Animaleslaboratorio

de

Diferencias en la respuestaa la furosemida entre ratas

de la cepas Wistar ySprague Dawley

Litiasis vesical e hidronefrosisbilateral en una rata de laboratorio.Reporte de un caso

Ensayo Piloto de inmunogenicidad ytoxicidad preclínica de la vacunaantimeningocóccica AW135en ratas Sprague Dawley

Histología pulmonar en un biomodelomurino de asma usado para el estudiode variantes de una vacuna antialérgica

No. 1 Año 1

Histología pulmonar en un biomodelomurino de asma usado para el estudio

de variantes de una vacuna antialérgica

Histología pulmonar en un biomodelomurino de asma usado para el estudio

de variantes de una vacuna antialérgica

Histología pulmonar en un biomodelomurino de asma usado para el estudio

de variantes de una vacuna antialérgica

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Conteni

do

Correspondencia: Isabel Martínez. Facultad de Ciencias Químicas. Edificio 105D. Planta baja. Ciudad Universitaria. Puebla. C.P. 72570. Tel. (01222) 2295500 ext 7362. Fax: (01222) 22443106. E-mail: mariai.

ABSTRACTExperimental models of diuresis are frequently used both in teaching and research. These models allow investigating on hypertension, diabetes, kidney disease, comparing the diuretic efficacy of various substances or trying new substances with possible diuretic activity. The procedures are simple and valuable data. On the other hand, in the teaching laboratories and research is important to know best the characteristic on the animal used, this knowledge will largely determine the validity of the data. In this paper we determine the effective dose to cause diuresis in two different strains of rat, Wistar and Sprague Dawley, plus time to get the maximum effect of furosemide.

Differences in the responseto furosemide in rats ofthe Wistar and Sprague

Dawley strains

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Arianna Bravo, Carlos Escamilla-Weinmann, Daniel Limón, Félix Luna e Isabel Martínez*

INTRODUCTIONThe scientific community has acknowledged that it has an ethical responsibility for the care and handling of laboratory animals. Anyone who uses animals for research and teaching must assume the responsibility the welfare of these. The proper treatment of laboratory animals requires scientific knowledge and professional experience. Currently, the care and management of laboratory animals is a fruitful area in biomedical research. The scientist has understood that the experimental results depends in large part on the state in which they find themselves the subject of experimentation, i.e. the good condition of the animals used validates the results obtained during the investigation. A good management program is one that provides for a system of housing and care that allow animals to grow, mature and reproduce. In addition, the proper management reduces

the variation in results that can modify the responses of the animal to the treatments during the experiments (de Aluja, 2002).There is experimental evidence on the anatomical, functional and behavioral differences between rat strains used in the laboratory. In a comprehensive study Tordoff and Cols, (2008), analyzed fourteen different strains and determine different preferences in food consumption and determine deference in body weight. Another study shows the existence of differences in the pharmacological effects caused by prolonged anesthesia with isoflurane, concluding that Wistar rats are more sensitive compared to Sprague Dawley rats (Siller-Matula and Jilma, 2008). Scholl et al., (2010), using three different strains of rats found a significant difference in the density of sites of transport for the neurotransmitters dopamine, serotonin and norepinephrine

Figure 1. Mechanisms of transport of Na + Cl- K+ in the thick ascending limb of the loop of Henle. The Na + -K + -ATPase pump maintains an intracellular Na + concentration low and a negative electrical potential in the cell. The symporter Na + - K + - 2Cl carries these ions from the tubular lumen into the tubular cells; loop diuretics such as furosemide selectively inhibit this symporter. The molecular mechanism by which this class of drugs blocking the symporter is unknown, but evidence to know its function

OBJETIVE Compare the effect of different doses of furosemide on urinary final volume in Wistar and Sprague Dawley (Harlan) strain obtained from the Bioterium “Claude Bernard” of the Benemérita Universidad Autónoma de Puebla.

MATERIAL AND METHODSAnimalsAll of the experimental procedures were performed in accordance with the guidelines of the Rules of the Committee for the Care and Use of Laboratory Animals of the Benemérita Universidad Autónoma de Puebla (2007), according to the Official Mexican Standard (NOM-062-ZOO-1999) regarding the “Technical specifications for the production, care and use of laboratory animals” permission for CICAUL/BCB/ 2009.Adult female Wistar rats (n=10) and Sprague Dawley (n=14) were acquired from Benemérita Universidad Autónoma de Puebla “Claude Bernard” bioterium. The rats were housed individually in acrylic cages at 22 ± 2 °C and 50 ± 5% relative humidity under 12 h artificial lighting. Food and water were provided ad libitum. Collection of urine samples were used for

insulin syringe that enabled to measure the volumes urinals with precision. Experimental subjects were placed in acrylic boxes with dimensions 36.5 x 27; base 27.5 x 18 cm and 16 cm high. To each of the used boxes there was placed a plate of the same material by orifices to 3 cm of the floor on which placed to the rat. The holes allow the passage of urine but not the feces thus avoiding contamination of the samples. The urine collection was performed every 30 minutes. For both strains the same methodology was conducted in which each animal was its own control, the same animals for different doses of furosemide are used, each dose was done in duplicate; with an interval of two days between each test, to ensure removal of the drug, as well as recovery of lost weight during the day of the experiment. Furosemide doses were 5, 10, 15, 20 mg / kg administered intraperitoneally (Lasix 20mg / 2ml, Sanofi Aventis).The day of the experiment, 5 minutes after the administration of furosemide the animals were placed in the individual boxes of experimentation and collections of urine

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RESULTSThe results of a series of experiments using different doses of the diuretic furosemide administered to Wistar rats and Sprague Dawley rats are presented.Quiate sam, andel erspero molupicit aut et ra sa vent. Pa quo dolesectium et venihil ibuscil isquam sumet aut qui que non cus doloribust dolo cum sed estrum facea vendest, officipsunt et dolorum ilibusam, non nem et que nihitis exeribus peratur rem assit ulparupta verempor amusdaest apernam nestibus, ommolende remporum venem quo exped mo voluptatus. Offic te pe parions equisit eiunt, cumqui bea sentior ehenihit hicatia sin preiciati odignim faccum, cus. Ones solo beature.

Table 1. Average (X) of the urine volume (ml) for different times and the value of the standard deviation (σ) is shown at baseline and after intraperitoneal administration of furosemide (F) at the doses of 5, 10, 15 and 20 mg/kg.

30’ 60’ 120’ 180’ 240’

Basal 87 54 545 866 43

5mg/kg F 87 5 98 643 2

10mg/kg F 54 54 54 54 454

15mg/kg F 76 5 874 4 88

20mg/kg F 56 54 246 543 54

that there was only a significant difference in the measured to the 60 min (t (21) = 2.90, p <0.01) urinary volume; and 120 min (U = 14, p <0.001) post administration.Offic te pe parions equisit eiunt, cumqui.

Urine volume values without diuretic are represented by black bars and gray lines. To compare urinary volume between these two strains of rat Student’s t test and Mann-Whitney U test was used for two independent samples, found

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Figure 3. Variation of the average of the urinary volume (ml), versus time (min), of Wistar rats (W) and Sprague Dawley (SD) rats administered with 15mg/kg intraperitoneally furosemide. The values of the urinary volume before the administration of the diuretic appear in gray and black bars with lines. To compare urinary volume between these two strains of rat Student’s t test and Mann-Whitney U test was used for two independent samples, found that there was only a significant difference in the measured 180 min (U=32.5, p <0.05) after administration.

Reyes Luna Rosalina1, Sampedro-Pacio Edith1, López Morales Dolores, Quiroz López Ubaldo, Escamilla-Weinmann Carlos3 y Flores-Alonso Juan Carlos2.

1Lab. Biología de la Reproducción, Escuela de Biología, BUAP, 2Lab. Biología de la Reproducción, CIBIOR, IMSS, Metepec, Puebla, 3Bioterio “Claude Bernard”, BUAP, Ciudad Universitaria, C.P. 72570, Puebla, Pue. México.

RESUMEN

La capacidad de una blastómera para generar un nuevo embrión y células troncales de origen embrionario nos ha permitido observar y estudiar su potencialidad de desarrollo in Vitro. Se determinaron los tiempos para el desarrollo de embriones a partir de blastómeras microseparadas de embriones obtenidos por FIV en ratones de la cepa CD-1. Quince grupos de 3 ratones hembra de 10 semanas de edad fueron estimuladas hormonalmente (superovulación) con la i.p. de 5 U.I. de PMCG seguida de la i.p. de 5 U.I. de HCG 48 h después. Las hembras se sacrificaron a las 16 h y los oviductos fueron recolectados y colocados en medio CZB-H para recuperar las células ovuladas. Las incubaciones se realizaron a 37°C en atmosfera húmeda de CO2 al 5% en medio CZB. Los óvulos recuperados se incubaron con 50,000 espermatozoides previamente capacitados 1 h. Se cultivaron las células hasta observar el desarrollo de embriones en estadio de 2 células. Mecánicamente se procedió a separar las blastómeras en medio CZB-H y después se cultivaron para el desarrollo de un nuevo

DESARROLLO DE EMBRIONES in vitro A PARTIR DE BLASTO-

MERAS OBTENIDAS DE EM-BRIONES DE RATON CD-1 EN

ESTADIO DE 2 CÉLULAS.

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INTRODUCCIÓN

La fertilización en mamíferos involucra la fusión de un ovulo con un espermatozoide, lo que permite el desarrollo de una célula diploide llamada zigoto que al dividirse forma un embrión. El estudio de este proceso ha incrementado nuestros conocimientos en los eventos primordiales de la fertilización y ha generado el desarrollo de las técnicas de Reproducción Asistida que tratan de igualar las condiciones del proceso de la fertilización In Vivo. Entre estas técnicas tenemos: 1).- La fertilización in Vitro (FIV), que consiste en unir óvulos y espermatozoides en un medio de cultivo para que fecunden y se desarrolle un embrión, 2).- La Transferencia de Embriones (TE), que consiste en la recolección de embriones de una hembra donadora o embriones producidos in Vitro para transferirlos a una hembra receptora; 3).- La Clonación mediante Transferencia Nuclear, que consiste en depositar el material genético

de una célula donadora (carioplasto) en una célula hospedera anucleada (citoplasto) para el desarrollo de un nuevo embrión con la misma carga genética de la célula donadora; 4).- La Micro-inyección Intracitoplásmica de espermatozoides (ICSI), que se ha convertido en una herramienta invaluable para fertilización in Vitro, ya que permite depositar espermatozoides en el citoplasma del óvulo y 5).- La Microseparación y Cultivo de Blastómeras, que se basa en la obtención de una sola blastómera a partir de un embrión para el desarrollo de un nuevo embrión o para establecer líneas de células madre embrionarias. La capacidad de una blastómera para generar un nuevo embrión ha sido estudiada por medio de las siguientes técnicas: a. Biopsia del embrión (Geber et al., 1999; Ludwig et al, 1998). b.- Co-cultivo de blastómeras en tejidos autólogos y heterólogos (Wiemer et al., 1998; Barmat et al., 1999). c.- Perforación de la zona pelucida (Gordon and Gang,

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1990). d.- Fusión de una blastómera con ovocitos anucleados (Mitani et al., 1993). Estos estudios nos han permitido observar la potencialidad de desarrollo in Vitro de las blastómeras microdisectadas y cultivadas al desarrollar embriones viables hasta la etapa de blastocisto. Se ha reportado la obtención de células madre embrionarias a partir de una blastómera microseparada de un embrión en ratón y humano (Lorthongpanich et al., 2008). Esta célula se obtuvo de manera similar a la usada en el diagnóstico genético de preimplantación y se ha encontrado que no se interfiere con el desarrollo potencial del embrión, por otro lado, cuando las líneas celulares embrionarias son aisladas de la masa celular interna del blastocisto, este procedimiento ocasiona la destrucción del embrión (Klimanskaya et al., 2006; Chung et al., 2006). El desarrollo primario de un zigoto es la división de esta célula en pares de células o blastómeras (2-32 blastómeras

en aproximadamente 96 horas post-fertilización en mamíferos), y a partir del cual se pueden extraer estas blastómeras que presentan la propiedad de ser indiferenciadas y multipotenciales. A la fecha, la experimentación con blastómeras se ha utilizado para producción de trillizos y cuatrillizos (Johnson et al, 1995¸ Willadsen and Polge, 1981) y gemelos monozigotos en ratón (Tsunoda and Mclaren, 1983), oveja (Willadsen 1980), bovino (Willadsen et al., 1981), cerdo (Saito and Niemann, 1991), caballo (Allen and Pashen, 1984), así como también para la obtención de células madre embrionarias (Klimanskaya et al., 2006; Chung et al., 2006). La investigación sobre células madre embrionarias y la microseparación de las blastómeras, en el caso del humano, se ha desarrollado lentamente por el hecho de que se destruye el embrión y lo priva de su potencial desarrollo en un ser humano, cuando éstas células son microdisectadas de la masa celular interna. Estudios recientes en

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RESULTSDespués de las 16 horas de la administración i.p. de HCG se recuperaron complejos ovocitos-células de la granulosa (COCs) de las asas de los oviductos de los ratones hembras sacrificadas. La estimulación hormonal permitió recuperar 21 ± 5.3 COCs por cada hembra que fue estimulada. Después de 3 h de incubación se disgregaron las células de la granulosa y se pudo observar la presencia del primer cuerpo polar en los óvulos (Fig.1) lo cual indica la madurez nuclear de la célula. Embriones en etapa de dos células se obtuvieron a las 22 h de incubación después de la FIV (Fig. 2). Cabe destacar que de los 15 experimentos realizados en un 26% se obtuvo óvulos fertilizados en estadio de dos células y dentro de los experimentos que presentaron fertilización el 67% de los óvulos fueron fertilizados (Tabla 1). El desarrollo de embriones en cultivo a etapa de dos células a partir de blastómeras microseparadas tomo 46 h de incubación y se presento en el 20% de las células separadas (Fig. 3). No se observaron diferencias en el desarrollo temprano de los embriones cuando las blastómeras fueron incubadas con y sin zona pelúcida.

Fig. 1. Microfotografía óptica de un ovulo obtenido por inducción hormonal en ratones hembras de la cepa CD-1, que presenta el primer lóbulo polar (flecha). 40x.

DISCUSIÓN

Se ha reportado en ratón que factores genéticos juegan un papel significante en el tiempo e índice de fertilización, penetración del espermatozoide y rango de división celular del embrión (Whitten and Dagg, 1961; Krzanowska, 1970; McLaren and Bowman, 1973). Se ha considerado que los estudios de fertilización in vitro que se realizan en cepas endogámicas como la C57BL/6 son menos eficientes que los realizados en cepas hibridas y no endogámicas (Liu et al., 2009).

En este trabajo se detallo el protocolo para la fertilización in vitro, desarrollo de embriones en etapa de 2 células y obtención de blastómeras en donde se utilizaron ratones de la cepa CD-1 (no endogámica). Se utilizaron ratones de la cepa CD-1 en donde se obtuvo un 67% de fertilización, datos similares a los reportados previamente (Vasudevan et al., 2010). A partir de la microseparación de las blastómeras nuevamente se desarrollaron embriones en etapa de 2 células en el 20% de los experimentos. Los embriones libres de zona pelúcida han sido usados para estudiar los linajes celulares en ratón (Graham and Deussen, 1978; Kelly et al., 1978; Graham and Lehtonen, 1979; Lehtonen, 1980) y se ha postulado que la influencia de remover la zona pelúcida puede tener impacto en el desarrollo

Fig. 2. Microfotografía óptica de embriones en etapa de dos células, obtenidos después de 22 h post- FIV. Las células fueron incubadas en medio CZB en atmósfera húmeda de CO2 al 5% y aire. a). 10x; b y c). 20x.

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