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FE DE ERRATAS
Usos Biológicos y Biomédicos de Aspergillus spp
Se hace notar que se ha detectado la siguiente errata, que se subsana a continuación
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35, 36, 38, 41,42 y 46 CONSUMO BIOTRANSFORMACIÓN
UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRES
FACULTAD DE CIENCIAS FARMACEÚTICAS Y BIOQUÍMICAS
MAESTRIA CIENCIAS BIOLÓGICAS Y BIOMÉDICAS
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES FÁRMACO BIOQUÍMICAS
Usos Biológicos y Biomédicos de Aspergillus spp.
“Tesis de Pos-grado para optar al título de Magister Scientiarum en Ciencias Biológicas y Biomédicas
en la mención de MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL”
Elaborado por: Carla Denisse Parra Lizarazu
La Paz – Bolivia
2015
UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRES
FACULTAD DE CIENCIAS FARMACEÚTICAS Y BIOQUÍMICAS
MAESTRIA CIENCIAS BIOLÓGICAS Y BIOMÉDICAS
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES FÁRMACO BIOQUÍMICAS
Usos Biológicos y Biomédicos de Aspergillus spp.
Asesores: Alberto Giménez Turba, Ph D.
Esther Ninoska Flores Quisbert, Ph D.
La Paz – Bolivia
2015
Este trabajo lo dedico a Dios por la enorme bendición
de su amor, a la memoria de mi amado padre Willy (Ɨ), y
a mi madre Flora ya que sin su ayuda, apoyo y bendición
esta experiencia no hubiera sido posible
AGRADECIMIENTOS
A mis tutores Dr. Alberto Giménez y Dra. Ninoska Flores a quien admiro y respeto mucho,
mil gracias por toda la paciencia, por su constante guía y por todo su apoyo y lo más
importante por dejarme formar parte del IIFB.
A Efrain Salamanca por todo su apoyo, paciencia y su valiosa amistad
A mi gran amigo Boris Espinoza por toda su ayuda y sus valiosas enseñanzas.
A Crispin Paredes por su linda amistad y todo su apoyo.
A mis amigos del I.I.F.B. Gabi, Zeny, Dani, Ceci y Reynaldo por hacer de este tiempo a su
lado una inolvidable experiencia.
A mis compañeros y compañeras de la maestría.
A mis hermanas y a toda mi familia por toda su confianza.
Al Centro de Tecnología Agroindustrial (CTA) de la UMSS y al proyecto Biomoléculas
UMSA-ASDI por la colaboración en la realización de los espectros de masas.
TABLA DE CONTENIDO
CAPITULO 1
Usos biomédicos de Hongos Filamentosos (Aspergillus spp.)
CARACTERIZACIÓN QUÍMICA Y BIOLÓGICA DE LOS PRODUCTOS
OBTENIDOS DE LA BIOTRANSFORMACIÓN DEL ALCALOIDE
ANTIPARASITARIO 2-FENIL-QUINOLINA
RESUMEN
ABSTRACT
1. INTRODUCCIÓN 1
2. ANTECEDENTES
2.1 Hongos filamentosos 3
2.1.1 Hongos del género Aspergillus spp. 4
2.2 Aspectos generales de los procesos de biotransformación 7
2.3 Procesos de biotransformación por hongos filamentosos 7
2.3.1 Aplicaciones industriales de los procesos de biotransformación por hongos 9
2.3.2 Aplicaciones Biomédicas de los procesos de biotransformación por hongos 11
2.4 Biotransformación de principios activos de plantas medicinales 13
2.5 Galipea longiflora (Evanta) 15
2.5.1 Estudios de Biotransformación de Galipea longiflora (Evanta) 17
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo General 20
3.2 Objetivos Específicos 20
4. METODOLOGIA
Esquema general de trabajo 21
4.1 Activación de la cepa 114QD 22
4.2 Obtención de colonias puras 22
4.3 Identificación Macroscópica y Microscópica 22
4.3.1 Examen macroscópico en placa 22
4.3.2 Examen microscópico en portaobjetos 22
4.4 Estudios de tolerancia de la cepa 114QD al alcaloide 2-fenilquinolina (Prueba de
toxicidad por el método de Mitscher) 23
4.4.1 Preparación de las soluciones de 2-fenilquinolina y controles 23
4.4.2 Preparación del medio de cultivo y llenado de la placa 24
4.4.3 Lectura de la microplaca 24
4.5 Cinética de crecimiento de la cepa 114QD 24
4.5.1 Técnica peso seco celular 24
4.6 Establecimiento de los procesos de biotransformación 24
4.6.1 Preparación de las suspensiones de esporas 24
4.6.2 Recuento de esporas 25
4.6.3 Cultivos Batch y procesos de Escalamiento (Scale up) 26
4.7 Obtención de extractos 26
4.8 Caracterización química de los productos de biotransformación 26
4.8.1 Análisis por cromatografía en capa fina (CCF) 26
4.8.2 Análisis por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) 27
4.8.3 Análisis por cromatografía de gases (CG) 27
4.8.4 Análisis por cromatografía cromatografía de gases acoplado
a espectroscopia de masas (CG-EM) 28
4.9 Caracterización biológica de los productos de biotransformación 28
4.9.1 Evaluación de la actividad antiparasitaria: Método colorimétrico XTT 28
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1 Activación de la cepa de trabajo 30
5.2 Identificación macroscópica y microscópica de la cepa 114QD 30
5.3 Evaluación de la toxicidad del sustrato 2-fenilquinolina frente a la cepa 114QD 31
5.4 Cinética de crecimiento de la cepa 114QD 31
5.5 Procesos de biotransformación (Establecimiento de cultivos Batch) 33
5.6 Análisis por cromatografía CCF 33
5.7 Análisis por cromatografía HPLC 34
5.8 Análisis por cromatografía de gases (CG) y acoplamiento a espectroscopia
de masas (CG-EM) 36
5.9 Procesos de Escalamiento (Scale up) 39
5.10 Caracterización química de los procesos de escalamiento 39
5.10.1 Análisis por CCF 39
5.10.2 Análisis por CG 41
5.11 Evaluación de la actividad antiparasitaria 44
6. CONCLUSIONES 46
CAPITULO 2
Usos biológicos de (Aspergillus spp.)
MICOTOXINAS
Producción y cuantificación de aflatoxina B1
RESUMEN
ABSTRACT
1. INTRODUCCIÓN 48
2. ANTECEDENTES.
2.1 Micotoxinas 50
2.2 Aflatoxinas 50
2.3 Origen y distribución 53
2.4 Factores para la producción de aflatoxinas 54
2.5 Efectos tóxicos de las aflatoxinas 55
2.5.1 Exposición Aguda 56
2.5.2 Exposición Crónica 57
2.6 Métodos de determinación de aflatoxinas 57
2.6.1 Cromatografía en capa fina (TLC) 57
2.6.2 Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) 58
2.6.3 Espectrometría de fluorescencia 58
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo general 59
3.2 Objetivos específicos 59
4. METODOLOGIA
Esquema general de trabajo 60
4.1 Elaboración de la curva de calibración de aflatoxina B1 por HPLC 61
4.1.1 Preparación de las soluciones patrón de aflatoxina B1 61
4.1.2 Análisis de las soluciones patrón 61
4.2 Elaboración de la curva de calibración de aflatoxina B1por Espectroscopia de
fluorescencia 62
4.2.1 Preparación de las soluciones patrón de aflatoxina B1 62
4.2.2 Análisis de las soluciones patrón 62
4.3 Producción de aflatoxina B1 por la cepa de Aspergillus spp (114QD) 63
4.3.1 Preparación del medio de arroz para la producción de aflatoxina B1 63
4.3.2 Obtención de los extractos 63
4.3.3 Purificación de los extractos 63
4.4 Análisis por cromatografía CCF de los extractos 64
4.5 Cuantificación de aflatoxina B1 por HPLC de los extractos 64
4.6 Cuantificación de aflatoxina B1 por Espectroscopia de Fluorescencia 64
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1 Elaboración de la curva de calibración de aflatoxina B1 por HPLC 65
5.2 Elaboración de la curva de calibración de aflatoxina B1 por
Espectroscopia de fluorescencia 67
5.3 Evaluación de la capacidad de producción de aflatoxina B1 por la cepa.114QD 69
5.3.1 Desarrollo de la cepa 114QD en medio de arroz 69
5.4 Análisis por CCF 70
5.5 Identificación y determinación de la concentración de aflatoxina B1 presente en los
extractos de arroz por cromatografía líquida de alta resolución HPLC 72
5.6 Identificación y determinación de la concentración de aflatoxina B1 presente en los
extractos de arroz por espectroscopia de fluorescencia 74
6. CONCLUSIONES 80
BIBLIOGRAFIA 83
ANEXOS
INDICE DE ESQUEMAS
Esquema 1. Tipos de biotransformaciones realizadas por hongos filamentosos 8
Esquema 2. Hidroxilación de la progesterona por hongos filamentosos 9
Esquema 3. Transformación por hongos filamentosos de los monoterpenos limoneno y
α pineno 10
Esquema 4. Biotransformación del citronelol por Aspergillus niger 11
Esquema 5. Biotransformación del naproxeno por especies de Cunninghamella y
Aspergillus 12
Esquema 6. Biotransformación de la doxepina por Cunninghamella elegans 13
Esquema 7. Biotransformación de Artemisina por Aspergillus flavus 14
Esquema 8. Biotransformación de chalconas por Aspergillus flavus 14
Esquema 9. Biotransformación de dihidrocumarinas por especies de Aspergillus sp. 15
Esquema 10. Biodegradación Bacteriana de Quinolina 18
Esquema 11. Biodegradación de 6-metilquinolina 19
Esquema 12. Formación de abductores de aflatoxina B1 con el ADN 56
INDICE DE FIGURAS
Capitulo 1
Usos biomédicos de Hongos Filamentosos (Aspergillus spp.)
Caracterización química y biológica de los productos obtenidos de la biotransformación del
alcaloide antiparasitario 2-fenil-quinolina
Figura 1. 2-fenilquinolina (1) 1
Figura 2. Características macro y microscópicas del género Aspergillus 5
Figura 3. Principales especies del género Aspergillus 6
Figura 4. Estructura química de la 2-fenilquinolina y derivados alquílicos y/o arílicos 16
Figura 5. Prueba de toxicidad de 2-fenilquinolina 31
Figura 6. Cinética de crecimiento de la cepa 114QD en 2-fenilquinolina 32
Figura 7. Análisis de los extractos de los cultivos Batch por CCF 33
Figura 8. a) Cromatogramas y Espectro 3D de los picos de 2-fenilquinolina obtenidos
en el tiempo
b) Espectros de absorción UV obtenidos por el detector PDA Espectro pico A (Tr: 1.79
min), Espectro pico B (Tr: 2.85 min), Espectro pico C (Tr: 4.1 min 2-fenilquinolin 34
Figura 9. Relación de la disminución del área de la 2-fenilquinolina y el incremento del
área del pico B con relación al tiempo de cultivo 35
Figura 10. Cromatograma extracto total cultivos Batch 36
Figura 11. Relación de la disminución del área de la 2-fenilquinolina y el incremento del
área del pico de interés (Tr: 44.01) con relación al tiempo de cultivo 37
Figura 12. Espectro de masas de la 2-fenilquinolina 37
Figura 13. Espectro de masas de la 2-hidroxifenilquinolina 38
Figura 14. Análisis por cromatografía en capa fina de los procesos de Escalamiento
a) Escalamiento sin glucosa b) Escalamiento con 1 % de glucosa) 40
Figura 15. Cromatograma proceso de escalamiento 0,025 mg/ml 41
Figura 16. Cromatograma procesos de escalamiento 0,050 mg/ml 42
Figura 17. Espectros de masas de los extractos totales de los procesos de escalamiento con
y sin glucosa 43
Figura 18. Actividad (IC 50) de los extractos frente a promastigotes de Leishmania 44
CAPITULO 2
Usos biológicos de (Aspergillus spp.)
MICOTOXINAS
Producción y cuantificación de aflatoxina B1
Figura 19. Estructura de la Aflatoxina B1 48
Figura 20. Estructura de las principales micotoxinas 51
Figura 21. Estructura química de las principales Aflatoxinas 52
Figura 22. Mecanismos de contaminación por aflatoxinas 53
Figura 23. Cromatograma del patrón de Aflatoxina B1 a distintas concentraciones 65
Figura 24. Curva de calibración de Aflatoxina B1 por HPLC 66
Figura 25. Espectros de emisión del patrón de Aflatoxina B1 a distintas concentraciones 67
Figura 26. Curva de calibración de Aflatoxina B1 por Espectroscopia de fluorescencia 68
Figura 27. a) Desarrollo de la cepa Aspergillus spp. (114QD) en medio de arroz a los 21
días de cultivo
b) Arroz enmohecido visto directamente a 366nm 70
Figura 28. Análisis por cromatografía en capa fina (CCF) de los extractos de arroz 71
Figura 29. Cromatograma (extracto de 50 g de arroz enmohecido) 72
Figura 30. Cromatograma (extracto de 20 g de arroz enmohecido) 72
Figura 31. Espectros de emisión de los extractos de 50 y 20 gramos de arroz 74
Figura 32. Comparación de la producción de aflatoxina B1 en 20 y 50 gramos de arroz por
ambos métodos 76
Figura 33. Comparación de los resultados hallados con respecto al método analítico
utilizado 76
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Valores de IC 50 de los extractos obtenidos de los diferentes procesos
evaluados por la técnica XTT 44
Tabla 2. Datos de la regresión lineal de las áreas obtenidas por HPLC 65
Tabla 3. Datos estadísticos de precisión y exactitud del método. 66
Tabla4. Datos estadísticos del porcentaje de recuperación 67
Tabla 5. Datos de la regresión lineal de la Intensidad a.u. obtenida por espectroscopia
de fluorescencia 68
Tabla 6. Datos estadísticos de precisión y exactitud del método 69
Tabla 7. Datos estadísticos del porcentaje de recuperación 69
Tabla 8. Tiempo de retención y áreas obtenidas por HPLC 73
Tabla 9. Concentraciones de aflatoxina B1 obtenidas por HPLC 73
Tabla 10. Picos de emisión y valores de Intensidad (a.u.) obtenidos por espectroscopia
de fluorescencia 74
Tabla 11. Concentraciones de aflatoxina B1 obtenidas por Espectroscopia de
fluorescencia 75
INDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Identificación macro y microscópica de la cepa 114QD 30
LISTA DE ABREVIATURAS
CCF Cromatografía en capa fina
HPLC Cromatografía líquida de alta resolución
CG Cromatografía de gases
CG-EM Cromatografía de gases acoplado a espectroscopia de masas
XTT Sodio(2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5sulfofenil)-2-H-tetrazolium-
5carboxanilide)
IC50 Concentración inhibitoria del 50%
Lma Leishmania amazonensis clon 1 (MHOM/BR/76/LTB-012)
DMSO Dimetilsulóxido
PMS Fenasin Metosulfato
PBS Tampón fosfato salino
Rf Factor de retención
Tr Tiempo de retención
2FQ 2-fenilquinolina
HR-ESI-MS High-resolution electrospray ionisation mass spectrometry
(Espectrometría de masas por ionización por electrospray de alta resolución)
EM Espectroscopia de masas
RMN Resonancia Magnética Nuclear
CAT Alcaloides totales de corteza de Galipea Longiflora (Evanta)
AND Ácido desoxirribonucleico
AFB1 Aflatoxina B1
ACN Acetonitrilo
DS Desviación estándar
CV Coeficiente de Variación
UV Ultravioleta
PDA Photodiode array detector (Detector de arreglo de fotodiodos)
FID Flame Ionization Detector (Detector de ionización de flama)
ppb Partes por billón
CAPITULO 1
Usos biomédicos de Aspergillus spp.
Caracterización química y biológica de los productos obtenidos de la
biotransformación del alcaloide antiparasitario 2-fenilquinolina
RESUMEN
Los procesos de biotransformación microbiana en la actualidad representan una
poderosa herramienta aplicable al campo de la biomedicina, biotecnología y química,
microorganismos como los hongos filamentosos han sido utilizados ampliamente en estudios
de biotransformación de fármacos y moléculas complejas de plantas.
En el presente trabajo, el alcaloide 2-fenilquinolina obtenido de la planta medicinal
Galipea longiflora fue el sustrato en procesos de biotransformación por la cepa 114QD
identificada como Aspergillus spp. La caracterización química realizada por cromatografía en
capa fina (CCF), cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y cromatografía de gases
(CG) permitió detectar la formación de un producto de biotransformación, el cual tiene
como características ser un compuesto de mayor polaridad con un espectro de absorción UV
diferente al del sustrato original, este producto presenta un desplazamiento batocrómico de
las bandas de absorción por sustitución por OH, un análisis acoplado a espectroscopia de
masas identificó de manera inequívoca la hidroxilación del anillo quinolínico al mostrar en su
espectro de masas un ión molecular a una relación de 221 m/z comparado con 205 m/z de la
2-fenilquinolina. Las técnicas cromatográficas permitieron además determinar que luego de
360 horas de incubación en Medio Basal para hongos, aproximadamente un 78% de sustrato
fue consumido. El análisis de las áreas en el tiempo para el producto formado mostro su
aumento de hasta 10 veces más al hallado durante las primeras horas de cultivo.
La actividad biológica frente a promastigotes de leishmania evaluada por el método
XTT, mostró valores de IC 50 diferentes a los del sustrato original que mejoran
considerablemente al utilizar en los procesos un co-sustrato como glucosa.
ABSTRACT
Microbial biotransformation processes nowadays represent a powerful tool applicable
to the field of biomedicine, biotechnology and chemistry; microorganisms such as
filamentous fungi have been widely used in biotransformation studies of drugs and complex
molecules of plants.
In this work, the alkaloid 2--phenylquinoline obtained from the medicinal plant
Galipea longiflora was the substrate in biotransformation processes by 114QD strain
identified as Aspergillus spp. Chemical characterization by thin layer chromatography (TLC),
high performance liquid chromatography (HPLC) and gas chromatography (GC) enabled to
detect the formation of a biotransformation product, which has as characteristics to be a
more polar compound with an UV absorption spectrum different from the original substrate
which has a bathochromic shift of the absorption bands for replacement by OH, an analysis
coupled to mass spectroscopy let to identify the hydroxylation of the quinoline ring showing
in its mass spectrum a molecular ion at 221 m/z compared to 205 m/z of the 2-
phenylquinoline. Chromatographic techniques also allowed determining that after 360 hours
of incubation in Basal Medium; approximately 78% of the substrate was consumed. The
analysis of the areas in time for the product formed showed an increase up to 10 times that
found in the early hours of culture.
Biological activity against promastigotes of Leishmania evaluated by XTT method, showed
IC 50 values different from the original substrate which considerably improved when using a
co-substrate such as glucose in the processes.
1. INTRODUCCIÓN
1
Los procesos de biotransformación microbiana en la actualidad representan una
poderosa herramienta biotecnológica aplicable al campo de la biomedicina, química e
industria, la cual está basada en la utilización de microorganismos como los hongos
filamentosos, los cuales poseen versátiles sistemas enzimáticos que les permiten modificar la
estructura química de diversas moléculas para generar no solo nuevos compuestos con
propiedades mejoradas, sino también utilizarlos para el estudio del metabolismo de drogas.
Hongos del género Cunninghamella y Aspergillus han sido utilizados ampliamente para
estudios de biotransformación de fármacos como el naproxeno (Zhong et al., 2003; Montoya
y Tataje, 2004) y la doxepina (Moody et al., 1999) obteniéndose metabolitos esencialmente
semejantes a los obtenidos en estudios realizados en humanos (Pinder et al.,1977; Shu et
al.,1990) y algunos metabolitos nuevos, estos procesos pueden ser utilizados como alternativa
emergente o complemento al uso de animales de experimentación y a las costosas pruebas
en líneas celulares.
La planta medicinal Galipea longiflora, conocida como Evanta entre las etnias
asentadas en la Amazonía Boliviana (Bourdy et al., 2000; Fournet et al., 1993), es
ampliamente empleada para el tratamiento de Leishmania y diarreas causadas por parásitos
intestinales. Su actividad biológica es atribuida a un grupo de alcaloides quinolínicos
obtenidos de los extractos crudos de corteza del tronco, corteza de raíz y hojas de la planta,
siendo la 2-fenilquinolina (1) el alcaloide mayoritario.
Figura 1. 2-fenilquinolina (1)
Se han llevado adelante distintos estudios relacionados a la biodisponibilidad de los
alcaloides de la Evanta, sin embargo hasta ahora no se ha podido establecer de manera
confiable aspectos referentes a la fármaco-cinética y fármaco-dinámica de estos compuestos
en concordancia con hallazgos de diversos autores.
2
En el presente trabajo, el alcaloide 2-fenilquinolina fue el sustrato en procesos de
biotransformación por hongos filamentosos, la cepa 114QD (Aspergillus spp.) fue
seleccionada del cepario del IIFB por su capacidad de utilizar esta molécula como única
fuente de carbono y nitrógeno para su desarrollo y crecimiento. Se conoce que distintas
cepas de Aspergillus presentan versátiles sistemas enzimáticos, lo que permite a estos
microorganismos modificar la estructura química de moléculas complejas presentes en una
variedad de plantas (Suchita et al., 2009; Correa et al., 2011; Aguirre-Pranzoni et al., 2011),
llevando a cabo reacciones de hidroxilación, metilación, reducción e hidrólisis (Velasco et al,
2009).
El consumo de 2- fenilquinolina y la formación de productos derivados de este
proceso fueron evaluados y analizados por cromatografía en capa fina (CCF), cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC) y cromatografía de gases (CG). Un análisis acoplado a
espectrometría de masas fue realizado con el fin de identificar inequívocamente los
productos formados. Un seguimiento de la actividad antiparasitaria de los extractos obtenidos
se llevó a cabo para identificar cambios de la actividad biológica con respecto al sustrato
original.
2. ANTECEDENTES
3
2.1 Hongos filamentosos
Los hongos filamentosos son microorganismos eucariotas, heterótrofos, acidófilos,
aerobios, con temperaturas de crecimiento en intervalos que comprenden entre los 0°C y
55°C, crecen lentamente entre 5 a 7 días (Cortés y Mosqueda ,2013; Arias y Piñeros, 2008).
Su pared celular está formada por polisacáridos, polipéptidos y quitina, esta pared es rígida
por lo cual no pueden fagocitar partículas alimenticias sino que absorben nutrientes simples y
solubles que obtienen al desintegrar polímeros mediante enzimas extracelulares llamadas
despolimerasas (Arenas, 1993).
La estructura fúngica consta de un complejo llamado talo o micelio que a su vez está
constituido por múltiples filamentos o hifas (hyphomycetos o mohos), la mayor parte de
estos hongos son inmóviles no obstante algunos pueden tener células reproductoras móviles
(Arenas, 1993). Las esporas son cuerpos resistentes que forman los hongos en estado latente
o de reposo, que se producen de dos maneras diferentes sexual y asexualmente (Moreno,
2000). Los organismos fúngicos pueden ser afectados en su forma de crecimiento al ser
expuestos a diferentes condiciones de estrés ya sea nutricional o ambiental generando
fenómenos como el dimorfismo (Arenas, 1993).
Fisiológicamente los hongos filamentosos se adaptan a condiciones más severas que
otros (Moreno, 2000). La glucosa representa la fuente de carbono de mayor
aprovechamiento para muchos de ellos, aunque algunos pueden utilizar otros compuestos de
carbono orgánico más complejos como almidón, celulosa, flavonoides, terpenos, cumarinas,
aromáticos, etc. Nitrógeno, potasio, fosforo, magnesio, azufre, calcio y vitaminas son otros
macronutrientes requeridos por estos microorganismos para su crecimiento, algunos
requieren además micronutrientes como el hierro, molibdeno, cobre y zinc (Kendrick,
2000).
Existen procesos metabólicos en la célula enfocados a la proliferación y crecimiento
celular denominado metabolismo primario, que incluye todas las rutas bioquímicas e
intermediarios (metabolitos primarios) en la obtención de energía, la reproducción celular y
viabilidad. Estos intermediarios son producidos en la etapa activa de crecimiento o fase
4
exponencial en la curva de crecimiento microbiano, siendo algunos de ellos ácidos orgánicos,
vitaminas, aminoácidos, entre otros. Pero también existen procesos metabólicos que incluyen
al metabolismo secundario el cual produce compuestos que comúnmente son excretados al
medio donde crece la célula y que no poseen una importancia vital para la misma,
obteniéndose a partir de la energía, intermediarios o productos finales del metabolismo
primario principalmente en etapas donde el crecimiento es lento y sostenido. La biosíntesis
de metabolitos secundarios ocurre generalmente debido a condiciones de agotamiento de
nutrientes en el medio, diferenciación y esporulación. Algunos ejemplos de metabolitos
secundarios generados en estos escenarios son los antibióticos, toxinas, alcaloides, entre
otros, los cuales presentan características comunes como la actividad biológica
(antimicrobianos, inmunomoduladora, toxoide, antitumorales, antivirales, etc.) la cual es
considerada una ventaja para el productor con respecto a sus competidores naturales por la
supervivencia en determinado nicho ecológico. Estos compuestos generalmente son de bajo
peso molecular, estereoquímica específica, y complejidad química estructural (Cortés y
Mosqueda, 2013).
Las funciones de los metabolitos secundarios no están del todo comprendidas; al ser
sintetizados en condiciones de estrés nutricional y cuando el crecimiento se ha detenido, se
cree que realizan funciones de activación de rutas biosintéticas alternas a las que dan origen a
metabolitos primarios. (Cortés y Mosqueda, 2013; Pares y Juárez, 2002)
2.1.1 Hongos del género Aspergillus spp.
Las especies del género Aspergillus, son consideradas de gran importancia en las
actividades humanas, han sido descritas unas 200 especies y una gran cantidad de variedades.
El color es la principal característica macroscópica para la identificación de los grupos de
aspergilos, poseen distintos tonos de verde, pardo, amarillo, blanco, gris y negro y a simple
vista las más grandes suelen parecer diminutos alfileres sobre el substrato (Kozakiewicz,
1989).
5
Los conidióforos de Aspergillus terminan en un hinchamiento llamado vesícula, a
partir de la cual nace en su superficie una hilera de fiálides productoras de cadenas de
conidios, a la vesícula junto con las cadenas de conidios se le conoce como cabeza conidial.
(Herrera, 1998). En los aspergilos, los conidios constituyen cadenas que se originan en la
célula conidiógena o fiálide. En algunos aspergilos hay células adyacentes a las fiálides
denominadas métulas o células de soporte. Los Aspergillus poseen una o dos series de
células sobre la vesícula, o bien presentan simultáneamente cabezas de ambos tipos. Las
cabezas conidiales presentan bajo el microscopio cuatro formas básicas: globosa, radiada,
columnar o claviforme (Kozakiewiez, 1989).
Figura 2. Características macro y microscópicas del género Aspergillus.
Fuente www.gefor.4t.com/hongos/aspergillusterreus.html
6
Los aspergilos son de los hongos más omnívoros que existen, capaces de asimilar
como alimento una enorme variedad de sustancias, debido al gran número de enzimas que
pueden producir para degradarlas. Los dos requisitos principales que deben tener los
diferentes sustratos para que se desarrollen estos hongos son la presencia de algún tipo de
materia orgánica y un poco de humedad; si ambos factores están presentes, los aspergilos
pueden crecer en casi cualquier sustancia, afectando el bienestar del hombre lo que ocurre
con las micotoxinas (Herrera, 1998), sin embargo esta adaptabilidad a cualquier sustrato y
condición ambiental puede ser aprovechada para procesos de biorremediación o
biotransformación beneficiosos para el hombre y el medio ambiente.
A. flavus
A. candidus
A. fumigatus
A. niger
A. versicolor
A. terreus
A. oryzae
A. ochraceous
A. parasiticus
Figura 3. Principales especies del género Aspergillus. Fuente: www.plantasyhongos.es/hongos/Aspergillus.htm
7
2.2 Aspectos generales de los procesos de biotransformación
Los procesos de biotransformación se definen como la utilización de
microorganismos completos o sus enzimas para realizar modificaciones estructurales sobre
compuestos exógenos, sin embargo las enzimas puras son escasas y tienen un alto valor
económico, por lo cual se presenta una gran preferencia por los sistemas biológicos
completos (Borges et al., 2008). En los microorganismos se hallan enzimas constitutivas las
cuales son producidas con el crecimiento celular. Si las enzimas no son constitutivas su
formación en microorganismos puede ser algunas veces inducidas por sustrato de interés o
por compuestos relacionados. Las enzimas inducidas pueden catalizar una variedad de
reacciones sobre los inductores, sustratos y aun componentes no relacionados. (Montoya y
Tataje, 2004).
La biotransformación es un ejemplo impresionante de la capacidad de los
microorganismos para alterar solo uno de muchos grupos funcionales mediante:
Reacciones de regio-especificidad: la enzima conduce una única reacción de tal
manera que lo realiza en un lugar determinado de la molécula
Reacciones de estéreo-selectividad: las enzimas pueden distinguir entre los
enantiómeros de un racemato en que ellas convierten exclusivamente o de
preferencia, solo una de las dos formas enantioméricas.
2.3 Procesos de biotransformación por hongos filamentosos
Los hongos filamentosos son los principales microorganismos utilizados en los
procesos de biotransformación, debido a la habilidad natural que poseen para modificar
compuestos orgánicos complejos como los presentes en las plantas durante su proceso de
colonización, entre estos compuestos están los terpenos, cumarinas, estibenos, fenilpropanos,
compuestos aromáticos y flavonoides, y en algunas ocasiones para hacer frente a los
mecanismos de defensa del huésped como la destoxificación de por ejemplo fitoalexinas.
Algunas especies de hongos pueden metabolizar sustancias xenobióticas, tales como
pesticidas y colorantes entre otros. Las células completas de los hongos filamentosos se
emplean frecuentemente debido a su habilidad para mediar en muchas reacciones
8
diferentes, incluyendo transformaciones oxidativas (hidroxilación, epoxidación,
dehidrogenación), reductivas, hidrolíticas y de isomerización sobre un amplio rango de
sustratos (Velasco et al., 2009).
Reacciones
Oxidativas
Hidroxilación
Dehidrogenación
Reacciones Reductivas
Reacciones Hidrolíticas
Esquema 1. Tipos de biotransformaciones realizadas por hongos filamentosos
Modificado de: es.slideshare.net/shishirkawde/biotransformation-10417087
9
2.3.1 Aplicaciones industriales de los procesos de biotransformación por hongos
Las biotransformaciones por hongos filamentosos son bastante empleadas en la
industria un ejemplo de esto es la obtención de esteroides como la cortisona a partir del uso
de hongos como Rhizopus sp., Aspergillus sp., Curvularia sp., y Cunninghamella sp., los
cuales son capaces de realizar hidroxilaciones en los carbonos 11α-, 11β- y 16α de la
molécula de progesterona (un intermediario en la síntesis de la cortisona), eliminando así 10
a 12 pasos de la síntesis convencional (Esquema 2). Gracias a esto, la mayoría de esteroides
que se fabrican hoy en día se hacen mediante un proceso mixto de biotransformación
microbiana y transformaciones químicas (Fernandes et al., 2003).
Esquema 2. Hidroxilación de la progesterona por hongos filamentosos
A partir de la oxidación de monoterpenos se obtienen epóxidos, aldehídos, cetonas,
ésteres y éteres, los cuales son intermediarios en la preparación de cosméticos, productos
farmacéuticos, agroquímicos, sabores y fragancias. Las biotransformaciones más efectivas de
monoterpenos como el limoneno y el α pineno han sido realizadas con hongos de los
géneros Aspergillus y Penicillium, ya que sus características los hacen catalizadores
difícilmente superables gracias a su resistencia ambiental y química, abundancia, y poder
transformador de sustratos difíciles, con alta selectividad (Castellanos et al., 2007; De
Carvalho et al., 2006).
Mediante la transformación microbiana del Limoneno y el α pineno se generan derivados
como el carveol, carvona, linalol, terpineol, verbenol y verbenona (Esquema 3), los cuales
10
tienen un mayor valor agregado que el sustrato inicial (Prieto et al., 2011 ; Rojas et al., 2009;
Castellanos et al., 2007; Barrera et al., 2008).
Esquema 3. Transformación por hongos filamentosos de los monoterpenos limoneno y α pineno
Modificado de: Prieto et al., 2011; Barrera et al., 2008
11
Aspergillus niger es utilizado como biocatalizador para la obtención del
hidroxicitronelol (Esquema 4), el cual es obtenido químicamente a partir del alcohol
monotérpenico citronelol, este alcohol se encuentra en concentraciones de hasta el 80% en
los aceites de rosa y geranio y es empleado en la industria cosmética y alimenticia como
aromatizante.(Lozano et al., 2007)
Esquema 4. Biotransformación del citronelol por Aspergillus niger
Fuente: Lozano et al., 2007
2.3.2 Aplicaciones Biomédicas de los procesos de biotransformación por hongos
Antes que un fármaco sea aprobado para el uso en humanos requiere de amplios
estudios para establecer su eficacia y seguridad. En la actualidad, microorganismos como los
hongos filamentosos son utilizados como un complemento al uso de animales de
experimentación y a las costosas pruebas en líneas celulares, los cuales son empleados en
estudios de farmacocinética y farmacodinamia. Esto se debe no solo a que los hongos poseen
versátiles sistemas enzimáticos, sino también a que estos microorganismos pueden imitar
cualitativamente la transformación metabólica de fármacos en humanos y animales de
experimentación. (Montoya y Tataje, 2004).
Hongos del género Cunninghamella y Aspergillus han sido utilizados ampliamente
para estudios de biotransformación de ciertos fármacos como el naproxeno (Zhong et al.,
2003; Montoya y Tataje, 2004) y la doxepina (Moody et al., 1999). El naproxeno fármaco
empleado como antiinflamatorio es transformado por especies del género Cunninghamella a
dos metabolitos presentes también humanos, el demetilnaproxeno (metabolito de fase I)
(Runkel et al., 1973) y el demetilnaproxeno-6-O-sulfato (metabolito de fase II) (Kiang et al.,
12
1989), Aspergillus transforma también el naproxeno a demetilnaproxeno y a un derivado
hidroxilado el 7-hidroxi-6-demetilnaproxeno (Esquema 5) (Montoya y Tataje, 2004)
Esquema 5. Biotransformación del naproxeno por especies de Cunninghamella y Aspergillus.
Modificado de: Zhong et al., 2003; Montoya y Tataje, 2004
La Doxepina, una droga antidepresiva producida como una mezcla de las formas cis
(E) y trans(Z) es transformada por el hongo Cunninghamella elegans a (E)-2-
hidroxidoxepina, (E)-2-hidroxi-N-desmetildoxepina, (E) y (Z) doxepin-N-oxido y (E) y (Z)- N
--desmetildoxepina los cuales son metabolitos esencialmente semejantes a los obtenidos en
estudios realizados en humanos ( Pinder et al.,1977; Shu et al.,1990; Moody et al.,1999),
13
Esquema 6. Biotransformación de la doxepina por Cunninghamella elegans
Modificado de: Moody et al., 1999
2.4 Biotransformación de principios activos de plantas medicinales
Los principios activos de las plantas medicinales son moléculas resultantes del
metabolismo celular de las plantas, unas son principios inmediatos como los azúcares,
proteínas o lípidos, pero la mayoría de ellas son metabolitos secundarios producidos en
diferentes rutas metabólicas. La investigación científica ha permitido descubrir una variada
gama de principios activos, de los cuales los más importantes desde el punto de vista de la
salud, son los aceites esenciales, los glucósidos o heterósidos, terpenoides, polifenoles, los
mucílagos, gomas y alcaloides (Pengelly, 1996).
Se han documentado biotransformaciones de principios activos de plantas, empleando
hongos filamentosos (Shibuya et al., 2002; Torrenegra, 2003) tal es el caso de los hongos del
género Aspergillus sp. que participan en procesos de biotransformación de moléculas como
la Artemisinina, componente activo antimalárico aislado de las partes aéreas de Artemisia
annua ( Familia: Asteraceae) a Deoxiartemisinina (Esquema 7). (Suchita et al., 2009.)
14
Esquema 7. Biotransformación de Artemisina por Aspergillus flavus
Modificado de: Suchita et al., 2009
Otro estudio revela que Aspergillus flavus aislado como endofítico de la planta del
Paspalum maritimum Trin fue evaluado por su potencial aplicación en reacciones de
biotransformación de chalconas. La importancia de las chalconas radica en que poseen un
amplio espectro de acción, tal como actividad antiviral, antiinflamatoria y antibacteriana
(Esquema 8). (Corrêa et al., 2011)
Esquema 8. Biotransformación de chalconas por Aspergillus flavus
Modificado de: Corrêa et al., 2011
15
Aspergillus niger y Aspergillus ochraceus han sido evaluados por su capacidad de
metabolizar cumarinas, compuestos producidos como metabolitos secundarios por plantas
de familias como la Apiaceae y Rutaceae, las cuales tienen una vasta aplicación como
agentes antioxidantes, antiinflamatorios, antivirales y anticoagulantes (Aguirre-Pranzoni et al.,
2011).
Esquema 9. Biotransformación de dihidrocumarinas por especies de Aspergillus sp.
Modificado de: Aguirre-Pranzoni et al., 2011).
2.5. Galipea longiflora (Evanta)
La planta medicinal Galipea longiflora Krause (Familia: Rutáceae), conocida como
Evanta entre las etnias Tacana, Moseten y Tsimane, empleada frecuentemente como
fortificante en niños y en adultos, es además utilizada en el tratamiento de diarreas causadas
por parásitos intestinales, así como en el tratamiento de la Leishmania o espundia (Bourdy et
al., 2000; Fournet et al., 1993)
16
Otros autores han demostrado que esta clase de alcaloides presentan una amplia
gama de actividades biológicas in vitro, como tripanocida, antiretroviral, antiplasmodial,
nematicida, tricomonicida y antimicobacteriana además de una serie de actividades
farmacológicas in vivo, como un efecto gastro-protector y antinociceptivo (Nakayama et al.,
2001; Mekouar et al., 1998; Gantier et al., 1996; Aguinaldo et al., 2007; Zanatha et al., 2009;
Campos et al., 2010). Estudios preliminares de seguridad pre-clínica referente a evaluaciones
in vitro de eficacia y frente a parásitos de Leishmania han permitido llevar a esta especie a
estudios de validación clínica (Herrera, 2008; Giménez et al., 2005).
La actividad biológica antiparasitaria de Galipea longiflora Krause, es atribuida a un
grupo de alcaloides quinolínicos obtenidos de los extractos crudos de corteza del tronco,
corteza de raíz y hojas de la planta, siendo la 2-fenilquinolina, el alcaloide mayoritario, este
compuesto representa más del 50% en peso de los alcaloides totales, que representan cerca
del 2% en relación al peso de la planta seca (Ticona, 2008). El compuesto 2-fenilquinolina
está acompañado por hasta 13 derivados caracterizados con sustituyentes alquílicos y/o
arílicos en posición 2 y con presencia, o no, de un grupo metoxilo en la posición 4
(Espinoza, 2012). La 2- fenilquinolina puede ser purificada por precipitación selectiva y re-
cristalización de una mezcla de etanol-agua, a partir de los alcaloides totales CAT.
2-Fenilquinolina
R1=Aril/Alquil y R2= H/OMe
Figura 4. Estructura química de la 2- fenilquinolina y derivados alquílicos y/o arílicos
17
2.5.1 Estudios de Biotransformación de Galipea longiflora (Evanta)
Los procesos de biotransformación de alcaloides quinolínicos sustituidos en la
posición C-2, como es el caso de la 2-fenilquinolina, principio activo mayoritario de Galipea
longiflora (Evanta) hasta ahora son desconocidos.
A pesar de haber llevado adelante distintos estudios relacionados a la
biodisponibilidad, de los alcaloides de la Evanta, no se ha podido establecer de manera
confiable aspectos referentes a la fármaco-cinética y fármaco-dinámica de estos alcaloides.
Hallazgos de diversos autores, quienes se centraron en obtener parámetros fármaco-
cinéticos sobre quinolinas sustituidas en la posición 2, no han proporcionado resultados
satisfactorios y se ha comprobado que algunas de estas quinolinas, no suelen ser detectadas
en plasma sugiriendo un secuestro, de estos compuestos, por componentes de la sangre. La
hipótesis de un rápido metabolismo de estos alcaloides fue planteada debido a que
resultados de estudios in vivo, mostraron que este tipo de compuestos no pueden ser
detectados 30 minutos o una hora después de la administración oral, o 5 minutos después de
la administración intravenosa, sugiriendo también una vida media corta de esta clase de
compuestos (Vieira et al., 2008).
Durante la búsqueda de información sobre el metabolismo microbiano de quinolinas
se han documentado hasta el momento estudios con bacterias (Esquema 10), diversos
autores han demostrado que el primer paso de la biotransformación de la quinolina tiene
lugar en la posición 2 del anillo nitrogenado, mediante reacciones de hidroxilación se genera
el compuesto 2-hidroxiquinolina, independientemente de la especie bacteriana utilizada. A
partir de la formación de la 2 hidroxiquinolina Pseudomonas nitroreducens por ejemplo, es
capaz de remover el nitrógeno modificando así el núcleo quinolínico, dando como resultado
de dicho proceso, estructuras de cumarina como la 8 hidroxicumarina. (Ribeiro et al., 2005),
bacterias del género Comamonas sp (Mingchao et al., 2004), Rhodococcus sp. y distintas
especies de Pseudomonas (Kaiser et al., 1996 ; Shukla, 1986) muestran su capacidad de
utilizar la quinolina para generar diversos derivados aromáticos nitrogenados, entre los que
se ha caracterizado el compuesto 5-hidroxi-6-(3-carboxi-oxopropenil)-1H-2-piridona.
18
Esquema 10. Biodegradación Bacteriana de Quinolina
Modificado de: Mingchao et al., 2004; Ribeiro et al., 2005; Kaiser et al., 1996; Shukla, 1986
19
Quinolinas sustituidas como la metilquinolina son particularmente resistentes al
ataque microbiano y bacterias como Pseudomona sp. han demostrado ser capaces de
producir derivados hidroxilados, generando la 2-hidroxi-6-metilquinolina (Aislabie et
al.,1990; Rothenburger et al., 1993) (Esquema 11).
Esquema 11. Biodegradación de 6-metilquinolina
Modificado de: Rothenburger et al., 1993
Si bien no se han encontrado referencias sobre procesos de biotransformación de
quinolinas por hongos filamentosos, hongos de los géneros Colletotrichum, Cunninghamella,
Penicillum y Aspergillus poseen la habilidad natural de transformar xenobióticos y
compuestos presentes en plantas, como terpenos, cumarinas y aromáticos sustituidos.
3. OBJETIVOS
20
3.1 Objetivo General
Determinar las características químicas y biológicas de los productos de la
biotransformación del alcaloide antiparasitario 2-fenilquinolina por la cepa 114QD.
3.2 Objetivos Específicos
Determinar la tolerancia de la cepa 114QD al alcaloide 2-fenilquinolina.
Evaluar el proceso de biotransformación del alcaloide mediante el establecimiento de
cultivos Batch y procesos de escalamiento (Scale up).
Caracterizar químicamente los productos de biotransformación de la 2- fenilquinolina
por cromatografía en capa fina (CCF).
Analizar los productos de biotransformación de la 2-fenilquinolina por cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC) y cromatografía de gases (CG)
Evaluar la eficacia del proceso por HPLC y cromatografía de gases (CG).
Identificar los productos de biotransformación por cromatografía de gases acoplada a
espectroscopia de masas (CG-EM).
Caracterizar biológicamente los productos de biotransformación de 2-fenilquinolina
mediante la evaluación de la actividad antiparasitaria por el método XTT.
4. METODOLOGIA
21
22
4.1 Activación de la cepa 114 QD
La cepa 114QD proveniente del cepario del Instituto de Investigaciones Fármaco
Bioquímicas (I.I.F.B), fue reactivada en Caldo Papa Dextrosa (Anexo 1) e incubada a 30°C
hasta su desarrollo.
4.2 Obtención de colonias puras
Las colonias provenientes del Caldo Papa Dextrosa fueron transferidas a cajas petri
(100 x 20 mm) conteniendo 25 ml de Agar Papa Dextrosa (Anexo 1) y cloranfenicol, a partir
de estos cultivos se realizaron varias resiembras hasta la obtención de colonias puras, cada
medio fresco se inoculó con discos de micelio de 5 mm de diámetro en la parte central.
Todos los cultivos se incubaron por un periodo de 168 horas a 30° C.
4.3 Identificación Macroscópica y Microscópica
4.3.1 Examen macroscópico en placa
La identificación de la cepa 114QD se realizó por el examen macroscópico en placa
mediante la observación de las características morfológicas y de pigmentación de la colonia
(micelio) a ambos lados de la caja petri.
4.3.2 Examen microscópico en portaobjetos
Para la identificación microscópica se apoyó el lado engomado de un trozo de cinta
adhesiva transparente sobre la superficie del micelio, luego se observó en el microscopio
utilizando el aumento 40X.
23
4.4 Estudios de tolerancia de la cepa 114QD al alcaloide 2-fenilquinolina
(Prueba de toxicidad por el método de Mitscher)
Con la finalidad de conocer la cantidad máxima de 2-fenilquinolina que se podía
suministrar en cada proceso sin que ésta afecte en mucha extensión el proceso normal de
desarrollo de la cepa se aplicó el método de Mitscher que fue modificado para este trabajo
en base a los objetivos propuestos. La metodología de esta prueba se detalla a continuación.
4.4.1 Preparación de las soluciones de 2-fenilquinolina y controles
Para esta prueba se prepararon soluciones de 2-fenilquinolina a concentraciones de
0,025, 0,050, 0,1 y 0,2 mg/ml, como control positivo de inhibición se utilizaron soluciones de
Anfotericina B a concentraciones de 1,25, 2,5, 5, 10 µg/ml. Se evaluó también el posible
efecto inhibitorio del disolvente DMSO a concentraciones de 2, 1, 0,5 y 0,25%.
4.4.2 Preparación del medio de cultivo y llenado de la placa
Se utilizaron microplacas de 24 pozos denominadas TC24 (Greiner), a cada pocillo
se colocó 1 ml de cada solución preparada de 2-fenilquinolina, Anfotericina B (Sigma) y
DMSO y se mezcló con 1ml de Medio Basal para hongos al cual se le adicionó agar al 1,5%
(Anexo 1), se esperó a que la mezcla gelifique y se inoculó cada pocillo con una solución de
esporas a concentración de 1x 106
esporas/ml. Como control negativo de inhibición se colocaron
2 ml del medio con esporas y sin alcaloide. La distribución de las soluciones de 2-fenilquinolina
y los distintos controles en las placas se detalla en la siguiente figura.
0,025 mg/ml
0,1 mg/ml
0,050 mg/ml
0,2 mg/ml 10 µg/ml
5 µg/ml
2,5 µg/ml
1,25 µg/ml
1%
2%
0,5 %
0,25 %
DMSO
24
4.4.3 Lectura de la microplaca
La observación del crecimiento o inhibición se realizó a las 168 y 360 horas de
incubación, comparando con los controles positivos y negativos. La lectura es cualitativa con
respecto a la población fúngica y cuantitativa con respecto al sustrato.
4.5 Cinética de crecimiento de la cepa 114QD
4.5.1 Técnica peso seco celular
Para la determinación de la cinética de crecimiento del microorganismo en un medio
con 2-fenilquinolina, se llevo a cabo la técnica de peso seco celular, se emplearon tubos
falcón de 50 ml conteniendo 0,5 mg de 2-fenilquinolina en 20 ml de Medio Basal para
hongos para una concentración final de 0,025 mg/ml, todos los tubos se incubaron a 30°C y
agitación de 100 rpm por 360 horas. La determinación del peso seco celular se realizó por
filtración en membranas de nitrocelulosa con un tamaño de poro 0,2 µm pre pesadas, las
células retenidas en el filtro se lavaron con solución fisiológica al 0,9% y los filtros se
colocaron en un horno por 6 a 10 horas a 105°C, una vez secos los filtros se pesaron
nuevamente, las muestras se tomaron hasta peso constante.
4.6 Establecimiento de los procesos de biotransformación
4.6.1 Preparación de las suspensiones de esporas
Para la obtención de las suspensiones de esporas, se inocularon discos de micelio de
5 mm a tubos de cultivo (16 x 160 mm) en pico de flauta conteniendo 15 ml de Agar Papa
Dextrosa, los tubos se incubaron por 168 horas a 30°C.
Finalizado el tiempo de incubación se añadieron 5ml de solución fisiológica al 0,9%
(Anexo 1) a los tubos de cultivo en pico de flauta, se mezcló por inversión cada tubo hasta
lograr resuspender las esporas en la solución. Todas las soluciones de esporas se ajustaron a
una concentración de trabajo de 1x106
esporas/ml mediante el recuento de esporas.
25
4.6.2. Recuento de esporas
Para el recuento de esporas, se realizaron diluciones 1/10 con solución fisiológica al
0,9% a partir de las soluciones concentradas para un volumen final de 5 ml, posteriormente
se tomó 20 µl de cada dilución procediendo al recuento en cámara de Thoma de la siguiente
manera:
Con el objetivo 10X del microscopio se enfocó la zona de recuento, para poder
contar las células se cambió al objetivo 40X. Se contaron las células contenidas en 16
cuadrados de acuerdo con el siguiente criterio:
S
Se contó y sumó todas las células que se encontraban dentro de los 16 cuadrados
incluyendo aquellas esporas que estaban tocando los lados superior y derecho de dichos
cuadrados. Una vez que se realizó el recuento la concentración de esporas en cada muestra
se calcula aplicando:
N x 104
espora/ml Donde N (es el total de células contadas en los 16 cuadrados
medianos)
En nuestro caso preferimos diluir las muestras para facilitar el recuento, por lo que se
tuvo que tener en cuenta el factor de dilución (f) al momento de calcular la concentración de
esporas según: Donde f (es el factor de dilución que en nuestro caso es 10)
N x 104
x f espora/ml
26
4.6.3 Cultivos Batch y procesos de Escalamiento (Scale up)
Los procesos de biotransformación fueron llevados a cabo en cada oportunidad en
matraces Erlenmeyer de 250 y 1000 ml conteniendo 50 y 300 ml de Medio Basal para
hongos respectivamente. Las cantidades del alcaloide 2 -fenilquinolina a añadir fueron 1,25
mg en 50 ml y 7,5 y 15 mg para 300 ml para alcanzar concentraciones finales de trabajo de
0,025 y 0,050 mg/ml. Cada matraz de 250 ml se inoculó con 200 µl de una solución de
esporas a una concentración de 1 x 10 6
esporas/ml, para los matraces de 1000 ml se
utilizaron 1200 µl de esta solución. Todos los cultivos fueron incubados a 30°C y en agitación
constante a 100 rpm por un periodo máximo de 360 horas. Controles del proceso fueron
procesados de la misma forma. Se adiciono al medio con 0,050 mg/ml de 2-fenilquinolina
glucosa al 1% el cual fue utilizado como co-sustrato en este proceso.
4.7 Obtención de extractos
Finalizado el tiempo de incubación la biomasa (micelio) formada se separó de los
medios de cultivo mediante filtración, los filtrados obtenidos se extrajeron en un sistema
continuo líquido- líquido con acetato de etilo por 3 veces, el extracto orgánico obtenido se
secó con NaCl, se filtró y concentró por evaporación del solvente en rotavapor
(Janke&Kunkel IKA), el extracto obtenido se transfirió a viales adecuadamente marcados y
pesados que se almacenaron hasta su procesamiento.
4.8 Caracterización química de los productos de biotransformación
4.8.1 Análisis por cromatografía en capa fina (CCF)
Los extractos obtenidos en cada proceso de biotransformación fueron sometidos a
CCF en placas de silicagel 60 F254 (Whatman) empleando un sistema de elusión compuesto
por CH2Cl2: MeOH (95:5), las placas fueron reveladas bajo luz UV a 254 y 366 nm. La
corrida de los extractos se realizó siempre junto a un patrón de 2-fenilquinolina para la
comparación de Rf´s.
27
4.8.2 Análisis por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
Los extractos se analizaron en el I.I.F.B. por HPLC en un equipo Waters serie 1525
de bomba binaria con detector PDA modelo 2996 bajo las siguientes condiciones
experimentales:
4.8.3 Análisis por cromatografía de gases (CG)
Los metabolitos volátiles y semivolátiles presentes en los extractos se analizaron por
cromatografía de gases en el I.I.F.B. empleando un cromatografo CLARUS 500 (Perkin
Elmer), bajo las siguientes condiciones de trabajo:
Columna SUPELCO Columna capilar de matriz polifásica
(5% difenil- 95% polisiloxano)
(0,32 mm x 0,25 µm x 30 m)
Temperatura del Horno:
Inicial
Razón de calentamiento
Final
50°C (5 min)
5°C/min
250°C (10 min)
Inyector 250°C
Flujo gas carrier H2 0,5 ml/min
Detector de ionización de flama (FID) 270°C
Columna SUPELCO C18 (150 mm x 4,6 mm) 5 µm
Temperatura del horno 30°C
Detector Detector de arreglo de fotodiodos (PDA)
Fase móvil MeOH/Agua (85:15 v/v)
Flujo 1 ml/min (isocrático)
Volumen de inyección 20 µl
Tiempo de corrida 10 min
28
4.8.4 Análisis por cromatografía de gases acoplado a espectroscopia de masas (CG-EM)
Los extractos se analizaron por CG-EM en el Centro de Tecnología Agroindustrial
(CTA) de la UMSS en un equipo Shimadzu con detector de masas (bajo las siguientes
condiciones experimentales:
4.9 Caracterización biológica de los productos de biotransformación
La caracterización biológica de los extractos se desarrolló en el I.I.F.B.
4.9.1 Evaluación de la actividad antiparasitaria: Método colorimétrico XTT
La actividad de las muestras se midió sobre cultivos in vitro del estadio promastigote
de Leishmania: complejo L. amazonensis clon 1 Lma (MHOM/BR/76/LTB-012),
complejo L. braziliensis (M2904 C192 RJA), cultivados durante 72 horas a 26°C en medio
Schneider suplementado al 5% con suero bovino fetal inactivado (56°C x 30 min). Parásitos
Columna Carbowax (0,25 µm x 30 m).
Temperatura del Horno:
Inicial
Razón de calentamiento
Final
40°C (5 min)
2°C/min
220°C (25 min)
Flujo 1,78 ml/min
Inyector 250°C
MS tiempo de inicio 2 min
Tiempo de finalización 120 min
Velocidad del barrido:
m/z inicial
m/z final
15
400
Temperatura de la fuente de iones 250°C
Ganancia del detector 0,7 KV
29
en fase de crecimiento logarítmico fueron distribuidos en microplacas de 96 pozos a una
concentración de 1x106
parásitos/ml, cada pozo fue tratado con diferentes concentraciones de
los extractos (100, 50 y 25 µg/ml). Se utilizó, una solución de XTT 1mg/ml disuelto en buffer
fosfato salino (PBS) pH 7.0 se incubó durante 10 minutos a 37o
C, y se añadió PMS (Sigma-
Aldrich) 0.06 mg/mL suspendido en PBS pH 7.0. Las lecturas se realizaron a 450 nm en
StatFax (Model 2100 series-Plate Reader). Los resultados de actividad leishmanicida fueron
expresados en valores de IC50 (concentración de la droga que inhibe el 50% del desarrollo
del parásito), obtenido mediante una típica curva dosis respuesta (log de la concentración de
la droga vs % de inhibición), como factor de tratamiento se realizó tres replicas y un control
de parásitos más DMSO al 1%, para evaluar la viabilidad y un control de parásitos con
Anfotericina B.
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
30
5.1. Activación de la cepa de trabajo
Se logró activar y purificar exitosamente la cepa 114QD que fue seleccionada del
cepario del I.I.F.B por su capacidad de crecer con 2-fenilquinolina.
5.2 Identificación macroscópica y microscópica de la cepa 114QD
La identificación de la cepa 114QD se realizó mediante el examen macroscópico en
placa y el examen microscópico por la técnica de la cinta pegante (Arias y Piñeros, 2008;
Ciancas et al., 2005), las muestras para el examen microscópico se tomaron entre el tercer y
cuarto día de crecimiento del frente hifal, lo cual permitió evaluar con mayor facilidad la
morfología de la colonia, las características se detallan en el siguiente cuadro.
CEPA 114QD Aspergillus spp.
Análisis Macroscópico
Colonias de color amarillo a amarillo verduzco que
permanecen verdes con el tiempo, aspecto arenoso
Análisis Microscópico
Vesículas redondas, esporulación en toda la superficie, conidióforos rugosos, cabezas conidiales radiales.
Cuadro 1. Identificación macro y microscópica de la cepa 114QD.
31
5.3 Evaluación de la toxicidad del sustrato 2-fenilquinolina frente a la cepa 114QD
En la figura 5 se presenta el comportamiento de la cepa 114QD frente a diferentes
concentraciones del sustrato 2-fenilquinolina. Finalizado el tiempo de incubación, se pudo
observar crecimiento solo a la concentración de 0,025 mg/ml, se tomó una muestra y se
observó por microscopía comprobando el desarrollo de la cepa. En el control positivo de
inhibición que fue Anfotericina B no se observó desarrollo alguno a ninguna concentración
de este.
Figura 5.Prueba de toxicidad de 2-fenilquinolina
5.4 Cinética de crecimiento de la cepa 114QD
El crecimiento de una población microbiana, dentro de un sistema por lote,
generalmente presenta una cinética de crecimiento sigmoidal (Larralde, 1996) que en los
hongos filamentosos generalmente presentan: la fase de no crecimiento evidente (lag), la fase
de rápido crecimiento (trofofase), la fase de mantenimiento (idiofase) y la fase de autólisis y
disminución del peso seco (Hanson,2008). El crecimiento puede ser cuantificado en hongos
Concentración 2FQ µg/mL 25 50 100 200
Medio basal + 2FQ - + + +
Inhibición (+)
Desarrollo del microorganismo (-)
32
filamentosos por el aumento en la biomasa por unidad de tiempo (Hernández, 2003) en este
trabajo se utilizó la técnica de peso seco para determinar la curva de crecimiento de la cepa
114QD en medio basal con de 2-fenilquinolina a la máxima concentración tolerada (figura
6), los pesos obtenidos en el tiempo se muestran en el Anexo 3
Figura 6. Cinética de crecimiento de la cepa114QD en 2-fenilquinolina
La curva construida permitió conocer el comportamiento de la cepa en el medio
empleado, el cual posee una relación C: N de 15:1, siendo el alcaloide 2-fenilquinolina la
única fuente de carbono y nitrógeno suministrada al microorganismo. Esta curva fue
comparada contra un control del medio con glucosa como fuente de carbono.
La biomasa obtenida al término del cultivo para el medio con glucosa fue de 5,1
mg/ml. Se observa que a una concentración de 0,025 mg/ml de 2-fenilquinolina la biomasa
alcanzada fue tan solo de 2,1 mg/ml, casi la mitad de la biomasa obtenida en un medio con
un sustrato fácilmente asimilable como la glucosa, lo cual indica que el crecimiento de
nuestro hongo se ve limitado en presencia del alcaloide.
En el control con glucosa la fase de mantenimiento se alcanzó a las 144 horas de
cultivo, en el medio con 2-fenilquinolina esta fase se alcanzó a las 240 horas dándose un
claro retardo en la fase de crecimiento del microorganismo, concentraciones mayores de
alcaloide no permiten el desarrollo de la cepa.
Fase de mantenimiento
33
5.5 Procesos de biotransformación (Establecimiento de cultivos Batch)
Se establecieron cultivos Batch con 50 ml de medio basal para hongos a los que se les
añadió 1,25 mg de 2-fenilquinolina para una concentración final de 0,025 mg/ml. Los
matraces se incubaron durante un periodo de 15 días a 30°C y 100 rpm, controles del
proceso fueron procesados de la misma manera (Hanson, 2008).
5.6. Análisis por cromatografía CCF
Figura 7. Análisis de los extractos de los cultivos Batch por CCF
El resultado del análisis por CCF de los extractos obtenidos del proceso Batch a 366
y 254 nm ( figura 7), reveló la presencia de bandas a la misma altura del patrón de 2-
fenilquinolina (1) para el medio basal con 2-fenilquinolina con un Rf de 0,94 y también la
presencia de otros productos de distinta polaridad (Rf 0,68, 0,64 y 0,3) (2y 3), la presencia de
estos productos fue descartada en el control de proceso utilizado (4) (medio basal sin
ninguna fuente de carbono), lo que indica que la cepa elegida tiene la capacidad de generar
otros productos a partir de la utilización de la 2-fenilquinolina como única fuente de carbono
y nitrógeno.
34
5.7 Análisis por cromatografía HPLC
a) b)
Figura 8 a) Cromatogramas y espectro 3D de los picos de 2-fenilquinolina obtenidos en el tiempo
b) Espectros de absorción UV obtenidos por el detector PDA
Espectro pico A (Tr: 1.79 min), Espectro pico B (Tr: 2.85 min),Espectro pico C (Tr: 4.1 min 2-fenilquinolina
En la figura 8a se muestran los cromatogramas obtenidos para las muestras tomadas a
las 72, 168 y 264 horas de cultivo, se puede observar que las áreas de los picos
correspondientes a la 2-fenilquinolina pico C, con un tiempo de retención de 4,1 min,
disminuyen en el tiempo y aparecen picos de mayor polaridad con áreas que se incrementan
a tiempos de retención de 1,79 y 2,85 min denominados A y B respectivamente.
A
B
C
B
A
C
35
Se obtuvo mediante el detector de arreglo de fotodiodos (PDA) los espectros de
absorción UV de los tres picos encontrados (Figura 8b). El espectro del pico C genera
bandas de absorción a 256,1 y 322,5 nm, las cuales son características de la molécula 2-
fenilquinolina (Anexo 4). El espectro del pico B presenta bandas de absorción a 216,1, 265,5
y 335,6 nm, presentando características espectrales similares al pico C, se conoce que las
sustituciones por grupos auxócromos como OH pueden producir un desplazamiento
batocrómico de las bandas de absorción (Lizalda, 2008; Skoog et al., 1998). Los datos de los
cromatogramas y espectros de absorción UV obtenidos permiten inferir que el producto B y
no así el A resulta ser un producto de biotransformación de la 2- fenilquinolina,
El análisis por HPLC permitió también determinar el consumo de sustrato y la
formación del metabolito B con relación al tiempo, dando un estimado de la eficacia del
proceso.
Los datos hallados con las áreas obtenidas permiten determinar un consumo de 2-
fenilquinolina a 264 horas del 77% quedando un remanente aproximadamente de un
23%.(Figura 9)
Figura 9. Relación de la disminución del área de la 2-fenilquinolina y el incremento del área del pico B con
relación al tiempo de cultivo
Tiempo (horas) Área 2-fenilquinolina % de 2FQ presente en la
muestra
Consumo de
2FQ
Área producto (X)
0 112869431 100% 0% 0
72 105743082 93,6% 6,4% 504680
168 71236484 63,1% 36,9% 1961856
264 26532299 23% 77% 4997215
36
5.8 Análisis por cromatografía de gases (CG) y acoplamiento a espectroscopia de masas (CG-
EM)
El análisis por cromatografía de gases permitió encontrar en las muestras el pico
correspondiente a la 2-fenilquinolina a un tiempo de retención de 38,66 minutos
comparando con el patrón puro, se hallaron también otros picos minoritarios, siendo el pico
encontrado a 44,01 minutos el único de interés al encontrarse presente solo en los medios
con alcaloide y no así en los controles del medio procesados (Anexo 5)
Figura 10. Cromatograma extracto total cultivos Batch
Un análisis de las áreas de 2-fenilquinolina obtenidas reveló una disminución de estas
en el tiempo, mientras que las áreas del producto de interés (Tr: 44,01) como se muestra en
la figura 11 se incrementaron. El análisis de las áreas permitió dar un estimado del consumo
de sustrato (2-fenilquinolina) en el proceso, siendo de aproximadamente un 78%.
37
Figura 11. R elación de la disminución del área de la 2-fenilquinolina y el incremento del área del pico de
interés (Tr: 44,01) con relación al tiempo de cultivo
El análisis por espectroscopia de masas confirmó que el pico a tiempo de retención
de 38,66min corresponde a la 2-fenilquinolina, ya que este muestra en su espectro de masas
un ión molecular a 205 m/z correspondiente a una formula molecular C15H11N (Figura 12),
se observó además un fragmento significativo a 102 m/z [C8H6] característico del patrón de
fragmentación de este compuesto (Ticona, 2008).
Tr: 38,66
Figura 12. Espectro de masas de la 2-fenilquinolina
Tiempo (horas) Área 2-fenilquinolina % de 2FQ presente en la muestra Consumo de 2FQ Área producto (X)
0 32245 100% 0% 0
72 26592 82% 18% 225
168 14243 44% 56% 441
264 7041 22% 78% 1356
20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 2100
50
100
%
205
10276 101 1768851 20218 15163 1283928
38
En la figura 13 se observa el análisis del pico obtenido a 44,01 min, este compuesto
muestra en su espectro de masas un ión molecular a 221 m/z correspondiente a una formula
molecular C15H11NO, el patrón de fragmentación obtenido muestra un fragmento
significativo a 204 m/z [C15H10N] que sugiere la pérdida de un grupo OH [M-17]+, lo cual
indica según comparación con la base de datos del CTA (UMSS) que el compuesto
analizado puede ser un derivado hidroxilado de la 2-fenilquinolina.
Tr: 44.01
Figura 13. Espectro de masas de la 2-hidroxifenilquinolina
Mediante la comparación de los patrones de fragmentación de este compuesto con el
determinado en estudios anteriores para la 2-fenil-4 metoxiquinolina (Ticona, 2008) se
sugiere que la hidroxilación de la molécula 2-fenilquinolina se podría dar en el carbono 4.
Compuesto Principales Fragmentos Estructura
2-fenil-4 metoxiquinolina
(Ticona, 2008)
m/z 235,204,191,165,156,143,128,117,102
Derivado hidroxilado de
la 2-fenilquinolina
Base de datos
m/z 221,204,191,165,139,128,110,95
20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 2200
50
100
%
221
222191 20495 11018 83 16563 7551 13939 12811528
39
Sin embargo por no tener la cantidad de producto suficiente no se pudo realizar el
análisis de RMN para confirmar o determinar la posición real del grupo hidroxilo sobre la
estructura de la 2-fenilquinolina.
En estudios realizados con hongos del género Aspergillus spp. se encontró que estos
tienen la capacidad de hidroxilar moléculas como cumarinas, terpenos y flavonoides (Suchita
et al., 2009, Correa et al., 2011, Aguirre-Pranzoni et al., 2011), porque poseen un sistema
enzimático de monooxigenasas, como parte importante del metabolismo de xenobióticos
(Velasco et al, 2009; Montoya y Tataje, 2004; Aguirre-Pranzoni et al., 2011).
Es importante la obtención de estos compuestos hidroxilados porque estos pueden
ser intermediarios de valor para procesos de síntesis química de compuestos con mayor
actividad biológica.
5.9 Procesos de Escalamiento (Scale up)
Para los procesos de escalamiento se trabajó a la máxima concentración de 2-
fenilquinolina tolerada (0,025 mg/ml) en un volumen de 300 ml de medio basal, se evaluó
también un proceso a la concentración de 0,050 mg/ml. Se ha reportado que la adición de
fuentes de carbono más fácilmente asimilables como glucosa altera substancialmente la
cinética de biotransformación de compuestos xenobióticos (Scow et al., 1989), en base a esto
se decidió evaluar la utilización de un co-sustrato en el proceso de biotransformación por lo
que se añadió glucosa al 1 % a un medio con 0,050 mg/ml de 2-fenilquinolina, la
concentración de glucosa utilizada fue seleccionada a partir de la elaboración de curvas de
crecimiento con 4 diferentes concentraciones de este sustrato (Anexo 6).
5.10 Caracterización química de los procesos de escalamiento
5.10.1 Análisis por CCF
Los extractos obtenidos de los procesos de escalamiento fueron analizados por CCF,
para evaluar principalmente cambios en el sustrato 2-fenilquinolina y la formación de
40
productos con respecto al tiempo (Hanson, 2008). Se tomaron muestras durante el
transcurso de los procesos: 2 muestras durante la fase de crecimiento (72 y 168 horas) y 2
muestras durante la fase de mantenimiento (264 y 360 horas) del crecimiento del hongo. Los
resultados obtenidos de los procesos sin co-sustrato se compararon con los obtenidos para el
medio al que se le añadió glucosa.
En la figura 14 a se observa el análisis por CCF a 254 y 366 nm de los extractos de
los cultivos con 0,025 y 0,050 mg/ml de 2-fenilquinolina sin glucosa, el cual reveló que
durante las primeras 72 horas se encuentra únicamente una banda con un Rf de 0,94 (carril
1) correspondiente a la 2-fenilquinolina, las muestras tomadas a las 168 y 264 horas (carriles
2 y 4) mostraron no solo la presencia del sustrato 2-fenilquinolina (Rf 0,94) sino también 2
nuevos productos de mayor polaridad (Rfs 0,68 y 0,41), que permanecieron en el medio
hasta el término del cultivo a 360 horas de incubación ( carril 5), siendo el único cambio
considerable para este tiempo la aparición de un producto nuevo (Rf 0,88) cuya banda se
encontraba próxima a la banda de la molécula 2-fenilquinolina (Rf 0,94).
a)
b)
Figura 14. Análisis por cromatografía en capa fina de los procesos de Escalamiento
a) Escalamiento sin glucosa b) Escalamiento con 1% de glucosa
41
La figura 14 b muestra los resultados obtenidos para el proceso con glucosa al 1% el
cual muestra un perfil cromatográfico distinto, en este proceso se pudo observar la presencia
a las 72 horas de cultivo de la banda correspondiente a la 2-fenilquinolina (Rf 0,94) y otras
dos bandas de polaridad diferente (Rfs 0,48 y 0,41) que no se encontraban en los procesos
sin glucosa, estas bandas permanecieron sin modificación hasta fin del cultivo, los únicos
cambios que se observaron durante el proceso fueron la aparición a partir de las 168 horas
de una banda de un producto nuevo con un Rf de 0,12 (carril 2) que al igual que las otras
bandas se mantuvo constante hasta el final y otra banda con un Rf de 0,76 que desaparece
con el tiempo.
5.10.2 Análisis por CG
La evaluación del consumo de sustrato de los procesos de escalamiento se realizó
solo por CG.
Escalamiento 0,025 mg/ml de 2FQ en 300 ml
Figura 15. Cromatograma proceso de escalamiento 0,025 mg/ml
Muestra TR Área
Tiempo 0 38.52
2-fenilquinolina
89584,39
Extracto total (360 horas) 38.52 43073,14
44.65 hidroxilado 188,69
Consumo aproximado de sustrato 52%
42
Escalamiento 0,050 mg/ml de 2FQ en 300 ml con y sin glucosa al 1%
Figura 16. Cromatograma procesos de escalamiento 0,050 mg/ml
Los cromatogramas revelan la presencia en los extractos de los procesos de
escalamiento los picos correspondientes a la 2-fenilquinolina y el pico a 44,50 min hallado
también en los procesos Batch. El uso de un co-sustrato como la glucosa permitió no solo el
desarrollo de la cepa a una mayor concentración de 2-fenilquinolina (0,050 mg/ml), sino
también un mejor consumo de sustrato comparado con el proceso sin glucosa.
Un análisis de espectroscopia de masas HR-ESI-MS realizado a los extractos de los
procesos de escalamiento con y sin glucosa en la Universidad de Lund en un equipo Waters
Q-TOF micro system spectrometer usando H3PO4 para la calibración y como estándar
interno confirmó la presencia del derivado hidroxilado de la 2-fenilquinolina a una [M+1]+
de 222 . Figura 17
Muestra TR Área
Tiempo 0 38.73 2-fenilquinolina 158309.98
Extracto total (360)
Sin glucosa
38,73 2-fenilquinolina 102344.24
44,50 hidroxilado 1818.04
Extracto total (360 horas)
Con glucosa al 1%
38.60 2-fenilquinolina 45744.02
44.50 hidroxilado 52,87
Consumo aproximado de sustrato
Medio sin glucosa = 36%
Medio con glucosa al 1% = 72%
43
Figura 17. Espectros de masas de los extractos totales de los procesos de escalamiento con y sin glucosa
Sin glucosa
Con glucosa
44
En el análisis de EM del proceso con glucosa se observó por la variación de los
valores de m/z la posible formación de una estructura tautomérica ceto- enólica con valores
de m/z en la configuración ceto de 236 y configuración enólica de 240, las masas halladas
sugieren la dihidroxilación de la molécula lo que debe ser corroborado por un análisis de
RMN en futuros estudios.
5.11 Evaluación de la actividad antiparasitaria
La actividad biológica de todos los extractos fue evaluada frente a promastigotes de
leishmania por la técnica XTT, los valores de IC 50 hallados se muestran en la siguiente
tabla:
Tabla 1. Valores de IC 50 de los extractos obtenidos de los diferentes procesos evaluados por la técnica XTT.
2FQ: 2-fenilquinolina, CAT: Alcaloides Totales de Corteza (G. longiflora). *Anfotericina B como control
positivo.
Figura 18. Actividad (IC 50) de los extractos frente a promastigotes de Leishmania
Extracto analizado Lma M2904
Cultivo Batch >100 >100
Proceso escalamiento
2 FQ (0,025) mg/ml
66,3±6 57,1±7
Proceso escalamiento
2 FQ (0,050) mg/ml
Sin glucosa
74,5±6 52,5±8
Proceso escalamiento
2FQ (0,050 mg/ml)
Glucosa al 1%
48,9±4,6 34,7±6
2FQ 38,5±1,5 23±0,5
CAT 17,8 14
Anfotericina B* 0,25 0,07
45
La actividad de los extractos se comparó con la de un patrón puro de 2-fenilquinolina
y con la del complejo de alcaloides totales CAT, la actividad de los extractos de los procesos
Batch y Escalamiento fue diferente a la obtenida para la 2-fenilquinolina. En la figura 18 se
observa que la actividad antiparasitaria es mejor frente al complejo L. braziliensis (M2904
C192 RJA) que frente a L. amazonensis, la utilización de un co-sustrato como glucosa mejoró
considerablemente la actividad biológica.
6. CONCLUSIONES
46
Se empleó a la cepa 114QD para estudios de biotransformación del alcaloide 2-
fenilquinolina, esta cepa fue identificada como Aspergillus spp. por el análisis macro y
microscópico realizado.
La caracterización química de los productos obtenidos de los procesos de
biotransformación fue realizada por métodos analíticos bastante selectivos como la CCF que
permitió evaluar la modificación del sustrato, la HPLC y la cromatografía de gases
permitieron determinar la eficacia del proceso mediante la evaluación del consumo del
sustrato que fue de un 77 y 78% respectivamente, demostrando que ambos métodos son
bastante congruentes.
Los espectros de absorción UV obtenidos por HPLC demostraron la presencia de la
2-fenilquinolina y de un producto que presentó un desplazamiento batocrómico de las
bandas de absorción debido a la sustitución del anillo quinolínico por un grupo OH.
Mediante el análisis por cromatografía de gases se obtuvo a un tiempo de retención
de 44.01 minutos un pico que resultó de interés al no estar presente en los controles
procesados, el acoplamiento a espectroscopia de masas determino que el pico
correspondiente a ese tiempo de retención presenta en su espectro de masas un ión
molecular a 221 m/z, el patrón de fragmentación de este compuesto muestra un fragmento
significativo a 204 m/z que sugiere la pérdida de un OH [M-17]+, demostrando la
hidroxilación de la molécula. Una comparación del patrón de fragmentación obtenido para
este compuesto con el hallado en estudios anteriores para el compuesto 2-fenil-4-
metoxiquinolina sugiere que la sustitución se pudo dar en el carbono 4, aunque existen otros
posibles sitios de ataque enzimático.
47
La actividad biológica evaluada sobre promastigotes de leishmania por el método
XTT, mostró valores de IC 50 diferentes a los valores hallados para el patrón 2-
fenilquinolina, teniendo una mejor actividad frente al complejo L. braziliensis (M2904 C192
RJA) que frente al complejo L. amazonensis, y que mejora cuando se utiliza glucosa como
co-sustrato.
Gracias a este trabajo se dio un gran paso en la elucidación del proceso de
biotransformación de la 2-fenilquinolina y se demostró además el potencial de Aspergillus
spp para modificar moléculas complejas como son los alcaloides y otros presentes en plantas
lo que hace a este microorganismo un excelente candidato a futuro para la evaluación de
dichos procesos en una gama de principios activos de plantas.
CAPITULO 2
Usos biológicos de Aspergillus spp.
MICOTOXINAS
Cuantificación y producción de aflatoxina B1
RESUMEN
Las aflatoxinas son producidas por cepas toxigénicas del género Aspergillus como
parte de sus productos metabólicos. Su toxicidad causa daños severos en la salud al ser
considerados carcinógenos potentes. Existen cepas de Aspergillus que en sustratos tales
como el arroz, crecen y producen micotoxinas a 30°C.
En este trabajo se desarrollaron dos métodos analíticos por cromatografía líquida de
alta resolución (HPLC) y Espectroscopia de Fluorescencia para la detección y cuantificación
de aflatoxina B1, se construyeron curvas de calibración para poder validar estos métodos y
con ellos poder evaluar la producción de esta toxina por la cepa de trabajo 114 QD
(Aspergillus spp). La producción de aflatoxinas se realizó en un medio con 50 y 20 gramos
de arroz, emulando en lo posible las condiciones de almacenamiento durante el periodo de
incubación.
El análisis de los extractos de 50 y 20 gramos de arroz por cromatografía líquida de
alta resolución (HPLC) dio concentraciones promedio de aflatoxina B1 de 94,93 y 24,64
ppb respectivamente. Por espectroscopia de fluorescencia se determinó concentraciones
promedio de 133,37 y 27,23 ppb. Las concentraciones de aflatoxina B1 obtenidas por ambos
métodos analíticos muestran una diferencia significativa (p<0,05) con respecto a la cantidad
de sustrato, siendo más alta la concentración de aflatoxina B1 a mayor cantidad de arroz en
el medio, la sensibilidad de ambos métodos permite detectar esta toxina desde 6 ppb.
ABSTRACT
Aflatoxins are produced by toxigenic strains of Aspergillus as part of their metabolic
products. Its toxicity causes severe health damage which makes them to be considered potent
carcinogens. There are Aspergillus strains that in substrates such as rice grow and produce
mycotoxins at 30 °C.
In this work two analytical methods by high performance liquid chromatography (HPLC)
and Fluorescence Spectroscopy for the detection and quantification of aflatoxin B1 were
developed, calibration curves were constructed to validate these methods and with them to
evaluate the production of this toxin by strain 114 QD (Aspergillus spp). Aflatoxin
production was performed in a medium containing 50 and 20 grams of rice emulating when
possible the storage conditions during incubation period.
The analysis of 50 and 20 grams rice extracts by high performance liquid chromatography
(HPLC) gave average concentrations of aflatoxin B1 of 94,93 and 24,64 ppb respectively. By
fluorescence spectroscopy average concentrations of 133,37 and 27,23 ppb were determined.
Aflatoxin B1 concentrations obtained by both analytical methods show a significant
difference (P <0,05) with respect to the amount of substrate, being higher the concentration
of aflatoxin B1 with greater amount of rice in the medium, the sensitivity of these methods
allows detect this toxin from 6 ppb.
1. INTRODUCCIÓN
48
Actualmente existen más de 200 tipos de mohos toxigénicos que bajo condiciones
especiales son capaces de producir distintos tipos de micotoxinas. Las toxinas que más se
han estudiado han sido las aflatoxinas sin embargo, toxinas como la Ochratoxina A
(Aspergillus ochraceus) o la citreoviridina (Penicillium spp) revisten igual importancia
(Valladares, 1988)
Las aflatoxinas son toxinas naturales producidas por cepas toxigénicas del género
Aspergillus como parte de sus productos metabólicos. Su toxicidad causa daños severos en la
salud al ser consideradas como los carcinógenos más potentes producidos en la naturaleza
(Montesano, 1997), principalmente la aflatoxina B1.
Figura 19. Estructura de la Aflatoxina B1
Aspergillus spp. requiere ciertas condiciones especiales para su crecimiento y la
producción de aflatoxinas. Aspergillus flavus la cepa más relacionada con la producción de
aflatoxina por ejemplo en sustratos tales como el arroz, crece entre 6 y 45°C con un óptimo a
37°C y la producción de micotoxinas se efectúa entre 11 y 36°C con un máximo de
producción a 30°C. Aspergillus parasiticus le sigue en importancia (Gimeno, 2002).
Aunque los Aspergillus crecen saprofítamente, los productos alimenticios pueden
servir como sustrato, favoreciendo la presencia de estos mohos. Factores como la capacidad
toxigénica del hongo, la temperatura, el tiempo, la humedad, la luz, la atmósfera de
almacenamiento y factores de tipo químico como la presencia de minerales o carbohidratos,
pueden ayudar a crecer e incluso a producir aflatoxinas (Ellis et al., 1991).
49
La presencia de Aspergillus no necesariamente implica presencia de aflatoxinas pues hay
cepas no toxigénicas, de igual forma la ausencia de Aspergillus en el alimento no implica que
el alimento no tenga aflatoxinas, debido a que la toxina puede persistir aún después que el
moho ha desaparecido ( Santos, 1999) por lo que su detección y cuantificación revisten gran
importancia.
En este trabajo se desarrollaron dos métodos analíticos para la detección y cuantificación
de aflatoxina B1 por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y Espectroscopía de
Fluorescencia, se construyeron curvas de calibración para poder estandarizar estos métodos y
con ellos poder evaluar la producción de esta toxina por la cepa de trabajo 114 QD
(Aspergillus spp). La producción de aflatoxinas se realizó en un medio de arroz a 30 °C, en
oscuridad y sin agitación emulando en lo posible las condiciones de almacenamiento de este
cereal.
2. ANTECEDENTES
50
2.1 Micotoxinas
Existen hongos benéficos que tienen funciones importantes como la producción de
quesos, vitaminas, antibióticos y enzimas, sin embargo al ser los hongos microorganismos
ubicuos en la naturaleza y crecer en todos los tipos de materia orgánica, se encuentran
frecuentemente como contaminantes en productos alimenticios, causando pérdidas y siendo
quizá el agente deteriorante más común dada su capacidad invasiva y su gran resistencia,
estos hongos contaminantes pueden producir sustancias químicas con carácter tóxico
conocidas como micotoxinas (Ellis et al., 1991; Jarvis y Williams, 1987).
Las micotoxinas son compuestos químicos de bajo peso molecular, policetónicos que
tienen lugar cuando en determinadas condiciones físicas, químicas y biológicas se interrumpe
la reducción de los grupos cetónicos en la biosíntesis de los ácidos grasos realizada por los
hongos, se suelen formar al final de la fase exponencial o al principio de la fase estacionaria
del crecimiento (Gimeno y Martins, 2006; D´Mello y Macdonald, 1997; Dutton, 1988). Solo
unas pocas especies de hongos son capaces de sintetizarlas e incluso dentro de una misma
especie de hongo solo ciertas cepas tienen esta capacidad, por lo que un grano enmohecido
no tiene por que ser necesariamente tóxico. Del mismo modo, puede detectarse una
micotoxina sin la presencia del hongo productor, ya que éste puede haber sido inactivado
por procesos químicos o por alteración de los factores ambientales mientras las micotoxinas
permanecen en el sustrato (Carrillo, 2003). El término micotoxinas proviene de dos palabras
griegas: “mykes” que significa hongo y “toxicum” que significa veneno (Organización de
Naciones Unidas para la agricultura y alimentación FAO, 1991; Céspedes, 1997).
Se conocen actualmente entre 300 y 400 clases de micotoxinas, aquellas que son más
importantes por su ocurrencia y toxicidad son: Aflatoxinas, Ocratoxina A, Citrinina, Patulina,
Deoxinivalenol, Zearalenona y Toxina T2 (Peraica et al., 1999; Sherif et al., 2009; Pozas y
Abad, 2010; Zheng et al., 2006), estas son producidas principalmente por 5 tipos de hongos:
Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Claviceps y Alternaria. (Anton y Lizaso).
51
Figura 20. Estructura de las principales micotoxinas
Fuente: Abrunhosa et al, 2012
2.2 Aflatoxinas
Son las micotoxinas más estudiadas, consideradas de difícil control al no poder ser
eliminadas completamente de los alimentos, y de mayor importancia ya que juegan un
importante papel en la elevada incidencia de carcinoma hepatocelular humana en ciertas
áreas del mundo (IARC, 2012; Herrera, 1998). Las aflatoxinas son producidas en pequeñas
concentraciones por hongos del género Aspergillus. Las especies Aspergillus flavus,
Aspergillus niger y Aspergillus parasiticus son las principales productoras, hongos del género
Penicillium como Penicillum verrucosum también pueden producir aflatoxinas (Ellis et al.,
1991). Actualmente se conocen unos 20 compuestos químicamente similares, pero los
principalmente presentes son las aflatoxinas B1, B2, G1 y G2 (Ellis et al., 1991).
52
Son de gran importancia en la industria de cereales, semillas, nueces de árboles y
frutos secos (Fu et al., 2008), ya que pueden ser contaminados por hongos toxigénicos, con
formación de micotoxinas según las condiciones de almacenamiento.
Las aflatoxinas pertenecen a la familia de las bisfuranocumarinas y tienen un peso
molecular que oscila entre 312 - 330. Son sustancias inodoras, insípidas e incoloras,
relativamente inestables a la luz y al aire, se descomponen en su punto de fusión que
comprende un rango de 237°C a 299°C. (Ortiz, 1991). El anillo lactona en las aflatoxinas G
las hace susceptibles a la hidrólisis alcalina y procesos que envuelven amonio, agentes
oxidantes o soluciones de hipoclorito de sodio. Son solubles en solventes moderadamente
polares como metanol, cloroformo, acetona, propilenglicol y dimetilformamida, poco
solubles en éteres etílicos e insolubles en hexano y éter de petróleo. (Ortiz, 1991; Soriano del
Castillo, 2007). Las aflatoxinas emiten fluorescencia con luz ultravioleta (UV) de onda larga
(360nm), esto permite detectar a estos compuestos a bajas concentraciones en placas de
cromatografía en capa fina (Holconb et al. 1992; Steyn et al ,1991; Scott et al, 1970), HPLC
(Truckses, 2001) y espectroscopia de fluorescencia.
Figura 21. Estructura química de las principales Aflatoxinas
Fuente: monographs.iarc.fr/ENG/Monographs/vol82/mono82-7A.pdf
53
2.3 Origen y distribución
Las aflatoxinas pueden localizarse en el micelio de los hongos, en las esporas, o
pueden ser excretadas como exotoxinas que se liberan al medio donde se desarrolla el
hongo. Las aflatoxinas pueden permanecer fijas en el micelio de los hongos que invaden el
alimento, pero pueden difundirse al propio alimento cuando la humedad y la consistencia
del producto lo permiten. La cantidad de toxina que producen los hongos no se relaciona
directamente con su crecimiento masivo y además no todas las especies de Aspergillus, ni
todas las cepas de Aspergillus flavus son productoras de aflatoxinas. La contaminación puede
realizarse a través de las esporas transportadas hacia las cosechas por el aire o los insectos, las
que al germinar ocasionan el crecimiento del hongo y posterior producción de las
aflatoxinas. La proliferación de hongos y producción de aflatoxinas puede exacerbarse en
lugares de almacenamiento con alta temperatura y humedad (Ortiz, 1991).
Figura 22. Mecanismos de contaminación por aflatoxinas
Fuente: http://www.aspergillusflavus.org/aflavus/
Aspergillus flavus se caracteriza por ser productor de aflatoxinas B1y B2, en tanto
Aspergillus parasiticus se da en áreas tropicales y subtropicales y produce aflatoxinas G1 y
G2 además de la B1 Y B2 ( Peterson et al., 2000; Ito et al., 2001).
54
2.4 Factores para la producción de aflatoxinas
Los factores más importantes que influyen el crecimiento de Aspergillus y la
producción de aflatoxinas son la temperatura y la humedad. En general, la temperatura
mínima necesaria para desarrollarse y producir micotoxinas es de 10-12°C. La actividad de
agua (aw) necesaria para iniciar su desarrollo y para producir micotoxinas es a partir de 0,75
y de 0,83, respectivamente. Aspergillus crece y puede producir micotoxinas de una forma
óptima a 25°C, con una actividad de agua de 0,95. Sin embargo, existen cepas de Aspergillus
flavus que en sustratos tales como el arroz, crecen entre 6 y 45°C con un óptimo a 37°C y la
producción de micotoxinas se efectúa entre 11 y 36°C con un máximo de producción a 30°C
(Gimeno, 2002).
Los sustratos son muy importantes para la producción de aflatoxinas. Sustratos con
grandes cantidades de carbohidratos y ácidos grasos aumentan la producción de la toxina;
sustratos con alto contenido de proteínas y bajos en carbohidratos no aumentan la
producción de las aflatoxinas de Aspergillus parasiticus, sin embargo Aspergillus flavus puede
sintetizar grandes cantidades de la toxina aun en bajas cantidades de carbohidratos. (Ellis et
al., 1991)
Azúcares como la glucosa, fructosa, sacarosa son las principales fuentes de carbono
para la producción de aflatoxinas por Aspergillus flavus, mientras que la xilosa y manosa
estimulan la producción de toxina en Aspergillus parasiticus. (Ellis et al., 1991; Harrigan y
Luchese, 1993)
Entre los aminoácidos que estimulan la producción se encuentran la glicina,
glutamato, prolina, aspartato y alanina, el cadmio, magnesio y zinc también son
estimuladores, hay otros compuestos químicos que inhiben la producción de aflatoxinas,
ellos son: cafeína (Buchanan y Lewis, 1984), nitrito de sodio (Obioha et al., 1983), cloruro de
sodio, ácido propiónico, hidróxido de amonio (Thanaboripat et al., 1992), bicarbonato de
potasio (Montville y Goldstein, 1987) y selenito de sodio (Badii et al., 1986).
55
2.5 Efectos tóxicos de las aflatoxinas
La fuente principal de exposición humana a las aflatoxinas son los alimentos
contaminados, se han identificado dos vías de exposición dietética: una es la ingestión directa
de aflatoxinas principalmente la B1 en alimentos como el maíz, maní, arroz, cereales y frutos
secos, y la segunda es la ingestión de aflatoxinas que pasan de los alimentos para animales a
la leche y productos derivados como el queso y la leche en polvo donde aparece la aflatoxina
M1 principalmente (OPS/OMS, 1983).
Las aflatoxinas pueden también causar daños en la salud de personas expuestas
ocupacionalmente a éstas, tal es el caso de personas que manejan cereales, piensos de maní,
harina de maní cuya exposición podría ocurrir fundamentalmente por inhalación de polvos
contaminados, y las que trabajan con toxinas en experimentos o con toxinas puras como
patrones para análisis. (OPS/OMS, 1983; Henry et al., 1998)
Las aflatoxinas pueden tener un efecto muy serio en la salud de los organismos vivos,
la severidad de la acción de la toxina puede causar efectos en la actividad relativa de las vías
de biotransformación y reparación del ADN, produciendo efectos principalmente
carcinogénicos y mutagénicos, y también alterando varios factores nutricionales, incluyendo
cambios en la grasa, proteínas, vitaminas y minerales esenciales o en procesos energéticos
(Valladares, 1988; Eaton y Groopman, 1994). Los principales abductores de AFB1 con el
ADN son identificados como 8,9- dihidro-8-(N7 guanil)-9- hidroxiaflatoxina B1 (AFB, N7-
Gua) y AFB1 formamidopirimidina (AFB1, FAP) (Montesano, 1997; Groopman et al.,
1992). El curso de la patología depende de muchos factores tales como la dosis, la toxicidad
del compuesto, los factores intrínsecos del hospedero tales como la especie, edad, sexo,
estado endocrino, factores de nutrición y períodos de exposición a la toxina ( Dvorackova,
1990).
56
Esquema 12. Formación de abductores de aflatoxina B1 con el ADN
2.5.1 Exposición Aguda
La exposición aguda se relaciona con el consumo de altos niveles de aflatoxinas sobre
períodos de tiempo relativamente cortos (días). La información en humanos es limitada
aunque se ha visto evidencia sustancial de exposición, observándose intoxicaciones masivas
de humanos en varios países del mundo como India y Kenia, con altas concentraciones de
aflatoxinas tanto en orina como en sangre (Eaton y Groopman, 1994; Maxwell, 1988). El
efecto de la toxina ha sido mejor reportada en animales tales como aves de corral, truchas,
ratones y conejos, que sufrieron de aflatoxicosis aguda clínica después del consumo de
productos contaminados (Pruthi, 1992; Pier, 1992). Algunos de los signos que se han visto en
varias especies animales, especialmente en mamíferos y aves, son hipolipidemia,
hipocolesterolemia e hipocarotenemia, asociada con esteatosis hepática y pérdida de peso
(Guzmán de Peña, 2007).
En la intoxicación con aflatoxinas se observa lesión hepática como coagulopatías,
aumento de la fragilidad capilar, hemorragia y tiempos prolongados de coagulación y
membranas ictéricas. La muerte del huésped puede suceder de horas hasta pocos días.
57
2.5.2 Exposición Crónica
La exposición crónica es más común que la exposición aguda; sin embargo, en cierta
forma es más difícil de identificar. Los animales y muy seguramente el hombre están
expuestos al consumo de cierta cantidad de toxina durante toda su vida o por largos períodos
de tiempo. Hay una gran cantidad de evidencia indicando que la exposición crónica a la
toxina induce a la producción de células cancerígenas, convirtiéndolo en un problema de
salud pública, especialmente cuando se asegura que del 20 al 50% de todos los cánceres
están relacionados con factores de la dieta (Montesano, 1997; Groopman et al., 1992).
Las aflatoxinas y sus metabolitos pueden afectar cualquier órgano, sin embargo el
órgano blanco principal es el hígado, produciendo hígado graso y pálido, necrosis moderada
y extensiva, hemorragia y otras patologías como alargamiento de la vesícula, daño en el
sistema inmune, nervioso o reproductivo (a) Dvorackova, 1990; b) Dvorackova , 1990;
Llewellyn, 1988) . También se ha considerado que tiene efectos en algunas de las formas
crónicas de malnutrición en niños en proceso de crecimiento. Algunos estudios asocian estas
micotoxinas con la infiltración grasa en el cerebro producida en el síndrome de Reye; sin
embargo hay otros estudios que muestran discrepancia (Dvorackova, 1990; Pier, 1992).
2.6 Métodos de determinación de aflatoxinas
Un método de análisis para aflatoxinas o cualquier otra micotoxina debe ser simple,
rápido, robusto, preciso, selectivo y sobre todo sensible dado las mínimas concentraciones
con las que se trabajan (Krska et al., 2005). Tanto las técnicas cromatográficas como los
inmunoensayos, presentan una elevada sensibilidad y exactitud en los resultados, ofreciendo
unos buenos límites de detección. Entre los principales métodos de determinación están:
2.6.1 Cromatografía en capa fina (CCF)
Numerosos métodos se han desarrollado para la determinación de las aflatoxinas
mediante cromatografía en capa fina (CCF). Placas de sílice se emplean con más frecuencia
con una serie de mezclas de disolventes. La mayoría de los sistemas de disolventes se basan
58
en cloroformo y pequeñas cantidades de metanol o acetona. Las aflatoxinas pueden ser
fácilmente detectados por fluorodensiometria, debido a que fluorescen fuertemente por sí
mismos sin ningún tratamiento adicional (excitación = 365 nm), (emisión = 435 nm). Los
límites de detección están en el rango inferior microgramo / kg.
2.6.2 Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
La técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es la más utilizada para
la detección de aflatoxinas y existen numerosos protocolos para el análisis de estas
micotoxinas. La mayoría de los protocolos se basan en realizar una pre-purificación de la
muestra con columna de extracción en fase solida (SPE por sus siglas en ingles) y la
separación por HPLC empleando como detector la fluorescencia o bien la espectrometría de
masas (EM). En la actualidad se utilizan columnas de purificación de inmunoafinidad
(Sharman y Gilbert, 1991).
2.6.3 Espectroscopia de fluorescencia
Todas las aflatoxinas tienen una máxima absorción cerca de 360 nm .La espectroscopia de
fluorescencia es un tipo de espectroscopia electromagnética que analiza la fluorescencia de
una muestra. Una de sus aplicaciones es la investigación de compuestos orgánicos. El ensayo
fluorométrico es un método cuantitativo eficiente para el análisis de micotoxinas que ha
estado disponible por más de una década, sin embargo la fluorescencia no solo se da cuando
están presentes las aflatoxinas existen otras substancias en el alimento o productos
metabólicos del hongo que fluorescen bajo radiación UV, volviéndola una técnica poco
específica (Espinosa et al., 2011)
.
3. OBJETIVOS
59
3.1 Objetivo General
Evaluar la producción de aflatoxina B1 por la cepa Aspergillus spp. 114 QD.
3.2 Objetivos Específicos
Desarrollar un método analítico para la detección y cuantificación de aflatoxina B1
por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
Desarrollar un método analítico para la detección y cuantificación de aflatoxina B1
por Espectroscopia de Fluorescencia.
Elaborar la curva de calibración para la cuantificación de aflatoxina B1 por
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
Elaborar la curva de calibración para la cuantificación de aflatoxina B1 por
Espectroscopia de Fluorescencia.
Cuantificar la producción de aflatoxina B1 por la cepa 114QD utilizando arroz como
sustrato por HPLC y Espectroscopia de Fluorescencia.
4. METODOLOGIA
60
61
4.1 Elaboración de la curva de calibración de aflatoxina B1 por HPLC
4.1.1 Preparación de las soluciones patrón de aflatoxina B1
Para la elaboración de la curva de calibración por HPLC, se empleó como patrón una
solución de aflatoxina B1 de 200000 ppb preparada a partir del patrón puro de 1 mg
(Sigma). Para obtener la solución madre de 200 ppb se realizó una dilución 1/1000 de la
solución de aflatoxina B1 en 10 mL de fase móvil Agua/MeOH/ACN, a partir de esta se
realizaron otras diluciones ½ hasta obtener concentraciones de 100, 50, 25 y 12,5 ppb. Todas
las diluciones se realizaron por triplicado. La solución madre y las diluciones se mantuvieron
en viales ambar en refrigeración a 4°C.
4.1.2 Análisis de las soluciones patrón
Las soluciones patrón se analizaron por HPLC empleando un equipo Waters serie
1525 de bomba binaria con detector de fluorescencia modelo 2475. El análisis se llevó a
cabo bajo las siguientes condiciones de trabajo:
Columna C18 (150 mm x 4,6 mm) 5 µm (SUPELCO)
Temperatura del horno 30°C
Detector de Fluorescencia λ excitación: 365 nm
λ emisión: 435 nm
Fase móvil Agua/MeOH/ACN: 50:40:10 (v/v/v)
Flujo 1 ml/min (isocrático)
Volumen de inyección 20 µl
Tiempo de corrida 10 min
La curva de calibración se construyó con los datos obtenidos de las áreas de los picos
correspondientes a la aflatoxina B1 utilizando el programa estadístico R y Excel 2007
obteniéndose la ecuación para el cálculo de la concentración de aflatoxina B1.
62
4.2 Elaboración de la curva de calibración de aflatoxina B1 por Espectroscopia de
Fluorescencia
4.2.1 Preparación de las soluciones patrón de aflatoxina B1
La curva de calibración se realizó utilizando como patrón una solución de aflatoxina
B1 de 200000 ppb preparada a partir del patrón puro de 1mg (Sigma). Para obtener una
solución madre de 200 ppb se realizó una dilución 1/1000 del patrón en 20 ml de metanol
(grado HPLC), a partir de esta solución se realizaron diluciones ½ hasta obtener
concentraciones de 100, 50, 25, 12,5 y 6 ppb. Todas las diluciones se realizaron por
triplicado. La solución madre y todas las diluciones se mantuvieron en matraces Erlenmeyer
en refrigeración a 4°C.
4.2.2 Análisis de las soluciones patrón
Las soluciones patrón se analizaron por espectroscopia de fluorescencia empleando
un Espectrofluorimetro, modelo Varian Cary Eclipse, el análisis se llevó a cabo bajo las
siguientes condiciones de trabajo:
Longitud de onda de excitación 365 nm
Longitud de onda de emisión Barrido (400 nm – 600 nm)
Apertura de excitación 5
Apertura de emisión 5
Detector PMT Medio (800 v)
Velocidad de barrido Medio (600 nm/min)
Tras su análisis se representó la curva de calibración con los valores de intensidad
(a.u.) en el programa estadístico R y Excel 2007 obteniéndose la ecuación para el cálculo de
la concentración de aflatoxina B1 por espectroscopia de fluorescencia.
63
4.3 Producción de aflatoxina B1 por la cepa de Aspergillus spp. (114QD)
La capacidad de la cepa 114 QD para producir aflatoxina B1 fue determinada
empleando arroz como sustrato natural.
4.3.1 Preparación del medio de arroz para la producción de aflatoxina B1
En matraces Erlenmeyer de 250 ml se colocaron 20 y 50 gramos de arroz pulido
hidratado con 25 ml de agua destilada, se esterilizó en autoclave a 121°C por 15 minutos,
posteriormente se inoculó el medio con 200 µl de una solución de esporas a una
concentración de 1x106
esporas/ml. Los matraces se dejaron incubar por 21 días a 30°C en
oscuridad y sin agitación para emular en lo posible las condiciones de almacenamiento.
4.3.2 Extracción de aflatoxinas
Finalizado el tiempo de incubación se realizó la extracción de las aflatoxinas de los
cultivos mediante el siguiente protocolo:
Al arroz enmohecido contenido en los matraces se le añadieron 200 ml de acetato de etilo,
esto con el fin de extraer las aflatoxinas provenientes no solo del sustrato sino también del
micelio. El contenido de cada matraz se mezcló por 5 minutos en licuadora (apta para
solventes), los licuados obtenidos fueron filtrados por una capa de algodón y gasa, y
colectados en balones a los cuales se los protegió de la luz hasta el proceso de purificación.
4.3.3 Purificación de los extractos
Para poder purificar los extractos se realizó la cristalización por par de disolventes,
tomando ventaja de las características de solubilidad de estas moléculas. A cada extracto se le
añadió poco a poco aproximadamente 8 ml de CH2Cl2 y gota a gota 4 ml de éter de petróleo
20/40, luego de observada una ligera turbidez los balones se taparon, protegieron de la luz y
dejaron a -20°C por 72 horas. Pasado este tiempo al contenido de cada balón se le añadió
nuevamente 3 ml de éter de petróleo 20/40, se filtró y colectó, los papeles filtro utilizados
64
fueron lavados con CH2Cl2 y esta fracción también se colectó, ambos fracciones se
concentraron a vacío en rotaevaporador (Janke&Kunkel IKA).
4.4 Análisis por cromatografía CCF de los extractos
Los extractos obtenidos fueron sometidos a CCF utilizando placas de silicagel 60
F254 (Whatman) con base de aluminio, se probaron 2 sistemas de elusión, el primero
compuesto por CHCl3: Acetona (90:10) y el segundo por CHCl3: MeOH (95:5). La corrida
de los extractos se realizó junto a la solución madre de aflatoxina B1 usada como patrón para
la comparación de Rf´s., las placas fueron reveladas bajo luz UV a 366 nm.
4.5 Cuantificación de aflatoxina B1 por HPLC de los extractos
Cada extracto fue resuspendido en 1 ml de la fase móvil Agua/MeOH/ACN y
sometido a sonicación por 30 segundos, luego los preparados fueron filtrados por
membranas de 0,45 µm antes de su inyección y analizados por el programa ya descrito, La
concentración de aflatoxina B1 producida se determinó por la ecuación hallada.
4.6 Cuantificación de aflatoxina B1 en los extractos por Espectroscopia de Fluorescencia
Cada extracto fue resuspendido en 20 ml de Metanol, filtrado y analizado bajo las
condiciones ya descritas. La concentración de aflatoxina B1 producida se determino por la
ecuación hallada.
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
65
5.1 Elaboración de la curva de calibración de aflatoxina B1 por HPLC
Se desarrolló un método de HPLC en fase reversa para la detección y cuantificación
de aflatoxina B1, para la elaboración de la curva de calibración se analizaron 5
concentraciones del patrón en un intervalo de 12,5 - 200 ppb. Se empleó un detector de
fluorescencia a una longitud de onda de excitación y emisión de 365 y 435 nm
respectivamente, una mezcla de Agua/MeOH/ACN: 50:40:10 (v/v/v) como fase móvil y un
tiempo de corrida de 10 minutos, bajo estas condiciones de trabajo el pico de aflatoxina B1
eluyó a un tiempo de retención de 8,56 (+/- 0,15) min. (Figura 23)
Figura 23. Cromatograma del patrón de Aflatoxina B1 a distintas concentraciones
En la siguiente tabla se detallan los valores de las áreas obtenidas en tres repeticiones
para cada una de las concentraciones del patrón analizadas.
Tabla 2. Datos de la regresión lineal de las áreas obtenidas por HPLC
Concentración
ppb Área 1 Área 2 Área 3 Promedio
12,5 4091229 3918628 3905526 3971794
25 5682968 5734340 5626866 5681391
50 8757277 8390165 9175746 8774396
100 17147442 16331034 16900773 16793083
200 30621898 30213612 30413612 30416374
Tr: 8,56 (+/- 0,15)
66
Figura 24. Curva de calibración de Aflatoxina B1 por HPLC
Del estudio de linealidad se obtuvo un coeficiente de determinación R2
de 0,999 y un
coeficiente de correlación de 0,9998; el cual muestra una correlación significativa entre la
concentración de aflatoxina B1 y las áreas obtenidas para cada una de ellas obteniéndose un
valor p < 0,05 (figura 24), con los valores del intercepto y la pendiente de la recta se obtuvo la
ecuación 1 que se aplicara para el cálculo de la concentración de aflatoxina B1 presente en
las muestras por HPLC.
La ecuación 1 permitió calcular la concentración experimental promedio para cada
una de las soluciones patrón analizadas por el método desarrollado:
Tabla 3. Datos estadísticos de precisión y exactitud del método.
Para el análisis de exactitud se tomaron 3 concentraciones diferentes: 200, 50 y 12,5
ppb, por triplicado y se determinó la desviación estándar, el coeficiente de variación, el % de
recuperación y el error relativo (%).
R2 0,999
Intercepto 2107026
Pendiente 142199
Coeficiente de
correlación 0,9998
p= 1.206e-05 <0.05
Concentración
teórica
Concentración
promedio
hallada
DS
CV%
Error
absoluto
Error
relativo %
12,5 13,1 0,72 5,49 0,6 4,8
25 25,1 0,4 1,59 0,1 0,4
50 46,9 2,75 5,86 -3,1 -6,2
100 103,2 2,96 2,86 3,2 3,2
200 199 1,45 0,72 -1 -0,5
y= 142199x + 2107026
R2= 0,999
Ecuación 1 [c] = Área - 2107026
142199
67
Tabla 4. Datos estadísticos del porcentaje de recuperación
5.2 Elaboración de la curva de calibración de aflatoxina B1 por Espectroscopia de
fluorescencia
Se desarrolló un método por espectroscopia de fluorescencia para la detección y
cuantificación de aflatoxina B1, para la elaboración de la curva de calibración se analizaron 6
concentraciones de la solución patrón, el intervalo fue de 200 a 6 ppb, siendo esta última la
minima concentración detectable por el equipo con respecto al blanco utilizado. Se trabajó
con valores de apertura de excitación y de emisión de 5 y una longitud de onda de
excitación de 365 nm, utilizada también en el análisis por HPLC. Bajo estas condiciones de
trabajo se pudo observar que la aflatoxina B1 genera espectros de emisión con picos que se
encuentran entre (408,00 a 446,06 nm) y una intensidad que va desde 2,90 hasta
aproximadamente 40 a.u. Estos espectros se van desplazando cuanto más se eleva la longitud
de onda de excitación. (Figura 25)
Figura 25. Espectros de emisión del patrón de Aflatoxina B1 a distintas concentraciones
Concentración ppb 200 50 12,5
Promedio +/- DS 199+/- 1.45 46,9 +/- 2,75 13,1 +/- 0,72
Error relativo (%) -0,5 -6,2 4,8
CV (%) 0,72 5,86 5,49
% de Recuperación 99 94 104
68
En la siguiente tabla se detallan los valores de Intensidad (a.u.) obtenidos en tres
repeticiones para cada una de las concentraciones del patrón analizadas.
Tabla 5. Datos de la regresión lineal de la Intensidad a.u. obtenida por espectroscopia de fluorescencia
b)
Figura 26. Curva de calibración de Aflatoxina B1 por Espectroscopia de fluorescencia
Del estudio de linealidad se obtuvo un coeficiente de determinación R2
de 0,997 y un
coeficiente de correlación de 0,998, el cual muestra una correlación significativa entre la
concentración de aflatoxina B1 y los valores de Intensidad a.u. obtenidos para cada una de
ellas (figura 26), obteniéndose un valor p de < 0,05, con los valores del intercepto y la
pendiente de la recta se obtuvo la ecuación 2 que se aplicara para el cálculo de la
concentración de aflatoxina B1 presente en las muestras por Espectroscopia de
Fluorescencia.
Concentración
ppb Intensidad (a.u.) 1 Intensidad (a.u.) 2 Intensidad (a.u.) 3 Promedio
6 2,967 2,914 2,940 2,940
12,5 4,614 3,781 4,500 4,298
25 7,300 6,201 6,306 6,602
50 9,421 12,265 11,543 11,076
100 25,646 21,037 20,600 22,427
200 39,200 37,484 42,865 39,849
R2 0,997
Intercepto 1,929
Pendiente 0,192
Coeficiente de
correlación
0,998
p= 1.69 e-06 <0,05
y= 0,192 x + 1,929
R2= 0,997
Ecuación 2 [c] = Intensidad (a.u.) – 1,929
0,192
69
La ecuación 2 permitió calcular la concentración experimental promedio para cada
una de las soluciones patrón analizadas por el método desarrollado:
Tabla 6. Datos estadísticos de precisión y exactitud del método.
Para el análisis de exactitud se tomaron 3 concentraciones diferentes: 200, 50 y 12,5
ppb, por triplicado y se determinó la desviación estándar, el coeficiente de variación, el % de
recuperación y el error relativo (%).
Tabla 7. Datos estadísticos del porcentaje de recuperación
5.3 Evaluación de la producción de aflatoxina B1 por la cepa 114QD
Se evaluó un método de producción de aflatoxina B1 en arroz utilizando a la cepa
Aspergillus spp. (114 QD).
5.3.1 Desarrollo de la cepa 114QD en medio de arroz
Tras un periodo de incubación de 21 días, se pudo evidenciar el desarrollo de la cepa
114 QD en el medio de arroz, los matraces conteniendo el arroz enmohecido se observaron
Concentración
teórica
Concentración
promedio
hallada
DS
CV% Error
absoluto
Error
relativo
%
6 5,3 0,13 2,45 -0,7 -11,6
12,5 12,3 2,35 19,10 -0,2 -1,6
25 24,3 3,15 12,96 -0,7 -2,8
50 47,6 7,69 16,15 -2,4 -4,8
100 106,7 14,55 13,63 6,7 6,7
200 197,5 14,31 7,29 -2,5 -1,25
Concentración ppb 200 50 12.5
Promedio +/- DS 197,5 +/- 14,31 47,6 +/- 7,69 12,3 +/- 2,35
Error relativo (%) -1,25 -4,8 -1,6
CV %) 7,29 16,15 19,10
% de Recuperación 98 95 98
70
bajo una lámpara de UV a 366 nm, observándose la emisión de fluorescencia en el medios
(Figura 27a y 27b).
a)
b)
Figura 27. a) Desarrollo de la cepa Aspergillus spp. (114QD) en medio de arroz a los 21 días de cultivo.
b) Arroz enmohecido visto directamente a 366 nm
El arroz resulto ser un buen sustrato inductor que permitió determinar la capacidad
productora de la cepa 114QD, si bien el arroz es un sustrato rico en hidratos de carbono,
ácidos grasos, vitaminas y otros nutrientes que desencadenan la ruta de síntesis de las
aflatoxinas, la composición del sustrato no es lo único que influye en la producción de estas
toxinas, también se consideran las condiciones climáticas y de almacenamiento, por lo que la
temperatura de trabajo considerada óptima para sustratos naturales (Nandi y Haggblom,
1984), fue de 30°C , parámetros como la oscuridad y la no agitación de los cultivos (Bennett
et al., 1981) también fueron considerados, se trabajó a la humedad ambiente del laboratorio.
71
Las condiciones de cultivo empleadas para el estudio permitieron emular ciertas
condiciones a las que son sometidos los frutos secos y cereales como el arroz durante su
almacenado. La presencia de aflatoxinas se evaluó cualitativamente por métodos
cromatográficos como CCF y cuantitativamente por HPLC y espectroscopia de
fluorescencia.
5.4 Análisis por CCF
Para el análisis por CCF se determinó que la fase móvil más adecuada para la
separación fue la de CH-Cl3-MEOH 5%.
Figura 28. Análisis por cromatografía en capa fina (CCF) de los extractos de arroz
En la figura 28 se muestra el resultado del análisis por CCF a 366 y 254 nm de los
extractos de 20 y 50 gramos de arroz, este reveló la presencia de bandas fluorescentes a la
misma altura del patrón de aflatoxina B1 empleado, el Rf del patrón fue de 0,56 y el Rf de
las muestras de 0,58. Los Rf de la aflatoxina B1 están en un rango de 0,4 a 0,7 (AOAC,
1999). Para poder identificar inequívocamente la presencia de aflatoxina B1 en los extractos
se realizaron los análisis por HPLC y Espectroscopia de fluorescencia.
72
5.5 Identificación y determinación de la concentración de aflatoxina B1 presente en los
extractos de arroz por HPLC.
El análisis por HPLC permitió encontrar en las muestras de 50 y 20 gramos el pico
correspondiente a la aflatoxina B1 a un tiempo de retención de 8,56 minutos comparado con
el patrón puro. Los cromatogramas revelan además la presencia de otros productos
fluorescentes que no fueron caracterizados pero que se presume podrían derivar del
metabolismo del hongo (Espinosa et al., 2011).
Figura 29. Cromatograma (extracto de 50 g de arroz enmohecido)
Figura 30. Cromatograma (extracto de 20 g de arroz enmohecido)
73
En la siguiente tabla se representan el tiempo de retención y las áreas de los picos
obtenidos de las muestras analizadas.
Tabla 8. Tiempo de retención y áreas obtenidas por HPLC
Para el cálculo de la concentración de aflatoxina B1 presente en las muestras se aplica
la ecuación 1 hallada con la curva de calibración.
Tabla 9. Concentraciones de aflatoxina B1 obtenidas por HPLC
En las muestras de 20 g de arroz se logró cuantificar a 21 días de cultivo una
concentración promedio de aflatoxina B1 de 24,68 ppb, mientras que en las muestras
correspondientes a 50 g de arroz se logro cuantificar 94,93 ppb.
Muestra Tiempo de retención
(min)
Área obtenida Área promedio
50 gramos
1 8,56 13615463
15607299 2 8,75 17599135
20 gramos
1 8,58 6079600
5616911 2 8,64 5154223
Concentración calculada Concentración promedio
50 gramos
80,93
94,93 ppb 108,94
20 gramos
27,93
24,68 ppb 21,42
Ecuación 1 [c] = Área (X) - 2107026
142199
74
5.6 Identificación y determinación de la concentración de aflatoxina B1 presente en los
extractos de arroz por espectroscopia de fluorescencia
En la figura 31 se observan los espectros de emisión de los extractos de 50 y 20
gramos de arroz que comparados con el obtenido para el patrón de aflatoxina B1 sugiere la
presencia de ésta en las muestras.
Figura 31. Espectros de emisión de de los extractos de 50 y 20 gramos de arroz.
Muestra Muestra Pico (nm) Intensidad (a.u.) Intensidad (a.u.)
promedio
50 gramos
1 411,06 26,259
27,537 2 410,96 28,816
20 gramos
1 408,00 6,456
7,158 2 409,07 7,861
Tabla 10. Picos de emisión y valores de Intensidad (a.u.) obtenidos por espectroscopia de fluorescencia
75
A partir de los valores de intensidad a.u. de los espectros obtenidos y con la ecuación
2 de la curva de calibración se obtiene la concentración de aflatoxina B1 presente en las
muestras
Tabla 11. Concentraciones de aflatoxina B1 obtenidas por Espectroscopia de fluorescencia
En las muestras correspondientes a 50 y 20 g de arroz se logró cuantificar a 21 días de
cultivo una concentración de aflatoxina B1 promedio de 133,37 y 27,23 ppb
respectivamente.
La figura 32 muestra una comparación de los resultados obtenidos por cada método
analítico, los valores promedio hallados indican que la producción de aflatoxina B1 aumenta
significativamente (p<0,05) en nuestro proceso, a mayor cantidad de arroz utilizado como
sustrato en la preparación de los medios.
Concentración calculada Concentración promedio
50 gramos
126,71
133,37 ppb 140,03
20 gramos
23,57
27,23 ppb 30,89
50 g de Arroz 20 g de Arroz
Ecuación 2 [c] = Intensidad (a.u.) (X) – 1,929
0,192
76
Figura 32. Comparación de la producción de aflatoxina B1 en 20 y 50 gramos de arroz por ambos métodos
Figura 33. Comparación de los resultados hallados respecto al método analítico utilizado
Una comparación de los resultados con respecto al método analítico utilizado (figura
35) muestra que existe discrepancia en las concentraciones de aflatoxina B1 halladas en las
muestras, siendo la concentración de aflatoxina B1 hallada por la técnica espectroscópica
mayor a la hallada por HPLC.
77
Esta diferencia se debe principalmente a las características del método aplicado, los
métodos cromatográficos como la HPLC son métodos selectivos capaces de producir una
respuesta para el analito de interés distinguible de todas las otras respuestas de los demás
componentes de una mezcla compleja (ICH Q2A, 1995). En cambio con las técnicas
espectroscópicas se toma ventaja de ciertas propiedades de las moléculas como en el caso de
las aflatoxinas, la fluorescencia a una determinada longitud de onda ( 360 nm), sin embargo
esta resulta ser una técnica poco específica, ya que la fluorescencia detectada no solo puede
ser exclusiva de las aflatoxinas presentes, sino que puede derivar de algún producto presente
en el sustrato o de otros metabolitos fluorescentes producidos por el hongo, tomando la
mezcla como una sola señal (Espinosa et al., 2011). El uso de columnas de inmunoafinidad en
futuros estudios permitirá eliminar señales interferentes.
6. CONCLUSIONES
78
Mediante la realización de curvas de calibración se estandarizaron la HPLC y la
Espectroscopia de fluorescencia como métodos para la detección y cuantificación de
aflatoxina B1.
Se desarrolló un método de producción de aflatoxina B1 mediante el cultivo de
Aspergillus spp. (114QD) en arroz, el arroz resultó ser un buen sustrato inductor.
Un paso importante para la recuperación de aflatoxinas, es el método de extracción a
emplear, nosotros desarrollamos un método de extracción para recuperar las aflatoxinas
presentes en el medio de arroz, utilizando acetato de etilo, el cual permitió una recuperación
de 95-98% considerada óptima.
La purificación por cristalización por par de disolventes fue también evaluada,
observándose a las 72 horas la formación de cristales que por CCF demostraron ser
aflatoxina B1.
La CCF permitió la detección de aflatoxina B1 en las muestras. El Rf obtenido para
el patrón de aflatoxina B1 fue de 0,56, las muestras mostraron una banda a la misma altura
que la del patrón Rf 0,58.
Mediante el análisis por HPLC se determinó una mayor producción de aflatoxina
B1con 50 g de arroz que con 20 g, la HPLC permitió obtener además los picos de otros
productos fluorescentes los cuales no pudieron ser caracterizados.
La espectroscopia de fluorescencia resultó un método bastante sensible al detectar
concentraciones de aflatoxina B1 desde 6 ppb, sin embargo una limitante de este método es
el no ser especifico pudiendo detectarse como una sola señal, la respuesta del analito y de
otros compuestos interferentes.
Gracias al estudio realizado se cuenta ahora en el cepario del I.I.F.B con una cepa
aflatoxigénica comprobada, y con dos métodos de referencia para la detección y
79
cuantificación de aflatoxina B1 presente en medios inductores como el empleado en este
trabajo, datos que pueden ser tomados en cuenta para futuros estudios.
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ANEXOS
94
ANEXO 1
MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS
Caldo Papa Dextrosa
Composición:
Papa 250g
Glucosa 10g
Agua destilada 1000mL
Agar Papa Dextrosa + Cloranfenicol
Composición:
Papa 250g
Glucosa 10g
Agar 15g
Cloranfenicol 0,4g
Agua destilada 1000mL
Medio Basal para hongos
Composición:
KH2PO4 0,5g
K2HPO4 0,6g
MgSO4 7H2O 0,5 g
Agua destilada 1000mL
+ Agar-Agar al 1,5%
Agar 15g
Solución fisiológica al 0,9%
Composición:
NaCl 9g
Agua destilada 1000mL
95
ANEXO 2
SELECCIÓN DE LA CEPA FÚNGICA BIOTRANSFORMADORA
Capacidad de la cepa 114 QD para desarrollar en un medio con 2-fenilquinolina
Aislamiento de las cepas fúngicas
2FQ Control sin 2FQ
96
ANEXO 3
Pesos obtenidos para la determinación de la cinética de crecimiento de crecimiento
Medio Basal + Glucosa
Tabla 1. Valores de peso seco mg/mL obtenidos para el medio basal con glucosa
Medio Basal + 2-fenilquinolina (0,025mg/ml)
Tabla 2. Valores de peso seco mg/mL obtenidos para el medio basal con 0,025 mg/ml de 2-
fenilquinolina
Tiempo
(horas)
0
24
48
72
96
120
144
168
192
216
240
264
288
Peso seco biomasa
(mg/mL) 0,3 1,7
2,6
3,4
4,1
5,2
5,4
5,2
5,2
5,2
5
5 5,1
DS 0,21 0,14 0 0,28 0,07 0,14 0,14 0,14 0,07 0,21 0,28 0,07 0
Tiempo
(horas)
0
24
48
72
96
120
144
168
192
216
240
264
288
Peso seco
biomasa
(mg/mL)
0,2 0,5
0,6
1
1,2
1,4
1,6
1,7
1,9
2
2,1
2 2,1
DS 0 0,14 0,14 0,28 0,21 0,14 0,14 0,07 0,21 0,14 0,07 0,14 0,07
97
ANEXO 4
Espectros de Absorción UV de la 2-fenilquinolina pura y CAT
2-fenilquinolina
CAT
98
ANEXO 5
Picos obtenidos por Cromatografía de gases para los controles del proceso de
biotransformación
Los controles del proceso de biotransformación fueron incubados a 30°C y en agitación
constante a 100 rpm por un periodo máximo de 360 horas.
Control medio basal sin alcaloide (2FQ)
99
Control 2-fenil quinolina en medio basal sin hongo
100
ANEXO 6
Selección de la concentración de glucosa utilizada como co-sustrato
Se ha reportado que la adición de fuentes de carbono más fácilmente asimilables como
glucosa altera substancialmente la cinética de biotransformación de compuestos xenobióticos,
se decidió evaluar la utilización de este co-sustrato en el proceso de biotransformación,
esperando no solo una mejora del consumo de sustrato sino también la formación de
mayores concentraciones de metabolitos derivados de este.
Para la selección de la concentración de glucosa se evaluó el crecimiento de la cepa 114QD
en nuestro medio basal al cual se le añadió diferentes concentraciones de glucosa 8,5,3 y 1%
se construyeron curvas de crecimiento a partir de la determinación de biomasa por peso seco
y se evaluó el consumo de sustrato con relación al tiempo, por el método del GOD-POD.
Glucosa 1%
Tiempo
(horas)
Biomasa pH Concentración de glucosa
(promedio) determinada por
GOD POD
0 0,3 6,8 1,2
24 0,6 6,8 1,1
48 0,8 6,8 0,93
72 1,2 6,5 0,65
96 1,5 6,3 0,63
120 1,8 6,3 0,55
168 2,2 5,4 0,48
216 2,4 4,9 0,36
240 2,4 5 0,37
Glucosa 3%
Tiempo
(horas)
Biomasa pH Concentración de glucosa
(promedio) determinada por
GOD POD
0 0,3 6,8 3,3
24 0,8 6,8 3,2
48 1,2 6,7 3,1
72 1,4 6,6 3,1
96 1,8 6,2 3
144 2,4 6,6 2,8
168 2,6 6,6 2,8
192 3 6,5 2,5
216 3 4,7 2,3
240 3 4,8 2,4
101
Glucosa 5%
Tiempo
(horas)
Biomasa pH Concentración de glucosa
(promedio) determinada por
GOD POD
0 0,2 6,8 5,5
24 0,5 6,8 5,4
48 0,8 6,7 5,1
72 1,4 6,6 5,1
96 1,9 6,6 5
120 2,3 6,5 4,5
144 2,8 6,5 4,3
168 3,3 6,5 3,9
192 3,1 5 3,3
216 3 5,7 3,1
240 3 4,9 3,2
Glucosa 8%
Tiempo
(horas)
Biomasa pH Concentración de glucosa
(promedio) determinada por
GOD POD
0 0,7 6,8 8
24 1,2 6,8 7,5
48 1,5 6,6 7,4
72 2,1 6,6 7,2
144 2,7 6,5 7
168 2,3 6,2 6,9
192 3 6,1 7
216 3 5,5 6,9
240 3 5,8 6,7
La glucosa se determino aplicando la siguiente formula
[C]g/l = Abs M x [c] del Estándar
Abs Estándar
102
En la figura anterior se observan las curvas de crecimiento construidas a diferentes
concentraciones de glucosa (1, 3,5 y 8%), se observa que la biomasa producida en todos los
cultivos fue de 3 mg/ml.
El consumo de sustrato se determino cada 24 horas durante 240 horas, momento en
el que todos los cultivos entran en fase de mantenimiento, los resultados obtenidos del
análisis por GOD-POD presentados en las anteriores tablas, muestran que a concentraciones
de glucosa de 3,5 y 8 % el sustrato no es consumido eficientemente por el hongo dando
lugar a una saturación del medio y la poca biomasa producida, sin embargo la curva de
crecimiento con glucosa al 1 % muestra un mejor consumo de sustrato durante las primeras
horas de cultivo, se da además la variación del pH hasta 5 debido al metabolismo activo del
hongo.
