forma cuando se fija brevemente se pueden eliminar si la muestra se lava durante varias horas en agua o alcohol (hecho que puede ocurrir durante el histo procesamiento de la muestra) ; sin embargo, cuando estos mismos grupos hidroximetileno están unidos a proteínas son capaces de participar en una segunda reacción con los grupos funcionales de las mismas proteínas o de proteínas vecinas formando puentes metilénicos estables. De esta manera distintas proteínas pueden entrecruzarse mediante puentes metilénicos químicamente estables. La formación de estos puentes es la reacción más relevante en el proceso de fijación con aldehídos. El grupo aldehído se puede combinar con el nitrógeno y algunos otros átomos de las proteínas, o con dos átomos de este tipo, si están muy cerca entre sí, formando una croos-link-CH2-llamado un puente metileno o enlace de entrecruzamiento. Los estudios de la química indican que el tipo más frecuente de reticulación formado por formaldehido en la fibra de colágeno es entre el átomo de nitrógeno al final de la cadena lateral de lisina y del átomo de nitrógeno de un enlace peptídico, y el número de tales enlaces cruzados aumenta con el tiempo. La acción fijadora de formaldehido probablemente se deba enteramente a sus reacciones con las proteínas. La penetración del formaldehido a los tejidos es rápida, pero el efecto sobre la proteína con formación de puentes de metileno procede mucho más lentamente. Sustancias tales como carbohidratos, lípidos y ácidos nucléicos se encuentran atrapados en una matriz de moléculas de proteínas insolubles y reticulado, pero no están químicamente modificadas por el formaldehido, a menos que la fijación se prolonga durante varias semanas.

(figura 2 ) (A) La adición de una molécula Formaldehido a una proteína. (B) La reacción de

formaldehido enlazado con otra molécula de proteína para formar un enlace cruzado de

metileno. (C) El detalle de la estructura del croos -linking de una cadena lateral de lisina a

un átomo de nitrógeno péptido

Características: es un gas, incoloro de un olor penetrante, en solución alcanza una

concentración máxima de 40% estabilizado con metanol

Usos: se usa en solución al 4%. Tóxico. Irritante

VENTAJAS DESVENTAJAS

barato, de elección para trabajos de rutina buen fijador único Fácil de preparar Buen desinfectante No endurece en exceso escasa retracción tisular Penetración intermedia (1 mm/hr) pero fija lento Se puede acelerar la fijación o retrasarla con temperatura Aditivo no coagulante Preserva lípidos pero no los insolubiliza Compatible con la mayoría de las tinciones

vapores de carácter irritante por acción de luz y oxígeno se transforma en ácido fórmico (frascos ambar, usar ss neutra) Fija lento Debido a su incorporación progresiva el tejido en forma de puentes metílicos, el formaldehído se consume durante el proceso de fijación, por lo que debe estar siempre en exceso. Peso y volumen del tejido se aumentan (180mOs) Soluciones ácida produce pigmento formolado

Algunas consideraciones prácticas:

Antes de utilizar una botella la solución de formaldehido al 37% debe ser transparente, incolora y no tener ningún precipitado, debe haber sido almacenada en la sala temperatura en una botella herméticamente cerrada, que no ha sido expuesto a la luz solar. No recomendamos el uso de una botella de valores que es mayor de 1 año, importante verificar fecha de caducidad. Botellas de 37% de formaldehido que ya están abiertos no debe utilizarse más allá de los seis meses. En consecuencia, se recomienda comprar formaldehido con mayor frecuencia y en presentaciones pequeñas. GLUTARALDEHÍDO

Usos: para M. Electrónica. El preparado comercial consiste en una solución acuosa de monómeros y oligómeros de glutaraldehído, aunque solo el monómero es activo como fijador, es por este motivo que es importante prepararlo antes de ser usado, además de cuidar el pH de la solución y temperaturas cercanas a los 4°; la pureza de la muestra puede demostrarse por espectofotometría, pues el pick máximo de absorción del monómero es de 280 nm mientras que de el oligómero es de 235 nm. El glutaraldehído tiene moléculas bastante pequeñas, cada una con

dos grupos aldehído, separados por una cadena flexible de 3 puentes de metileno. Es de HCO-

(CH2) 3-CHO. El potencial para la reticulación es, obviamente, mucho mayor que con

formaldehido debido a que puede producirse a través de ambos el-CHO grupos y sobre distancias variables. En soluciones acuosas, el glutaraldehído está presente en gran parte como polímeros de tamaño variable. Hay un grupo aldehído libre que sobresale del lado de cada unidad de la molécula de polímero (fig. 3), así como una en cada extremo. Todos estos grupos-CHO se combinará con los nitrógenos de proteínas con las que entran en contacto, por lo que existe un enorme potencial para la reticulación, y eso es precisamente lo que ocurre (Fig. 4).

fig 3

Aspectos prácticos de la fijación con glutaraldehído

Varios puntos importantes que deben tenerse en cuenta cuando se utiliza como fijador de glutaraldehído para microscopía óptica o electrónica.

1. Si es para ser cualquier uso como un fijador, especialmente para la microscopía electrónica, la solución de glutaraldehído debe contener el monómero y polímeros (oligómeros) con moléculas pequeñas como para penetrar en el tejido con bastante rapidez. Esto significa que se debe comprar un "grado EM" glutaraldehído (25% o 50% de solución), no más barato "técnico" de grado.

2. La reacción química de glutaraldehído con la proteína es rápido (minutos a horas), pero las moléculas más grandes, especialmente los oligómeros, penetrar en el tejido lentamente.

3 . La reticulación generada por el glutaraldehido impide la penetración de las moléculas de parafina bastante grandes.

4. Inmunohistoquímica, para la correcta identificación de los antígenos se requiere tantas aminoácidos con cadenas laterales intactas como sea posible, lo que se ve seriamente afectada por la fijación glutaraldehído. El entrecruzamiento generado también se traduce en la pérdida o reducción grave de la mayoría de las actividades enzimáticas histológicamente demostrables, aunque algunos se conservan después de la fijación breve

fig 4

Reacción de poli (glutaraldehído) con grupos amino de las proteínas.

VENTAJAS DESVENTAJAS

penetra lento fijación irreversible requiere de muestras delgadas Mantiene ultraestructura mejor que cualquier otro aldehído

sobre endurece Requiere un buffer de soporte Debe ser preparado antes de usarlo, soluciones frescas.

GLIOXAL Es uno fijador nuevo en el mercado, se vende y promociona como un fijador con las características

de la formalina pero sin ser tóxico.

El Glioxal es un oxalaldehído, que en solución se encuentra como hidrato de glioxal, necesita de un pH 4.0. En teoría fija de manera similar a la formalina pero de una manera más rápida, muestras pequeñas requieren de 1 hora y grandes de 9 horas. Es un di aldehído que actúan sobre las proteínas, asegurando su máxima preservación química y espacial. Sus potenciales de oxidación están próximos al formol. Es un compuesto miscible en agua y el poder de penetración es mayor, a pesar que los pesos moleculares de estos son mayores que el correspondiente al formol. Generalmente, se preparan en soluciones diluidas a pH fisiológicos. Fija correctamente proteínas y estructuras celulares y de matriz asociadas a ellas, tales como ADN y membranas. El glioxal al 5% en buffer de fosfatos a pH 7,4 tiene aplicación reciente en microtécnica de rutina.

fig 5

TETROXIDO DE OSMIO

Fijador oxidante, se desconoce con certeza su mecanismo de fijación, pero se sabe que genera

cierto grado de entrecruzamiento entre las proteínas, esto se ve por el rápido nivel de

viscosidad de la solución de proteínas que toman contacto con el tetróxido de osmio. El osmio

presenta un alta avidez por los lípidos por lo que además de fijarlos los contrasta, siendo esto

especialmente útil en microscopía electrónica

Características: cristales amarillentos solubles en agua, muy volátiles y tóxicos. Se vende en

ampollas de vidrio selladas.

Usos: 1% en tampón fosfato

VENTAJAS DESVENTAJAS

actúa por reticularización fijando proteínas y grasas Es el mejor fijador estructural, se usa en M Electrónica, como segundo fijador y contraste.

caro y se descompone en presencia de la luz es algo insoluble muy tóxico, debe ser siempre manipulado bajo campana penetración lenta incompatible con fijadores reductores (formaldehido ppalmente) y con la coloración de PAS. Al fijar por reticularización inactiva casi por completo las enzimas y altera notablemente la composición antigénica tisular.

Fuera de las cuatro categorías descritas, en el año 1997 se patenta el España un fijador

denominado comercialmente COMPLUCAD, al ser este una marca registrada no se dan a

conocer todos sus componentes, sin embargo se sabe que contiene “una solución de

alcoholes y peróxidos”, se comercializa como libre de formaldehido y por tanto de todos

los riesgos tóxicos asociados. Inicialmente se promociona con un fijador para

conservación de cadáveres y piezas anatómicas, pero en la actualidad se utilizaría en

fijación de muestras para estudios histológicos.

Factores que intervienen en la fijación.

La fijación es un proceso complejo en el que intervienen toda una serie de factores tanto

propiedades y características del fijador, como la muestra y factores externos.

1. pH: generalmente suele ajustarse el pH a uno cercano al fisiológico ( entre 6 y 8),

utilizando para ello tampones o buffers. Fuera del rango fisiológico se pueden

producir artefactos especialmente visibles a nivel ultraestructural.

2. Osmolaridad: movimiento de agua a través de una membrana semi permeable, las

soluciones tienden a igualar las presiones. Hay que evitar problemas de retracción

( si el fijador es hipertónico) o de turgencia ( si es hipotónico). Los fijadores

isotónicos tienden a hinchar levemente la muestra. Isotónico en mamíferos es de

300-340 mOsm.

3. Temperatura: si bien no es crítica, elevar la temperatura del fijador reduce de 12-

20 horas a 1-2 horas de fijación (40°c aprox). Para microscopía óptica debe ser

realizada la fijación a 4°c evitando la difusión por arrastre de los componentes

celulares.

4. Concentración del fijador:

5. velocidad de penetración: rapidez con la que un fijador difunde hacia el interior del

tejido, por lo tanto, el tamaño de la muestra se relaciona directamente a la

velocidad de penetración del fijador. A fin de conocer el poder de penetración de

los agentes fijadores, se ha establecido un valor “K”, que se define como el

coeficiente de difusión del fijador en el tejido, “d” es la distancia penetrada ( en

mm)y “t” es el tiempo (en horas), resulta que:

2

t= d

K

Esta ecuación nos permite determinar el tiempo de fijación (tener presente que no

es sinónimo penetración del agente fijador con fijación de la muestra)

Se estima que la formalina penetra los tejidos a 0,9 mm/hora y 0,3mm/hora ácido

pícrico y sublimados. La mayor velocidad la tienen los alcoholes y acetona.

FIJADOR K

FORMALDEHIDO 3.6

GLIOXAL 3.3

ACIDO PRCRICO 0.8

ACIDO ACETICO 2.75

GLUTARALDEHIDO 3.4

ETANOL 1.3

METANOL 1.45

6. velocidad de fijación: en el caso de la formalina la fijación es posterior a la

penetración, tarda en estabilizar y precipitar los componentes químicos de los

tejidos. En el caso de los fijadores que forman sales, estos van generando una

barrera mecánica, demorando aun más la fijación.

7. grosor y densidad de la muestra: al aumentar la densidad de la muestra ésta opone

resistencia al ingreso del fijador; por este motivo es que las muestras deben

ajustarse a los requerimientos de tamaño y grosor adecuados.

8. volumen de fijador: debe ser 10 a 30 veces mayor que el volumen de la muestra.

Bibliografía:

• “Técnicas en histología y biología celular” Luis Montuenga Badia

• “Manual de Laboratorio Clínico Diagnóstico” Raimundo García del Moral 2000

• “Histological and Histochemical Methods” Theory and Practice Kiernan 4° edición

• “Histotechnology A Self- Instructional Text” Carson 3° edición