FACULTE D E MEDECINE.constantine. 4 è m e a n n é e . M O D U L E D'INFECTIEUX . Cours de Microbiologie :

DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE D'UNE DIARRHEE (COPROCULTURE)

I - INTRODUCTION : • D i a r r h é e infectieuse s a i g u ë s : > à 3 selles molle s ou liquide s / jour (o u poids > à 300 g/j) pendan t moin s de

10J. D i a r r h é e infectieuse s a i g u ë s = syndrome d i a r r h é i q u e +/ - vomissements +/ - f i è v r e . Viennent a u 2em e ran g a p r è s le s infection s respiratoires . 5 à 10 millions enfant s d é c è d e n t / ans dan s le s pays e n voie d e d é v e l o p p e m e nt (pa r d é s h y d r a t a t i o n + +) Responsables é g a l e m e n t d e : Malnutrition. Retard d e d é v e l o p p e m e nt physiqu e e t mental.

II fau t savoi r qu e : Tous le s é p i s o d e s d i a r r h é i q u e s n e sont pa s infectieux . Toutes le s d i a r r h é e s infectieuse s n e sont pa s b a c t é r i e n n e s (parasites , levures , virus ) Toutes le s d i a r r h é e s b a c t é r i e n n e s n e sont pa s due s à des b a c t é r i e s s p é c i f i q u e s . Etiologie b a c t é r i e n n e dan s > 50 % des cas .

Il- PHYSIOPATHOLOGIE : Muqueuse intestinal e f o r m é e : • Enterocytes : Absorptio n de s nutriments • Cellule s caliciformes : S é c r é t i on d e mucus. • Cett e assis e cellulair e repose su r un chorion muqueu x (lamin a propria ) • L'intesti n es t capable d'absorbe r o u de s é c r é t er d e l'eau e t des é l e c t r o l y t e s (Na+ , Cl , K+ )

L A MUQUEUS E INTESTINAL E C E L L U L M E

CALICIFORMES

FORMATIONS LYMPHOIDES

~H M U C U S I

ENTEROCYTE

ABSORPTION

BORDURE E N

BROSSE

L A M I N A PROPRIA

VAISSEAU S A N G U I N

• L'intesti n d e l'homme d è s la naissance c o l o n i s é pa r d e nombreuses e s p è c e s b a c t é r i e n n e s la plupart s sont de s commensales .

• certaine s son t indispensable s a u bo n fonctionnemen t d e l'apparei l digestif •La d i a r r h é e es t l e r é s u l t a t soit :

• D'un e diminution d'absorption (destructio n de s Enterocytes : d i a r r h é e s virales , inhibitio n d e l'absorption pa r un e e n t é r o t o x i n e s )

• D'un e augmentation d e l a s é c r é t i o n d'ea u ( d i a r r h é e s osmotiques , e n t é r o t o x i n e s ) ^ L'infectio n e n t é r i q u e es t du e :

• soi t à la p r é s e n c e dan s l'intesti n d'un germ e e n t é r o p a t h o g è n e . • Soi t à la p r o l i f é r a t i o n anormal e d'u n germ e qu i fait parti e d e l a flore intestinal e sous l'effe t d'u n

traitement antibiotiqu e ou d é s é q u i l i b r e d e flore. • Transmissio n / voie f é c o - o r a l e

• Soi t direct e pa r l ' i n t e r m é d i a i r e de s mains . • Soi t indirect e pa r l ' i n t e r m é d i a i r e d'ea u o u d'aliment s c o n t a m i n é e s pa r le s m a t i è r e s f é c a l e s d e l'homm e

ou le s animaux .

III- ETIOLOGIES: • Le s b a c t é r i e s agent s d'infectio n intestinale s sont r e g r o u p é e s selo n l a physiopathologi e d e l'infectio n e n

deux groupe s : • B a c t é r i e s enterotoxinogenes:

Elles s é c r è t e n t un e e n t é r o t o x i n e responsabl e d'un e fuit e importante d'ea u e t d ' é l e c t r o l y t e s , elle s provoquen t des d i a r r h é e s aqueuse s san s é m i s s i o n d e san g o u d e leucocyte s e t san s f i è v r e . La g r a v i t é d e ce s d i a r r h é e s es t uniquemen t l ié e à la d é s h y d r a t a t i o n qu'elle s provoquent . Dans c e groupe o n trouv e :

• Vibrio n c h o l é r i q u e • E. coli e n t é r o t o x i n o g è n e . • Staphylococcus aureus. • Aeromonas.hydrophila.

V. parahémolyticus. • B a c t é r i e s entero-invasives:

Elles envahissen t l a muqueus e intestinal e et provoquen t de s dysenterie s cà d é m i s s i o n d e selle s sanglante s e t purulentes, l a f i è v re es t habituelle . Dans c e group e o n trouv e :

. Shigella. • Salmonella (certaine s e s p è c e s passen t dan s l e sang) . • Yersinia. • Campylobacter.

E.coli e n t é r o - i n v a s i v e . Invasion d e l a muqueuse — • Destructio n de s structure s villositaire s •Trouble s d e l'absorptio n

S H I G E L L A

2

«BO» DE C

^ , » r « i ; p i * w »

i l e j î ) , H r i i -rrr i u m i n

S A L M O N E L L A YERSINIA

Fixation à la surface d e l ' é p i t h é l i um digesti f — • L i b é r a t i on d e toxin e — • S é c r é t i o n d'ea u et d ' é l e c t r o l y t e s par le s cellule s é p i t h é l i a l e s

H 2 0 + ELECTROLYTE S

VIBRION CHOLERIQU E E.COLI ENTEROTOXINOGEN E STAPHYLOCOCCUS AUREU S

IV-LE DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE : repose su r : La coprocultur e + + +.(non s y s t é m a t i q u e ) L ' h é m o c u l t u r e . Etude b a c t é r i o l o g i q u e de s aliments , (dan s le s TIAC = toxi-infection alimentair e chroniqu e )

LA COPROCULTURE

A) - Principales b a c t é r i e s r e c h e r c h é e s selon le contexte : — • Adult e e t enfant plu s d e deux an s : Salmonella ,Shigella . Vibrion cholérique ( à la demande), ains i que Yersinia enterocolitica e t Campylobacter spp . — • Enfant s de moins d e deux an s : en plus de s b a c t é r i e s d é j a s c i t é e s o n recherche E. coli e n t e r o p a t h o g è n e sans oublie r l'étiologi e viral e f r é q u e n t e à cet â g e . — • TIA C : S. aureus, Bacillus cereus, C. perfringens, C. botulinum, Salmonella spp, Yersinia enterocolitica. — • Notio n d e voyag e r é c e n t e n pays tropical : V. cholérae, Aeromonas spp. — • D i a r r h é e pos t AT B : C. difficile, S. aureus ,Candida albicans. — • D é t e c t i o n d e portage che z le personnel d e restauration : Salmonelle spp et S. aureus. — • Syndrom e h é m o l y t i q u e e t u r é m i q ue (SHU ) : E. coli 0157 . — • D é t e c t i o n d e la colonisation pa r de s b a c t é r i e s m u l t i r é s i s t a n t e s au x ATB (BMR ) : e n t e r o b a c t é r i e s productrice s d e BLSE , Enterocoque Vancomycin e R* .

* E n pratique d e routine : • Che z l'adult e o n recherche : Salmonella, Shigella e t le Vibrion c h o l é r i q u e ( à la demande) .

• Che z l'enfan t < à 2 ans o n recherch e : E. coli entéropathogène, Salmonella, Shigella e t Vibrio n c h o l é r i q u e ( à la demande) .

B- L e p r é l è v e m e n t : • Le s selle s son t é m i s e s dan s u n r é c i p i e n t propr e (po t à vis). Che z l e nourrisso n e t l e peti t enfan t o n

p r o c è d e à un é c o u v i l l o n n a g e rectal . • Lor s d'u n é p i s o d e d i a r r h é i q u e a i g u ë 2 ou 3 p r é l è v e m e n t s peuven t ê t r e n é c e s s a i r e s . • Le s biopsie s d e muqueus e rectal e son t t r a i t é e s comm e de s selles . • L'acheminemen t a u laboratoir e doi t ê t r e rapid e sino n conservatio n d u p r é l è v e m e n t à + 4° c san s

d é p a s s e r 12h . Dan s l e cas o u l'acheminemen t es t tro p lon g on utilis e un milie u de transpor t ( g l y c é r i n e t a m p o n n é e ) .

• L a fiche d e renseignemen t doi t a c c o m p a g n é e l e p r é l è v e m e n t e t doi t comporte r : nom, p r é n o m , â g e , signes cliniques , germes particulier s a rechercher, notio n d e pris e d'ATB , notio n d e voyage à un pay s tropical, notio n d e TIAC.

C) - Conduite de l'examen c y t o b a c t é r i o l o g i q u e : 1 - Examen macroscopique :

• L a sell e peu t ê t r e normal e m o u l é e , moll e o u liquide . • Ell e peu t ê t r e d i a r r h é i q u e a f é c a l e ave c glaires sanglante s ( d y s e n t é r i f o r m e s ) , o u incolor e ea u d e ri z

( c h o l é r i f o r m e ) .

2 - examen microscopique : Permet d'oriente r l a culture.

• Exame n direc t à l'éta t frai s : permet d e d é c e l e r l a p r é s e n c e d ' h é m a t i e s e t d e leucocyte s ( é v e n t u e l l e m e n t des parasites ) e n ca s d e d i a r r h é e invasives .

• Coloratio n d e ble u d e m é t h y l è n e : Recherche d e p o l y n u c l é a i r e s . • Coloratio n d e gra m :

Elle perme t d ' a p p r é c i é l'équi l ibr e d e l a flore . A l'éta t norma l o n trouv e environ s 4/ 5 de bacille s en m a j o r i t é des Gra m (- ) e t 1/ 5 de cocc i e t d e rare s levures . On fai t un e dilutio n d e l a selle solid e a u 1/1 0 dans d e l'ea u dist i l lée , bie n agite r a u vortex, fair e u n é t a l e m e n t su r lam e e t colorer . En ca s d e sell e liquid e é t a l er directemen t un e goutt e su r lame .

3 - Mise en culture : On utilis e deux type s d e milieux .

• Le s milieu x d'isolemen t sélect i f s e t d i f f é r e n t i e l s : HECKTOEN, BCP , GNAB . • Le s milieu x d'enrichissemen t favorisen t l a croissance d e germe s p a t h o g è n e s qu i son t pe u abondant s

dans l e p r é l è v e m e n t : - EP A (ea u p e p t o n é e alcaline ) —+V. cholerae. - S é l é n i t e d e sodiu m —> Salmonella.

METHODOLOGIE AU LABORATOIRE xoproculture

Pot à vis

* prendr e un e parcell e d e l a taill e d'un peti t poi s * selle s liquide s Vi d'un e pipette

ûz é t a t frai s : ( leucocytes , h é m a t i e s , ^

germes mobiles,levures , parasite s ) bleu/gram :

é c o u v i l l o n

immerger l 'écouvi l lo n

Recherche d'E.col i e n t e r o p a t h o g è n e :hez l'enfan t < 2 ans

prendre 2 colonies lactos e (+ ) — • TSI + U r é e -st4actos e +,gaz +,

l g t t e

Enrichissement

V V u r é e -,indol e + ^identificatio n a n t i g é n i q u e

Eau physiologiqu e (dilutio n au 1/10 ) :tte

Culture su r milie u s é l e c t i f * HECKTOE N

*GNAB I si suspicion d e vibrio n c h o l é r i q u e

Recherche d e salmonell e Recherche d e vibrio n c h o l é r i q u e la demand e

SFM I [ A p r è s 6 h 16 gttes SFM I I HECKTOEN I I

EPAI a p r è s 6 h I

6 gtte s e n S 2

EPAII GNAB II

1 i HECKTOEN II I

Repiquer 5 colonies lactos e ( - ) Ou lactos e ( - ) H2S ( + )(vertes +/ - centre noir )

La m o i t i é d e l a colonie su r mile u TS I L'autre m o i t i é su r milie u u r é e / indole

GNAB L_

colonies transparente s G#(+) TSI/KIA _>lac(-),gaz(-),H2S(- )

OX + -a§ g ave c serumO l - > 0139 S i (- ) _VDC,ODC , AD H

i Incubation à 37 °C pendan t 1 8 à 24 h

i 5̂ Colonies verte s T S I - t - y r é e Si u r é e (-) , indol e ( - ),lactos e ( - ),H2 S +/ - s i u r é e + s i lactose (- ) H2 S (- ) LDC(+), TDA (- ) • Salmonell a | 1 ( s i gaz + , H2S + :mineur e o u par a B ) TD A (+ ) P r o t é u s TDA(- ) ( s i gaz + , H2S - :par a A ) a r r ê t e r l'identificatio n Yersini a ? ( s i gaz - , H2S - o u + :Typhi ) — • P r o c é d e r à l'identification a n t i g é n i q u e .

gaz ( - ) , u r é e (-),LD C (- ) TDA(-) - é h i g e l l e

Identification a n t i g é n i q u e

( N B : Salmonelles majeure s r e c h e r c h é e s é g a l e m e n t dan s l ' h é m o c u l t u r e , e t par s é r o d i a g n o s t ic d e Widal ).

D - Identification des colonies suspectes : 1"-Recherche de Salmonella et 5h/oe//a:Prendre le s colonies lactos e - H2 S - e t lac - H2 S + .

Repiquer a u moin s 4 colonies su r milieu u r é e indole.Incube r à 37 °C au bain-marie pendan t 4h. • U r é a s e + :Proteus .

— • U r é a s e - : ensemencer à partir de chaque milie u un TSI et LDC + t é m o in ( 37 ° C pdt une nuit ) • S i u r ée - TD A - LD C + : Salmonella ( si gaz +, H2S+ :mineur e o u para B )

( s i gaz +, H2S- :par a A ) ( s i gaz -, H2S - o u + :Typhi )

— • P r o c é d e r à l'identification a n t i g é n i q u e .( N B : Salmonelles majeure s r e c h e r c h é e s é g a l e m e n t dans l ' h é m o c u l t u r e , e t par s é r o d i a g n o s t ic d e Widal ).

• S i u r ée - , TDA - , LDC - : Shigella ( gaz -, H2 S - , Lac et Sacch - )— • identification a n t i g é n i q u e . 2° -Recherche d'E. coli e n t é r o p a t h o g è n e s : (nourrisson < ou = à 2 ans )

A parti r des boite s de BCP repiquer 8 à 10 colonies La c + sur milieu u r é e indol e ou eau p e p t o n n ée exempt e d'indole e t sur TSI .incube r à 37 °C pendan t 2 4 h . Les colonie s indol e +, u r é e - , TDA - e t gaz+, lactos e + dans l e TSI — • identification a n t i g é n i q ue à l'aide de s é r u m s ant i EPEC. 3 ° - R e c h e r c h e de Yersinia enterocolitica : E f f e c t u é e à la demande. A parti r de la suspension d e selle, effectuer u n isolement su r Hecktoen. Incube r le s boites à 28 °C de p r é f é r e n c e s i non à 37 °C pendan t un e nuit ( rarement + ) et un enrichissement su r milieu de Rappapor t m o d i f i é i n c u b é pendan t 3 semaines à + 4°C e n faisant des repiquages toute s le s semaines.( u r é e + , Lac +, gaz - , H2S -,ODC +, VP + à t°p d u labo et - à 37° C ). 4"-Recherche de V.cholerae : Se fait à la demande. Su r GNAB, r e p é r e r le s colonies suspectes Transparentes , b l e u t é e s , plate s et à contours r é g u l i e r s . A parti r de chaque colonie , effectuer un e recherche d'oxydase . • S i oxydase + :Repiquer l e reste d e la colonie sur milieu KIA et Incuber à 37 °C . • S i KIA :glucose + , gaz -, lac -, on agglutine ave c l e s é r um 0 1 polyvalent ant i V.cholerae e t 0139 . • S i agglutination + : C'est un Vibrion .cholerae. • S i agglutination - : Ensemencer un e galerie biochimiqu e contenant le s acides a m i n é s . Ell e nou s perme t

de d i f f é r e n c i e r V.cholerae no n 01 des Aeromonas e t Plesiomonas . Vibrio Aeromonas Plesiomonas

ADH - + + ODC V - +

5"-Recherche de Campvlobacter : E f f e c t u é e à la demande. Cultur e su r milieu de SKIRROW pendan t 4 8 h en m i c r o - a é r o p h i l i e . I l s'agit d'u n bacill e gram - e n virgule o u en S , t r è s mobile , oxydase +. 6°- D i a r r h é e post ATB : D é t e c t i o n d e la toxine B dans le s filtrats d e selles pa r recherche d'u n EC P sur des cultures cellulaire s (cellule s Vero , MRC5 , Ma c Co y ). 7°-Dans les TIAC : Cas du botulisme, recherche d e la toxine dan s l e s é r um d u malade e t dans l'alimen t suspect. 8"-Dans le cas du SHU : Recherche d'E.col i 015 7 sur Mac conk y + sorbitol (si sorbitol n é g a t i f ) -> Agglutination ave c l e s é r um ant i 0157 .

E - L'antibiogramme : Il est s y s t é m a t i q u e, i l permet un e surveillance é p i d é m i o l o g i q u e de s r é s i s t a n c es au x ATB. Le traitement ATB n'es t j u s t i f i é qu'e n ca s de d i a r r h ée t r è s invasiv e ave c selle s sanglante s ou mucopurulentes, che z le s personnes ayan t u n déf ic it immunitair e ou en cas de prolongation anormal e d'un e d i a r r h é e d'origin e b a c t é r i e n n e .

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