Expresión Diferencial del Genoma en el Desarrollo - II
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Expresión Diferencial del Genoma en el
Desarrollo - IIBiol 3019Biología del DesarrolloUniversidad de Puerto
Rico-AguadillaJA Cardé, PhD
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ObjetivosRepasar los conceptos de equivalencia genómica
y de expresión diferencial del genoma.Repasar la anatomía de un gen y del mRNA
Promotores, enhancers, TF y silencers
Explicar los mecanismos de transcripción diferencial
Discutir el procesamiento diferencial del mRNAResumir los mecanismos de controlde expresión
genética: transcripcional, traduccional, pos-traduccional; y sus implicaciones en el desarrollo.
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Mecanismos de Transcripción diferencial
TF: Ya se sabe quienes son, pero no se sabía su rol?
ChIP-Seq Technique: Aislar y crosslink la cromatinaCortar el DNA (sonicación/enzimas)Incubar con AB vs la proteína de
interésPrecipitar complejo AB-Prot-DNASeparar el DNA, PCR y secuenciar
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Mecanismos de Transcripción diferencialChIP-Seq, identifica dos tipos de promotoresHigh CpG content promoters
Default ON, DNA no metilado activo; para inactivarlo metilar las histonas
En genes de control del desarrollo temprano Regulan la síntesis de TF y otras proteínas
reguladorasLow CpG content promotors
proteínas características de etapas tardías, células maduras
Defaults OFF: DNA metilado inactivo, hay que demetilar y esto permite modificar las histonas (H3K4me3) y la RNA pol II entra.
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Transcripción diferencial: mecanismosMetilación del DNA: ON/OFF switch
Histonas metiladas para?________________… y el DNA? En las citosinas del promotor5 Metilcitosina (5ta base) estabiliza nucleosomas
previene transcripciónPresente en 5% de las C (seguidas por G) luego de
la replicaciónRegulación transcripcional en vertebradosMetilación del DNA:
Bloquea la unión de TF a enhancers con C metiladaFacilita reclutamiento de metilasas y deacetilasas,
estabilizando el nuclesoma para evitar transcripción (MeCP2)
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Transcripción diferencial: mecanismosMetilación del DNA: ON/OFF switch
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Como comparan en (términos de metilación) el promotor de las globinas en RBC inmaduros vs RBC maduros durante el desarrollo?
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Metilación: Patrones heredables: DNMT3DNMT1
DNA CpG||
DNMT3 (de novo)
||
DNMT1 (forever)
Asignado: 3 estados de la cromatina: activa, reprimida o “poised” (pag 51).
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RNAProcesamiento Diferencial:La clave de la diferenciación celular es la síntesis de diferentes
proteínas en diferentes tipos de célulasEn bacteria el control es: transcripcion, traduccion y
postraduccionEn eucariota: uno mas; procesamiento y transporteSplicing isoforms:En humanos 90% de los genes lo usan
“Human Genes are multitaskers” – Christopher BurgeGenoma: 20,000 genes < Proteoma: 20,000 proteínas
Genes Cells ProteinsC elegans 20,000 959 ~20000H sapiens 20,000 100,000 bil ~100,000
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Alternative Splicing Variants
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Bcl-XS vs Bcl-XL:- large Bcl = inhibe apoptosis- short Bcl = induce apoptosisen tumores cual predomina?
Spliceosome
Factores de splicing- Expresados diferencial-mente
- snRNA U1 y SF2 en 5’
- U2AF en 3’
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RNAProcesamiento Diferencial:ER - Drosphila Dscam geneLa clave de la diferenciación celular es la síntesis de
diferentes proteínas en diferentes tipos de célulasSplicing isoforms:
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Altenative Splicing: FGF
IIIb vs IIIc - Ambos en
entre ex 7 y 8
- En mesenq IIIC: mesodermo
- En epitelio IIIB :ectodermo
- Metilaciones marcan splicing
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Splicing enhancers y recognition factorsSplicing enhancer (cis) sequences (SES)
Cerca de sitios de splicing Promueven el ensamblaje del spliceosome
Recognition factors (trans) proteins Reconocen las SES y reclutan el splicesoma Polypirimidine track binding proteinas (PPT) reprimen
la formacion del spliceosoma
Hay señales que sugieren que el contexto tambien es importante
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Aplicación clínicaMutaciones en splicing sites:La mayoria resultan en proteinas NO
funcionalesDistrofina: mutación en un “splicing
site” causa que se salte el exónMyostatin gene: mutacion en el induce
personas mas “fuertes”Su proteina es un regulador negativo
de division celular muscularHipertrofia muscular – como miostatina
no esta, el musculo se sigue dividiendo hasta mas tarde: musculos mas grandes
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Myostatin Knockout
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Control: Nivel traduccional:longevidad diferencialLongevidad diferencial del mRNA
: media vida del mRNAMientras mas estable mas dura y
mas copias de la proteínaLongitud del poli A, secuencias
en el 3’UTR para mayor longevidad
Estabilización de ciertos mRNA en ciertos momentos en ciertas células
mRNA caseína : 1.1 hr en tejido mamario vs 28.5 hrs en lactancia (prolactina)
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Control: Nivel traduccional:Inhibicion selectiva de mRNAsOvocito: fabrica y almacena los mRNAs
que se usarán solamente luego de fecundación.
Se mantienen en estado durmiente hasta que llegue la señal: polaridad / iones
Ej de mRNAs en el huevo: histonas, actina/tubulina, ciclinas
Drosophila: bicoid, caudal, nanos (homeobox)
Regulación traduccional “negativa”: inhibidores
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Control: Nivel traduccional:Inhibicion selectiva de mRNAs5’Cap, 3’ Poly A ; si no estan no
traduccionCircularización de mRNA- 5’ cerca de 3’- eIF4E +- eiF4A
(helic)- eiF4G (scaf)- poliABP
- Maskin- CPEB
(3’UTR) (uuuuau)
- eIF4E- Fosforilacio
n de CP y Maskin activa
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Control: Nivel traduccional- Tienen favoritismos los ribosomas? NO!- a favor: mRNAs de Euc son traducidos por ribosomas de Proc- sistema reticuloendotelial: traduccion por excelenciaSI: Selectividad ribosomal – Ribosomas
tienen proteinas distintas dependiendo del tejido
Observación de un gen que causaba deformidad esqueleto axial
Por la traducción diferencial del gen : Rpf38
Proteina 38 del ribosoma en las somitas, controla expresion del Hox6
Deficiencia de Rpf38 causa deformidad vertebral
Rpf38 Hox6
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Control: Nivel traduccionalpuede el RNA como las proteinas unirse a un acido nucleico y bloquearlo? SImicroRNAs – eficiente y específico medio
de regular la traduccion de un mRNAPequeños, complementarios a mRNA o
parte de elAnti sense RNA, primera vez en C elegansLin-4: RNA 21nctds silencia mRNA de
lin 14 uniéndose a su 3’UTR, marcado para degradación
Lin14 usado en larva temprana, luego inactivado
miRNAs – sobre 1000 en humanos, regulan 50% de nuestros genes estructurales
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- Conservado- El precursor tiene
varios repeats, cada uno forma un loop
- Estos loops son procesados por Drosha y Dicer (RNAsas
- Estas lo hacen SS RNA
- Empacado en RISC- Argonauta- Se unen al 3’UTR
- Inhiben traducción
- Perfect
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Prim-DroshaPrem-DicermicroAgo
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microRNAsmiR1- controla el balance entre crecimiento
ventricular y diferenciacionmiR181 – esencial para la determinacion de celulas
progenitoras en celulas BmiR430 – operacion limpieza de mRNAs maternales el
ovocito una vez traducidos (zebra fish)Fine tuning de Nodal: determinacion de
ectodermo/endodermoSon de 22 ncltds, pero con region “seed” de 5ncltd en
el 5’mRNA con 3’UTR mutado y micro RNA no lo reconoce?Texel sheep: myostatinMutacion en el previene splicing hipertrofia muscular,
por deficiencia de miostatinaOtra forma: transicion AG en 3’UTR, mir1 y mir 206,
degradan el mRNA
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Control de expresion de RNA: localización citoplásmicaSe regula el timing y la localizacion de la
expresion3’UTR – represion selectiva y localizacion
selectiva3 mecanismos de localizacion
Difusion y anclaje por proteinas activadoras (nanos)
Proteccion por localizacion (hsp83)Libre difusion como nanos pero no es
degradada en unas zonas especificas (polo posterior)
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• Transporte activo (mecanismo mas usado)
• Proteinas motoras ligan el 3’UTR y lo transportan
• Son ATPAsas (Dineina y kinesina, osar y bicoid)