“Actividad antimicrobiana y expresión génica diferencial ...

Universidad de León

Departamento de Biología Molecular

“Actividad antimicrobiana y expresión génica diferencial

en fagocitos humanos infectados con micobacterias

y Legionella pneumophila”

David Reyes Ruvalcaba

León, 2010

Los trabajos de investigación realizados en esta Memoria de Tesis Doctoral son

parte de los proyectos: PI05/1288 financiado por el Fondo de Investigación Sanitaria.

Ministerio de Sanidad y Consumo. Y LE07-04 financiado por la Junta de Castilla y

León

El autor de esta Memoria ha sido beneficiario de una beca de postgrado

(UACDJ-139) correspondiente al Programa de Mejoramiento del Profesorado de la

Universidad Autónoma de Ciudad Juárez - Secretaría de Educación Pública, México.

AGRADECIMIENTOS

Con la ayuda de Dios, los sueños sí se cumplen… a cualquier edad.

Sherry Buchanon

Primero agradezco a Dios N.S. por haberme concedido la gracia de llegar hasta

este momento. A mis padres (María Elena Ruvalcaba Hernández y Máximo Reyes Lara)

por haberme dado la vida y la oportunidad de haberme enviado a la escuela, que es la

mejor herencia que me han otorgado. A mis hermanos, Saúl, Favio y Ulises, y al resto

de familiares (presentes y ausentes). Por su apoyo incondicional, mil gracias.

Mi más profundo y sincero agradecimiento al Dr. Octavio Miguel Rivero

Lezcano por su paciencia y constante ayuda, sin la cual no hubiese logrado culminar

este trabajo. Y a los demás miembros del Grupo de Investigación en la Inmunología de

la Tuberculosis, Cristina y Carolina, gracias por su apoyo y consejos que me fueron

muy rentables para poder concluir este objetivo. También agradezco al Hospital de

León las facilidades proporcionadas para mi estancia en la Unidad de Investigación. Así

mismo hago extensivo mi agradecimiento al personal de extracciones del Hospital de

León por su ayuda desinteresada en la toma de muestras sanguíneas.

Agradezco de todo corazón la ayuda, consejos y apoyo proporcionado por dos

personas muy queridas por mí, Héctor Reyes Leal y Martha de la Torre Grajiola,

quienes a lo largo de este camino han estado ahí, en las buenas y en las malas.

Finalmente, no así menos importantes, a los Directivos de la UACJ, por las

facilidades otorgadas para poder culminar este trabajo. Y a mis amistades les agradezco

de corazón su apoyo moral y amistad.

DEDICATORIA

Dedico este Tesis a mí amada e incansable esposa, Myrna Gabriela, y a

nuestros hijos, Anayanci Carolina, David Eduardo y Jesús Alejandro. Gracias por su

cariño, apoyo, consuelo y sobre todo por su paciencia y por seguirme en esta aventura

que nos ha costado muchos sacrificios, pero también muy buenos momentos. Los quiero

mucho.

Ab imo pectore

Lo bueno de los años es que curan heridas,

lo malo de los besos es que crean adicción.

Joaquín Sabina

ÍNDICE

i

Índice General ---------------------------------------------------------------------------- i

Índice de Figuras ------------------------------------------------------------------------ vii

Índice de Tablas ------------------------------------------------------------------------- viii

Índice de Abreviaturas ---------------------------------------------------------------- ix

Introducción y Objetivos

Epidemiología de la tuberculosis -------------------------------------------- 1

Clasificación de las micobacterias y L. pneumophila ------------------ 3

Complejo Mycobacterium tuberculosis --------------------------------- 3

M. tuberculosis ---------------------------------------------------- 4

Otros miembros del CMT -------------------------------------- 5

Micobacterias no-tuberculosas ----------------------------------------- 5

L. pneumophila ----------------------------------------------------------- 7

Patogénesis y patología de la tuberculosis -------------------------------- 8

Desarrollo de la enfermedad ------------------------------------------- 9

Predisposición genética ------------------------------------------------- 10

Respuesta inmune frente a la tuberculosis -------------------------------- 11

Respuesta inmune innata o específica -------------------------------- 11

Macrófagos ------------------------------------------------------ 12

Interacción M. tuberculosis-macrófago, señalización

intracelular y fagocitosis ------------------------------- 13

Células epiteliales ----------------------------------------------- 15

Neutrófilos ------------------------------------------------------- 16

Células dendríticas ---------------------------------------------- 17

Células NK ------------------------------------------------------- 17

Respuesta Inmune adaptativa o específica ---------------------------- 17

Respuesta inmune celular (linfocitos T-Th/Tc) ------------- 18

Células CD4+ o Th --------------------------------------- 18

Células CD8+ o Tc --------------------------------------- 19

Células T γδ ---------------------------------------------- 19

Células CD1-restricted αβ ------------------------------ 19

Respuesta inmune humoral (linfocitos B) ------------------- 19

Granuloma tuberculoso ---------------------------------------- 20

Índice

ii

Evasión de la respuesta inmune --------------------------------------- 22

Citocinas ------------------------------------------------------------------------- 23

Citocinas pro-inflamatorias -------------------------------------------- 23

Interferón gamma (IFNγ) -------------------------------------- 23

Factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) --------------------- 25

Interleucina-12 (IL-12) ----------------------------------------- 25

Otras citocinas pro-inflamatorias ----------------------------- 26

Citocinas anti-inflamatorias -------------------------------------------- 26

Interleucina-10 (IL-10) ----------------------------------------- 26

Factor de crecimiento tumoral beta (TGFβ) ----------------- 26

Interleucina-4 (IL-4) -------------------------------------------- 27

Quimiocinas --------------------------------------------------------------- 27

Otras moleculas implicadas en la actividad antimicrobiana ---------- 29

Defensinas ----------------------------------------------------------------- 29

Catepsinas (CTS) --------------------------------------------------------- 30

Bomba de protones dependiente de ATP ----------------------------- 30

NADPH oxidasa ---------------------------------------------------------- 31

Óxido nítrico (NO) ------------------------------------------------------- 32

Slc11a1 --------------------------------------------------------------------- 32

Receptores de citocinas -------------------------------------------------- 33

IFNGR1 e IFNGR2 ---------------------------------------------- 33

TNFRSF1A -------------------------------------------------------- 33

Objetivos --------------------------------------------------------------------------- 35

Material y Métodos

Bacterias ---------------------------------------------------------------------------- 36

Cepas bacterianas ---------------------------------------------------------- 36

Manipulación y cultivo de bacterias ------------------------------------------ 37

Condiciones de cultivo ---------------------------------------------------- 37

Individualización de bacterias -------------------------------------------- 37

Cuantificación de bacterias ------------------------------------------------ 38

Células humanas ------------------------------------------------------------------- 39

Manipulación y cultivo de las células ------------------------------------ 39

Líneas celulares -------------------------------------------------------------- 39

Índice

iii

Células sanguíneas humanas ----------------------------------------------- 39

Reactivos para la purificación de monocitos y

neutrófilos ----------------------------------------------------------- 40

Solución tampón DPBS con BSA ------------------------- 40

ACD --------------------------------------------------------- 40

Solución dextrano ------------------------------------------- 40

Solución de KCL -------------------------------------------- 40

Purificación y cultivo de monocitos ----------------------------- 40

Purificación y cultivo de neutrófilos ----------------------------- 41

Infecciones --------------------------------------------------------------------------- 43

Reactivos específicos ------------------------------------------------------- 43

TPA ------------------------------------------------------------------ 43

Vit-D3 --------------------------------------------------------------- 43

Citocinas ------------------------------------------------------------ 43

Infecciones de líneas celulares -------------------------------------------- 43

Infecciones de monocitos y neutrófilos ---------------------------------- 43

Cuantificación de bacterias intracelulares y extracelulares ----------- 44

Comprobación de la fagocitosis de micobacterias (tinción

Kinyoun-Giemsa) ----------------------------------------------------------- 45

Reactivos específicos de la tinción Kinyoun-Giemsa -------- 45

Solución Etanol-HCl --------------------------------------- 45

Colorante Giemsa ------------------------------------------ 45

Solución A -------------------------------------------------- 45

Etanol ------------------------------------------------------- 45

Tinción Kinyoun-Giemsa ---------------------------------------- 45

Infecciones para cuantificación de citocinas --------------------------- 46

Infecciones para obtención de ADNc ----------------------------------- 46

Análisis estadístico -------------------------------------------------------- 46

Cuantificación de citocinas ----------------------------------------------------- 48

Método ELISA ------------------------------------------------------------- 48

Método CBA --------------------------------------------------------------- 48

Análisis estadístico -------------------------------------------------------- 49

Expresión génica ------------------------------------------------------------------ 50

Índice

iv

Reactivos específicos ------------------------------------------------------ 50

Solución TE -------------------------------------------------------- 50

Solución TAE ------------------------------------------------------ 50

SYRB green-fluoresceína ---------------------------------------- 50

Genes diana ----------------------------------------------------------------- 50

Diseño de cebadores ------------------------------------------------------- 50

Obtención de ARN total y síntesis de ADNc -------------------------- 53

Estimación de las eficiencias de las reacciones de PCR ------------- 53

Estudio de expresión diferencial mediante qPCR en tiempo

real -------------------------------------------------------------------------- 55

Resultados

Infecciones en diferentes tipos celulares ----------------------------------- 56

Infecciones en células promielocíticas humanas (HL60) ----------- 56

Infección de células HL60 con M. avium -------------------- 56

Efecto del suero en el crecimiento intracelular de mico-

bacterias con grado distinto de patogenicidad en células

HL60 infectadas ------------------------------------------------- 56

Infecciones en monocitos primarios ----------------------------------- 58

Infección de monocitos con M. avium y M. gordonae ----- 58

Infecciones en células epiteliales pulmonares (A549) -------------- 59

Capacidad de los fagotitos humanos (monocitos y neutrófilos)

para eliminar a micobacterias no patógenas ------------------------------ 61

Actividad anti-microbiana de fagotitos humanos ------------------- 61

Infección de monocitos y neutrófilos con bacterias de

diferentes grado de patogenicidad --------------------------- 61

Cuantificación de micobacterias extracelulares y

determinación de la fagocitosis ------------------------------ 64

Patrón de secreción de citocinas en los fagotitos infectados ----- 64

Cuantificación de citocinas pro y anti-inflamatorias ------ 64

Neutralización de citocinas en monocitos infectados con

M. tuberculosis y M. gordonae atenuada ------------------- 66

Activación de los fagotitos con citocinas y su efecto en la

actividad anti-microbiana ---------------------------------------------- 68

Índice

v

Efecto del IFNγ y del TNFα en la actividad anti-

microbiana -------------------------------------------------------- 68

Expresión génica de monocitos infectados con diferentes

bacterias ---------------------------------------------------------------------------- 70

Expresión génica mediante qPCR en tiempo real -------------------- 73

Expresión génica de CCL20 en monocitos infectados

con diferentes micobacterias -------------------------------------------- 75

Discusión

Infecciones ------------------------------------------------------------------------ 77

Infecciones en las líneas celulares HL60 y A549 -------------------- 77

Infecciones en monocitos ----------------------------------------------- 78

Efecto del suero en el crecimiento intracelular de

M. avium en monocitos ---------------------------------------- 78

Obtención del modelo de infección ----------------------------------- 78

Actividad antimicrobiana de fagotitos humanos -------------------- 79

Activación de los fagotitos con citocinas y su efecto en la

actividad anti-microbiana ---------------------------------------------- 81

Patrón de secreción de citocinas en fagotitos infectados ---------- 82

Expresión génica mediante qPCR en tiempo real ---------------------- 84

Expresión génica -------------------------------------------------------- 84

Defensinas (DEFB 1, 2, 3, 4) ------------------------------------------ 84

CTS D y G ---------------------------------------------------------------- 85

NRAMP1 ------------------------------------------------------------------ 85

Receptores de citocinas ------------------------------------------------- 86

IFNGR1 e IFNGR2 --------------------------------------------- 86

TNFRSF1A ------------------------------------------------------ 87

Subunidades de la bomba de protones dependiente de ATP

(ATP6V1G1 y ATP6V0C) ---------------------------------------------- 87

Subunidades de la NADPH oxidasa (p47 phox y gp91 phox) ----- 88

iNOS ----------------------------------------------------------------------- 88

Quimiocina CC ligando 20 -------------------------------------------- 89

Conclusiones

Conclusiones -------------------------------------------------------------------- 91

Índice

vi

Bibliografía

Bibliografía ---------------------------------------------------------------------- 92

Anexos

Anexo 1: Publicación: Human phagocytes lack the ability to kill Mycobacterium

gordonae, a non-pathogenic mycobacteria ------------------------- 113

Índice

vii

Índice de Figuras

Figura 1: Incidencia de la tuberculosis a nivel mundial en el año 2007 ------ 2

Figura 2: Incidencia de la tuberculosis respiratoria por Provincias en

Castilla y León. Tasa por cada 100.000 habitantes ------------------- 2

Figura 3: Esquema de la pared celular de M. tuberculosis --------------------- 5

Figura 4: Vías de entrada y transmisión de M. tuberculosis ------------------- 9

Figura 5: Representación esquemática de la formación de las células

sanguíneas ----------------------------------------------------------------- 13

Figura 6: Esquema de la formación del granuloma tuberculoso --------------- 21

Figura 7: Purificación de monocitos: separación de la capa de células

mononucleares (monocitos y linfocitos) del resto de los

componentes sanguíneos ------------------------------------------------- 41

Figura 8: Actividad anti-microbiana de los fagotitos (A, monocitos;

B; neutrófilos) -------------------------------------------------------------- 63

Figura 9: Activación de fagocitos con citocinas. La multiplicación intracelular

de las bacterias en monocitos (A) o neutrófilos (B) ----------------- 69

Figura 10: Geles de agarosa de los genes diana p47 phox, gp91 phox, iNOS,

NRAMP1, CTSG y D, ATP6V1G1, ATP6V0C, TNFRSF1A,

INFGR1, IFNGR2 y CCL20 --------------------------------------------- 71

Figura 11: Geles de agarosa de los genes de las DEFB1, 2, 3 y 4 ---------------- 72

Índice

viii

Índice de Tablas

Tabla 1: Clasificación científica de M. tuberculosis y L. pneumophila ------- 7

Tabla 2: Bacterias utilizadas -------------------------------------------------------- 36

Tabla 3: Descripción de los genes utilizados ------------------------------------- 51

Tabla 4: Cebadores utilizados ------------------------------------------------------ 52

Tabla 5: Comparación de la supervivencia de micobacterias de diferente grado

de patogenicidad, a diferentes concentraciones de suero ------------ 57

Tabla 6: Efecto del suero en el crecimiento de las micobacterias ------------- 58

Tabla 7: Efecto del suero en el crecimiento de micobacterias en

monocitos infectados ----------------------------------------------------- 59

Tabla 8: Supervivencia de micobacterias en línea celular A549 -------------- 60

Tabla 9: Prueba t de student para la igualdad de medias en neutrófilos infectados - 64

Tabla 10: Cantidad de citocinas liberadas de fagocitos infectados ------------- 66

Tabla 11: Actividad anti-microbiana de monocitos frente a M. tuberculosis y M. gordonae atenuada en presencia de anticuerpos de neutralización

anti-citocinas --------------------------------------------------------------- 67

Tabla 12: Expresión génica de diversos genes en ADNc de monocitos ------- 74

Tabla 13: Expresión génica de CCL20 en monocitos infectados con dos

cepas diferentes de M. tuberculosis ------------------------------------- 76

Tabla 14: Expresión de CCL20 en monocitos infectados con micobacterias

de diferente grado de patogenicidad ------------------------------------ 76

Tabla 15: Cebadores de los genes normalizadotes -------------------------------- 76

Índice

ix

Índice de abreviaturas

% Porcentaje

> Mas de

º C Grado centígrado

7H2O Hepta hidratado

A549 Línea celular epitelial pulmonar (adenocarcinoma humano)

ADC Citrato Ácido Dextroxa, siglas en inglés

ADN Ácido Desoxi-Ribonucleico

ADNc Ácido Desoxi-Ribonucleico complementario

AELC Asociación Europea de Libre Comercio

Anti-CD Anti-cluster of differentiation

anti-IL-β1 Anti-Interleucina Beta 1

APC Células Presentadoras de Antígenos, siglas en inglés

ATP6V0C Subunidad V0C de la bomba de protones vacuolar

ATP6V1G1 Subunidad V1G1 de la bomba de protones vacuolar

CBA “Cytometric Bead Array”, siglas en inglés

cc Centímetro cúbico

CCL20 Quimiocina CC ligando 20

CCR6 Receptor de quimiocina 6

CD cluster of differentiation

CMA Complejo Mycobacterium avium

CMT Complejo Mycobacterium tuberculosis

Ct Ciclo umbral

CTS Catepsina

DE Desviación estándar

DEFB- Defensina β-

dH2O Agua destilada

dNTP´s Di-Nucleotidos Tri-Fosfato

EDTA Etilen-Diamino Ácido Tetra-acético, siglas en inglés

EF1α Factor de elongación1 alfa

ELISA “Enzime-linked immunosorbent assays”

g velocidad angular + radio

g/l Gramo por Litro

Índice

x

GM-CSF Granulocito-Macrófago Factor Estimulante de colonias

gp91 phox subunidad gp91 de la NADPH oxidasa

gr Gramo

HCl Ácido clorhídrico

IFN-γ Interferón gamma

IgG1 Inmunoglobulina G 1

IL- Interleucina-

INFGR1 Receptor de la cadena alfa del Interferón gamma

INFGR2 Receptor de la cadena beta del Interferón gamma

iNOS2 Oxido nítrico sintetasa 2A

Kb Kilo base

KCl Cloruro de potasio

KDa Kilo dalton

KH2PO4

MIP3α Proteína Inflamatoria del Macrófago 3 alfa

ml Mililitro

mM Mili molar

mm Milímetro

MOI “Multiplicity of infection”

M-SFM Medio de macrófagos libre de suero

N Normal

Na2PO4 Fosfato de sodio

NaCl Cloruro de Sodio

NK Células Asesinas Naturales, siglas en inglés

nM Nano Molar

nm Nanómetro

NRAMP1 Resistencia natural-asociada a la proteína 1 del macrófago

p47 phox subunidad p47 de la NADPH oxidasa

PAM´s Patrones moleculares asociados a patógenos

pb Pares de bases

PBS Tampón de fosfato salino

PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa

pg Picogramo

pH Potencial ión hidrógeno

Índice

xi

PMA forbol 12-miristato 13-acetato

PRR´s Receptores de reconocimiento de patógenos

qPCRrt PCR cuantitativa en tiempo real

RD Regiones de diferencia

SFB Suero fetal bovino

SFM Medio libre de suero

Slc11a1 Gen acarreador de solutos de la familia 11 miembro 1

SPSS Paquete estadístico de las ciencias sociales, siglas en ingles

TAE Tris-ácido acético-EDTA

Tc Célula T citotóxica

TE Tris-EDTA

TGF-β1 factor de crecimiento tumoral β1

Th Célula T helper

TNFRSF1A Receptor del factor de necrosis tumoral de la súper familia 1A

TNF-α Factor de necrosis tumoral alfa

TPA forbol 12-miristato 13-acetato

UFC Unidad formadora de colonias

V Versión

Vit-D3 1,25 dihidroxicolecalciferol

W Watts

w/v Peso / volumen, siglas en inglés

µg Microgramo

µl Microlitro

INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS

1

EPIDEMIOLOGÍA DE LA TUBERCULOSIS

Uno de los principales problemas de salud publica a nivel mundial es la

tuberculosis, que durante siglos ha azotado a la humanidad, y actualmente es

considerada como una enfermedad emergente [van Soolingen et al., 1997]. El virus de

la inmunodeficiencia humana (VIH) y el surgimiento de cepas multirresistentes están

contribuyendo al aumento de la mortalidad por tuberculosis, que es considerada como

una enfermedad curable [Olleros et al., 2005].

La Organización Mundial de la Salud, en el año 2009, informa que el número

estimado de nuevos casos de tuberculosis para el año 2007, fue de 9,27 millones (139

por 100.000 habitantes) entre ellos 4,1 millones de nuevos casos bacilíferos, es decir el

44,0 % del total (61 por cada 100.000 habitantes) y aproximadamente 1,37 millones

(14,8 %) son VIH-positivos.

Para ese año se estimó que 13,7 millones fueron casos prevalentes de

tuberculosis (206 por 100.000 habitantes) de los cuales 687.000 (5 %) eran VIH-

positivos. La cifra estimada de defunciones, en ese mismo año, fue de 1,32 millones

VIH-negativos y adicionalmente 456.000 casos fueron VIH-positivos [WHO, 2009].

En España la tuberculosis en al año 2007 presentó una incidencia de todas las

formas de 13.103 casos (tasa de 30 por cada 100.000 habitantes) [WHO, 2009]. Y una

tasa de 15,1 por cada 100.000 habitantes de tuberculosis respiratoria [Enfermedades de

Transmisión Respiratoria, JCyL, 2009]. La prevalencia fue de 10.320 casos (tasa de 23

por cada 100.000 habitantes). Siendo la mortalidad fue de 1.375 casos (tasa de 3 por

cada 100.000 habitantes) [WHO, 2009]. En la Fig.1 se representa esquemáticamente la

incidencia de la tuberculosis a nivel mundial para el año 2007, donde se observa que

España se encuentra en el rango de 25 a 49 por cada 100.000 habitantes.


2

Fig. 1: Incidencia de tuberculosis a nivel mundial en el año 2007, [WHO 2009].

De acuerdo con el Boletín Epidemiológico de Castilla y León (Enfermedades de

Transmisión Respiratoria, año 2007) en la comunidad de Castilla y León, se registraron

458 casos de todas las formas clínicas de tuberculosis (tasa de 18,11 casos por 100.000

habitantes). Siendo la incidencia más elevada en el grupo de edad de 20 a 45 años, otro

grupo de edad que presenta una alta incidencia fue el de 75 a 80 años De todas las

provincias de esta Comunidad, la provincia de León presentó la más alta incidencia con

20,91 por cada 100.000 habitantes (Fig. 2), y la de Zamora la más baja (3,04 casos por

100.000 habitantes) [Enfermedades de Transmisión Respiratoria, JCyL, 2009].

Fig. 2: Incidencia de tuberculosis respiratoria por Provincias en Castilla y León. Tasa por cada 100.000 habitantes. [JCyL,2009].

3

CLASIFICACIÓN DE LAS MICOBACTERIAS Y L.

PNEUMOPHILA

Las micobacterias están ampliamente distribuidas en la naturaleza y se incluyen

tanto bacterias saprofitas como patógenas, tienen una amplia gama de huéspedes que va

desde plantas a humanos [Pieters, 2001]. Las cepas patógenas, que incluyen a M. leprae

y los miembros del complejo Mycobacterium tuberculosis (CMT), como M.

tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti, y M. canettii, que son los micro-

organismos cuya recuperación del cuerpo humano esta casi siempre asociada con la

enfermedad. Dentro del grupo de las micobacterias también encontramos a las llamadas

no tuberculosas que comprende a todas las otras especies de micobacterias que pueden

causar trastornos pulmonares que se asemejan a la tuberculosis [Piersomoni y Scarpano,

2008]. Las micobacterias que causan la enfermedad tuberculosa se pueden englobar en

dos grandes grupos: CMT y micobacterias no tuberculosas (MNT).

Complejo Mycobacterium tuberculosis

El CMT comprende varias especies de micobacterias muy parecidas entre si,

estrictamente responsables de la tuberculosis humana y zoonótica. Son bacterias de

crecimiento lento, ácido resistentes, y genéticamente comparten secuencias idénticas de

la fracción 16S del ARN ribosomal y más del 99.0 % de su secuencia nucleotídica es

idéntica. Sin embargo, difieren significativamente en su morfología, bioquímica, y en el

rango de huéspedes que afectan [Boddinghaus et al., 1990; Sreevatsan et al., 1997].

El alto grado en la conservación de secuencias del ADN entre las micobacterias

pertenecientes al CMT, ha limitado el desarrollo de herramientas diagnósticas a nivel

molecular para identificar los miembros individuales. No obstante, estudios

filogenéticos recientemente han puesto en evidencia regiones del genoma que exhiben

múltiples polimorfismos, que han sido colectivamente designados como regiones de

diferencia (RD) [Liebana et al., 1996; Gordon et al., 1999; Brosch et al., 2002;

Mostowy et al., 2002; van Embden et al., 2000]. La comparación del ADN total de la

cepa de referencia de M. tuberculosis H37RV con el genoma de otras micobacterias del


4

complejo, han revelado la existencia de 16 RD, de un tamaño entre 2 y 12,7 Kb

presentes en el genoma de M. tuberculosis pero ausentes en otros miembros del CMT

[Gordon et al., 1999; Brosch et al., 2002; Mostowy et al., 2002; Mostowy et al., 2004].

Debido a que los loci RD parecen haberse acumulado secuencialmente y están

diferencialmente distribuidos entre varios grupos de micobacterias del CMT, estos han

sido propuestos como marcadores genéticos para diferenciar entre subespecies de este

complejo [Brosch et al., 2002; Huard et al., 2003; Mostowy et al., 2004].

M. tuberculosis

La bacteria M. tuberculosis fue descubierta por Heinrich Hermann Robert Koch

(1843-1910) a finales del siglo XIX (1882) [Koch, 1982]. Es un patógeno intracelular,

que puede ocasionar patología grave, es de lento crecimiento y aerobio estricto [Pieters,

2001]. Pertenece a la familia Mycobacteriaceae, la clasificación científica se muestra en

la tabla 3, y es considerado como el agente principal causante de la tuberculosis humana

en el mundo [van Soolingen et al., 1997]. Tras varias décadas de disminución de la

incidencia de la tuberculosis, a mediados de los ochenta se produjo un drástico

incremento. Las principales causas para el desarrollo de esta enfermedad son debidas a

las malas condiciones económicas y sociales de la población, así como la extensión de

la epidemia del VIH [Hartmann y Plumm, 1999; Raja, 2004].

Las causas de la virulencia de M. tuberculosis aun no se conocen del todo, ya

que no tienen factores de virulencia clásicos como la producción de toxinas. Se han

realizado estudios de mutación de genes para determinar los factores que la hacen

virulenta tanto en modelos humanos como de animales. Y se ha observado que genes

que codifican para enzimas que intervienen en la síntesis de la pared celular se

relacionan con la patogenicidad de la bacteria. La pared celular (Fig. 3) es una

estructura compleja formada por proteínas, lípidos y carbohidratos, que son diferentes a

las demás bacterias, Un ejemplo es el lipoarabinomanano (LAM), el mayor componente

de la pared celular, que es un complejo glicolípido que contiene repeticiones del

disacárido arabinosa-manosa y que es un importante inmunomodulador [Smith, 2003].

Se ha observado que esta molécula es un potente inhibidor de la actividad del IFNγ en

macrófagos de ratón [Chan et al., 1991].


5

Fig. 3: Esquema de la pared celular de M. tuberculosis (1); Lípidos externos (2); Ácidos micólicos (3); Arabinogalactano (4); Péptido glicano (5); LAM (6); Fosfatidilinositol monóxido (7); Membrana plasmática (8).

Otros miembros del CMT

Aunque M. tuberculosis se conoce como el principal agente causal de la

tuberculosis humana, se ha reconocido la importancia epidemiológica de la transmisión

zoonótica de M. bovis al humano, ocasionada por estar en contacto o consumo de

productos de animales infectados [Zumárraga et al., 1999; Michael, 2002; Ayele et al.,

2004; Fritsche et al., 2004]. También se ha documentado la coinfección con M. bovis

variedad BCG, en niños y M. bovis en pacientes infectados con el VIH [Samper et al.,

1997: Hesseling et al., 2004].

M. africamun es una micobacteria que se subdivide en dos tipos, el tipo I, que se

considera como epidémico en el Este de África y el tipo II, en el oeste de África

[Frothingham et al., 1993]. M. canetti, considerada como la más ancestral de las

micobacterias causante de tuberculosis [Mostowy y Behr, 2005], encontrada

anecdóticamente en un niño somalí en 1993 [van Soolingen et al., 1997]. M. microti,

micobacteria que afecta a pequeños roedores del campo [Wells, 1953], también ha sido

aislada en humanos [van Soolingen et al., 1998]. M. caprae, es una rara enfermedad en

el ganado [Aranaz et al., 1999; Aranaz et al., 2003], además de ser una tuberculosis

zoonótica en humanos [Blaas et al., 2003].

Micobacterias no-tuberculosas

Las micobacterias no tuberculosas [American Thoracic Society, 1990], han sido

también descritas como micobacterias atípicas [Pinner, 1935], anónimas [Runyon,

1959], no clasificadas [Corpe et al., 1963] o ambientales [Caminero-Luna, 2001]. Estas


6

bacterias incluyen a todas las especies que no forman parte del CMT. Pueden producir

infecciones con muchos de los síntomas de la tuberculosis. A pesar de que estas

micobacterias son comunes, por lo general causan infección solo en las personas con un

sistema inmunitario debilitado (inmunocomprometido, principalmente pacientes con

SIDA). La mayoría de estas bacterias viven libres como saprofitas y están ampliamente

distribuidas por todo el mundo y en una gran variedad de reservorios ambientales,

especialmente en el agua (dulce o salada) y en la tierra. Aunque también se han aislados

del polvo, aerosoles y biofilms de sistemas de distribución de agua para consumo

[Collins et al., 1984; Rodgers et al., 1999; Caminero-Luna, 2001; Falkinham, 2002].

Estas micobacterias son patógenos oportunistas capaces de ocasionar linfadenitis

e infecciones en: pulmones, piel, tejidos blandos, articulaciones y huesos [Benson,

1994; Benson y Ellner, 1993; Wallace et al., 1990; Wolinsky, 1979]. Las infecciones de

piel, tejidos blandos, articulaciones y huesos, ocasionadas por las MNT, están asociadas

a heridas traumáticas o quirúrgicas [Wallace et al., 1990; Fitzgerald et al., 1995;

Sanders et al., 1995].

Las micobacterias no tuberculosas conforman un grupo muy amplio, pero para

nuestro estudio solo vamos a considerar tres: Complejo M. avium (CMA), M. kansasii y

M. gordonae. El CMA incluye tres especies reconocidas (M. avium, M. intracellulare y

M. chimaera) y otros organismos no clasificados (denominados como especies de

Mycobacterium avium-intracellulare grupo X). Son de lento crecimiento, bacilos ácido

resistentes y no pigmentados [Piersimoni, 2008]. Se ha observado que la incidencia de

la enfermedad que producen ha aumentado en los últimos años [McGarvey y Bermudez,

2002]. M. kansasii es, después del CMA, la especie de MNT mas frecuente, responsable

de la enfermedad pulmonar en individuos inmunocomprometidos. Es una micobacteria

de lento crecimiento. En España, en pacientes con SIDA es la especie más

frecuentemente aislada [Caminero-Luna, 2001]. M. gordonae es una micobacteria

saprofita, que es frecuentemente aislada e identificada en los laboratorios, y casi

siempre considerada como no patogénica, pero ocasionalmente produce patología

pulmonar. Es de lento crecimiento y ácido resistente. Se encuentra ampliamente

distribuida en el medio ambiente agua, tierra, y leche no esterilizada [Douglas et al.,

1986; Weinberger y Berg, 1992].


7

L. pneumophila

L. pneumophila es la bacteria causante de la legionelosis o enfermedad de los

legionarios, una forma grave de neumonía que en ocasiones produce una infección

sistémica, y que se ve particularmente en individuos inmunocomprometidos que tienen

un mecanismo de respuesta inmune deficiente [Nakachi, et al., 2000]. Esta bacteria es

un bacilo facultativo intracelular, Gram negativo [Müller et al., 1996]. Se clasifica en la

Clase de las Proteobacterias gamma y la Familia Legionellacae (clasificación científica

se muestra en la tabla 1). Es considerada como un microorganismo exigente en cuanto a

sus condiciones de cultivo ya que requiere de un pH óptimo, estrechos rangos de

temperatura y no crecen en condiciones anaeróbicas [Brenner et al., 1979].

Tabla 1: Clasificación científica de M. tuberculosis y L. pneumophila

Reino Bacteria Bacteria

Filum Actinobacteria Proteobacteria

Clase Actinobacteria Proteobacteria gamma

Orden Actinomycetales Legionellale

Familia Mycobacteriaceae Legionellaceae

Género Mycobacterium Legionella

Especie M. tuberculosis L. pneumophila

Nombre binomial Mycobacterium tuberculosis Legionella pneumophila

Esta bacteria invade a los pulmones y tiene la capacidad de reproducirse en las

células que la fagocitan, como los monocitos y macrófagos alveolares [Horwitz y

Silverstein, 1980], leucocitos polimorfonucleares [Horwitz, 1984], También se ha

observado que se reproduce en la línea celular promielocítica HL60 [Marra et al., 1990]

y la línea celular U937 [Pearlman et al., 1988].

8

PATOGÉNESIS Y PATOLOGÍA DE LA TUBERCULOSIS

M. tuberculosis es una bacteria que tiene predilección por el tejido pulmonar rico

en oxígeno. La principal ruta de entrada al organismo es la vía respiratoria (Fig. 4). La

micobacteria se difunde desde el sitio inicial de la infección en el pulmón por el tejido

linfático y la sangre a otras partes del cuerpo, siendo el ápice pulmonar y los nódulos

linfáticos regionales sus sitios preferentes. Los sitios de difusión extrapulmonar son la

pleura, el tejido linfático, hueso, el sistema genito-urinario, las meninges, peritoneo y la

piel; esto sucede en aproximadamente el 15% de los enfermos con tuberculosis [Raja,

2004].

La transmisión de la infección tuberculosa es casi siempre por la vía aérea,

siendo éste un proceso de entrada natural, por el mecanismo de la respiración del sujeto

receptor. Otras vías de entrada, poco comunes, son la digestiva, dérmica o mucosa, que

requieren de situaciones especiales o anómalas en el huésped, como lo son la pérdida

de continuidad en las superficies expuestas (heridas o lesiones).

Para su transmisión es conveniente tomar en consideración dos condiciones que

nos permitan valorar el riesgo transmisor:

La fuente: Que es el reservorio emisor del agente infeccioso (persona enferma).

En algunas ocasiones, poco comunes, la fuente puede ser un animal enfermo. La

emisión de bacterias depende del carácter bacilífero de la fuente. Los principales

bacilíferos son los enfermos activos de tuberculosis laríngea o pulmonar, los

enfermos portadores de tuberculosis con cepas más virulentas y los enfermos

con SIDA.

El vehículo transmisor: Son los aerosoles emitidos por las personas enfermas,

las gotas que se desprenden de un estornudo o un acceso de tos, generalmente,

son gotas que se evaporan rápidamente y los residuos de esta evaporación son

pequeñas gotas que contienen a la micobacteria llamados núcleos goticulares de

Wells que, por su pequeño tamaño (1-10 µm), son capaces de mantenerse


9

suspendidos en el aire [Rodríguez-Bayarri y Madrid-San Martín, 2004; Bates y

Nardell, 1995].

Fig. 4: Vías de entrada y transmisión de M. tuberculosis.

Desarrollo de la enfermedad

Los núcleos goticulares de Wells son inhalados y hospedados en las vías

respiratorias dístales (alvéolos). Las micobacterias son fagocitadas por los macrófagos

alveolares, iniciando una cascada de eventos que puede resultar en una eliminación de la

infección o progresión de la infección a enfermedad activa. Aunque el riesgo de

desarrollar la enfermedad activa, varia de acuerdo al tiempo de la infección, edad, la

resistencia del huésped así como la virulencia del Mycobacterium [Pieters, 2001].

La tuberculosis con frecuencia se presenta de forma asintomática o como una

infección latente. La mayoría de los pacientes contiene la enfermedad de 2 a 10 semanas

con el subsiguiente desarrollo de una respuesta de hipersensibilidad de tipo retardada.

En aproximadamente el 5% de las personas infectadas el control de la replicación del

microorganismo es inadecuada, y desarrollan la enfermedad después de un periodo de

latencia de 1 a 2 años posteriores a la infección (tuberculosis primaria). En otro 5% la

contención del organismo falla dando como resultado el desarrollo de la enfermedad en

algún momento de su vida (tuberculosis postprimaria) [Hartmann y Plumm, 1999;

Flynn y Chan, 2001; van Crevel et al., 2002; Flynn et al., 2003]. La tuberculosis

pulmonar se puede manifestar clínicamente como tuberculosis primaria o post-primaria.

La sintomatología de la tuberculosis pulmonar primaria es inespecífica.


10

Síntomas generales: Son los más frecuentes y a veces pasan desapercibidos.

Astenia, anorexia, ligera elevación febril, alteración en la curva de peso, modificaciones

del carácter. La fiebre puede ser el síntoma principal.

Síndrome de hipersensibilidad a las proteínas del bacilo, como el eritema nodoso

y la querato-conjuntivitis flictenular. Sugiere una etiología tuberculosa, pero puede ser

debido a otras causas.

Síntomas respiratorios: Tos, dolor torácico, expectoración, hemoptisis. Los

cuales son poco frecuentes [Milburn, 2001].

La tuberculosis postprimaria es poco frecuente en la infancia; ocurre

principalmente en la adolescencia después de haber estado infectado durante varios

años. Puede producirse como consecuencia de una reactivación endógena, por las

micobacterias que han estado en estado latente desde que ocurrió la infección primaria,

o bien proceder del exterior y producir una reactivación exógena. Los síntomas son los

propios de la tuberculosis del adulto: Fiebre, tos, astenia, anorexia, dolor torácico,

esputo hemoptoico [Wallis y Jonson, 2001].

Predisposición genética

En 1926 en la ciudad de Lubeck, Alemania, hubo un trágico accidente durante

un programa de vacunación con el bacilo de Calmette-Guérin, donde 249 niños fueron

vacunados una bacteria viva de M. tuberculosis virulenta, y aunque 76 murieron, 173

sobrevivieron. Esta desafortunada experiencia mostró que hay una amplia variación de

grados de la inmunidad innata contra M. tuberculosis [Bellamy, 2005]. Estudios

posteriores han demostrado que la presencia de polimorfismos o de defectos genéticos

en ciertos genes favorecen la infección contra M. tuberculosis. Un ejemplo es el gen

NRAMP1 (resistencia natural-asociada a la proteína 1 del macrófago) [Liu et al.,

1995], actualmente conocido como Scl11a1 (miembro 1 de la familia 11 de

transportador de solutos) [Wyllie et al., 2002].

Otros ejemplos son el caso de mutaciones en los genes que codifican el receptor

1 del interferón γ, implicados en la diseminación infecciosa de BCG posterior a una

vacunación [Cassanova et al., 1996], y el receptor 2 del interferón γ, que han dado lugar

a infecciones por micobacterias no tuberculosas [Bellamy, 2005]. Lo mismo sucede en

personas con deficiencias genéticas en los sistemas de producción de las interleucinas

12 y 23 [Ottenhoff et al., 2005].

11

RESPUESTA INMUNE FRENTE A LA TUBERCULOSIS

El sistema inmunológico innato es activado después de la invasión de los

microorganismos patógenos, y coordina la defensa de huésped durante las primeras

horas y días posteriores a la infección. Aunque, el sistema inmunológico innato es muy

eficaz con la mayoría de los patógenos, la especificidad es conferida sólo por la

activación secundaria de inmunidad adquirida regulada por los linfocitos T y B [Netea

et al., 2004].

Respuesta inmune innata o inespecífica

La respuesta inmune innata forma parte de los mecanismos inespecíficos que

representa el primer sistema defensivo del organismo, siendo de especial importancia la

protección del organismo frente a las infecciones. Los mecanismos que conforman la

inmunidad de tipo innato están constituidos por las barreras naturales, que son la piel y

las mucosas, que no sólo actúan aislando al individuo del exterior sino que también

exhiben actividades bactericidas y promotoras de la inflamación debido a la presencia

de múltiples moléculas, factores y células con función defensiva. Estas células se

caracterizan por su capacidad para actuar de manera inmediata sin requerir de un

aprendizaje previo siempre que algún patógeno sobrepasa las barreras naturales.

En la respuesta inmune innata de los pulmones (espacio alveolar) intervienen

una serie de células que incluyen a los macrófagos alveolares y las células epiteliales del

pulmón (células alveolares tipo I y tipo II) que son el primer contacto con los

patógenos. Además de neutrófilos, linfocitos B, células dendríticas, células NK [Raja,

2004; Rivas-Santiago et al., 2005]. También intervienen factores solubles como la

mucina, lisosima, lactoferrina [Knowels y Boucher, 2002], surfactantes, fosfolipasa A2

[Freguson y Schlesinger, 2000], defensinas, catelicidinas [Ganz, 2002],

inmunoglobulinas y proteínas del complemento [van Crevel et al., 2002], cuya función

es mantener la homeostasis pulmonar y la eliminación de partículas o bacterias que

entren por el tracto respiratorio.


12

La llegada de M. tuberculosis hasta el espacio alveolar significa que ha superado

la barrera muco-ciliar del tracto respiratorio. Los macrófagos alveolares, que

constituyen la primera línea de defensa, establecen el primer contacto con la

micobacteria, junto con las células epiteliales, y va a ser crucial para definir el control

de la infección o el desarrollo de la enfermedad. La fagocitosis de la micobacteria es

principalmente llevada a cabo por los macrófagos alveolares a través de diversos

mecanismos y es favorecida por la proteína surfactante A, producida por las células

epiteliales alveolares tipo II, ya que aumenta la interacción entre la micobacteria y los

macrófagos [Freguson y Schlesinger, 2000].

Macrófagos

Los macrófagos, al igual que otras células sanguíneas tienen su origen en la

médula ósea (Fig. 5), se forman a partir de las células madre, unidad formadora de

colonias granulosito-macrófago, monoblasto, promonocito y finalmente monocito, este

último pasa al torrente circulatorio para dirigirse a un órgano blanco y ahí se introduce

al micro-ambiente local para ser diferenciado como célula específica y heterogénea, que

en el caso de los pulmones, se diferencia a macrófago alveolar, donde residen durante

varios años [Ma et al., 2003].

Los macrófagos juegan un papel doble en la defensa del huésped, pues son un

componente de la respuesta inmune innata, pero también actúan como células accesorias

importantes en la respuesta inmune adaptativa [Ma et al., 2003], dado que son células

presentadoras de antígenos [Rivas-Santiago et al., 2005].


13

Fig. 5: Representación esquemática de la formación de las células sanguíneas.

Interacción M. tuberculosis-macrófago, señalización intracelular y

fagocitosis

Raja caracteriza la secuencia de interacción macrófago-M. tuberculosis y el

papel de los macrófagos en la respuesta inmune del huésped en un proceso de cinco

etapas: 1. Unión de la superficie del M. tuberculosis al macrófago; 2. fusión fagosoma-

lisosoma; 3. crecimiento micobacteriano inhibición/muerte; 4. reclutamiento de células

inmunes secundarias a la respuesta inflamatoria local, y 5. presentación de antígenos de

las células T para el desarrollo de la inmunidad adquirida [Raja, 2004].

Durante las primeras etapas de reconocimiento, los macrófagos pueden

interactuar de dos maneras con las micobacterias: pueden hacerlo de forma directa con

los receptores de superficie de los macrófagos; o se puede establecer gracias a diversos

elementos séricos que el macrófago puede reconocer de manera específica, como los

anticuerpos o, de manera inespecífica como los componentes del complemento o

proteínas de la fase aguda, los cuales funcionan como opsoninas. [Hirsch et al., 1994].


14

Inicialmente, la fagocitosis no opsónica realizada por los macrófagos es crítica para la

defensa del huésped en el pulmón, debido a que en el fluido bronco-alveolar no

inflamatorio no hay cantidad suficiente de opsoninas [Linehan et al., 2000].

Los macrófagos alveolares son el primer tipo celular involucrado en la

fagocitosis de M. tuberculosis. Luego de este primer encuentro, las células dendríticas y

los macrófagos derivados de monocitos también forman parte del proceso fagocítico

[van Crevel et al., 2002]. La endocitosis de M. tuberculosis involucra diferentes

receptores de las células fagocíticas, que actúan en el reconocimiento del bacilo

tuberculoso. En los macrófagos humanos, los receptores primarios para el

reconocimiento de M. tuberculosis son el receptor de manosa y el receptor de

complemento 3, mientras que para las células dendríticas, el principal receptor es DC-

SIGN [Tailleux (b) et al., 2003]. Esta micobacteria, también es reconocida por los

receptores tipo Toll (TLR), como el TLR2, TLR 9 y TLR4 [Heldwein y Fenton 2002;

Quesniaux et al., 2004], que se unen a ligandos pro-inflamatorios como lipoproteínas,

peptidoglicanos complejos, lípidos y LAMs. Otros receptores participantes en este

proceso son: el receptor de la proteína surfactante A que facilita la entrada de M.

tuberculosis a los macrófagos [Gaynor et al., 1995], pneumocitos tipo II [Bermúdez y

Goodman, 1996] o neutrófilos [Ernst, 1998]; el receptor “scavenger” clase A , que se

unen a los sulfolípidos de la micobacteria [van Crevel et al., 2002], las lecitinas de

unión a manosa [Garred et al., 1997] y la dectina-1 [Yadav y Schorey, 2006].

Una vez que se ha unido la micobacteria con el fagocito, el colesterol de la

membrana del macrófago se acumula en el sitio de entrada de la bacteria, y se produce

una invaginación de la bacteria a través de la pared celular formando el fagosoma

[Gatfield y Pieters, 2000].

Las células tratan de controlar la infección y al mismo tiempo producen varias

citocinas como IL1β, IL-6, IL-10, TNFα e IL-12, para el reclutamiento y activación de

células del sistema inmunológico [Rivas-Santiago et al., 2005]. La activación de los

macrófagos infectados se manifiesta de distintas maneras. El fagosoma madura y se

fusiona con los lisosomas, que aportan potentes enzimas hidrolíticas. Estas enzimas

funcionan a pH ácidos (4,5-5,0), que se produce gracias la bomba de protones

dependiente de ATP, la H+-ATPasa vacuolar, que se encuentra en la membrana

[Mellman et al., 1986]. Los macrófagos activados también producen especies reactivas

de oxígeno (agua oxigenada, anión superóxido, etc.) y nitrógeno (óxido nítrico). Sin


15

embargo, la habilidad de las especies reactivas de oxígeno para aniquilar a M.

tuberculosis solo ha sido demostrado en ratones [Flesch y Kaufmann, 1987; Raja,

2004]. El óxido nítrico es sintetizado por la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS2 o

NOS2), que utiliza como sustrato arginina. Aunque su importancia en la defensa del

huésped contra M. tuberculosis ha sido documentada tanto en estudios in vitro como in

vivo, en modelos de ratón, su papel en infecciones humanas es controvertido [Shiloh y

Nathan, 2000].

Se ha argumentado que la 1,25 dihidroxivitamina D3 induce la expresión de

iNOS2 e inhibición en la actividad de M. tuberculosis en la línea celular macrofágica

humana HL-60 [Rockett et al., 1998]. Hay estudios donde se han encontrado niveles de

expresión de ARMm de la NOS2 en macrófagos infectados con M. tuberculosis tratados

con IFNγ, no así en los no tratados, encontrándose una mayor cantidad de ARNm en

macrófagos co-cultivados con linfocitos y tratados con INFγ [Bonecini-Almeida et al.,

1998]. También se han encontrado altos niveles de expresión de NOS2 en macrófagos

obtenidos de lavados broncoalveolares de individuos con tuberculosis pulmonar

[Nicholson et al., 1996].

Células epiteliales

Inicialmente se pensó que el primer contacto lo establecía M. tuberculosis con

los macrófagos alveolares. Sin embargo, actualmente se sabe que las micobacterias

infectan a las células epiteliales alveolares, como una alternativa para evadir las

agresiones del medio y escapar de los macrófagos. Debido a que al inicio de la infección

hay relativamente pocos macrófagos alveolares para fagocitar a las micobacterias, son

las células epiteliales las que pueden ser invadidas. Se han realizado ensayos de

adherencia e invasión en la línea celular epitelial alveolar tipo II humana (A549) con

diferentes micobacterias (M. tuberculosis H37Rv y H37Ra y con M. avium) y se

observó que estás micobacterias pueden invadir y replicarse intracitoplasmáticamente

[Bermúdez y Goodman, 1996]. Las células epiteliales del tracto respiratorio también

poseen receptores de reconocimiento de patógenos, como las lectinas de unión a

manosa, TLR y CD14 [Netea et al., 2004; Hogg, 2004]. Se ha demostrado que estas

células secretan quimiocinas para el reclutamiento de neutrófilos, linfocitos y monocitos

al pulmón [Rivas-Santiago et al., 2005]. Asimismo, también producen péptidos

antimicrobianos como las defensinas (β-defensina-2) y las catelicidinas (LL-37). Este

tipo de péptidos pueden activar a las células dendríticas inmaduras, dando como


16

resultado un aumento de moléculas co-estimuladoras [Biragyn et al., 2002; Davidson et

al., 2004].

Neutrófilos

Los neutrófilos son de las primeras células que se activan en la respuesta

inflamatoria [Sibille y Reynolds, 1990]. Aunque la tuberculosis se caracteriza por la

migración predominante de momocitos/macrófagos al sitio de infección, la respuesta

más temprana a la invasión del tejido por la micobacteria es una afluencia de neutrófilos

con menos monocitos/macrófagos [Kobayashi et al., 1985]. Por otro lado, los

neutrófilos tienen un papel importante en la protección contra la infección

micobacteriana [Appelberg et al., 1995] a través de la producción de quimiocinas

[Riedel y Kaufmann, 1997]. Además, han mostrado que producen varias citocinas como

IL-1, IL-6, IL-8, TNFα, receptor antagonista de IL-1 y MIP1α [Kasahara et al., 1998]

En estudios in vivo, se ha demostrado que los neutrófilos pueden aniquilar a la

cepa no virulenta de M. tuberculosis (H37Ra) [Majeed et al., 1998]. Los neutrófilos, en

su papel defensivo frente a las infecciones microbianas, pueden emplear sistemas

microbicida oxidativos o no oxidativos. En los gránulos de los neutrófilos se encuentran

las defensinas, que son las más abundantes entre una serie de proteínas y péptidos

antimicrobianos [Fu, 2003]. Se ha observado que las defensinas producidas por los

neutrófilos son activas contra micobacterias no tuberculosas [Ogata et al., 1992], M.

tuberculosis H37Ra, así como también en aislados clínicos de M. tuberculosis

[Miyakawa et al., 1996].

Existe una discrepancia con respecto a si los neutrófilos utilizan la vía oxidativa

o la no oxidativa frente a M. tuberculosis. Hay estudios que demuestran la activación de

la vía oxidativa en la infección de neutrófilos con este bacilo [May y Spagnuolo, 1987;

González-Cortés et al., 2009]; pero otros autores consideran que el mecanismo

antimicrobiano principal es no oxidativo, asociado a la producción de las defensinas

[Kisich et al., 2002]. Hay un estudio realizado por Jones y Amirault, donde se observa

en presencia de la superóxido dismutasa y la catalasa fallan en la disminución del

aniquilamiento de M. tuberculosis, por lo que estos investigadores consideran que el

mecanismo de acción de los neutrófilos es el no oxidativo [Jones y Amirault, 1990].

Además Martineau et al., han demostrado la importante participación de los neutrófilos

en la inmunidad innata frente a la tuberculosis, actividad que está asociada con la


17

producción de sus péptidos antimicrobianos como LL-37 y la lipocalina-2 que limitan el

crecimiento de la bacteria [Martineau et al., 2007].

Células dendríticas

Las células dendríticas son una familia de células presentadoras de antígenos

derivadas tanto del tejido mieloide como linfoide [Robinson et al., 1999], con una

excelente capacidad de interactuar con las células T y modular su respuesta [Reis e

Sousa et al., 1999]. La interacción entre las células dendríticas presentes en las vías

aéreas y la micobacteria, se considera que es crítica para la respuesta inmune y para

determinar el resultado de la infección. Förstch et al., observaron que las células

dendríticas son huéspedes importantes para M. tuberculosis, ya que esta micobacteria se

puede multiplicar dentro de ellas [Förstch et al., 2000]. Sin embargo, estos hallazgos no

fueron corroborados por Tailleux et al., que llegó a la conclusión de que la

supervivencia intracelular de M. tuberculosis se redujo en estas células. [Tailleux (a) et

al., 2003].

Células NK

Las células NK representan aproximadamente el 10% del total de linfocitos en

sangre periférica [Cooper et al., 2001]; son consideradas como células efectoras de la

inmunidad innata, ya que reconocen y lisan células infectadas y son productoras de

citocinas como el IFNγ [Schierloh et al., 2007]. Se ha demostrado que M. bovis BCG

puede interactuar directamente con las células NK en ausencia de

monocitos/macrófagos y puede inducir la producción de IFNγ, y el aumento de su

actividad citotóxica [Esin et al., 2004].

Aunque primero se creía que tenían solamente actividad citotóxica contra células

tumorales y células infectadas por virus, ahora se conoce que son mediadores

importantes en la respuesta inmune innata frente a una variedad de microorganismos

patógenos incluyendo bacterias intracelulares [Lodoen y Lanier, 2006]. Se conoce que

las células NK producen granulisina, que asociada con la perforina pueden matar

micobacterias [Korbel et al., 2008].

Respuesta inmune adaptativa o específica

Las principales células de la respuesta inmune adaptativa son los linfocitos, que

se desarrollan a partir de progenitores linfoides inmaduros (pre-linfocitos) y se dividen


18

en dos grandes grupos, linfocitos B y linfocitos T. Los linfocitos B están especializados

en la producción de anticuerpos. Los linfocitos T son responsables de las respuestas

inmune celular y de tipo retardada [LeBien y Tedder, 2008]. La respuesta de inmunidad

adaptativa es específica y su desarrollo depende en gran medida de la eficiencia de la

inmunidad innata, ya que si los macrófagos alveolares no son capaces de controlar la

infección se favorece una respuesta inmunitaria humoral (Th2), que no es protectora en

la tuberculosis y que se caracteriza por la producción de citocinas como IL-4, IL-5, IL-

6, IL-10, IL-13 y TGF-β, las cuales antagonizan la respuesta de inmunidad celular tipo

Th1, eficiente en infecciones causadas por microorganismos intracelulares y

caracterizada por la producción de citocinas como IFN-γ, IL-2, IL-12, IL-18 y TNF-α

[Rivas-Santiago et al., 2005]

La respuesta inmune celular a la tuberculosis involucra macrófagos, células T

CD4+, células CD8+ y células T γδ. Los macrófagos son críticos en el control de la

infección por M. tuberculosis porque ellos albergan la bacteria en un compartimiento

intracelular y presentan los antígenos de la micobacteria, vía MHC clase II, a las células

T CD4+ [Pai et al., 2003].

Respuesta inmune celular (linfocitos T –Th/Tc)

Los linfocitos T reconocen y responden solo a antígenos presentados por las

células presentadoras de antígeno. Dentro de las células T encontramos principalmente a

los linfocitos T “helper” (Th) o CD4+ y a los linfocitos T citotoxicos (Tc) o CD8+.

Células CD4+ o Th

M. tuberculosis reside principalmente en una vacuola de los macrófagos, que

evoluciona de fagosoma a fagolisosoma y donde en última instancia se produce la

degradación del patógeno. Los péptidos que se originan se unen a las moléculas MHC

clase II y son presentados a las células CD4+. Estas células son las más importantes en

la respuesta de protección contra la tuberculosis [Hartmann y Plum, 1999; Flynn y

Chan, 2001].

Las células T CD4+ pueden desarrollar al menos dos fenotipos que están

asociados con distintos perfiles de expresión de citocinas después de la estimulación

antigénica: a) Células Th-1 que son inducidas por la IL-12 y producen INFγ, TNFα e

IL-2; estas citocinas activan intracelularmente la capacidad microbicida de los

macrófagos e inician y mantienen la respuesta inflamatoria granulomatosa protectora. b)


19

Células Th-2, son inducidas por la IL-4 y producen grandes cantidades de esta citocina

y de otras, incluyendo IL-5, IL- 10 e IL-13. Un subgrupo de células T CD4+, son las Th-

17 que son inducidas por el TGFβ y la IL-6, sostenida, al menos en parte por la IL-23, y

produce altas concentraciones de IL-17. Las células Th-17 al parecer pueden ser

importantes en la inmunidad protectiva o pueden estar más involucradas en la respuesta

patológica que ocurre durante la progresión de la tuberculosis así como en la respuesta

autoinmune [Hoft, 2008].

Células CD8+ o Tc

Las células CD8+ pueden reconocer y eliminar células diana infectadas con

patógenos intracelulares. Los antígenos peptídicos son presentados a ellas por las

moléculas MHC clase I y pueden reconocer células diana infectadas con M. tuberculosis

y destruirlas. Estas células citolíticas pueden reaccionar con antígenos proteicos y

lipídicos derivados de la micobacteria [Hoft, 2008]. Los linfocitos CD8+ son capaces de

producir IFNγ e IL-4 y así pueden desempeñar un papel en la regulación del equilibrio

de las células Th1 y Th2 en los pulmones de pacientes con tuberculosis [McDonough et

al., 1993].

Células T γγγγδδδδ

Las células T γδ producen citocinas después de una estimulación con antígenos.

Se concentran en la superficie epitelial y pueden ser un mecanismo de defensa temprano

en el inicio de una invasión con patógenos ambientales. En humanos y en macacos, pero

no en ratones, en la infección con M. tuberculosis se generan los subtipos γ9+δ2, que

esta asociada con una protección parcial a la tuberculosis. [Hoft, 2008].

Células CD1-restricted ααααββββ

Estas células pueden presentar moléculas lipídicas micobacterianas a las células

T γδ, estimulando tanto la respuesta específica de citocinas a la micobacteria como a la

actividad citolítica [Hoft, 2008].

Respuesta inmune humoral (linfocitos B)

El papel definitivo de los linfocitos B en la defensa del huésped frente a M.

tuberculosis aún no está muy esclarecido. Algunos autores han considerado poco

importante la participación de los linfocitos B y de los anticuerpos en la tuberculosis

[Turner et al., 2001]. Sin embargo, los linfocitos B están presentes en un gran número


20

de granulomas tuberculosos de humanos y ratones [Bosio et al., 2000]. Recientemente,

se han identificado estructuras dominantes parecidas a los folículos en la periferia del

granuloma en pulmones con tuberculosis y se ha sugerido que las células B puede jugar

un papel importante en la inmunidad local [Ulrichs et al., 2004].

Granuloma tuberculoso

La formación del granuloma tuberculoso se inicia con la infección de los

macrófagos alveolares por M. tuberculosis, resultando en la producción de citocinas,

quimiocinas y la aparición una respuesta inflamatoria, con la afluencia de monocitos,

neutrófilos y células dendríticas. En este punto los bacilos son fagocitados por las

células dendríticas y transportados desde el pulmón hasta los nódulos linfáticos donde

se encuentran las células T naïves (Fig. 6). Posteriormente, las células T y B efectoras y

nuevos monocitos migran desde la sangre hacia el pulmón y a través del tejido

pulmonar se dirigen hacia el sitio de la infección. El lento crecimiento de la

micobacteria (tiempo de duplicación, aproximadamente 24 horas in vivo) previene que

se produzca una abrumadora infección micobacteriana antes de la respuesta

granulomatosa. Una vez que las células llegan al sitio donde están los macrófagos

infectados, forman una estructura para contener la infección, el granuloma. En el cual

las células T interactúan con los macrófagos infectados y son activadas para el control

de la infección. Debido a que esta activación no es muy exitosa las bacterias

permanecen dentro del granuloma. Sin embargo, en la mayoría de los casos, la bacteria

es controlada por un largo período [Scott-Algood et al., 2005].


21

Fig. 6: Esquema de la formación del granuloma tuberculoso.

El granuloma esta formado por dos tipos de macrófagos, los activados, con

citoplasma más abundante (macrófagos epiteloides) y los no activados. Además,

también participan en este proceso formas multinucleadas de células gigantes de

Langerhans, células T (CD4+ y CD8+), células NK y células γδ y fibroblastos [Co et al.,

2004; Salgame, 2005]. En la formación y mantenimiento del granuloma, es importante

resaltar la importancia del TNFα como citocina clave de este mecanismo de defensa

[Co et al., 2004; Scott-Algood et al., 2005].

Los macrófagos, a través del granuloma, pueden contener a la micobacteria en

un período de latencia por décadas. Sin embargo, M. tuberculosis puede reactivarse

como resultado de un fallo en el sistema inmune, con la consecuente liberación de los

microorganismos del granuloma y la progresión de la enfermedad a clínicamente activa

[Skeiky y Sadoff, 2006].


22

Evasión de la respuesta inmune

M. tuberculosis presenta diversas estrategias para evadir la respuesta inmune. La

pared celular de las micobacterias tiene mucha importancia en la resistencia a los

mecanismos de defensa del huésped, ya que su alto contenido lipídico dificulta la

degradación de la bacteria por las enzimas lisosomales; además, existen proteínas como

la superóxido dismutasa, catalasa, peroxidasa y el sistema thioredoxina que degradan

los radicales libres de oxígeno y de otras sustancias que podrían atravesar la pared de la

micobacteria [Andersen et al., 1991]. Otros componentes de la pared micobacteriana

son los glucolípidos fenólicos I y LAM que son potentes secuestradores de los radicales

de oxígeno [Chan et al., 1991]. Otro lípido, la trealosa 6,6´dimicolato, forma parte de la

cápsula de la micobacteria, y actúa sobre las mitocondrias inhibiendo la respiración y la

fosforilación oxidativa e inhibe la migración de los leucocitos [Daffé y Ettienne, 1999].

Los macrófagos infectados por M. tuberculosis disminuyen su capacidad para

presentar antígenos vía MCH clase II y la co-estimulación de las células Th. Estos

defectos al parecer están relacionados con la disminución de la expresión de moléculas

clase II por los macrófagos infectados [Hmama et al., 1998].

También hay estudios que refieren que las micobacterias virulentas son capaces de

inhibir la fusión de los fagosoma con los lisosomas, debido a la liberación de derivados

sulfatados a partir de la glicoproteína trehalosa 2-sulfato, que detiene la maduración del

lisosoma en el estadio de endosoma temprano [Keane et al., 1997]. Así mismo, la

proteína que contiene una capa de triptófano-aspartato (TACO), es la causante de la

incapacidad de los fagosomas, que contienen a las micobacterias, para fusionarse con

los lisosomas [Ferrari et al., 1999].

23

CITOCINAS

El reconocimiento de M. tuberculosis por células fagocíticas de la inmunidad

innata conduce a la activación celular y la producción rápida de citocinas pro y anti-

inflamatorias. Estas citocinas, incluyendo a las quimiocinas, reclutan células

inflamatorias a las áreas de infección, y coordinan las respuestas inflamatoria e inmune

adaptativa en contra de la micobacteria.

Las citocinas son mediadores de comunicación celular, de bajo peso molecular,

las cuales incluyen las interleucinas (IL), interferones (IFNs), factores de crecimiento,

factores estimulantes de colonias, y otros grupos. Estas moléculas son liberadas por una

variedad de células y por lo general actúan localmente en un tejido que afectan a las

células adyacentes de una forma paracrina. Las citocinas también pueden actuar dentro

de una célula (intracrina), afectan a la misma célula después de la liberación (autocrina),

o viajar a través de la circulación para actuar a distancia de forma endocrina. Las

citocinas llevan a cabo funciones importantes en la fisiología normal como en las

respuestas del huésped a la infección o de otras amenazas exógenas de la integridad del

organismo. Un principio importante que emerge es que la respuesta biológica en un

órgano o tejido refleja un equilibrio entre los niveles locales de citocinas pro-

inflamatorias y anti-inflamatorias. Por lo tanto, una enfermedad crónica puede ser

consecuencia de la producción excesiva de citocinas pro-inflamatorias o la producción

inadecuada de citocinas anti-inflamatorias. [Arend y Gabay, 2004]. La respuesta

inflamatoria a M. tuberculosis no solo es crucial para el control inicial de la infección

sino que también pueden contribuir en el control de la infección crónica y la patología

asociada [Flynn y Chan, 2001].

Citocinas pro-inflamatorias

Interferón gamma (IFNγ)

El IFN fue descrito por primera vez como un producto capaz de interferir con la

replicación viral de células infectadas con virus [Isaacs y Lindenmann, 1988]. En

humanos, los IFNs, han sido clasificados en tres tipos, sobre la base de la secuencia de


24

sus genes, la localización cromosómica, y la especificidad de los receptores [Pestka et

al., 2004]. El tipo I, que incluye 13 formas del IFNα, y una forma para los IFNs β, ω, ε,

y κ. Estas moléculas señalizan a través de un receptor expresado de forma ubicua,

compuesto por dos cadenas: IFN-αR1 e IFN-αR2. El IFN tipo II sólo incluye el IFNγ,

que señaliza por vía de un receptor expresado de forma ubicua, compuesto por las

subunidades IFN-γR1 e IFN-γR2. Y el IFN tipo III, del cual se han identificado tres

miembros, IFN-λ1 (IL-29), IFN-λ2 (IL-28A) y el IFN-λ3 (IL-28B), actúa a través de un

receptor compuesto de dos cadenas: un IFN-λ específico IFN-λR1 expresado

selectivamente por ciertos tipos celulares y otro expresado ubicuamente, el IL-10Rβ, el

cual forma parte de los receptores de la IL-10, IL-22 e IL-26. En modelos

experimentales de infecciones en ratones in vivo, se ha observado que los IFN-α/β, son

esenciales para la inmunidad de la mayoría de los virus, mientras que el IFN-γ es

importante para la inmunidad a un número menor de virus, además de bacterias,

hongos, y parásitos. El papel preciso de IFN-λ no ha sido bien dilucidado [Zhang et al.,

2008].

El IFNγ es una citocina prototipo de la respuesta celular Th1, y es esencial para

un control efectivo de M. tuberculosis en el huésped. Es producida por las células T

tanto por CD4+ como las CD8+, y por las células NK. Estimula una respuesta

micobactericida en macrófagos de ratón caracterizada por la inducción de la NOS2

[Flynn y Chan, 2001]. El IFNγ puede aumentar la presentación de antígenos y el

reclutamiento de los linfocitos CD4+ y CD8+. Aunque la producción de IFNγ, que por si

sola no es suficiente para el control de la infección por M. tuberculosis, es requerida

para la respuesta protectora a éste patógeno. La producción del INFγ por los diferentes

tipos celulares, en la fase temprana de la respuesta inmune, tiene un papel significativo

en la activación, diferenciación y expansión de las células Th1 específicas de antígeno.

Estas células son la mayor fuente de INFγ durante la respuesta inmune adaptativa y es

necesaria para el control de la fase crónica de la infección. Por eso cualquier alteración a

nivel de la señalización del INFγ puede causar un desarrollo de la enfermedad. Se ha

observado que en personas con mutaciones en los genes que codifican la proteína INFγ

presentan infecciones graves a micobacterias, incluyendo las poco patógenas como las

no tuberculosas o M. bovis atenuado (BCG) y a la bacteria Salmonellae. Dichos


25

defectos genéticos son principalmente a nivel de sus receptores (INF-γR) [Ottenhoff et

al., 2005].

Factor de necrosis tumoral alfa (TNFαααα)

El TNFα es la citocina típica proinflamatorias y es producida por monocitos,

macrófagos, células dendríticas y células T cuando se exponen a M. tuberculosis y a

productos micobacterianos. Desempeña un papel importante en la formación del

granuloma en tuberculosis y tiene propiedades inmuno-reguladoras. En estudios tanto in

vivo como in vitro en el modelo de ratón se ha observado que el TNFα sinergiza con

IFNγ e induce en los macrófagos activados a la producción de NO y RNI vía NOS2

usando como substrato L-arginina [Flynn y Chan, 2001].

El TNFα es importante en la contención de la infección por M. tuberculosis, en

la prevención de la diseminación, y afecta la migración celular. También tiene

influencia en la expresión de moléculas de adherencia, quimiocinas y receptores de

quimiocinas [Raja, 2004]. En pacientes con artritis reumatoide o con la enfermedad de

Crohn, que reciben tratamiento con anticuerpos monoclonales (anti-TNFα) se ha

advertido una asociación con la reactivación de la tuberculosis [Dinarello, 2003].

Interleucina-12 (IL-12)

La IL-12 es una citocina heterodimérica perteneciente a una familia de varias

citocinas que incluye la IL-23, IL-27 [Trinchieri, 2003], y la IL-35 [Collison y Vignali,

2008]. El heterodímero IL-12p70, de la IL-12, esta formado por dos subunidades, la p35

y p40, las cuales para que presenten actividad biológica requieren de la interacción con

el complejo IL-12R, compuesto por IL-12Rβ1 e IL-12Rβ2. En estudios con ratones con

ausencia de la subunidad IL-12p40 se ha detectado una disminución de la respuesta

inmune a las micobacterias, dando como resultado una disminución en la producción de

IFNγ, y aumento del crecimiento bacteriano y de la mortalidad [Khader et al., 2005]. Es

producida después de la fagocitosis de la micobacteria por los macrófagos y las células

dendríticas, e induce la diferenciación de las células T en células Th1 y la producción de

IFNγ [Flynn y Chan, 2001; van Crevel et al., 2002; Berrington y Hawn, 2007]. Algunos

receptores tipo toll (TLR2, TLR4) cuando se activan inducen la producción de IL-12 y

de TNFα [Verreck et al., 2004].


26

Otras citocinas pro-inflamatorias

IL-1β. Esta citocina es producida principalmente en los monocitos, macrófagos

y células dendríticas. En pacientes con tuberculosis se ha encontrado en exceso la IL-1β

en los sitios de la infección. En estudios con ratones que presentan una deficiencia de la

IL-1β se ha visto una insuficiente formación del granuloma [van Crevel et al., 2002].

IL-18. Comparte muchas características con la IL-1, fue inicialmente descubierta

como un factor inductor de IFNγ y es sinérgica con la IL-12, por lo que tiene un papel

de protección en la infección de M. tuberculosis [van Crevel et al., 2002].

IL-6. Esta citocina se considera que tiene las propiedades pro y anti-

inflamatorias y es producida en las primeras fases de la infección micobacteriana. Tiene

múltiples funciones en la respuesta inmune, incluyendo la inducción de una respuesta

inflamatoria, favorece la hematopoyesis y la diferenciación de las células T. La IL-6

puede ser perjudicial en la infección, ya que inhibe la producción de TNFα e IL-1β [van

Crevel et al., 2002; Raja, 2004].

Citocinas anti-inflamatorias

La respuesta pro-inflamatoria, iniciada por M. tuberculosis es antagonizada por

mecanismos anti-inflamatorios. Receptores solubles de citocinas (como el receptor

soluble de TNFα I y II) evitan la unión de las citocinas a los receptores celulares,

bloqueando además la señalización. Además, 3 citocinas anti-inflamatorias, IL-10,

TGFβ e IL-4, pueden inhibir la producción o los efectos de las citocinas pro-

inflamatorias en la tuberculosis [van Crevel et al., 2002].

Interleucina-10 (IL-10). Es producida por macrófagos activados, las células

dendríticas, los linfocitos B y los subtipos de los linfocitos T. Posee propiedades de

desactivación de macrófagos, incluyendo la disminución de la producción de IL-12, que

a su vez disminuye la producción de IFNγ por los linfocitos T e inhibe directamente la

respuesta de los linfocitos T CD4+ [Flynn y Chan, 2001]. En pacientes enfermos de

tuberculosis, esta citocina se expresa en exceso en el sitio de la infección [van Crevel et

al., 2002].

Factor de crecimiento tumoral beta (TGFββββ). Los productos micobacterianos

inducen la producción de TGFβ en monocitos y en las células dendríticas. El TGFβ

suprime la inmunidad celular mediada por células T inhibiendo su proliferación y la


27

producción de IFNγ. En los macrófagos antagoniza la presentación de antígenos y la

producción de citocinas pro-inflamatorias. El TGFβ de manera selectiva induce la

producción de IL-10, y ambas citocinas muestran sinergismo en la represión de la

producción de IFNγ [van Crevel et al., 2002].

Interleucina-4 (IL-4). Citocina característica de la respuesta Th2, producida por

una gran variedad de tipos celulares, como lo son las células T, eosinófilos, basofilos,

mastocitos, células NK y algunas células presentadoras de antígeno [Rook et al., 2004].

En estudios de pacientes con tuberculosis, la IL-4 induce una disminución de la

respuesta Th1 pero un aumento de la Th2 en sangre periférica [Flynn y Chan, 2001].

Quimiocinas

Las quimiocinas son una gran familia de pequeñas citocinas quimiotácticas

caracterizadas por la conservación de los residuos de cisteína [Schutyser et al., 2000].

Desempeñan un papel importante en las reacciones inmune e inflamatoria y en las

infecciones virales [Mantovani, 1999]. Más recientemente, su papel ha sido reconocido

en muchos procesos biológicos, tales como angiogénesis, angiostasis, hematopoyesis,

organogénesis, proliferación celular, polarización linfocítica, apoptosis, metástasis

tumoral [Esche et al., 2005] y sobre todo en la regulación del tráfico celular [Yang et

al., 2003]. En humanos, más de 40 quimiocinas han sido identificadas. Dependiendo de

la presencia o posicionamiento (adyacente o no) de los dos primeros residuos de

cisteína, se han clasificado en cuatro subfamilias: CXC (familia-α), CC (familia-β), C

(familia-γ), y CX3C (familia-δ) [Zlotnik y Yoshie, 2000].

M. tuberculosis es un gran inductor de la expresión de quimiocinas. Los estudios

que se han realizado se han centrado principalmente en el patrón de expresión de

quimiocinas inducibles tras la infección de macrófagos por M. tuberculosis in vitro. Se

ha observado que ésta micobacteria, induce la expresión de quimiocinas en las 2

primeras horas post-infección [Rhoades et al., 1995]. Los macrófagos humanos

producen las quimiocinas CCL2, CCL3, CCL4 y CCL5 en respuesta a cepas virulentas

de M. tuberculosis [Sadek et al., 1998]. Esta respuesta se ve disminuida cuando se usan

cepas no virulentas (H37Ra) para CCL3 pero no para CCL4 o CCL5 [Saukkonenn et

al., 2002]. Tejidos de nódulos linfáticos y monocitos CD14+ aislados de sangre de

pacientes con tuberculosis, expresan más CCL2, que los de los sujetos control [Lin et

al., 1998]. Los macrófagos alveolares producen significativamente más CCL2, CCL3 y


28

CCL5 que los monocitos en sangre después de una infección con M. tuberculosis

[Sadek et al., 1998].

29

OTRAS MOLÉCULAS IMPLICADAS EN LA ACTIVIDAD

ANTIMICROBIANA

El sistema inmunológico es capaz de generar numerosos tipos de células y

moléculas capaces de reconocer y eliminar específicamente una variedad aparentemente

ilimitada de invasores extraños [Conus y Simon, 2008]. M. tuberculosis es una bacteria

que no solo activa la producción de citocinas y quimiocinas en macrófagos, sino que

también activa o inhibe genes que intervienen en la respuesta inmune del huésped.

Algunos de estos genes son los siguientes:

Defensinas

Son péptidos catiónicos, ricos en cisteína, con un peso molecular entre 3 y 5

KDa con actividad antimicrobiana. Constituyen un importante componente de la

inmunidad innata. Las defensinas se clasifican en las familia α y β, en función de la

homología de su secuencia y de la conservación de sus seis residuos de cisteína [Wu et

al., 2003]. Las defensinas α se encuentran en los gránulos de los neutrófilos [Fu, 2003],

y las defencinas β se encuentran en el epitelio de las superficies internas y externas del

cuerpo humano (piel, tracto respiratorio e intestinal) [Rivas-santiago et al., 2006- Salud

pública de Mx]. Las defensinas α son efectivas contra bacterias Gram positivas y Gram

negativas y las β principalmente contra las cepas Gram negativas [Harder, et al., 2001].

También se ha demostrado su actividad antimicrobiana frente a M. tuberculosis en

neutrófilos [Miyakawa et al., 1996,] y células epiteliales [Rivas-santiago, 2005]. Las

defencinas β además de tener actividad antimicrobiana también tienen un papel

quimiotactico sobre células dendríticas inmaduras (DEF1, 2, 3), células T de memoria

(DEF2), macrófagos (DEF3) y monocitos (DEF4) [King et al., 2003]. Aunque estas

proteínas son características de neutrófilos, algunos autores han observado la expresión

de las defensinas β 1 y 2 en monocitos humanos activados con IFNγ y LPS de E. coli

[Duits et al., 2002].


30

Catepsinas (CTS)

Las catepsinas son enzimas proteolíticas lisosomales, e incluye a las serín-

proteasas (CTS A y G), aspártico-proteasas (CTS D y E) y cisteín-proteasas (CTS B, C,

F, H, K, L, O, S, V, X, W). Se sintetizan como proenzimas inactivas, glucosiladas post-

translationalmente y dirigidas hacia los lisosomas por medio de receptores de manosa-6-

fosfato [Chwieralski et al., 2006]. La mayoría de las CTS son endopeptidasas, con la

excepción de las CTS C y X [Vasiljeva y Turk, 2008]. En leucocitos polimorfonucleares

se han encontrado proteasas lisosomales con actividad antimicrobiana como lo son las

CTS D y B (activas a pH ácido) y la CTS G (activas al pH neutro y alcalino) [Thorne et

al., 1976]. Hay estudios en conejos infectados con BCG, donde se ha visto una mayor

cantidad de la CTSD en los macrófagos alveolares que se acumularon alrededor de las

lesiones ocasionadas [Rojas-Espinosa et al., 1974]. Mediante análisis de PCR de

transcriptasa reversa, se ha demostrado que en infecciones de células humanas

monocíticas TPH-1 infectadas con M. tuberculosis, o expuestos a LPS inducen la

expresión de los genes CATB y CATD, pero no así de la CATG [Rivera-Marrero et al.,

2004].

Bomba de protones dependiente de ATP

La bomba de protones dependiente de ATP (H+-ATPasas vacuolares) es un

complejo de subunidades que se encuentran en todas las células eucarióticas y consiste

de un dominio V1, el cual contiene la actividad de ATPasa, y un dominio V0, que

contiene un canal de protones transmembrana. Es expresada ubicuamente en varios

compartimientos intracelulares (retículo endoplasmático, aparato de Golgi, lisosomas y

endosomas) y es responsable de su acidificación [Lee (a) et al., 2004].

En ciertos tipos celulares también interviene en el transporte de protones a través

de la membrana plasmática. La V-ATPasa intracelular tiene funciones tanto en la

membrana endocítica como en las membranas intracelulares de tráfico, en la

transformación y degradación de macromoléculas, y se acopla al transporte de pequeñas

moléculas como el ATP y neurotransmisores. También interviene en la entrada de

agentes patógenos como virus y toxinas bacterianas. Las V-ATPasas están presentes en

la membrana plasmática de los macrófagos y son importantes la homeostasis del pH. Se

compone de un dominio periférico (V1) que lleva a cabo la hidrólisis del ATP y un

dominio integral (V0) responsable del transporte de protones. El dominio V1 contiene 8


31

subunidades (A-H), mientras que el V0 contiene 6 subunidades (a,c,c´,c´´,d y e)

[Cipriano et al., 2008].

En el macrófago, la función fagolisosomal en la infección por M. tuberculosis se

puede encontrar afectada. Dentro del lisosoma existen potentes enzimas hidrolíticas

capaces de degradar una amplia gama de macromoléculas, incluyendo

microorganismos. Estas enzimas actúan óptimamente en un pH ácido (4,5-5,0)

mantenido por la H+-ATPasas vacuolares. El bacilo tuberculoso, tiene la capacidad de

producir cantidades importantes de amoníaco, lo que puede limitar la toxicidad del

ambiente intravacuolar de los lisosomas [Araujo et al., 2008].

NADPH oxidasa

La nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) oxidasa, son un grupo

de complejos enzimáticos que se encuentran en una variedad de células. La más

estudiada de ellas es la NADPH oxidasa de leucocitos, que se encuentra en fagocitos y

linfocitos B. La NADPH oxidasa cataliza la producción de superóxido (O2-) por la

reducción de un electrón de oxígeno, utilizando NADPH como donante de electrones.

El O2- generado por esta enzima sirve como materia prima para la producción de un

amplio surtido de moléculas oxidantes [Babior, 1999].

El complejo principal consta de cinco componentes PHOX {por PHagocyte

(fagocito) OXidase (oxidasa)}: p40phox, p47phox, p67phox, p22phox y gp91phox [Babior,

1999], y de dos proteínas G pequeñas: Rac1 y Rac2 [Vignais, 2002]. En las células en

reposo, tres de los cinco componentes (p40phox, p47phox y p67phox) se encuentran

acomplejados en el citosol. Los otros dos componentes (p22phox y gp91phox) se

encuentran en las membranas de las vesículas secretoras y en gránulos específicos,

donde constituyen la flavo-hemoproteína heterodimérica conocido como citocromo b558.

La separación de estos dos grupos de componentes entre los distintos compartimentos

subcelulares garantiza que la oxidasa es inactiva en las células en reposo. Cuando la

célula se activa, el componente citosólico p47phox se fosforila [Babior, 1999], los

factores de intercambio de nucleótidos de guanina convierten Rac-GDP en Rac-GTP

[Kawahara y Lambeth, 2007] y todo el complejo citosólico emigra a la membrana,

donde se asocia con el citocromo b558 para ensamblar la oxidasa activa. Los fagocitos

generan especies reactivas de oxígeno (ROS) como el superóxido y H2O2 en los

fagosomas que ayudan a contener a los microorganismos invasores. Se ha comprobado


32

que la producción de ROS mediada por M. tuberculosis depende en gran medida por

NOX2 (gp91 phox) y TLR2 [Yang et al., 2009].

Óxido nítrico (NO)

La producción de NO y otros metabolitos reactivos del nitrógeno desempeñan un

papel importante en la inmunidad innata [Chan et al., 1992]. El NO es un radical libre

difusible, capaz de reaccionar con el oxígeno y los intermediarios reactivos del oxígeno

en solución y formar una amplia variedad de productos como el dióxido de nitrógeno

(NO2), nitrito (NO2-), nitrato (NO3-), trióxido de nitrógeno (N2O3), y con el superóxido

produce el anión peroxinitrito (ONOO-) [MacMicking et al., 1997; Miller et al., 2004].

La iNOS es la principal enzima generadora de RNI en las células del sistema inmune

[Lowenstein y Padalko, 2004]. La elevada producción de NO por los macrófagos

activados es un mecanismo antimicrobiano potente. Estos fagocitos, bajo la activación

por agentes apropiados tales como el IFNγ y TNFα, generan NO e intermediarios

reactivos de nitrógeno vía NOS2 usando L-arginina como sustrato. La actividad de estos

óxidos de nitrógeno tóxicos en la defensa del huésped ha sido bien documentada, tanto

in vitro como in vivo, particularmente en modelos de ratón. En el ratón, los RNI juegan

un papel protector en la infección tuberculosa aguda y crónica persistente. En

individuos con TB pulmonar activa se ha detectado un elevado nivel de expresión de

NOS2 en macrófagos obtenidos por lavado pulmonar alveolar. Además, se ha

observado que el nivel de NO exhalado aumenta en los pacientes con tuberculosis. El

papel del oxígeno tóxico en el control de la infección micobacteriana permanece en

controversia ya que no se ha confirmado su habilidad para matar a M. tuberculosis.

Además, las micobacterias son capaces de evadir su efecto tóxico de diferentes maneras.

Por ejemplo los componentes micobacterianos LAM y el fenolicoglicolípido-I (PGL-I)

son potentes destructores de los radicales de oxígeno. Asimismo, los sulfátidos

micobacterianos interfieren con el mecanismo antimicrobiano dependiente de radicales

de oxígeno del macrófago [Araujo et al., 2008].

Slc11a1

Slc11a1, también conocido como NRAMP1 es uno de los pocos genes de

resistencia en ratón que se ha identificado a nivel molecular. Es una proteína de

membrana que es expresada en el compartimiento lisosomal de los macrófagos. Es parte

de un gran familia de genes conservados de transportadores de cationes bivalentes tanto


33

en humanos como en bacterias [Gruenheid y Gros, 2000]. En estudios en ratones se ha

demostrado que la proteína esta localizada en el endosoma tardío y en los componentes

lisosomales [Atkinson et al., 1997; Gruenheid et al., 1997; Searle et al., 1998], pero no

en el endosoma temprano [Gruenheid et al., 1997]. Empleando ratones y líneas

macrofágicas transfectadas se ha observado que este gen desempeña un papel

importante en la ruta de activación de los macrófagos. Tiene muchos efectos

pleiotrópicos sobre la función del macrófago incluyendo la regulación de quimiocinas

CXC, IL-1β, iNOS, moléculas del MHC clase II, TNFα, así como sobre la actividad

antimicrobiana [Blackwell et al., 2000].

La función principal de la proteína Slc11a1 es la de transportar hierro a través de

la membrana [Liu et al., 1995]. Sin embargo, hay controversia sobre su función

biológica. Una escuela propone que su función es aumentar el Fe2+ intrafagosomal a fin

de proporcionar el catalizador para la reacción Haber-Weiss/Fenton que generan

radicales hidroxilo, altamente tóxicos. La segunda escuela propone que su función es

privar a la bacteria intrafagosomal de la disponibilidad de Fe2+ y otros cationes

bivalentes (Zn2+, Mn2

+, de la superóxido dismutasa) que son críticos para la bacteria

[Wyllie et al., 2002].

Receptores de citocinas

INFGR1 e IFNGR2

En años recientes, se han observado pacientes con trastornos de la producción de

IFNγ (errores innatos que afectan a la producción o la respuesta del IFNγ), causados por

mutaciones específicas en ciertos genes [Zhang et al., 2008]. Este trastorno es conocido

como susceptibilidad mendeliana a enfermedades micobacterianas, el cual es un raro

síndrome congénito que se define como una enfermedad clínica grave que confiere una

predisposición a infecciones causadas por especies de micobacterias poco virulentas,

como las de la vacuna BCG y MNT. En este síndrome se han identificado algunas

mutaciones del IFNGR1 y del IFNGR2 [Filipe-Santos et al., 2006 TNFRF1A

El TNFα ejerce sus efectos pro-inflamatorios a través de 2 receptores,

TNFRSF1A (TNFRI p55) y TNFRSF1B (TNFRII p75). El TNFRSF1A se encuentra

ampliamente distribuido y parece ser el principal receptor de inducción de la


34

señalización del TNFα soluble [Siebert et al., 2005]. Se ha visto en ratones que

presentan una alteración en el gen que codifica el TNFRSF1A, y que fueron infectados

con M. tuberculosis fueron incapaces de controlar la infección y fallecieron rápidamente

en comparación con una cepa control [Flynn et al., 1995].


35

OBJETIVOS:

1. Estandarizar un protocolo de infección de monocitos humanos con

micobacterias.

2. Cuantificar citocinas proinflamatorias e inhibitorias, en sobrenadantes de

monocitos y neutrófilos infectados.

3. Determinar el efecto de la actividad antimicobacteriana de los monocitos

y neutrófilos activados con IFNγ y TNFα.

4. Estudiar las diferencias de la expresión génica en monocitos humanos

infectados con M. tuberculosis y L. pneumophila.

MATERIAL Y MÉTODOS

36

BACTERIAS

Cepas bacterianas

Las cepas utilizadas para la realización de este trabajo se encuentran

puntualizadas en la tabla 2.

Las micobacterias son aislados clínicos procedentes del Hospital de León y del

Hospital del Bierzo. Mycobacterium gordonae atenuada (HL184Gat) es una cepa

obtenida en la Unidad de Investigación del Hospital de León. La atenuación se observó

tras las resiembras realizadas durante más de un año para su conservación. La cepa

atenuada de M. gordonae proviene de la cepa original rugosa (HL184G) y tiene la

característica de ser lisa, menos pigmentada y más fácil de dispersar en medio líquido.

Tabla 2: Bacterias utilizadas

Cepa bacteriana Identificación

Mycobacterium tuberculosis HL186T1

Mycobacterium tuberculosis 453442

Mycobacterium kansasii HL228K1

Mycobacterium avium HL70A1

Mycobacterium gordonae HL184G1

Mycobacterium gordonae atenuada HL184Gat3

Legionella pneumophila SG1 tipo Philadelphia4 1 Aislado clínico Hospital de León, cedidas por Julio Blanco y Manuela Caño 2 Aislado clínico del Hospital del Bierzo, proporcionada por Ramiro López 3 Unidad de Investigación, Hospital de León, 4 ATCC no 13151, cedida por Carmen Peláz

Material y Métodos

37

Manipulación y cultivo de bacterias

Condiciones de cultivo

Las manipulaciones con las bacterias se realizaron en cuarto con sistema de

extracción de aire y filtros de seguridad en las salidas del extractor; y en campana de

seguridad biológica de flujo laminar vertical BHA 48 FASTER (Cultek, S.L.U.).

Las micobacterias se cultivaron en los siguientes medios:

• Medio líquido 7H9 con 0,2% glicerol y enriquecido con 10% (v/v) de

suplemento Middlebrook ADC (albúmina dextrosa catalasa, Becton

Dickinson Microbiology Systems).

• Medio sólido 7H11 con 0,2% glicerol y con 10% (v/v) de suplemento

Middlebrook OADC (ácido oleico albúmina dextrosa catalasa, Becton

Dickinson Microbiology Systems).

L. pneumophila se cultivó en agar base con carbón activado y extracto de

levadura (BCYE, “Buffered Charcoal Yeast Extract”, CONDA), suplementado con: 1%

N-2-Acetamido-2-Aminoetano Ácido Sulfónico, 0,025% pirofosfato férrico, 0,04%

clorhidrato de L-cisteína, 0,1% alfa-cetoglutarato e hidróxido potásico, pH 6,9. Este

suplemento fue preparado fresco y esterilizado por filtración con membranas de 0,22

µm (Millipore).

Todas las bacterias se incubaron a 37º C en un incubador de CO2 con 95% de

aire/5% de CO2.

Individualización de bacterias

Las micobacterias son muy hidrofóbicas, y muestran una fuerte tendencia a

crecer en grandes agrupaciones. Fue preciso por tanto individualizar las bacterias (u

obtener pequeños grumos de no más de tres bacterias), para aumentar la

reproducibilidad de los ensayos y facilitar su cuantificación y manipulación.

Cada muestra del cultivo fresco en agar 7H11, de las micobacterias se

resuspendió en medio X-VIVO-15 sin antibióticos (Cambrex Bio Science). Se sonicó

con un disruptor celular ultrasónico digital S-450 (Branson, Danbury), con pulsaciones

de 3 segundos a una amplitud del 10% (2W), y se centrifugó a 100 × g durante 1 minuto

a temperatura ambiente. Después de recuperar los sobrenadantes, se repitió la

Material y Métodos

38

sonicación y centrifugación tantas veces como fue necesario para obtener bacterias

individualizadas, generalmente de tres a cuatro rondas. La viabilidad de las bacterias se

determinó por microscopía después de teñirlas con el kit LIVE/DEAD Baclight

bacterial (Molecular Probes, Invitrogen).

En el caso de L. pneumophila, no fue necesario el procedimiento de la

sonicación, solamente se tomó una muestra del cultivo fresco de la placa de agar y se

resuspendió en DPBS (2.0 g/l KCl, 2.0 g/l KH2PO4, NaCl, 21.6 g/l Na2PO4 · 7H2O, pH

de 7,4) sin calcio ni magnesio.

Para la conservación y almacenamiento de las bacterias individualizadas, se

guardaron en congelación a –80º C con glicerol al 25% en medio de cultivo RPMI sin

suero.

Cuantificación de bacterias

Para estimar la concentración de las micobacterias se realizaron una serie de

diluciones decimales y se sembraron en placas de 96 pocillos en medio líquido 7H9

suplementado. Las siembras se hicieron por triplicado y se incubaron a 37º C durante

6-10 días. Las micobacterias crecen en líquido como microcolonias debido a su

hidrofobicidad [Fazal et al., 1992]. Las UFC fueron determinadas mediante

visualización en un microscopio de inversión.

En el caso de L. pneumophila, las bacterias se resuspendieron en DPBS sin

calcio ni magnesio y las diluciones se sembraron en placas Petri de 60 mm de diámetro

con BCYE suplementado. Las siembras se realizaron por triplicado y fueron incubadas

a 37º C. A los 4 días se determinaron las UFC por recuento directo.

39

CÉLULAS HUMANAS

Manipulación y cultivo de las células

Las manipulaciones de los cultivos celulares se efectuaron guardando

condiciones de esterilidad y trabajando en campana de seguridad biológica de flujo

laminar vertical. Los cultivos celulares se realizaron en placas de 6, 24 o 96 pocillos de

fondo plano (según las necesidades del ensayo), con tapa de baja evaporación (Falcon/

Becton Dickinson). Se incubaron a 37º C en un incubador de CO2 con 95% de aire y 5%

de CO2.

Líneas celulares

Se han mantenido en cultivo dos líneas celulares:

• A549: línea de células pulmonares alveolares tipo II humanas,

proporcionadas por Antonio Fernández Medarde. Se ha demostrado que

las micobacterias son capaces de infectar estas células, por lo que

constituyen un buen modelo de estudio [Bermudez y Goodman, 1996].

• HL60: línea promielocítica humana, cedida por José Ignacio Rodríguez

Barbosa. Estas células se pueden diferenciar a macrófagos y

consecuentemente infectar con micobacterias.

Ambas líneas se cultivaron en placas de 6 pocillos con medio RPMI 1640 con

tampón HEPES 25 mM suplementado con 10% (v/v) de suero fetal bovino, 2mM

glutamina, 250 µg/ml de anfotericina B y 100 U/ml de penicilina G potásica.

Células sanguíneas humanas

Las células sanguíneas se obtuvieron a partir de sangre de voluntarios jóvenes y

sanos. Todos los donantes firmaron voluntariamente un documento de consentimiento

informado, accediendo a donar sangre con fines de investigación, cuya redacción fue

aprobada por la Comisión Ética de Investigación Clínica del Hospital de León. Las

Material y Métodos

40

muestras fueron tomadas en el servicio de extracciones del Hospital de León, por

personal capacitado en tubo con anticuagulante (EDTA).

Reactivos para la purificación de monocitos y neutrófilos

• Solución tampón DPBS con BSA: Reactivo utilizado en la purificación

de los monocitos (recomendación del proveedor del kit de purificación).

Constituido por 0,5% albúmina sérica bovina y 2,0 mM EDTA en DPBS

sin calcio ni magnesio.

• ACD: Usado en la purificación de neutrófilos como anticoagulante.

Preparado con ácido cítrico 65 mM, citrato sódico 85 mM y dextrosa al

2%, disueltos en agua destilada y esterilizado por filtración (Steritop,

Millipore)

• Solución dextrano: Usado para sedimentar neutrófilos. El dextran-500

se preparó al 6%, disuelto en solución salina 0,9%. Se esterilizó por

filtración (Steritop, Millipore).

• Solución de KCl: Este reactivo fue usado para restablecer la fuerza

iónica de las células y evitar la lisis. Se preparó KCl 0,6 M, y se

esterilizó en autoclave a 121º C de presión durante 20 minutos.

Purificación y cultivo de monocitos

La sangre fue mezclada con DPBS sin calcio ni magnesio en volúmenes iguales

y se añadió sobre un lecho de Ficoll-Paque Plus (General Electric Healthcare Life

Sciences) con una densidad de 1,077 g/ml. Se centrifugó a 300 × g durante 30 minutos

a 20º C para separar las células mononucleares del resto de los componentes de la

sangre (Fig. 7). Se recuperó la capa de células mononucleares, en la interfase, por

encima del Ficoll [Böyum, 1968, modificado], y se purificaron las células CD14+

(monocitos) por separación magnética celular en columna (Myltenyi Biotec). Se

realizaron tres lavados con solución tampón DPBS con BSA, para eliminar las células

CD14- y se eluyeron las células CD14+ en un medio de cultivo adecuado en función del

uso requerido para los monocitos, ya sea el medio X-VIVO-15 o en medio de

macrófagos libre de suero (M-SFM).

Para la purificación de los monocitos también se usó el protocolo del kit

EasySep (StemCell Technologies), con el cual se obtuvo un mayor rendimiento de

Material y Métodos

41

células. En éste kit se utilizaron las células mononucleares obtenidas en gradiente de

Ficoll, y se incubaron en un tubo de plástico de 11 × 70 mm con bolitas magnéticas

recubiertas de anti-CD14. En presencia de un imán se retuvieron las células CD14+ y se

eliminaron las restantes por decantación, se lavó con la solución tampón DPBS con

BSA. La células purificadas se resuspendieron en el medio de cultivo apropiado. Los

monocitos se mantuvieron en incubación a 37º C.

El recuento celular se realizó en una cámara de Neubauer, en un microscopio de

contraste de fases. La pureza de los monocitos fue determinada por citometría de flujo,

usando anticuerpos anti-CD45 (panleucocitario) y anti-CD14 (que reconocen

monocitos). Con el kit de Miltenyi se obtuvo una pureza > 94% y con el kit EasySep, >

95%.

Fig. 7: Purificación de monocitos: separación de la capa de células mononucleares (monocitos y linfocitos) del resto de los componentes sanguíneos.

Purificación y cultivo de neutrófilos

Para la purificación de neutrófilos se siguió la técnica de Böyum con

modificaciones [Böyum, 1968]. Por cada 4,5 ml de sangre anticoagulada se agregó 1 ml

de ACD y 2.5 ml de dextrano, se mezcló por inversión 20 veces para posteriormente

dejar en reposo a temperatura ambiente de 45 a 60 minutos, con la finalidad de separar

los eritrocitos, que van al fondo del tubo, del resto de las células sanguíneas. Tras

recuperar el sobrenadante, se realizó una lisis hipotónica del resto de eritrocitos, que no

habían sido decantados, con 3 ml de agua destilada fría, dejándolo en reposo no más de

20 segundoss. Se agregó 1 ml de KCl 0,6 M, para el restablecimiento la fuerza iónica.

Material y Métodos

42

Se centrifugó a 300 × g durante 5 minutos a 20º C, y se desechó el sobrenadante. Se

repitió este paso tantas veces como fue necesario para eliminar los eritrocitos,

generalmente 2-3 veces. Se recuperaron los neutrófilos y las células mononuclerares y

fueron resuspendidas en 3 ml de DPBS. Se depositaron en un tubo con Ficoll-Paque

Plus, para separar los neutrófilos mediante gradiente de sedimentación, centrifugándolos

a 400 × g durante 30 minutos a una temperatura de 20º C. Después se retiró el

sobrenadante, y los neutrófilos fueron recuperados del fondo del tubo y resuspendidos

en medio X-VIVO-15 o en medio M-SFM, según las necesidades del ensayo.

Los neutrófilos se mantuvieron en incubación a 37º C. El recuento también se

realizó en una cámara de Neubauer, en un microscopio de contraste de fases. La pureza

fue determinada por citometría de flujo, usando anticuerpos anti-CD66b, que reconocen

neutrófilos. > 95% de células fueron CD66b+.

43

INFECCIONES

Reactivos específicos

• TPA: Utilizado para diferenciar células HL60 a células de tipo

macrofágico.

• Vit-D3: Utilizada para diferenciar células HL60 a células de tipo

macrofágico.

• Citocinas: Usadas para activar los monocitos. Interferón gamma (IFNγ,

>2 ×107 unidades/mg), 25 y 100 ng/ml; factor de necrosis tumoral alfa

(TNFα, >2 × 107 unidades/mg), 25 ng/ml, ambas de Peprotech.

Preparados en el medio de cultivo X-VIVO-15 o en medio M-SFM,

según las necesidades del ensayo.

Infección de líneas celulares

Las infecciones de las células HL60 y A549 se realizaron en placas de cultivo

celular de 96 pocillos, infectando 105 células HL60 y 2 × 104 células A549 (de mayor

tamaño) con 103 de bacterias, lo cual representa un MOI de 0,01 y 0,05

respectivamente. Se cultivan en medio RPMI 1640 con suero, en un volumen final del

cultivo de 100 µl, y se incubaron a 37º C por cuatro días. Cuando fue necesario se

agregó TPA a una concentración de 50 nM [modificado de Gallagher et al., 1979] o Vit-

D3 a una concentración de 0,1 µM [modificado de McCarthy et al., 1983]. La lisis

celular y el recuento de las bacterias se realizaron de la misma manera que en el caso de

las infecciones de los monocitos.

Infección de monocitos y neutrófilos

En placas de cultivo celular de 96 pocillos se infectaron 105 de las células

sanguíneas con 103 bacterias, siendo los MOI de 0,1. Se cultivaron en medio X-VIVO-

15 sin antibióticos o medio M-SFM en un volumen final de 100 µl. Para L.

pneumophila se requirió una opsonización, con 10% de suero autólogo.

Material y Métodos

44

Para los experimentos de inhibición aplicamos 2 µg de los anticuerpos de ratón

IgG1, anti-TNFα y anti-IL-β1 o de rata IgG1, anti-IL-6 (eBioscience), en el medio de

cultivo X VIVO 15, con los correspondientes controles isotípicos.

Las infecciones de monocitos se incubaron durante cuatro días y las de

neutrófilos durante 1 día a 37º C.

Después del periodo de incubación, se lisaron las células por medio de

sonicación con micropunta (Branson) con una amplitud del 10% (2 W) durante 3

segundos para liberar las bacterias. En estas condiciones de ruptura celular, sólo se

lisaron las células pero no se vio afectada la viabilidad de las bacterias. Para el recuento

del crecimiento intracelular de las micobacterias, se realizaron diluciones decimales, en

medio 7H9 y se inocularon 100 µl en placas de 96 pocillos por triplicado [Fazal et al.,

1992]. En el caso de L. pneumophila, se resuspendieron en DPBS sin calcio ni magnesio

y se sembraron 100 µl en placas de agar BCYE. Las micobacterias se incubaron durante

6-10 días y L. pneumophila 4 días, ambos casos a 37º C.

Cuantificación de bacterias intracelulares y extracelulares

Para determinar la cantidad de bacterias intracelulares y extracelulares se hizo

una infección con MOI = 0,1. Se infectaron 105 células (monocitos o neutrófilos) con

103M. tuberculosis, y se incubaron durante 3 y 24 horas a 37º C. Después de cada

tiempo de incubación, se recolectó el sobrenadante del cultivo celular y se lavó el

cultivo (sin desprender las células) con 50 µl de DPBS y se volvió a recolectar junto con

el sobrenadante. Se agregaron 100 µl de medio X-VIVO-15 al cultivo y se lisó (como

en protocolos anteriores). Tanto al sobrenadante como a las células lisadas se les

realizaron diluciones decimales y se sembraron en medio sólido (7H11) por duplicado.

Las bacterias fueron incubadas a 37º C durante10 días. El recuento de las micobacterias

se realizo por recuento directo.

Material y Métodos

45

Comprobación de la fagocitosis de micobacterias (tinción

Kinyoun-Giemsa)

Reactivos específicos de la tinción de Kinyoun-Giemsa

• Solución Etanol-HCl: Solución utilizada para decolorar la tinción de

Kinyoun. Preparada en etanol al 70% en agua destilada con 0,5 ml de

HCl en un volumen final de 50 ml.

• Colorante Giemsa: Utilizado como 2º colorante. Se preparó la solución

Giemsa al 10% en agua destilada.

• Solución A: Solución decolorante utilizada para lavar las muestras

teñidas con la tinción de Giemsa. Se prepararon 50 ml de etanol absoluto

+ 2 gotas de ácido acético glacial.

• Etanol: Utilizado como decolorante de la tinción de Giemsa. Se utilizó

etanol absoluto y al 96% en agua destilada.

Tinción Kinyoun-Giemsa

En algunos casos fue necesario teñir las células infectadas, para comprobar si

las micobacterias eran debidamente fagocitadas. Aprovechando que las paredes

celulares lípidicas de las micobacterias poseen la característica de tener afinidad y

fijación del colorante carbofuccina (tinción de Kinyoun), la micobacterias se tiñen de

color rosa. Como coloración diferencial se empleó la tinción Giemsa. Esta técnica esta

formada por varios colorantes, los tintes neutros utilizados combinan el azul de metileno

como tinte básico y la eosina como tinte ácido, que da una amplia gama de colores. El

citoplasma se tiñe de rosa y los núcleos de azul.

Para la realización de la tinción se infectaron monocitos o neutrófilos (8,1 × 105)

con la misma cantidad de bacterias (M. gordonae y M. gordonae atenuada), MOI = 1,0,

en 100 µl de medio de cultivo el cual fue depositado sobre un cubreobjetos circular de

12 mm de diámetro, en placa de cultivo celular de 24 pocillos. Después de 3 horas de

incubación se agregaron hasta 400 µl del medio de cultivo y se incubaron a 37º C, en el

caso de los monocitos, durante 4 días, y para los neutrófilos por 1 día. Después de la

incubación, se retiró el medio de cultivo y se fijaron con metanol durante 30 min. a

Material y Métodos

46

temperatura ambiente. Posteriormente se agregó el colorante Kinyoun, colocando las

muestras a 60º C durante 1 hora, se lavo con agua del grifo hasta que no saliera color y

se procedió a decolorar con solución de etanol-HCl procedimiento realizado en 2

ocasiones. Después se lavó con agua del grifo y se añadió el colorante Giemsa

dejándolas en reposo durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente se les

realizó una seria de lavados con la solución A, etanol al 96 %, etanol 100 % y Xilol (en

4-2-2-2 ocasiones respectivamente). Finalmente se aplicó una gota de líquido de montar

(Pertex) a un portaobjetos y se puso encima el cubreobjetos ya teñido. Las

micobacterias intracelulares fueron visualizadas por microscopía a 1.000 aumentos.

Infecciones para cuantificación de citocinas

Las infecciones para cuantificar las citocinas pro-inflamatorias (IL-1β, IL-6, IL-

8, IL-12 y TNFα) y citocinas inhibitorias de la respuesta inmune (IL-4, IL-10 y TGF-

β1), en sobrenadantes de cultivo se realizaron utilizando el mismo esquema de

tratamiento ya mencionado para monocitos y neutrófilos. Las infecciones fueron por

triplicado, en medio X-VIVO-15, en un volumen final de 100 µl. Se recuperó el

sobrenadante de los tres cultivos, en el caso de los monocitos a los cuatro días pos-

infección y al día siguiente de la infección en el caso de los neutrófilos.

En ambos casos, para eliminar las bacterias del sobrenadante se centrífugo la

muestra a 8000 × g durante 3 minutos a temperatura ambiente en filtros ultrafree-MC

(Millipore), con un tamaño de poro de 0,45 µm. Los sobrenadantes se mantuvieron a

–80º C hasta el momento de realizar su cuantificación.

Infecciones para obtención de ADNc

Para la obtención de ADNc, a partir de ARN total de monocitos, se incubaron

durante 4 horas a 37º C, después se infectaron 5 × 105 células con 5 × 105 bacterias

(MOI = 1), y se cultivaron en placas de cultivo celular de 24 pocillos, en un volumen

final de 400 µl de medio X-VIVO-15 o medio M-SFM e incubados a 37º C durante una

noche.

Análisis estadístico

En el análisis estadístico de la actividad antimicrobiana de los monocitos y

neutrófilos, frente a diversas bacterias, se determinó que la transformación logarítmica

Material y Métodos

47

de la variable UFC seguía una distribución normal. Cuando se compararon dos

muestras, el logaritmo de UFC se analizó usando la prueba t de Student. Cuando más

de dos grupos fueron comparados, se determino un análisis de la varianza de una vía y

realizaron las comparaciones múltiples con la prueba de Tukey´s. Cuando las varianzas

fueron desiguales, se aplicó la prueba Tamhane. En todos los casos, Se consideró

significativamente estadístico un nivel de probabilidad de p <0,05. Los análisis

estadísticos se realizaron con el paquete estadístico SPSS v. 14.0.

48

CUANTIFICACIÓN DE CITOCINAS

Método ELISA

El método ELISA empleado consta de un anticuerpo de captura inmovilizado en

una placa de 96 pocillos en el que se aplica la muestra a estudiar. La citocina presente

en la muestra se une al anticuerpo, y queda disponible para unirse a un segundo

anticuerpo (de detección), que está biotinilado. Para determinar la cantidad de citocina

presente se une al anticuerpo estreptavidina que lleva acoplada covalentemente la

enzima peroxidasa de rábano. La cantidad de citocina es proporcional a la cantidad de

color detectado espectrofotométricamente cuando se adiciona el sustrato TMB (3,3´,5,5´

tetrametilbencidina), que vira de transparente a azul. Se obtiene mayor sensibilidad si se

adiciona HCl 250 mM que da lugar a la formación de un color amarillo que es medido a

450 nm.

La lectura de la reacción coloreada se midió en un lector de ELISA OPSYSMR,

DYNEX a 450 nm

• La cuantificación de la citocina IL-4 se realizo con el kit de IL-4 BD

OptEIA ELISA (Becton Dickinson). Los estándares fueron diluciones

1:2 desde 500 hasta 7,8 pg.

• La cuantificación de la citocina TGF-β1 se determinó con el kit de TGF-

β1 Emax immunoassay system (PROMEGA). Los estándares fueron

diluciones 1:2 desde 1000 hasta 15,6 pg/ml.

En todos los casos el control negativo fue medio de cultivo y las muestras

fueron analizadas por duplicado.

Método CBA

El kit Cytometric Bead Array Human Inflamation Kit (BD Biosciences) permite

la cuantificación de citocinas por citometría, mediante el empleo de unas bolitas de un

tamaño distinto para cada citocina, que tiene acoplado el anticuerpo correspondiente. El

Material y Métodos

49

kit se empleó siguiendo las instrucciones del fabricante, midiendo simultáneamente en

cada muestra IL-12 p70, TNFα, IL-10, IL-6, IL-1β e IL-8 en 30 µl de sobrenadante.

Análisis estadístico

En la cuantificación de citocinas los datos no siguen una distribución normal, y

se analizaron usando el método no paramétrico Krustal-Wallis. Se uso la prueba Dunn´s

para comparaciones pairwise. En todos los casos, Se consideró significativamente

estadístico un nivel de probabilidad de p <0,05. Los análisis estadísticos se realizaron

con el paquete estadístico G-Stat v. 2,0 (prueba de Dunn´s).

50

EXPRESIÓN GÉNICA

Reactivos específicos

• Solución TE: Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM.

• Solución TAE: Tris-Base 4,84 g, ácido acético glacial 1,142 ml, 20 ml

de EDTA 0,5 M (pH 8,0), por litro de solución.

• SYBR green-fluoresceína: El fluorescente intercalante empleado en la

PCR en tiempo real fue SYBR green (1:10.000), que tiene la

característica de emitir una baja fluorescencia cuando esta libre en la

solución que aumenta al unirse a ADN de doble cadena. Dicha

fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN presente en la

reacción. El sistema de detección iCycler de Bio-Rad requiere que para

uniformizar cualquier variación del sistema óptico o de pipeteo, se añada

a la mezcla de reacción fluoresceína (10 nM), que emite fluorescencia a

una longitud de onda similar a la del SYBR green.

Genes diana

Los genes diana se detallan en la tabla 3, estos genes fueron seleccionados por

codificar proteínas que de alguna manera intervienen en la inmunidad innata del

huésped.

Diseño de cebadores

Se usaron una serie de cebadores (tabla 4), un par (“forward/reverse”) para cada

gen en estudio. Se emplearon secuencias ya descritas por otros autores, o fueron

diseñados por nosotros con el programa Primer3 V 4,0, de libre acceso en Internet

(http://frodo.wi.mit.edu/primer3).

Material y Métodos

51

Tabla 3: Descripción de los genes utilizados

Gen

[código HUGO]*

Nombre Código

secuencia&

p47 phox

[NCF1] Factor citosólico 1 de neutrófilos BC002816

gp91 phox

[CYBB] Citocromo b-245, polipéptido beta BC032720

DEFB1

[DEFB1] Defensina beta 1 BC047677

DEFB2

[DEFB4] Defensina beta 4 Z71389

DEFB3

[DEFB103A] Defensina beta 103 A AF301470

DEFB4

[DEFB104A] Defensina beta 104 A AJ314834

iNOS

[NOS2] Oxido nítrico sintetasa 2 A X73029

NRAMP1

[Slc11a1]

Resistencia natural del macrófago asociada a la proteína 1

BC041787

CTSD

[CTSD] Catepsina D BC016320

CTSG

[CTSG] Catepsina G BC014460

ATP6V1G1

[ATP6V1G1] H+-ATPasa lisosomal V1 subunidad G1 BC008452

ATP6V0C

[ATP6V0C] H+-ATPasa lisosomal V0 subunidad c BC007389

TNFRSF1A

[TNFRSF1A]

Receptor del factor de necrosis tumoral de la superfamilia 1 A

BC010140

IFNGR1

[IFNGR1] Interferon gamma receptor 1 BC005333

IFNGR2

[IFNGR2] Interferon gamma receptor 2 U05875

CCL20

[CCL20] Quimiocina CC ligando 20 BC020698

* Nombre del gen y símbolo de acuerdo al Comité de nomenclatura del gen HUGO & Secuencia obtenida del EMBL BANK.

Material y Métodos

52

Tabla 4: Cebadores utilizados

Primer Secuencia ( 5´-3´ ) Amplicón

(pb) Referencia

p47 phox-F p47 phox-R

CCCTGCTGGGCTTTGAGAA

CCGACAGGTCCTGCCATTT 81 Watanabe et al. 2003

gp91 phox-F gp91 phox-R

TCTGCGATTCACACCATTGC

TTGCCTGTCTCCAAGTTCAGAG 111 Éste trabajo

DEFB1-F DEFB1-R

TTGTCTGAGATGGCCTCAGGTGGTAAC

ATACTTCAAAAGCAATTTTCCTTTAT 253 Lehmann et al. 2002

DEFB2-F DEFB2-R

TCCAGGTGTTTTTGGTGGTATAGG

TCTGAATCCGCATCAGCCA 117 Éste trabajo

DEFB3-F DEFB3-R

TGAGGATCCATTATCTTCTGTTTGC

TGTGTTTATGATTCCTCCATGACC 80 Joly et al. 2005

DEFB4-F DEFB4-R

TTGTGCTGCTATTAGCCGTTTCTC

GCAGTCCCATAACCACATATTCTGTC 94 Éste trabajo

iNOS2-F iNOS2-R

ACGAGTGGTTTCGGGAACTG

ACGTCACAGAAGTCCCGGAC 151 Éste trabajo

NRAMP1-F NRAMP1-R

GCTGGAAGCTTTTTTTGGACTCC

GCCGAGTGCAGGTAGATGTTGT 204 Éste trabajo

CTSD-F CTSD-R

GACACAGGCACTTCCCTCAT

CCTCCCAGCTTCAGTGTGAT 151 Verhoeckx et al. 2004

CTSG-F CTSG-R

GGTTCCTGGTGCGAGAAGACTT

GGATGGTCCGCTGATTATATTGAG 165 Éste trabajo

ATP6V1G1-F ATP6V1G1-R

CCGCAAAAGAAAGAACCGGA

CCTTGGCCTTGAATTCTTTCTCC 101 Éste trabajo

ATP6V0C-F ATP6V0C-R

AGTCCATCATCCCAGTGGTC

CAGCTGGAGGAAGCTCT 119 Lee et al. 2004

TNFRSF1A-F TNFRSF1A-R

TGCCTACCCCAGATTGAGAA

ATTTCCCACAAACAATGGAGTAG 169 Éste trabajo

INFGR1-F INFGR1-R

CCAGGGTTGGACAAAAAGAATCT

TGATATCCAGTTTAGGTGGTCCAAT 93 Martinez et al. 2002

INFGR2-F INFGR2-R

TGAGCAATAGCACGAGGCCT

GTGTACAATTCACCCCTATGGACA 102 Éste trabajo

CCL20-F CCL20-R

GGCTGCTTTGATGTCAGTGC

GATGTCACAGCCTTCATTGGC 151 Éste trabajo

Material y Métodos

53

Obtención de ARN total y síntesis de ADNc

Se retiró el sobrenadante del cultivo celular infectado de una noche, y se

procedió a obtener ARN total siguiendo el protocolo de UltraClean Tissue RNA

Isolation Kit (MOBIO). Una vez obtenido el ARN total fue necesario aplicar un

tratamiento con ADNasa (General Electric Healthcare, Life Sciences,), para eliminar los

restos de ADN genómico. Seguidamente se continúo con el protocolo de qScript

cDNA SuperMix (Quanta Biosciences) para obtener ADNc. En un volumen final de 20

µl se mezcló el ARN (15,5µl) con el tampón (qScript cDNA SuperMix (5X)) que

contiene concentraciones optimizadas de MgCl2, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP),

un inhibidor de ARNasa, qScript transcriptasa reversa, primers de secuencia aleatoria,

oligo (dT) primer y estabilizantes, y se incubo en un termociclador con la programación

siguiente:

Paso 1 25º C por 5 min.



Paso 4 4º C por tiempo indefinido

Las muestras se guardaron en alícuotas diluidas 1:2,25 en TE a -20º C.

Estimación de las eficiencias de las reacciones de PCR

Mediante la técnica de PCR se amplificaron los genes diana. Se uso la enzima

Taq polimerasa (Taq Hot Star DNA polymerase, Hotmaster) en el tampón suministrado

por el fabricante (5 prime). Los componentes de la reacción de PCR fueron: ADNc (0,3

µl de la reacción de retrotranscripción diluida), solución tampón con magnesio (2,5

mM), cebadores (0,2 mM), dNTP´s (0,2 mM), Taq ADN polimerasa (0,5 U) en un

volumen final de 20 µl. Como agente fluorescente se utilizó SYBR Green-FAM

(Molecular Probes) diluido (1/10.000). Programación del termociclador (ciclos):

Ciclo 1 1 repetición 95º C por 1 min.

Ciclo 2 30 repeticiones

Paso 1 95º C por 30 seg.



Material y Métodos

54


Ciclo 3 1 repetición 25º C por tiempo indefinido

En éste último paso a 85º C se tomó la lectura de la fluorescencia emitida por

el SYBR green, porque a esa temperatura los productos específicos (amplicones)

formados no están desnaturalizados pero los productos inespecíficos (primer-dimers)

sí lo están y no se unen al colorante. Con esto nos aseguramos de que solo se tomó la

lectura de los amplicones.

Los productos de la PCR se analizaron por electroforesis en geles de agarosa, de

acuerdo a la metodolología descrita en el “Current Protocols in Molecular Biology”

(modificada). Se usaron concentraciones de agarosa de 0,8% y 3% en función al tamaño

de los amplicones de la muestras de ADN a separar. Como tampón de electroforesis se

empleó TAE. Como fluoróforo intercalante del ADN en la electroforesis se usó

bromuro de etidio (0,4 µg/ml). El marcador de tamaño molecular incluido en los geles

fue MassRuler DNA Ladder Mix (103 ng/µl; Fermentas Life Sciences), y como

indicador de seguimiento de la electrofóresis se uso 1 µl de 6 × MassRuler DNA

Loading Buffer (Fermentas Life Sciences). Los geles se fotografiaron sobre un

transiluminador de luz ultravioleta Chemidoc con cámara integrada (BIORAD).

El estudio de eficiencias se realizó a partir de amplicones purificados de agarosa

de acuerdo al protocolo del kit de purificación “GFX PCR DNA and Gel band”

(Amersham/Biosciences), basado en el uso de agentes caotrópicos que desnaturalizan

las proteínas, disuelven la agarosa y promueve la unión de los enlaces dobles del ADN a

una matriz de fibra de cristal. Una vez capturado el ADN, las proteínas y sales

contaminantes son lavadas y desechadas, el ADN es conservado en un tampón de

elución (TE pH 8.0, Tris-HCl 10 mM pH 8,0 o agua libre de DNAsas).

Con ayuda del software del instrumento iCycler IQ (Bio-Rad), se determinó la

eficiencia de la amplificación de cada gen a estudiar mediante la construcción de una

recta a partir de diluciones 1/8 del amplicón purificado de geles de agarosa, y aplicando

la ecuación E = 10-1/valor de la pendiente.

Material y Métodos

55

Estudio de expresión diferencial mediante qPCR en tiempo

real

Una vez obtenida la E de los genes diana, se utilizó el ADNc para determinar

la expresión génica de las células infectadas (muestras) en relación con las células no

infectadas (muestra control), su cálculo fue en base a la siguiente relación: {(Eref)Ct

muestra/(Emuestra)Ct test]/ [(Eref)

Ct control/(Emuestra)Ct control} [Pffafl, 2001]. Donde los valores

del Ct para cada uno de los genes diana se normalizaron con el Ct del gen factor de

elongación 1 alfa (EF-1α). Este gen normalizador se expresa por igual en las células

sanguíneas utilizadas en los diversos ensayos y tratadas como se ha explicado

anteriormente.

Se realizó la qPCR como se ha indicado el cálculo de la eficiencia, las muestras

fueron por triplicado, pero en este caso, en lugar de la muestra de ADN obtenida de la

purificación de la banda de agarosa, se utilizó ADNc, sintetizado a partir de ARNt

obtenido de células tratadas como se indicó en cada experimento. Se realizaron

comparaciones entre células infectadas y no infectadas. La programación del

termociclador fue la misma que para el cálculo de la eficiencia, pero en lugar de 30

ciclos se realizaron 40 ciclos.

RESULTADOS

56

INFECCIONES EN DIFERENTES TIPOS CELULARES

Con el propósito de buscar y adecuar un modelo de infección que se asemeje a la

infección causada por M. tuberculosis en el pulmón y su interacción con los macrófagos

alveolares; se realizaron varios ensayos para determinar la multiplicación intracelular de

varias cepas de bacterias con diferente grado de patogenicidad en células

promielocíticas humanas (HL60), monocitos primarios y células epiteliales pulmonares

(A549), probando diferentes medios de cultivo y aplicando distintos tratamientos.

Infecciones en células promielocíticas humanas (HL60)

Infección de células HL60 con M. avium

Siendo M. avium una micobacteria de más rápido crecimiento que M.

tuberculosis, se decide usarla para infectar células HL-60 y valorar su crecimiento

intracelular en diferentes medios de cultivo (suplementados con suero y libres de suero),

diferenciando las células a macrófagos con distintos tratamientos.

Cuando se realizaron infecciones con 1 micobacteria por cada 100 células (105

células con 103 micobacterias) en presencia de tres medios de cultivo: el RPMI,

suplementado con 10% de suero de ternera o suero fetal bovino, y el medio X-VIVO-

15, que no precisa la adición de suero, no se observó diferencia alguna en la tasa de

crecimiento intracelular de M. avium.

Con la finalidad de determinar en qué condiciones se reproducen mejor las

micobacterias, se infectaron células HL60 diferenciadas a macrófagos con la aplicación

de TPA o con Vit-D3 y, de nuevo, no se pudieron apreciar diferencias en el número de

micobacterias recuperadas tras la infección.

Efecto del suero en el crecimiento intracelular de micobacterias con grado

distinto de patogenicidad en células HL60 infectadas

Para determinar si el suero presente en el medio de cultivo influye en la

multiplicación intracelular de la micobacteria, se decide realizar un ensayo usando un

medio de cultivo que no requiere de suero (X-VIVO-15) y adicionar suero humano a

Resultados

57

una concentración de 5% para evaluar si éste tiene efecto sobre el crecimiento

intracelular de la bacteria.

Para este experimento se opta por usar otras cepas de micobacterias con

diferente grado de patogenicidad y valorar si el comportamiento es similar o diferente

entre las micobacterias. Se infectan las células HL60 con M. tuberculosis, M. avium y

M. gordonae. Las células fueron diferenciadas a macrófagos con TPA a una

concentración de 50 nM, pues con este agente las células HL60 adquieren

características similares a macrófagos, las células blanco de M. tuberculosis. Células

infectadas en ausencia de suero representaron el control negativo. Los resultados nos

muestran que las infecciones realizadas con M. avium en ausencia de suero presentan un

ligero crecimiento intracelular con respecto de las infecciones realizadas en presencia

suero, aunque no significativas estadísticamente. No así en el caso de M. tuberculosis

que los resultados son prácticamente iguales; sin diferencias significativas, por lo que

deducimos que el suero no influye en el crecimiento intracelular de estas micobacterias

(tabla 5). Aunque el suero se suele considerar como fuente de opsoninas, los resultados

obtenidos apuntan a que no es necesario para que las micobacterias sean eficientemente

fagocitadas.

Aunque en experimentos realizados por nuestro grupo en el pasado demostraban

que M. gordonae se multiplicaba en monocitos humanos, en estos experimentos

observamos que tanto en ausencia de suero como en presencia del mismo, hay una

drástica disminución en el número de bacterias viables con respecto al inóculo inicial (p

< 0,01).

Tabla 5: Comparación de la supervivencia de micobacterias de diferente grado de patogenicidad, a diferentes concentraciones de suero

Micobacteria Inóculo Sin suero Suero 5%

M. avium 3,17±0,05 3,82±0,56 3,64±0,30

M. tuberculosis 3,05±0,02 3,35±0,18 3,44±0,15

M. gordonae 3,05±0,21 1,67±0,30* 1,87±0,36* Los datos son el resultado de 3 experimentos independientes y consecutivos y representan el promedio de los Log de las UFC±DE. * p < 0,05, estadísticamente significativa

Otro aspecto que puede influir en la viabilidad de las bacterias es la actividad

antimicrobiana intrínseca del suero. Para averiguar su importancia frente a

Resultados

58

micoboacterias se cultivaron en el medio X-VIVO-15 con y sin suero. En el ensayo se

agregaron 103 micobacterias tanto patógenas (M. tuberculosis, M. avium) como no

patógenas (M. gordonae), en medio libre de suero y con suero al 5%, y se observó que

las micobacterias patógenas daban lugar a microcolonias visualizables al microscopio

en el medio sin suero, pero no en el medio con suero (tabla 6). M. gordonae no presenta

crecimiento en ninguno de los casos. De estos resultados concluimos que el suero ejerce

un efecto inhibitorio sobre la multiplicación de las micobacterias.

Tabla 6: Efecto del suero en el crecimiento de las micobacterias

Micobacteria Sin suero Suero al 5%

M. tuberculosis + - M. avium + - M. gordonae - -

+ Visualización de UFC - No visualización de UFC

Experimentos realizados posteriormente revelaron que M. tuberculosis y M.

avium en medio X-VIVO-15 tanto en presencia como en ausencia de suero era capaces

de mantenerse vivos, puesto que se recuperaba un número de colonias semejante al

inóculo inicial. No así en M. gordonae donde se observó una ligera disminución. Por lo

tanto el suero presenta una actividad bacteriostática frente a M. tuberculosis y M. avium,

y una ligera actividad bactericida frente a M. gordonae. Podemos deducir de estos datos

que el empleo del suero es dispensable en infecciones in vitro con micobacterias.

Infecciones en monocitos primarios

Infección de monocitos con M. avium y M. gordonae

En base a los resultados obtenidos en las infecciones de las células HL60 con la

cepa de M. gordonae, donde se observó una contundente disminución del crecimiento

intracelular, y para valorar si el suero también tiene algún efecto sobre el crecimiento

intracelular en M. avium y M. gordonae, se infectaron las células con las micobacterias

(MOI = 0,1). Se emplearon dos cepas distintas de M. gordonae: siendo una de ellas en

la que se observo disminución de la multiplicación intracelular (cepa de varios años de

resiembras), que denominamos M. gordonae atenuada (cepa HL184Gat), y otra cepa

obtenida de viales congelados originalmente, que nunca habían sido resembradas (cepa

Resultados

59

original, HL184G). Las infecciones se realizaron en medio X-VIVO-15 y adicionando

suero humano a una concentración de 5%.

En las infecciones de monocitos con M. avium en ausencia de suero se produjo

una gran proliferación, estadísticamente significativa . No así en presencia del suero,

donde el crecimiento es poco mayor que en el control (tabla 7). Este resultado refleja el

crecimiento extracelular de M. avium, pues si se permite la incubación de la infección

durante seis o siete días aparecen microcolonias de la micobacteria entre los monocitos

del tapiz celular.

Tabla 7: Efecto del suero en el crecimiento de micobacterias en monocitos infectados

Micobacteria Inoculo Sin suero Suero 5%

M. avium 3,15±0,14 4,73±0,53 3,49±0,63

M. gordonae

(original) 3,15±0,14 3,75±0,33* 2,80±0,33*

M. gordonae

atenuada 3,16±0,20 1,72±0,46* 1,80±0,54*

Los datos son el resultado de 3 experimentos independientes y consecutivos y representan el promedio de los Log de la UFC±DE. * p < 0,05 (estadísticamente significativa).

En la cepa original de M. gordonae se aprecia un mayor crecimiento en las

infecciones en ausencia de suero, pero no así en presencia de suero, de forma que hay

diferencias significativas cuando se comparan los dos grupos entre ellos (p < 0,05), pero

no cuando se comparan con el inóculo. Este resultado es paralelo al obtenido para M.

avium, pero de menor magnitud

En el caso de M. gordonae atenuada, se ve claramente una disminución de la

multiplicación de la micobacteria, tanto en ausencia como en presencia de suero, con

diferencias significativas entre cada grupo y el inóculo (p < 0,05). Al observar la

morfología de las colonias sobre medio sólido de esta micobacteria, apreciamos que son

diferentes, siendo la cepa atenuada menos pigmentada y lisa (González-Cortés et al.,

2009).

Infecciones en células epiteliales pulmonares (A549)

En la literatura se describe la multiplicación de micobacterias en la línea celular

epitelial pulmonar A549, por lo que decidimos comprobar si este modelo permite tasas

Resultados

60

de crecimiento comparables a HL60. Al ser las células A549 más grandes que las HL60,

se decide hacer un ensayo para calcular el número de células a usar en las infecciones y

se observó que a una concentración de 2 x 104 células hay una confluencia de

aproximadamente el 85%, lo que es considerado como la mejor opción. Se infectaron

con M. tuberculosis y M. gordonae y se observó que se recuperaron 9 y 3 veces más

bacterias, respectivamente, que las inicialmente inoculadas (p < 0,01) (tabla 8). Estos

resultados confirman los obtenidos por otros autores, y establecen que A549 representan

un modelo adecuado para estudiar la multiplicación intracelular de micobacterias.

Tabla 8: Supervivencia de micobacterias en línea celular A549

Micobacterias T=0 T=4d

M. tuberculosis 2,85±0,00 3,79±0,01

M. gordonae 3,00±0,00 3,48±0,04

Los datos reportados son la media geométrica del Log de la UFC ± DE de dos infecciones consecutivas e independientes T=0 Inóculo inicial T=4d crecimiento intracelular de las bacterias después de 4 días de incubación

61

CAPACIDAD DE LOS FAGOCITOS HUMANOS

(MONOCITOS Y NEUTRÓFILOS) PARA ELIMINAR A

MICOBACTERIAS NO PATÓGENAS

Una vez obtenido un modelo de infección, se decidió hacer una serie de

experimentos con voluntarios, para evaluar la actividad microbicida, cuantificar la

secreción de citocinas pro y anti-inflamatorias, y valorar efecto del INFγ y del TNFα en

la actividad anti-microbiana, tanto en monocitos como de neutrófilos

Actividad anti-microbiana de fagocitos humanos

Infección de monocitos y neutrófilos con bacterias de diferente grado de

patogenicidad

Dado que las micobacterias de baja patogenicidad como M. gordonae muy

raramente dan lugar a procesos clínicos, a pesar de ser ubicuas y encontrarse de forma

abundante en el medio ambiente, la hipótesis de trabajo inicial fue que sería

eficientemente eliminada por fagocitos humanos. Sin embargo, en los experimentos

iniciales obtuvimos evidencias sobre la incapacidad que tienen de matar a ninguna

micobacteria. Para corroborar estos resultados en monocitos, y testar la actividad de

neutrófilos, hicimos nuevas infecciones con un protocolo estandarizado. Cada una de las

infecciones fue realizada con monocitos y neutrófilos purificados simultáneamente del

mismo voluntario. Una de las razones por las que se escogió M. gordonae para testar la

actividad de los fagocitos frente a micobacterias no patógenas fue que tiene un tiempo

de reproducción similar al de M. tuberculosis, lo que permitió emplear el mismo

protocolo de infección. En experimentos preliminares observamos que las micobacterias

de crecimiento rápido crecían en medio de cultivos celulares a gran velocidad, lo que

impedía realizar infecciones de cuatro o cinco días como las realizadas con M.

tuberculosis. Como control de la actividad antimicrobiana empleamos dos modelos

distintos: L. pneumophila y la cepa atenuada de M. gordonae obtenida en nuestro

laboratorio. Se realizaron cuatro experimentos independientes y consecutivos, donde se

Resultados

62

infectaron tanto monocitos como neutrófilos, con M. gordonae y M. gordonae atenuada.

Se infectaron 105 células (monocitos o neutrófilos) con 103 bacterias. Para mejorar la

fagocitosis de L. pneumophila, se empleó para opsonizar suero autólogo sin inactivar.

Dicho tratamiento no fue requerido para las infecciones realizadas con las

micobacterias.

En la infección de monocitos se observa un pequeño pero consistente

crecimiento intracelular de M. tuberculosis (Fig. 8 panel A) con un valor de p= 0,070.

En contraste, L. pneumophila presentó un crecimiento intracelular mayor en el orden de

106 después de cuatro días de incubación, lo que podríamos considerar como una

evidencia de que los fagotitos son viables y representan un huésped apropiado para la

multiplicación intracelular.

Cuando la infección fue con M. gordonae se observan niveles significativos de

la multiplicación intracelular, lo que demuestra que aunque esta micobacteria esta

reconocida como no patógena [Weinberger y Berg, 1992], los monocitos no tienen la

capacidad de eliminarla. No así cuando se infectan con la cepa de M. gordonae

atenuada, donde se detectan niveles muy significativos de la eliminación de ésta

micobacteria.

En el caso de los neutrófilos (Fig.8 panel B), que fueron obtenidos de la misma

muestra de sangre, se probó la actividad anti-microbiana en paralelo. La principal

diferencia que se observa cuando se comparan los neutrófilos con monocitos, es que L.

pneumophila es eficazmente eliminada por los neutrófilos (p=0,005); (tabla 9). Como se

esperaba, también M. gordonae atenuada es parcialmente eliminada. Este resultado

demuestra que en estas condiciones de infección los neutrófilos ejercen una actividad

anti-microbiana sobre estas bacterias. Sin embargo, el comportamiento de los

neutrófilos fue similar al de los monocitos cuando se infectaron con las otras

micobacterias. Nuevamente observa crecimiento de M. tuberculosis y M. gordonae

después de un día de infección, pero no significativo.

Resultados

63

Fig. 8: Actividad anti-microbiana de los fagocitos (A, monocitos; B, neutrófilos). Los datos representan la media de la DE de cuatro experimentos independientes. * Se consideran como valores significativos de la prueba t de student p <0,05 + 105 células t = 0 cantidad de bacterias al momento de la infección. t = 4d cantidad de bacterias intracelulares después de cuatro días de incubación. t = 1d cantidad de bacterias intracelulares después de un día de incubación.

Resultados

64

Tabla 9: Prueba t de student para la igualdad de medias en neutrófilos infectados

95% Intervalo de

confianza para la

diferencia t *Sig.

(bilateral)

Diferencia

de medias

Error

típico de la

diferencia Inferior Superior

M. tuberculosis -0,353 0,736 -0,09246 0,26216 -0,73395 0,54902

M. gordonae

atenuada 4,092 0,006 0,83005 0,20284 0,33371 1,32638

M. gordonae -0,711 0,504 -0,10743 0,15111 -0,47719 0,26232

L. pneumophila 5,834 0,005 0,72147 0,12366 0,37331 1,06963

* Valores significativos de la prueba t de student con p <0,05 t valor de la prueba t de student

Cuantificación de micobacterias extracelulares y determinación de la

fagocitosis

A la hora de cuantificar la actividad antimicrobiana celular se debe siempre tener

en cuenta el nivel de fagocitosis, pues las bacterias que permanecen extracelularmente

no se ven expuestas a los mecanismos de defensa intracelulares. Para calcular el número

de bacterias extracelulares (no fagocitadas) se recuperó el sobrenadante al cabo de 24

horas de los fagocitos infectados con M. tuberculosis, tanto de monocitos como

neutrófilos. La cuantificación de las micobacterias se realizó tanto en el sobrenadante

como en lisados celulares (bacterias intracelulares), y se observó que permanecieron

extracelulares el 29% de las bacterias cuando se infectaron monocitos, y el 10% cuando

se infectaron neutrófilos.

De igual forma se consideró la posibilidad de que la diferencia de crecimiento

intracelular entre M. gordonae y M. gordonae atenuada, estuviera relacionada con

diferentes niveles de fagocitosis atribuibles a los cambios morfológicos sufridos por la

micobacteria atenuada. Para dar respuesta a estas conjeturas, se infectaron células con

ambas micobacterias y se tiñeron con la técnica de Kinyoun y no se apreciaron

diferencias en el número de bacterias fagocitadas en ambas cepas.

Patrón de secreción de citocinas en los fagocitos infectados

Cuantificación de citocinas pro y anti-inflamatorias

Para estimar la relación entre la actividad microbicida y el patrón de producción

de citocinas por las células infectadas, se analizaron dos tipos principales de citocinas:

Resultados

65

pro-inflamatorias (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12 y TNFα) e inhibitorias (IL-4, IL-10 y TGF-

β1). Los datos que se muestran en la tabla 10 son valores expresados en pg/ml. La razón

por la que algunas medianas son cero y los rangos de los intercuartiles distintos de cero

es que la citocina sólo se detectó en uno de los cuatro sobrenadantes analizados. Los

sobrenadantes de los controles negativos (células no infectadas) tuvieron unas medianas

<20 pg/ml, con la excepción de las citocinas IL-6 donde se encontró en los

sobrenadantes de los monocitos (161,9 pg/ml); y de la IL-8, de los sobrenadantes tanto

de monocitos (21.594,0 pg/ml) como de neutrófilos (2.494,2 pg/ml). En el caso de la

citocina TGF-β1 se encontró presente en el suero utilizado para la opsonización de las

infecciones con Legionella (3.184,5 pg/ml). La mediana de cada una de citocinas en los

controles negativos se restó de la cantidad calculada a partir de las muestras. Las

cantidades después de la sustracción ≤ 0 se les dio un valor de 0,0 pg/ml.

No se observó producción de IL-4 o IL-12, incluso en los controles negativos.

Para las citocinas producidas por L. pneumophila varias comparaciones múltiples

mediante la prueba de Dunn´s fueron significativas, pero no para las producidas por las

tres micobacterias. La IL-1β se produjo en mayor cantidad en monocitos infectados por

las bacterias patógenas M. tuberculosis y L. pneumophila, pero no en los neutrófilos

infectados. Un patrón similar se encontró con el TNFα e IL-6 en los monocitos. Pero en

los neutrófilos se encontró que la IL-6 sólo se producía en las células infectadas con L.

pneumophila. La IL-8 se secretó en grandes cantidades tanto en monocitos como en

neutrófilos, aun cuando no estuvieran infectados, pero cantidades superiores a las

obtenidas en los controles negativos sólo se detectaron en los neutrófilos. Sin embargo,

no hubo diferencias significativas entre las cuatro bacterias con las que se infectaron.

En cuanto a las citocinas inhibitorias, la IL-10, se secretó en los monocitos

infectados con M. tuberculosis y L. pneumophila, pero sólo se encontró diferencias

significativas en las células infectadas con L. pneumophila. En el caso de TGF-1β sólo se detecto en grandes cantidades en L. pneumophila, con diferencias significativas en

los neutrófilos cuando se comparó con los tres micobacterias. Aunque no se encontró

diferencia estadística cuando se realizaron comparaciones por pares con la prueba de

Dunn´s para esta citocina en los monocitos (p ≤ 0,06), la prueba Kruskall-Wallis para

este grupo fue significativa (p = 0,017).

Resultados

66

Tabla 10 Cantidad de citocinas liberadas de fagocitos infectados

IL-1ββββ IL-6 IL-8 IL-12 TNFαααα IL-4 IL-10 TGF-1ββββ

Monocitos

M.

tuberculosis

4,5 (507,0)

43,5 (6363,6)

0,0 (0,0)

0,0 (0,0)

20,05 (339,8)

0,0 (0,0)

0,0 (8,6)

0,0 (0,0)

M. Gordonae 0,0 (2,2)

0,0* (0,0)

0,0 (0,0)

0,0 (0,0)

0,0* (0,0)

0,0 (0,0)

0,0* (0,0)

0,0 (0,0)

M. gordonae atenuada

0,0* (0,0)

4,4 (8,7)

0,0 (0,0)

0,0 (0,0)

0,0 (1,3)

0,0 (0,0)

0,0* (0,0)

0,0 (0,0)

L.

pneumophila

90,5 (760,3)

6964,4 (4104,8)

0,0 (0,0)

0,0 (0,0)

62,95 (105,5)

0,0 (0,0)

34,7 (131,0)

2725,0 (1682,8)

Neutrófilos

M.

tuberculosis 0,0 (0,0)

0,0 (9,0)

257,3 (3585,2)

0,0 (0,0)

0,0 (0,7)

0,0 (0,0)

0,0 (0,0)

0,0* (0,0)

M. Gordonae 0,0 (0,0)

0,0* (0,0)

0,0 (2196,2)

0,0 (0,0)

0,0 (0,0)

0,0 (0,0)

0,0 (0,0)

0,0* (0,0)

M. gordonae atenuada

0,0 (0,0)

0,0* (0,0)

0,0 (1908,3)

0,0 (0,0)

0,0 (0,0)

0,0 (0,0)

0,0 (0,0)

0,0* (0,0)

L.

pneumophila 0,0

(24,3) 117,1 (799,9)

4700,4 (13426,8)

0,0 (0,0)

2,3 (36,7)

0,0 (0,0)

0,0 (0,0)

2526,3 (1857,8)

Las cantidades (pg/ml) se obtienen restando la cantidad de citocinas liberadas por las células infectadas a las células no infectadas. Los datos son la mediana (rango intercuartil) de cuatro experimentos independientes. la prueba Dunn´s se utilizó para las comparaciones por pares vs L. pneumophila. * p < 0.05 se considera como estadísticamente significativa.

Neutralización de citocinas en monocitos infectados con M. tuberculosis y M.

gordonae atenuada

Ninguna de las citocinas testadas fue asociada a la actividad anti-microbiana.

Aunque la diferencia en el número de micobacterias recuperadas entre M. gordonae y

M. gordonae atenuada después de la lisis de las células fue más de cien veces para los

monocitos y diez para los neutrófilos, tanto el tipo y la cantidad de citocinas producidas

fueron muy similares. Se encontró una posible relación entre el patrón de producción de

citocinas y la patogenicidad, pero este patrón no tiene asociación con la actividad anti-

microbiana mostrado por monocitos o neutrófilos. Cabe la posibilidad de que los

mecanismos de defensa frente a la actividad bactericida tanto de M. tuberculosis como

de M. gordonae son diferentes. Por este motivo se contrastó la neutralización de

citocinas en monocitos infectados con ambas micobacterias para valorar si presentaban

Resultados

67

alguna influencia en la actividad anti-microbiana. La diferencia más pronunciada en el

patrón de citocinas inducidas por estas bacterias se encontró en monocitos infectados en

presencia de las citocinas IL-1β, IL-6 y TNFα. Debido a que en los patrones a partir de

las cepas de M. gordonae original y atenuada eran similares, se optó por usar la

micobacteria atenuada contra la cual los monocitos son eficaces.

La adición de los anticuerpos neutralizantes no tuvo ningún efecto sobre la

actividad anti-microbiana de los monocitos (tabla 11) contra M. tuberculosis o M.

gordonae atenuada, ya que no hubo diferencias entre las células no tratadas y las

tratadas con cualquier combinación de anticuerpos. La adición de anticuerpos de control

del mismo isótopo demostró que los anticuerpos no específicos no influyen en los

resultados finales. En esta serie de experimentos se encontraron diferencias

significativas en el número de M. tuberculosis entre el inoculo inicial (t = 0) y las

micobacterias recuperadas tras cuatro días de infección, al contrario de lo observado en

la figura 8, en que las diferencias no fueron significativas, si bien la p fue bastante baja

(p = 0.07). Estos resultados confirman que no existe ninguna relación entre la

producción de estas tres citocinas y la actividad anti-microbiana de los monocitos

infectados.

Tabla 11: Actividad anti-microbiana de monocitos frente a M. tuberculosis y M. gordonae atenuada en presencia de anticuerpos de neutralización anti-citocinas.

M. tuberculosis M. gordonae atenuada

Bacterias inoculadas (t=0) 3,24 SD 0,06 (2,66-3,82)* 2,82 SD 0,26 (0,51-5,13)*

Tratamiento

Sin tratamiento 3,88 SD 0,08 (3,68-4,09) 2,27 SD 0,02 (2,21-2,33)

Anti-TNFα 3,92 SD 0,02 (3,86-3,98) 2,38 SD 0,14 (2,02-2,73)

Anti-IL-1β 3,94 SD 0,09 (3,73-4,15) 2,29 SD 0,08 (2,08-2,50)

Anti-IL-6 3,97 SD 0,10 (3,72-4,22) 2,31 SD 0,12 (2,00-2,62)

Anti-TNFα-IL-1β-IL-6 3,97 SD 0,07 (3,79-4,14) 2,41 SD 0,12 (2,11-2,70)

Control (IgG1 rata) 3,91 SD 0,19 (2,23-5,59) 2,30 SD 0,09 (2,08-2,52)

Control (IgG1 ratón) 3,90 SD 0,12 (3,60-4,20) 2,35 SD 0,04 (2,24-2,46) Los datos son el promedio del log del número de colonias con la desviación estándar, SD (95% de intervalo de confianza) de tres experimentos independientes. Sólo las comparaciones por pares frente a t = 0 fueron significativas, * p < 0,05.

Resultados

68

Activación de los fagocitos con citocinas y su efecto en la

actividad anti-microbiana

Efecto del INFγγγγ y del TNFαααα en la actividad anti-microbiana

En el siguiente experimento se probó si la adición de citocinas de activación,

como el IFNγ o TNFα, a las células infectadas podría ayudar en el control del

crecimiento bacteriano. Se advirtió una moderada producción de TNFα en monocitos

infectados con M. tuberculosis y L. pneumophila (20,05 y 62,95 pg/ml respectivamente;

(tabla 10) y no se correlacionó con una aparente actividad anti-microbiana. Se

adicionaron grandes concentraciones de las citocinas (25 ng/ml) por separado, o ambas

en conjunto, para valorar si esto ayudaría a las células a matar a las bacterias.

Cuando se añadieron estas citocinas a los monocitos en el momento de la

infección, no se encontraron diferencias significativas en el número de micobacterias

recuperadas después de la lisis celular entre las células activadas y las no tratadas (Fig.

9, panel A). Aunque M. gordonae atenuada fue eliminada eficazmente por los

monocitos, como se demuestra en la Fig. 8, panel A, la adición de las citocinas no

mejora esta actividad. En cambio, cuando se activan los monocitos con IFNγ, más del

80% del control de L. pneumophila es eliminado. Este resultado demuestra el buen

estado de las células y su capacidad de activación por el IFNγ. Sin embargo, el TNFα

no tiene ningún efecto sobre la actividad de los monocitos frente a L. pneumophila.

Estos resultados también se corroboraron con la adición de estas citocinas en las

infecciones de los neutrófilos (fig. 9, panel B), se observa que el IFNγ también estimuló

a las células para eliminar a L. pneumophila, aunque los valores no alcanzaron niveles

de significación. Tanto en los monocitos como en los neutrófilos, las citocinas no

mejoraron su actividad contra las micobacteria M. gordonae atenuada, y no tienen

ningún efecto notable sobre M. tuberculosis o M. gordonae.

Resultados

69

Fig 9: Activación de fagocitos con citocinas. La multiplicación intracelular de las bacterias en monocitos (A) o neutrófilos (B), en presencia de 25 ng /ml de las citocinas indicadas. Los datos son el logaritmo de la UFC y representa la media + la desviación estándar de cuatro experimentos independientes. + 105 células. * Prueba Tukey´s post-hoc con p <0,05 se consideró significativa.

70

EXPRESIÓN GÉNICA DE MONOCITOS INFECTADOS CON

DIFERENTES BACTERIAS

Los resultados obtenidos hasta este momento nos indican que en nuestro modelo

de infección, tanto de monocitos como de neutrófilos, el INFγ y el TNFα no tienen

efecto microbicida sobre las micobacterias M. tuberculosis, M gordonae e inclusive

sobre la cepa atenuada de M. gordonae. Pero sí se observó este efecto en el INFγ tanto

en los monocitos como en los neutrófilos infectados con L. pneumophila.

Desconocemos qué diferencias en los perfiles de expresión génica hay en

monocitos infectados con ambos patógeno, M. tuberculosis y L. pneumophila.

Determinar qué mecanismos empleados frente a L. pneumophila, que se traducen en una

eficiente eliminación de la bacteria, y que no son funcionales en monocitos infectados

con M. tuberculosis, puede suponer una información muy valiosa para entender la forma

en que las micobacterias sobreviven a las defensas microbicidas de los monocitos. Por

tal motivo se decidió examinar mediante PCR en tiempo real la expresión diferencial de

algunos genes que de una manera u otra intervienen en los mecanismos de defensa del

huésped, infectando monocitos con M. tuberculosis y L. pneumophila (MOI 1,0).

A partir de ADNc obtenido de monocitos infectados, se realizaron una serie de

PCR y electroforesis en geles de agarosa, para detectar la banda del amplicón de los

genes diana. Como control positivo de expresión génica se utilizó el gen EF1α. Debido

a que el tamaño del amplicon era muy variado se decidió usar 2 concentraciones de

agarosa en los geles, al 3% para los amplicones menores de 100 pb y al 1% en los

mayores de 100 pb.

De los genes escogidos solo se obtuvieron amplicones de gp47 phox, NRAMP1,

CTSD, ATP6V1G1, ATP6V0C, TNFRSF1A, INFGR1 y 2, y CCL20 (Fig. 10). No se

lograron obtener amplicones de los genes: gp91, CTSG, iNOS2 (Fig. 10) y en las DEFB

1, 2, 3 y 4 (Fig. 11).

Resultados

71

Fig. 10: Geles de agarosa de los genes diana: p47 phox, gp91 phox, iNOS, NRAMP1, CTSG y D, ATP6V1G1, ATP6V0C, TNFRSF1A,INFGR1, IFNGR2 y CCL20. – Monocitos sin infectar L Monocitos infectados con L. pneumophila T Monocitos infectados con M. tuberculosis

Resultados

72

A monocitos sin activar

B monocitos activados con INFγγγγ y LPS de E. coli

Fig. 11: Geles de agarosa de los genes de las DEFB1, 2, 3 y 4 – Monocitos sin infectar L Monocitos infectados con L. pneumophila T Monocitos infectados con M. tuberculosis

Resultados

73

En el caso de las defensinas, se sabe que se encuentran en los gránulos de los

neutrófilos, pero se decidió trabajar con ellas porque en la literatura se encontró una

referencia en la que se informa sobre la expresión de DEFB1 y 2 en monocitos [Duits et

al., 2002]. Sin embargo, nosotros no conseguimos observar esta expresión, a pesar de

activar los monocitos con INFγ y LPS de E. coli como documentaron los autores del

mencionado artículo.

Expresión génica mediante qPCR en tiempo real

El gen seleccionado como normalizador, el EF1α, fue elegido por presentar

menos variabilidad que otros genes usados generalmente como normalizadores como es

en el caso del gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) o la proteína de

activación tirosina 3 monooxigenasa/triptofano 5 polipéptido zeta (YWHAZ) [Carrol et

al., 2007], usados frecuentemente como genes de referencia. En la tabla 12 se muesran

las caracteristicas de los cebadores utilizados de los genes normalizadotes.

Tabla 12 Cebadores de los genes normalizadores

Cebador Secuencia ( 5´-3´ ) Amplicón (pb) Referencia

EF1α-F EF1α-F

TGTTCCTGTTGGCCGAGTG

ATTGAAGCCCACATTGTCCC 151 Éste trabajo

GAPDH-F GAPDH-R

GGAGTCAACGGATTTGGTCG

GGAATTTGCCATGGGTGG 151 Éste trabajo

YWHAZ-F YWHAZ-R

AAACTGGCCGAGCAGGCT

CCCTCCAAGATGACCTACGG 151 Éste trabajo

En la tabla 13 se muestran resultados representativos de las expresiones génicas

de los ADNc de monocitos infectados con M. tuberculosis y L. pneumophila,

comparándolos con los monocitos sin infectar (control de la expresión). Consideramos

expresiones diferenciales cuando el aumento o disminución es mayor de dos veces.

En las subunidades de las NADPH oxidasa solo encontramos expresión génica

de la subunidad p47 phox, en la que se observa una disminución de la expresión de

aproximadamente 3 veces tanto en los monocitos infectados con M. tuberculosis (0,35)

como por L. pneumophila (0,35). No detectamos actividad transcripcional de la

subunidad gp91 phox.

Resultados

74

En el gen NRAMP1 se aprecia una expresión génica de los monocitos infectados

con M. tuberculosis >3 con respecto al control sin infectar y >2 con respecto a los

infectados con L. pneumophila.

Tabla 13: Expresión génica de diversos genes en ADNc de monocitos

Genes

diana Muestra de ADNc Expresión génica

Sin infectar* 1,00

Infectado con M. tuberculosis 0,35 p47 phox

Infectado con L. pneumophila 0,35

Sin infectar* 1,0

Infectado con M. tuberculosis 3,71 NRAMP1


Sin infectar* 1,00

Infectado con M. tuberculosis 0,78 CTSD


Sin infectar* 1,00

Infectado con M. tuberculosis 1,48 ATP6V1G1


Sin infectar* 1,00

Infectado con M. tuberculosis 0,32 ATP6V0C


Sin infectar* 1,00

Infectado con M. tuberculosis 4,26 TNFRSF1A


Sin infectar* 1,00

Infectado con M. tuberculosis 1,45 IFNGR2


Sin infectar* 1,00

Infectado con M. tuberculosis 16,70 CCL20

Infectado con L. pneumophila 41,45 Los resultados fueron analizados con el macro excel de BioRad * Muestra control de la expresión

Resultados

75

Con respecto a las enzimas proteolíticas lisosomales solo logramos detectar

expresión génica de la CTSD, pero no así de la CTSG. La expresión encontrada en la

CTSD, en el caso de los monocitos infectados con M. tuberculosis fue menor al control

(0,78) y en el caso de L. pneumophila ligeramente superior (1,37), pero en ambos casos

no los consideramos significativas.

En los componentes de la bomba de protones dependientes de ATP,

encontramos expresión génica en la subunidad del dominio V1 (ATP6V1G1) mayores al

control, en el caso de los monocitos infectados con M. tuberculosis fue de sólo 1,48,

pero de y de 3,65 para los infectados con L. pneumophila. En la subunidad del dominio

V0 (ATP6V0C), los monocitos infectados con ambas bacterias presentaron una

disminución de aproximadamente 3 veces con respecto al control.

En los receptores de las citocinas del TNFα (TNFRSF1A) y del INFγ (INFGR1 e

INFGR2), se observó que sólo el TNFARSF1A tiene una expresión diferencial

considerable (4,26 veces) en células infectadas con M. tuberculosis con respecto al

control sin infectar. No vimos diferencias reseñables en la expresión del IFNGR2, y

expresiones muy bajas de IFNGR1, que no siempre fue detectable, y que impedía una

cuantificación precisa de los niveles de transcripción.

Finalmente con la quimiocina CCL20 encontramos la expresión génica

diferencial más evidente. Se aprecia una notable diferencia en la expresión en células

infectadas con respecto a las no infectadas, > 40 veces en el caso de los monocitos

infectados con L. pneumophila y >16 veces en el caso de los infectados con M.

tuberculosis. La diferencia de expresión en monocitos infectados con una u otra bacteria

fue de ~ 2,5 veces.

Expresión génica de CCL20 en monocitos infectados con diferentes

micobacterias

Debido a que CCL20 fue el que nos dio una expresión diferencial mayor se

decidió analizar su expresión génica en monocitos infectados con diferentes

micobacterias.

Para determinar si las diferencias de expresión son específicas de cepas, y no

sólo de especie, infectamos monocitos primarios con dos cepas distintas de M.

tuberculosis, la empleada hasta ahora (HL186T), y la cepa 45344 (tabla 14). De nuevo

observamos que hay mayor expresión en células infectadas que en el control, pero sin

Resultados

76

grandes variaciones entre cepas. El resultado con la cepa HL186T es menor que en el

experimento anterior porque los monocitos se obtuvieron de un voluntario distinto.

Tabla 14: Expresión génica de CCL20 en monocitos infectados con dos cepas diferentes de M. tuberculosis.

Muestra de ADNc Expresión génica

Sin infectar* 1,00

Infectado con la cepa HL186T 6,58

Infectados con la cepa del hospital del Bierzo 5,55 Los resultados fueron analizados con el macro excel de BioRad * Muestra control de la expresión

Al no encontrar diferencias de expresión entre las dos cepas de M. tuberculosis,

se decidió valorar si había diferencias de expresión de CCL20 entre micobacterias de

distinto grado de patogenicidad. Para lo cual se infectaron monocitos con M.

tuberculosis, M. avium y M. kansasii. Los resultados muestran una marcada diferencia

entre los monocitos infectados con M. tuberculosis con respecto a los no infectados y

los infectados con M. avium, presentando una diferencia >30 veces, y con M. kansasii

la diferencia es > 5 veces (tabla 15). De nuevo observamos que la diferencia de

expresión en monocitos infectados con M. tuberculosis HL186T es grande, y distinta a

los valores obtenidos anteriormente, dado que los monocitos pertenecen a un voluntario

distinto.

Tabla 15: Expresión de CCL20 en monocitos infectados con micobacterias de diferente grado de patogenicidad.

Muestra de ADNc Expresión génica

Sin infectar* 1,00

Infectados con M tuberculosis 39,43

Infectados con M. avium 1,48

Infectados con M. kansasii 7,57 Los resultados fueron analizados con el macro excel de BioRad * Muestra control de la expresión

DISCUSIÓN

77

INFECCIONES

Una de las finalidades de la presente investigación fue obtener un modelo de

infección que se asemejara lo más posible al lo que en realidad pasa en la tuberculosis

pulmonar, es decir, reproducir al máximo la interacción macrófago/micobacteria.

Infecciones en las líneas celulares HL60 y A549

Considerando que en el alveolo pulmonar las células inicialmente infectadas son

sobre todo los macrófagos alveolares, pero también las células epiteliales, inicialmente

se decidió usar las células HL-60 y las A549 por ser líneas celulares de origen humano

(macrofágica y epitelial, respectivamente).

Las células HL-60 se pueden diferenciar a otros tipos celulares (granulocitos,

monocitos, macrófagos o eosinófilos) mediante la adición de diversos agentes [Collins,

1987], lo cual es conveniente para trabajar con varios modelos celulares con semejanzas

a las células sanguíneas primarias. Rockett et al., encontraron que M. tuberculosis es

fagocitada y se replica en las células HL-60 y que si estas células son diferenciadas a

macrófagos con 1,25-dihidroxi-vitamina-D3 pueden inhibir la multiplicación

intracelular de la micobacteria por medio de un mecanismo dependiente de NO [Rockett

et al., 1998]. Sin embargo en nuestro trabajo no observamos diferencias de crecimiento

intracelular entre las células diferenciadas con Vit-D3 o con TPA y las no tratadas

(resultados no mostrados). En otros estudios, como el de Nordenfelt et al., donde

diferenciaron las células HL60 a neutrófilos con ácido transretinoico (ATRA), y las

infectaron con Streptococcus pyogenes, en sus resultados sugieren que las células

diferenciadas tienen un comportamiento antibacteriano parecido a los neutrófilos, con

fusión de los fagosomas con gránulos azurofililicos [Nordenfelt et al., 2009].

En las células A549 se han realizado varios estudios de infecciones de las células

con micobacterias, uno de los pioneros fue el trabajo de Bermúdez y Goodman, en

donde demuestran que algunas micobacterias patógenas como M. tuberculosis y M.

avium son capaces de unirse, invadir y multiplicarse dentro de estas células [Bermudez

y Goodman, 1996]. En nuestros resultados también observamos un crecimiento

Discusión

78

intracelular de diversas micobacterias, tanto patógenas (M. tuberculosis) como las

consideradas no patógenas (M. gordonae), en esta línea celular.

Con los resultados de los anteriores estudios, podríamos concluir que estas dos

líneas celulares son útiles como modelos comparativos para el análisis de los eventos

intracelulares a que se ve expuesto M. tuberculosis en células primarias.

Infecciones en monocitos

Efecto del suero en el crecimiento intracelular de M. avium en monocitos

En nuestros resultados de las infecciones de monocitos con M. avium, se vio que

la presencia del suero inhibe el crecimiento intracelular de la micobacteria, aunque de

forma no significativa estadísticamente. Estos resultados coinciden con los de Douvas et

al., quienes observaron que la presencia de suero influye en el crecimiento de M. avium.

Observaron que al adicionar suero en el momento de la infección se produce una

considerable disminución del crecimiento de M. avium, en los primeros 4 días de

cultivo. Posteriormente la micobacteria presentaba un rápido aumento, muy parecido al

del crecimiento bacteriano en ausencia de suero [Douvas et al., 1992]. En nuestro caso

los cultivos se dejaron cuatro días. Esta coincidencia de resultados es a pesar de las

diferencias en los métodos de cultivo y de infección, ya que ellos los cultivos los

realizaron en medio RPMI y usaron de 1 a 2 bacterias por célula, además de que

realizaron lavados después de 1 hora postinfección para retirar las bacterias

extracelulares restantes. En cambio, nosotros utilizamos un medio libre de suero (X-

VIVO-15) y usamos i bacteria por cada 100 células, además de que no se realizó ningún

lavado post-infección.

Obtención del modelo de infección

Son numerosos los estudios en los que se realizan infecciones de monocitos con

M. tuberculosis in vitro, en los que se utilizan antibióticos en los medios de cultivo para

eliminar micobacterias extracelulares, o se realizan una serie de lavados posteriores a la

infección para eliminar los posibles restos de micobacterias no fagocitadas,

introduciendo una importante fuente de variabilidad, pues es sumamente complicado

conseguir lavar distintos pocillos de una forma perfectamente homogénea.

Tomando como referencia algunas características de los métodos de cultivo e

infecciones de la literatura, se ha diseñado un protocolo de infección que minimiza las

Discusión

79

manipulaciones técnicas, presentando, a nuestro criterio, varias ventajas: en primer

lugar, la purificación de los monocitos por separación magnética de las células evita los

lavados utilizados en las técnicas que se basan en la adhesión de monocitos, en las que

se seleccionan monocitos que se adhieren fuertemente. En segundo lugar, el

mantenimiento de las células en medios libres de suero reduce la variabilidad, porque la

composición del suero presente en los medios varía entre lotes, además de tener una

composición muy compleja y mal caracterizada. En tercer lugar, emplear una MOI baja

(0,01 bacterias/célula) en vez de las habituales de 1 -20 bacterias/célula, se asemeja más

a la forma natural de la infección, y elimina la necesidad de lavados para eliminar las

bacterias extracelulares.

En nuestros ensayos hemos observado que ni M. gordonae ni L. pneumophila, se

multiplican en el medio X-VIVO-15, no así M. tuberculosis, que sí forma colonias en

este medio. También se determinó que un día después de la infección el 90% de las

bacterias son intracelulares en neutrófilos y el 71% en monocitos. Probablemente la

mayoría, si no la totalidad de las bacterias, habrán sido fagocitadas por los monocitos

después de cuatro días de cultivo. Como un beneficio final al modelo de infección, la

lisis de las células para la liberación de las bacterias intracelulares por medios físicos

(ultrasonido) dispersan a los grupos de bacterias que puedan haberse formado, al tiempo

que se evita la adición de reactivos (por lo general detergentes) que aumentan el

volumen final, y que también pueden inhibir el crecimiento de algunas micobacterias,

como es el caso de M. gordonae (datos no mostrados). En nuestras condiciones hemos

observado una menor tasa de multiplicación de las micobacterias, en comparación con

el uso de medios de cultivo con suero, pero esta situación puede reflejar mejor la

infección natural en los pulmones.

Actividad antimicrobiana de fagocitos humanos

El uso de distintos protocolos y modelos de infecciones bacterianos en la

literatura científica no permiten hacer una fácil comparación de los resultados

obtenidos. Por esta razón, se ha examinado la actividad tanto de monocitos como de

neutrófilos de un mismo voluntario, al mismo tiempo y en las mismas condiciones,

contra una especie de micobacteria no patógena, M. gordonae. Como modelo

comparativo se ha empleado una micobacteria patógena (M. tuberculosis) y como

control de activación de los fagocitos se uso a L. pneumophila, ya que se ha descrito que

Discusión

80

en esta bacteria se ve disminuida su multiplicación intracelular en monocitos activados

con IFNγ [Bhardwaj et al., 1986].

Hemos observado una significativa disminución en el número de bacterias M.

gordonae atenuada tanto en los neutrófilos como en los monocitos infectados, pero no

así en la cepa original, que a pesar de ser considerada como no patógena [Douglas et

al., 1986] no se observa inhibición de su crecimiento intracelular. Desconocemos

exactamente la naturaleza del proceso de atenuación de M. gordonae, pero las colonias

de la cepa atenuada tienen una morfología lisa, claramente diferenciable de la rugosa de

la cepa original. Se ha comprobado que en otras micobacterias no tuberculosas, como

M. abscessus, el aspecto morfológico de la variante lisa, que es menos virulenta, se ve

influida por la expresión de un lípido glicopéptido [Howard et al., 2006]. Este hecho

pudiera tener relación con la atenuación observada.

En estudios previos realizados por otros autores se ha observado que los

monocitos no son capaces de eliminar micobacterias no patógenas, Barker et al.

observaron que monocitos adherentes no inhiben el crecimiento de M. smegmatis,

aunque células a las que se ha impedido adherirse si eliminan a esta micobacteria

[Barker et al., 1996]. Sin embargo, también se ha descrito que otra micobacteria de baja

patogenicidad, M. fortuitum, puede ser eliminada por los monocitos [Nziramasanga et

al., 1993].

El incremento en la multiplicación de M. tuberculosis en los monocitos

infectados, la consideramos biológicamente relevante ya que en términos de UFC es >3

veces que el inoculo inicial. Estos resultados son comparables con los de otros trabajos

realizados donde se ha demostrado el crecimiento intracelular de M. tuberculosis

virulenta y no virulenta tanto en monocitos humanos diferenciados a macrófagos como

en macrófagos de ratón [Paul et al., 1996].

En nuestro trabajo hemos observado la multiplicación en neutrófilos de tanto las

micobacterias como de L. pneumophila, lo que demuestra que estas células proveen un

ambiente de multiplicación adecuado a las bacterias. La importancia clínica de estas

células está siendo reconocida. Eum et al han identificado neutrófilos infectados en

muestras de esputo, fluidos de lavados bronco-alveolares y granulomas tuberculosos de

pacientes [Eum et al., 2010].

Discusión

81

En el caso de L. pneumophila percibimos un incremento muy significativo (p<

0,001) en los monocitos infectados. Caso contrario sucedió con las infecciones de los

neutrófilos, donde apreciamos una disminución significativa (p= 0,005), lo que nos

sugiere que los neutrófilos ejerce una importante actividad bactericida sobre este

patógeno.

Horwitz y Silverstein han comprobado que los monocitos no pueden frenar la

multiplicación de L. pneumophila [Horwitz y Silverstein, 1980]. Sin embargo, estos

mismos investigadores también infectaron neutrófilos con L. pneumophila y observaron

una ligera disminución en el número de bacterias recuperadas tras la infección [Horwitz

y Silverstein, 1981]. En contraste con nuestros estudios, la infección con bacterias en

presencia de suero humano no permitía la actividad antimicrobiana de los neutrófilos. El

efecto que observaron sólo fue posible con suero inmune (con anticuerpos anti-

Legionella). Nosotros no analizamos la presencia de anticuerpos específicos en los

sueros que empleamos para opsonizar, pero nos parece improbable que todos los

voluntarios que estudiamos hayan estado en contacto con la bacteria. Las diferencias

observadas pueden estar justificadas con los distintos métodos de infección.

Activación de los fagocitos con citocinas y su efecto en la

actividad antimicrobiana

En nuestras condiciones de cultivo, los monocitos y los neutrófilos activados o

no con las citocinas IFNγ y/o TNFα, no eliminan ni a M. tuberculosis ni a M. gordonae.

La validez del método queda atestiguada por la eliminación casi total de M. gordonae

atenuada por los monocitos y en una gran proporción por los neutrófilos. En el caso de

los monocitos estos resultados son parecidos a los de Robertson y Andrew, quienes

observaron que los monocitos activados o no con INFγ son incapaces de eliminar ni a

M. tuberculosis ni a M. phlei [Robertson y Andrew, 1991]. Denis ha observado que

monocitos diferenciados a macrófagos activados con TNFα son capaces de eliminar una

cepa no virulenta de M. avium pero no una virulenta [Denis, 1991]. Estos resultados

difieren de los nuestros con la cepa atenuada de M. gordonae, pues no hemos

encontrado un aumento en la actividad microbicida gracias a TNFα. Desconocemos la

razón de esta disparidad, pero el empleo de dos especies distintas puede justificarlo.

En nuestros experimentos, los neutrófilos no eliminaron a M. tuberculosis,

aunque se ha visto que en infecciones de neutrófilos activados con TNFα inhiben el

Discusión

82

crecimiento de la micobacteria, no así los activados con INFγ [Kisich et al., 2002].

Ignoramos la razón de esta discrepancia, aunque podría ser por las grandes diferencias

con respecto al método de infección, principalmente la infección con un MOI de 10, y el

posterior lavado de las bacterias extracelulares.

Nuestros resultados con las infecciones con M. gordonae, muestran que los

fagocitos humanos no tienen una capacidad intrínseca para eliminar las micobacterias

no patógenas, a pesar de su escasa asociación con la enfermedad [Katoch, 2004].

Patrón de secreción de citocinas en fagocitos infectados

Los fagocitos infectados con M. tuberculosis inducen la secreción de muchas

citocinas, algunas activadoras, y otras inhibidoras [Flynn y Chan, 2001]. Hemos

observado que existe una asociación entre la patogenicidad de las micobacterias y el

patrón de citocinas secretadas, pues las bacterias patógenas (M. tuberculosis y L.

pneumophila), en los monocitos indujo la producción de IL-1β, IL-6 y TNFα, al

contrario que M. gordonae. Estos resultados difieren notablemente de los obtenidos por

Beltan et al., que encontraron que los macrófagos infectados con micobacterias no

patógenas (M. smegmatis y M. phlei) secretaban cantidades más altas de estas citocinas

que los infectados con M. tuberculosis [Beltran et al., 2000].

En el caso de los neutrófilos, las micobacterias no inducen, o lo hacen a un nivel

muy bajo, la producción de cualquier citocina, con la excepción de IL-8, que fue

inducida de manera similar por las tres micobacterias. Por el contrario, Fäldl et al.,

encontraron que los neutrófilos infectados con micobacterias no patógenas (M.

smegmatis) producen más TNFα, IL-6 e IL-8 que los infectados con M. tuberculosis

[Fäldt et al., 2002]. Atribuimos los resultados contradictorios al modelo y método de

infección. Nosotros no utilizamos el habitual medio de cultivo RPMI con suero, sino

que utilizamos uno libre de suero (X-VIVO-15), y nuestro MOI era más bajo (0,01

bacterias/célula). Por ejemplo, en estas condiciones no detectamos la producción de IL-

12, aunque se ha descrito su producción en macrófagos humanos infectados con

micobacterias [Matsumoto et al., 1997]. De hecho, en diferentes cepas de una especie

en particular se pueden inducir cantidades variables de distintas citocinas. Chacón-

Salinas et al., han encontrado que las cepas de M. canetti y M tuberculosis H37Rv y la

cepa de Beijing inducen en monocitos la secreción de diferentes cantidades tanto de IL-

1β, como de TNFα [Chacón-Salinas et al., 2005]. En otros estudios donde se ha

Discusión

83

valorado la expresión de citocinas y quimiocinas en plasma de pacientes con

tuberculosis y se ha encontrado un significativo incremento de la cantidad de IL-6, IL-8,

CCL5, CXCL9 y CXCL10, y una disminución en INFγ, TNFα y TGFβ en contraste con

los voluntarios sanos [Pokkali y Das, 2009]. La disparidad observada en todos estos

resultados sugiere que el patrón de secreción de citocinas puede depender de las

condiciones de cultivo, la estrategia de la infección y el modelo bacteriano, y que podría

no haber una correspondencia directa con los acontecimientos que ocurren in vivo.

No tenemos conocimiento de ningún estudio en el que se analice la relación

entre el patrón de la producción de citocinas y la actividad antimicrobiana de los

fagocitos humanos. Sin embargo, los fagocitos infectados con ambas cepas de M.

gordonae (original y atenuada) prácticamente no producen citocinas, con la excepción

de la IL-8, en la cual se encontraron cantidades similares en ambos casos. Concluimos

que las citocinas probadas no tienen ninguna influencia en la actividad microbicida de

los fagocitos, debido a que la cepa atenuada fue significativamente más susceptible que

la original.

Nuestros resultados sugieren que existen factores desconocidos que impiden que

el sistema inmunitario controlae la multiplicación de las micobacterias no patógenas en

el huésped humano, que no hemos sido capaces de determinarlos en nuestras

infeccionesr in vitro. En este sentido, la susceptibilidad de M. gordonae atenuada por

los fagocitos humanos puede resultar una herramienta útil para diseccionar a nivel

molecular los mecanismos de defensa que fallan en la eliminación de las micobacterias.

84

EXPRESIÓN GÉNICA MEDIANTE qPCR EN TIEMPO REAL

M. tuberculosis y L. pneumophila son dos bacterias que afectan a las vías

respiratorias, ambas son facultativas e intracelulares y sobreviven dentro de los

macrófagos, ya que logran resistir la acidificación de los fagosomas e inhiben la fusión

fagosoma-lisosoma. A pesar de que utilizan mecanismos diferentes para evadir su

eliminación, ambas logran crear un entorno propicio en el fagosoma para lograr

sobrevivir y multiplicarse [Clemens y Horwitz, 2000]. Una diferencia fundamental entre

ambas es que L. pneumophila es eliminada cuando se activan los monocitos infectados

con IFNγ, mientras que esta citocina no consigue activarlos frente a las micobacterias.

Determinar a nivel transcripcional las diferencias en la expresión génica de monocitos

activados con IFNγ infectados con una u otra bacteria puede dar información relevante

acerca de los mecanismos de defensa que fracasan frente a las micobacterias, pero son

exitosos frente a L. pneumophila.

Expresión génica

De los genes que estudiamos, no de todos hay evidencia de su expresión en

monocitos infectados, ni de su participación en infecciones por M. tuberculosis. En

nuestras condiciones de infección de monocitos y con nuestras condiciones de PCR, no

encontramos expresión en los genes de las DEFB 1-2-3-4, CTSG, GP91, iNOS. La

expresión de INFGR1 fue muy baja e irregular, pues no fue siempre detectada.

Defensinas (DEFB 1, 2, 3, 4)

Para este estudio solo se consideraron las defensinas β, porque en humanos las

las defensinas se encuentran en los neutrófilos [Ogata et al., 1992], específicamente las

α que se encuentran en los gránulos azurófilos [Fu, 2003], pero no estan presentes en

monocitos, linfocitos o eosinófilos de sangre periférica, aunque se desconoce si los

macrófagos contienen defensinas [Ogata et al., 1992]. Duits et al., demostraron

mediante hibridación in situ en células individuales, la presencia de las DEFB1 y 2, en

macrófagos alveolares. También observaron que en monocitos y MDM activados y sin

activar con LPS de E. coli e INFγ había expresión del ARNm de estas las defensinas

Discusión

85

[Duits et al., 2002]. Por otro lado, Rivas-Santiago et al., han encontrado expresión

génica de la DEFB2 en células epiteliales A549 y macrófagos alveolares infectados con

M. tuberculosis (H37Rv), pero no en monocitos infectados. Cuando los monocitos

fueron estimulados con LPS, solo en 2 de 5 casos se encontró expresión de la DEFB2

[Rivas-Santiago et al., 2005]. Nosotros no hemos identificado expresión de las

defensinas β (1, 2, 3 y 4) aún cuando los monocitos fueron activados con IFNγ y LPS de

E coli.

Catepsinas D y G

Con respecto a las catepsinas, se consideraron para este estudio una aspártico

proteasa (CTSD), y otra serín proteasa (CTSG). En algunos leucocitos se han encontrado

proteasas lisosomales con actividad antimicrobiana que son activas a distinto pH, como

la CTSD que es activa a pH ácido, y la CTSG, que se activa a pH neutro [Thorne et al.,

1976]. Se ha observado que en monocitos THP-1 infectados con M. tuberculosis se

presenta un aumento de la expresión génica de la CTSD, y una disminución de

expresión en las CTSB y G. Este efecto también se observó cuando las células THP-1

fueron diferenciadas a macrófagos y fueron expuestos a LPS [Rivera-Manero et al.,

2004]. Este mismo resultado se ha encontrado en pulmones de ratón infectados con la

cepa de M. tuberculosis H37Rv y la cepa hipervirulenta ∆acr [Stewart et al., 2006]. En

nuestras condiciones no hemos encontrado expresión del CTSG, y la expresión de

CTSD no varió significativamente entre monocitos infectados con cualquiera de las dos

bacterias y células no infectadas. Estos resultados no aportan evidencias acerca de un

papel en la actividad antimicrobiana frente a L. pneumophila, dado que es

semejantemente expresado en monocitos infectados por M. tuberculosis, que no es

eliminado.

NRAMP1

La proteína traducida de este gen se ha visto implicada en el transporte de

cationes bivalentes tanto de humanos como de bacterias [Gruenheid y Gros, 2000],

principalmente el Fe2+, [Liu et al., 1995]. Con respecto a la función bioquímica de este

gen hay mucha controversia. Algunos autores consideran que su papel principal es

aumentar la cantidad de Fe2+ dentro del fagosoma, para generar especies reactivas de

oxígeno en las que está presente este metal y así combatir a la bacteria. Sin embargo

otros autores consideran que su función se basa en disminuir la cantidad de iones

Discusión

86

divalentes (Fe2+, Zn2+, Mn2+) accesibles a la bacteria intrafagosomal, principalmente

Fe2+, que es fundamental para el crecimiento del patógeno. La asociación de este gen

con la tuberculosis ha sido muy estudiada, principalmente en ratones, donde se ha

encontrado una clara asociación entre la expresión de este gen y la susceptibilidad a la

tuberculosis [Wyllie et al., 2002]. Sin embargo, es controvertido el papel de distintos

polimorfismos de este gen en el padecimiento de esta enfermedad en humanos

[Takahashi et al., 2007].

En nuestros resultados se observo una mayor expresión de NRAMP1 en los

monocitos infectados con M. tuberculosis (3,71 veces) que en los infectados con L.

pneumophila (1,54 veces) con respecto a los no infectados. Siendo la diferencia entre

ambas de 2,41 veces. Este resultado es una evidencia adicional sobre la importancia de

este gen en la respuesta a la tuberculosis, como ya se había detectado en el modelo de

ratón. Sin embargo una mayor expresión del gen no se traduce en una actividad

antimicrobiana efectiva frente a M. tuberculosis.

Receptores de citocinas

IFNGR1 e IFNGR2

Personas que padecen síndromes mendelianos, defectos congénitos que dan

lugar a una enfermedad clínica grave, presentan una predisposición a infecciones

causadas por especies de micobacterias poco virulentas, como las de la vacuna BCG y

MNT. Evidentemente también se ven afectados a especies más virulentas de

micobacterias como M. tuberculosis. Esta enfermedad esta causada por mutaciones en 5

genes autonómicos entre los cuales encontramos al IFNGR1 y el IFNGR2 [Filipe-Santos

et al., 2006]. Se ha observado que en células CD14+ infectadas con M. tuberculosis

presentan una disminución en la expresión del IFNGR1 en comparación con las células

no infectadas [Singhal et al., 2007]. Pero no se ha encontrado asociación entre la

tuberculosis y el gen IFNGR2 [Cooke et al., 2006]. Sin embargo, determinados

polimorfismos que afectan tanto a la producción como a la capacidad de respuesta del

IFNγ pueden influir en el riesgo de desarrollar tuberculosis [Yew et al., 2007].

En nuestro estudio analizamos la expresión génica de las dos subunidades del

IFNGR. La expresión del receptor 1 fue siempre muy baja, y de baja reproducibilidad.

Aunque la del receptor 2 fue más alta, no se observó expresión diferencial significativa

entre células infectadas o no infectadas. Estos receptores están constitutivamente

Discusión

87

expresados en monocitos humanos, y no parece que la infección de estas bacterias

induzca ningún cambio.

TNFRSF1A

Los efectos pro-inflamatorios del TNFα se deben a 2 receptores, TNFRSF1A

(TNFRI p55) y TNFRSF1B (TNFRII p75). El TNFRSF1A se encuentra ampliamente

expresado y se considera el principal receptor de inducción de la señalización del TNFα

soluble [Siebert et al., 2005]. Estudios en ratones han demostrado la importancia de este

receptor en la tuberculosis, se observo que ratones carentes del TNFRSF1A e infectados

con M. tuberculosis, no pueden controlar la infección y mueren en poco tiempo en

comparación con los que si tienen funcional el gen TNFRSF1A [Flynn et al., 1995].

En nuestros resultados observamos una expresión del TNFRSF1A en los

monocitos infectados con M. tuberculosis >4 en comparación con los no infectados y >3

con respecto a los infectados con L. pneumophila. Este resultado puede ser reflejo de la

importancia del TNFα en la tuberculosis, pues es una citocina fundamental en la

defensa frente a la enfermedad, como demuestran los pacientes que son sometidos a

terapias anti-TNFα, que ven aumentado dramáticamente el riesgo de reactivación de la

tuberculosis [Dinarello, 2003].

Subunidades de la bomba de protones dependiente de ATP (ATP6V1G1 y

ATP6V0C)

Para nuestro estudio seleccionamos una subunidad representativa de cada

dominio del complejo, una del dominio periférico V1 (encargado de la hidrólisis del

ATP), y otro del dominio integral V0 (responsable del transporte de protones). Los

patrones de expresión de ambas subunidades en células infectadas fue muy distinto,

pues el componente de la subunidad V1 está más expresado en células infectadas, e

incluso con sensibles diferencias entre ambos patógenos, pues se expresa más del doble

en monocitos infectados con L. pneumophila que con M. tuberculosis. Por el contrario

el componente de la subunidad V0 se expresa menos de 1/3 en células infectadas que no

infectadas. Estos resultados son difíciles de interpretar, pero en última instancia la

subunidad menos expresada es la que produce el intercambio de protones, lo cual se

puede correlacionar con el menor grado de acidificación que se detecta en fagosomas

que contienen a M. tuberculosis o M. avium [Crowle et al., 1991].

Discusión

88

Subunidades de la NADPH oxidasa, genes NCF1 (p47 phox) y CYBB (gp91

phox)

No se encontró expresión del gen de la subunidad de la NADPH oxidasa gp91

phox. En estudios realizados independientemente, hemos observado un aumento de la

producción de ROS en monocitos infectados con M. tuberculosis (datos no mostrados).

De este hecho deducimos que si bien no hemos observado nueva transcripción el gen

gp91 la proteína está presente en la célula antes de la infección, pues es funcional. Sin

embargo, sí hemos detectado inhibición (de 3 veces) de la expresión de p47phox cuando

los monocitos se infectan por cualquiera de las dos bacterias. Esta inhibición pudiera

afectar a la producción de ROS no en el momento de la infección en que se produce la

denominada explosión oxidativa gracias a las proteínas ya presentes en la célula, sino a

la producción continua de ROS más adelante. Este ROS puede tener funciones distintas

de la actividad microbicida, por cuyo motivo estas bacterias intracelulares pueden tener

interés en que no se produzca.

Algunos autores han observado una gran explosión oxidativa en los neutrófilos,

como una respuesta a la infección, como es el caso de neutrófilos infectados con M.

tuberculosis, por ejemplo May y Spagnuolo infectaron neutrófilos opsonizados con

bacterias de M. tuberculosis muertos por calor, siendo el resultodo en un incremento

de O2- a los 30 minutos de exposición [May y Spagnuolo, 1987]; Perskvist et al., al

infectar neutrófilos con esta micobacteria y observaron que se producia apoptosis de los

neutrófilos atraves de una vía dependiente de oxígeno [Perskvist et al., 2002]. También

se ha visto este efecto con otras micobacterias como M. avium, M. kansasii, M.

smegmatis y M. phlei [N’Diaye et al., 1998].

iNOS

La iNOS es la principal enzima generadora de RNI en las células del sistema

inmune [Lowenstein y Padalko, 2004]. Se ha demostrado que la iNOS es importante en

control inmunológico contra M. tuberculosis, como lo demuestran estudios de

infecciones en ratones que carecen del gen de la iNOS, donde se observo que la

ausencia de iNOS conduce a un rápido crecimiento de las micobacterias, neumonitis

granulomatosa necrótica, y muerte.; se cree que la iNOS desempeña una función similar

en los macrófagos humanos, aunque esta hipótesis no ha sido esclarecida [MacMicking

et al., 1996]. La expresión de iNOS2 en monocitos o macrófagos humanos es muy

Discusión

89

controvertida [Nicholson et al., 1996; Davis et al., 2007]. En nuestras condiciones de

trabajo no hemos observado expresión de este gen.

Quimiocina CC ligando 20

Esta quimiocina junto con su receptor (CCR6), están considerados como

responsables de la migración y reclutamiento de células presentadoras de antígenos y de

células inmunocompetentes durante las respuestas inflamatoria e inmunológica. CCL20

y las β defensinas-2 no solo comparten el mismo receptor, sino que también tienen otra

característica estructural común: su carga positiva, que se considera importante para la

actividad antimicrobiana de las defensinas [Pérez-Cañadillas et al., 2001]. Se ha

observado que E. coli y S. aureus son susceptibles a la proteína de CCL20 [Yang et al.,

2003]. Se ha visto que MDM de pacientes con tuberculosis, estimulados con el antígeno

30kDa de M. tuberculosis, promueven la expresión de CCL20, en comparación con los

de controles sanos [Lee et al., 2007]. Se ha demostrado la regulación la transcripción

del gen CCL20 por distintas bacterias, por ejemplo, en pacientes con gastritis

ocasionada por Helicobacter pylori a diferencia de los controles que muestran niveles

muy bajos o nulos [Tomimori et al., 2007]. Shigella flexneri en células epiteliales

humanas derivadas de carcinoma de colón que disminuyen la regulación del gen CCL20

[Sperandio et al., 2008]. No solo las bacterias patógenas inducen CCL20, también se ha

encontrado que algunas bacterias probióticas inducen su expresión en monocitos

diferenciados a células dendríticas [Latvala et al., 2008].

En nuestro trabajo los resultados muestran una gran nivel de expresión génica de

CCL20 >40 veces en el caso de los monocitos infectados con L. pneumophila y >16

veces en el caso de los infectados con M. tuberculosis con respecto a los no infectados.

Esta diferencia en los niveles de expresión es la más elevada de todos los genes que

hemos analizado.Además se ve una clara diferencia de expresión entre los infectados

con L. pneumophila y M. tuberculosis, 2,48 veces.

Desconocemos si la expresión de CCL20 es un mecanismo de defensa de la

respuesta inmune frente a M. tuberculosis. Creemos que esta micobacteria es capaz de

aprovechar las propiedades biológicas de CCL20 de atraer a las células dendríticas,

como una respuesta quimotactica al receptor CCR6 presente en estas células [Pérez-

Cañadillas et al., 2001] para propagarse dentro del organismo. Hay autores como

Förstch et al., que han demostrado que M. tuberculosis es capaz de reproducirse dentro

Discusión

90

de las células dendríticas [Förstch et al., 2000], y las células dendríticas son consideras

como una de las principales células presentadoras de antígenos, y al fagocitar a los

antígenos de bacteria o la micobacteria la conducen a través de sistema linfático a los

órganos linfoides [Benchereau et al., 2000].

CONCLUSIONES

91

Primera:

En estudios in vitro el suero humano no es necesario para la fagocitosis de las

micobacterias.

Segunda:

El pase de la cepa de M. gordonae (HL184G) durante más de un año originó una

cepa atenuada.

Tercera:

En ensayos in vitro, ni monocitos, ni neutrófilos exhiben actividad

antimicobacteriana

Cuarta:

Las citocinas activadoras IFNγ y TNFα no influyen en la actividad

antimicobacteriana de los monocitos y neutrófilos.

Quinta:

No hay relación entre el perfil de producción de citocinas y la actividad

antimicobacteriana de los monocitos y neutrófilos.

Sexta:

Se ha encontrado expresión diferencial en monocitos infectados con M.

tuberculosis y L. pneumophila de los genes: NRAMP1, CTSD, ATPG1V1, TNFRSF1A y

CCL20.

BIBLIOGRAFÍA

1. American Thoracic Society. 1990. Diagnostic and treatment of disease caused by

nontuberculous mycobacteria. Am. Rev. Respir. Dis 142: 940-953.

2. Andersen P, Askgaard D, Ljungqvist L, Bennedsen J, Heron I,. 1991. Proteins

released from Mycobacterium tuberculosis during growth. Infect. Immun.; 59:

1905-1910.

3. Appelberg R, Castro A G, Gomes S, Pedrosa J, Silva M T,. 1995. Suceptibility of

beige mice to Mycobacterium avium: role of neutrophils. Infect Immun.; 63:

3381-3387.

4. Aranaz A, Cousins D, Mateos A, Domínguez L,. 2003. Elevation of

Mycobacterium tuberculosis subsp. caprae Aranaz et al. 1999 to species rank as

Mycobacterium caprae comb. nov., sp. nov.. Int. J. Syst. Evol. Microbiol.; 53:

1785-1789.

5. Aranaz A, Liébana E, Gómez-Mampaso E, Galán J C, Cousins D, Ortega A, et al.,.

1999. Mycobacterium tuberculosis subsp. caprae subsp. nov.: a taxonomic

study of a new member of the Mycobacterium tuberculosis complex isolated

from goats in Spain. Int. J. Syst. Bacteriol.; 49: 1263-1273.

6. Araujo Z, Acosta M, Escobar H, Baños R, Fernández de Larrea C, Rivas-Santiago

B,. 2008. Respuesta inmunitaria en tuberculosis y el papel de los antígenos de

secreción de Mycobacterium tuberculosis en la protección, patología y

diagnóstico. Invest. Clin.; 49: 411-441.

7. Arend W P, Gabay C,. 2004. Cytokines in the rheumatic diseases. Rheum. Dis.

Clin. N. Am.; 30: 41-67.

8. Armstrong J A, Hart P D,. 1971. Response of cultured macrophages to

Mycobacterium tuberculosis, with observations on fusion of lysosomes with

phagosomes. J. Exp. Med.; 134: 713-740.

9. Atkinson P G P, Blackwell J M, Barton C H,. 1997. Nramp1 locus encodes a 65

kDa interferon-γ-inducible protein in murine macrophages. Biochem. J.; 325:

779-786.

10. Ayele W Y, Neill S D, Zinsstag J, Weiss M G, Pavlik I,. 2004. Bovine

tuberculosis: an old disease but a new threat to Africa. Int. J. Tuberc. Lung Dis.;

8: 924-937.

Bibliografía

93

11. Babior B M,. 1999. NADPH oxidase: an update. Blood; 93: 1464-1476.

12. Bates J H, Nardell E,. 1995. Institutional control measures for tuberculosis in the

era of múltiple drug resístanse. Chest; 108: 1690-1710.

13. Bellamy R,. 2005. Genetic susceptibility to tuberculosis. Clin. Chest Med.; 26:

233-246.

14. Beltan E, Horgen L, Rastogi N,. 2000. Secretion of cytokines by human

macrophages upon infection by pathogenic and non-pathogenic micobacteria.

Microb. Pathog.; 28: 313-318.

15. Benchereau J, Briere F, Caux C, Davoust J, Lebecque S, Liu Y J, et al.,. 2000.

Immunobiology of dendritic cells. Annu. Rev. Immunol.; 18: 767-811

16. Benson C A, Ellner J J,. 1993. Mycobacterium avium complex infection and AIDS:

advances in theory and practice. Clin. Infect.Dis.; 17: 7–20.

17. Benson C A,. 1994. Disease due to the Mycobacterium avium complex in patients

with AIDS: epidemiology and clinical symptoms. Clin. Infect. Dis. 18: S218–

S222.

18. Bermudez L E, Goodman J,. 1996. Mycobacterium tuberculosis invades and

replicates within type II alveolar cells. Infect. Immun.; 64: 1400-1406.

19. Berrington W R, Hawn T R,. 2007. Mycobacterium tuberculosis, macrophages, and

the innate immune response: does common variation matter? Immunol. Rev.;

219: 167-186.

20. Bhardwaj N, Nash T W, Horwitz M,. 1986. Interferon-γ-activated human

monocytes inhibit the intracellular multiplication of Legionella pneumophila. J.

Immunol.; 137: 2662-2669.

21. Biragyn A, Ruffini P A, Leifer C A, Klyushnenkova E, Shakhov A, Chertov O, et

al.,. 2002. Toll-Like receptor 4-dependent activation of dendritic cells by β-

defensin 2. Science; 298: 1025-1029

22. Blaas S H, Böhm S, Martín G, Erler W, Glück T, Lehn N, et al.,. 2003. Pericarditis

as primary manifestation of Mycobacterium bovis ssp. caprae infection. Diagn.

Microbiol. Infect. Dis.; 47: 431-433.

23. Blackwell J M, Searle S, Goswami T, Miller E N,. 2000. Understanding the

multiple functions of Nramp1. Microbes Infect.; 2: 317-321.

24. Böddinghaus B, Rogall T, Flohr T, Blöcker H, Böttger E C,. 1990. Detection and

identification of mycobacteria by amplification of rRNA. J. Clin. Microbiol.;

28: 1751-1759.

Bibliografía

94

25. Bonecini-Almeida M G, Chitale S, Boutsikakis I, Geng J, Doo H, He S, et

al.,.1998; Induction of in vitro human macrophage anti-Mycobacterium

tuberculosis activity: requirement for IFN-γ and primed lymphocytes. J.

Immunol.; 160: 4490-4499.

26. Bosio C M, Gardner D, Elkins K L,. 2000. Infection of B cell-deficient mice with

CDC 1551, a clinical isolate of Mycobacterium tuberculosis: delay in

dissemination and development of lung pathology. J. Immunol.; 164: 6417-

6425.

27. Böyum A,. 1968. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human

blood. Isolation of mononuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes

by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand. J. Clin. Lab.

Invest. Suppl.; 97: 77-89.

28. Brenner J, Steigerwalt A, McDade J E,. 1979. Classification of the Legionnaries’

disease bacterium: Legionella pneumophila, genus novum, species nova, of the

Family Legionellaceae, familia nova. Ann. Intern. Med.; 90: 656-658.

29. Brosch R, Gordon S V, Marmiesse M, Brodin P, Buchrieser C, Eiglmeier K, et al.,.

2002. A new evolutionary scenario for the Mycobacterium tuberculosis

complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.; 99: 3684-3689.

30. Caminero-Luna J A,. 2001. Micobactrerías atípicas. BSCP Can. Ped.; 25: 237-248.

31. Carrol E D, Salway F, Pepper S D, Saunders E, Mankhambo L A, Ollier W E,. et

al.,. 2007. Successful downstream application of the Paxgene Blood RNA

system from small blood samples in paediatric patients for quantitative PCR

analysis. BMC Immunol.; 8:20. http://www.biomedcentral.com/1471-

2172/8/20.

32. Casanova J L, Abel L,. 2002. Genetic dissection of immunity to mycobacteria: the

human model. Annu. Rev. Immunol.; 20: 581-620.

33. Cassanova J L, Blanche S, Emile J F, Jouanguy E, Lamhamedi S, Altare F, et al.,.

1996. Idiopatic disseminated bacillus Calmette-Guérin infection: a French

national retrospective study. Pediatrics.; 98: 774-778.

34. Chacón-Salinas R, Serafín-López J, Ramos-Payán R, Méndez-Aragón P,

Hernández-Pando R, Van Soolingen D, et al.,. 2005. Differential pattern of

cytokine expression by macrophages infected in vitro with different

Mycobacterium tuberculosis genotypes. Clin. Exp. Immunol.; 140: 443-449.

Bibliografía

95

35. Chan J, Fan X, Hunter S W, Brennan P J, Bloom B R,. 1991. Lipoarabinomannan,

a possible virulence factor involved in persistence of Mycobacterium

tuberculosis within macrophages. Infect. Immun.; 59: 1755-1761.

36. Chan J, Xing Y, Magliozzo R S, Bloom B R,. 1992. Killing of virulent

Mycobacterium tuberculosis by reactive nitrogen intermediates produced by

activated murine macrophages. J. Exp. Med.; 175: 1111-1122.

37. Chwieralski C E, Welte T, Bühling F,. 2006. Cathepsin-regulated apoptosis.

Apoptosis; 11: 143-149.

38. Cipriano D J, Wang Y, Bond S, Hinton A, Jefferies K C, Qi J, et al.,. 2008.

Structure and regulation of the vacuolar ATPases. Biochim. Biophys. Acta;

1777: 599-604.

39. Clemens D L Lee, B Y, Horwitz M A,. 2000. Mycobacterium tuberculosis and

Legionella pneumophila phagosomes exhibit arrested maturation despite

acquisition of Rab7. Infect. Immun.; 68: 5154-5166.

40. Co D O, Hogan L H, Kim S Il, Sandor M,. 2004. Mycobacterial granulomas: keys

to a long-lasting host–pathogen relationship. Clin. Immunol.; 113: 130-136.

41. Collins C H, Grange J M, Yates M D,. 1984. Mycobacteria in water. J. Appl.

Bacteriol.; 57: 193-211.

42. Collins S J,. 1987. The HL-60 promyelocytic leukemia cell line: proliferation,

differentiation, and cellular oncogene expression. Blood; 70: 1233-1244.

43. Collison L W, Vignali D A A,. 2008. Interleukin-35: odd one out or part of the

family?. Immunol. Rev.; 226: 248-262.

44. Conus S, Simon H U,. 2008. Cathepsins: key modulators of cell death and

inflammatory responses. Biochem. Pharmacol.; 76: 1374-1382.

45. Cooper M A, Fehniger T A,. Caligiuri M A,. 2001. The biology of human natural

killer-cell subsets. Trends Immunol.; 22: 633-640.

46. Corpe R F, Runyon E H, Lester W, (American Thoracic Society). 1963. Status of

disease due to unclassified mycobacteria. Am. Rev. Respir. Dis.; 87: 459–61.

47. Crowle A J, Dahl R, Ross E, May M H,. 1991. Evidence that vesicles containing

living, virulent Mycobacterium tuberculosis or Mycobacterium avium in

cultured human macrophages are not acidic. Infect. Immun.; 59: 1823-1831.

48. Daffé M, Etienne G,. 1999. The capsule of Mycobacterium tuberculosis and its

implications for pathogenicity. Tuber. Lung Dis.; 79: 153-169.

Bibliografía

96

49. Davidson D J, Currie A J, Reid G S D, Bowdish D M E, MacDonald K L, Ma R C,

et al.,. 2004. The cationic antimicrobial peptide LL-37 modulates dendritic cell

differentiation and dendritic cell-induced T cell polarization. J. Immunol.; 172:

1146-1156.

50. Davis A S, Vergne I, Master S S, Kyei G B, Chua J, Deretic V,. 2007. Mechanism

of inducible nitric oxide synthase exclusion from mycobacterial phagosomes.

PLoS Pathogens. http//www.plospathogens.org.; 3: e186.

51. Denis M, 1991. Tumor necrosis factor and granulocyte macrophage-colony

stimulating factor stimulate human macrophages to restrict growth of virulent

Mycobacterium avium and to kill avirulent M. avium: killing effector

mechanism depends on the generation of reactive nitrogen intermediates. J.

Leukoc. Biol.; 49: 380-387.

52. Dinarello C A,. 2003. Anti-cytokine therapeutics and infections. Vaccine; 21:

S2/24-S2/34.

53. Douglas J G, Calder M A, Choo-Kang Y F J, Leitch A G,. 1986. Mycobacteriun

gordonae: a new pathogen?. Thorax; 41: 152-153.

54. Douvas G S, May M H, Ross E, Crowle A J,. 1992. Characterization of inhibition

of Mycobacterium avium replication in macrophages by normal human serum.

Infect. Immun.; 60: 345-352.

55. Duits L A, Ravensbergen B, Rademaker M, Hiemstra P S, Nibbering P H,. 2002.

Expression of β-defensin 1 and 2 mRNA by human monocytes, macrophages

and dendritic cells. Immunology; 106: 517-525.

56. Enfermedades de transmisión respiratoria. Año 2007. Boletín epidemiológico de

Castilla y León.; 24: 5-12.

57. Ernst J D,. 1998. Macrophage receptors for Mycobacterium tuberculosis. Infect.

Immun.; 66: 1277-1281.

58. Esche C, Stellato C, Beck L A,. 2005. Chemokines: key players in innate and

adaptive immunity. J. Invest. Dermatol.; 125: 615-628.

59. Esin S, Batoni G, Pardini M, Favilli F, Bottai D, Maisetta G, et al.,. 2004.

Functional characterization of human natural killer cells responding to

Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guérin. Immunology; 112: 143-152.

60. Eum S Y, Kong J H, Hong M S, Lee Y J, Kim J H, Hwang S H, et al.,. 2010.

Neutrophils are the predominant infected phagocytic cells in the airways of

patients with active pulmonary TB. Chest; 137: 122-128.

Bibliografía

97

61. Falkinham III J O,. 2002. Nontuberculous mycobacteria in the enviroment. Clin.

Chest Med.; 23: 529-551.

62. Fazal N, Bartlett R, Lammas D A, Kumararatne D S,. 1992. A comparison of the

different methods available for determining BCG-macrophage interactions in

vitro, including a new method of colony counting in broth. FEMS Microbiol.

Immunol.; 105: 355-362.

63. Ferguson J S, Schlesinger L S,. 2000. Pulmonary surfactant in innate immunity and

the pathogenesis of tuberculosis. Tuber. Lung Dis.; 80: 173-184.

64. Ferrari G, Langen H, Naito M, Pieters J,. 1999. A Coat protein on phagosomes

involved in the intracellular survival of mycobacteria. Cell; 97: 435-447.

65. Filipe-Santos O, Bustamante J, Chapgier A, Vogt G, de Beaucoudrey L, Feinberg

J, et al.,. 2006. Inborn errors of IL-12/23- and IFN-γ-mediated immunity:

molecular, cellular, and clinical features. Semin. Immunol.; 18: 347-361.

66. Fitzgerald D A, Smith A G, Lees A, Yee L, Cooper N, Harris S C, et al. 1995.

Cutaneous infection with Mycobacterium abscessus. Br. J. Dermatol.; 132:

800–804.

67. Flesch I, Kaufmann S H E,. 1987. Mycobacterial growth inhibition by interferon-γ-

activated bone marrow macrophages and differential susceptibility among

strains of Mycobacterium tuberculosis. J. Immunol.; 138: 4408-4413.

68. Flynn J L, Chan J,. 2001. Immunology of tuberculosis. Annu. Rev. Immunol.; 19:

93-129.

69. Flynn J L, Chan J,. 2003. Immune evasion by Mycobacterium tuberculosis: living

with the enemy. Curr. Opin. Immunol.; 15: 450-455.

70. Flynn J L, Goldstein M M, Chan J, Triebold K J, Pfeffer K,. Lowensteln C J, et al.,.

1995. Tumor necrosis factor-α is required in the protective immune response

against Mycobacterium tuberculosis in mice. Immunity; 2: 561-572.

71. Förtsch D, Röllinghoff M, Stenger S,. 2000. IL-10 converts human dendritic cells

into macrophage-like cells with increased antibacterial activity against virulent

Mycobacterium tuberculosis. J. Immunol.; 165: 978-987.

72. Fritsche A, Engel R, Buhl D, Zellweger J P,. 2004. Mycobacterium bovis

tuberculosis: from animal to man and back. Int. J. Tuberc. Lung Dis.; 8: 903-

904.

Bibliografía

98

73. Frothingham R, Strickland P L, Bretzel G, Ramaswamy S, Musser J M, Williams

D L,; 1999. Phenotypic and genotypic characterization of Mycobacterium

africanum isolates from West Africa. J. Clin. Microbiol.; 37: 1921–1926.

74. Fu L M,. 2003. The potential of human neutrophil peptides in tuberculosis therapy.

Int. J. Tuberc. Lung Dis.; 7: 1027-1032.

75. Gallagher R, Collins S, Trujillo J, McCredie K, Ahearn M, Tsai S, et al.,. 1979.

Characterization of the continuous, differentiating myeloid cell line (HL-60)

from a patient with acute promyelocytic leukemia. Blood; 54: 713-733

76. Ganz T,. 2002. Antimicrobial polypeptides in host defense of the respiratory tract.

J. Clin. Invest.; 109: 693-697.

77. Garred P, Richter C, Andersen A B, Madsen H O, Mtoni I, Svejgaard A, et al.,.

1997. Mannan-binding lectin in the Sub-Saharan HIV and tuberculosis

epidemics. Scand. J. Immunol.; 46: 204-208.

78. Gatfield J, Pieters J,. 2000. Essential role for cholesterol in entry of mycobacteria

into macrophages. Science.; 288:1647-1650.

79. Gaynor C D, McCormack F X, Voelker D R, McGowan S E, Schlesinger L S,.

1995. Pulmonary surfactant protein A mediates enhanced phagocytosis of

Mycobacterium tuberculosis by a direct interaction with human macrophages. J.

Immunol.; 155; 5343-5351.

80. González-Cortés C, Reyes-Ruvalcaba D, Diez-Tascón C, Rivero-Lezcano O M,.

2009. Apoptosis and oxidative burst in neutriphils infected with Mycobacterium

spp. Immunol. Lett.; 126: 16-21.

81. Gordon S V, Brosch R, Billault A, Garnier T, Eiglmeier K, Cole S T,. 1999.

Identification of variable regions in the genomes of tubercle bacilli using

bacterial artificial chromosomes arrays. Mol. Microbiol.; 32: 643-655.

82. Gruenheid S, Gros P,. 2000. Genetic susceptibility to intracellular infections:

Nramp1, macrophage function and divalent cations transport. Curr. Opin.

Microbiol.; 3: 43-48.

83. Gruenheid S, Pinner E, Desjardins M, Gros P,. 1997. Natural resistance to infection

with intracellular pathogens: the Nramp1 protein is recruited to the membrane

of the phagosome. J. Exp. Med.; 185: 717-730.

84. Harder J, Bartels J, Christophers E, Schröder J M,. 2001. Isolation and

characterization of human β-defensin-3, a novel human inducible peptide

antibiotic. J. Biol. Chem.; 276: 5707-5713.

Bibliografía

99

85. Hartmann P, Plum G,. 1999. Immunological defense mechanisms in tuberculosis

and MAC-infection. Diagn. Microbiol. Infect. Dis.; 34: 147-152.

86. Heldwein K A, Fenton M J,. 2002. The role of Toll-like receptors in immunity

against mycobacterial infection. Microbes Infect.; 4: 937-944.

87. Hesseling A C, Schaaf H S, Victor T, Beyers N, Marais B J, Cotton M F, et al.,

2004. Resistant Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin disease:

implications for management of Bacillus Calmette-Guerin disease in human

immunodeficiency virus-infected children. Pediatr. Infect. Dis. J.; 5: 476-479.

88. Hickman S P, Chan J, Salgame P,. 2002. Mycobacterium tuberculosis induces

differencial cytokine production from dendritic cells and macrophages with

divergent effects on naïve T cell polarization. J. Immunol.; 168: 4636-4642.

89. Hirsch C S, Ellner J J, Russell D G, Rich E A,. 1994. Complement receptor-

mediated uptake and tumor necrosis factor-α -mediated growth inhibition of

Mycobacterium tuberculosis by human alveolar macrophages. J. Immunol.;

152: 743-753.

90. Hmama Z, Gabathuler R, Jefferies W A, de Jong G, Reiner N E,. 1998. Attenuation

of HLA-DR expression by mononuclear phagocytes infected with

Mycobacterium tuberculosis is related to intracellular sequestration of immature

class II heterodimers. J. Immunol.; 161: 4882-4893.

91. Hoft. D,. 2008. Tuberculosis vaccine development: goals, immunological desig,

and evaluation. Lancet; 372: 164-175.

92. Hogg J C,. 2004. Pathophysiology of airflow limitation in chronic obstructive

pulmonary disease. Lancet; 364: 709-721.

93. Horwitz M A, Silverstein S C,. 1980. Legionnaires' disease bacterium (Legionella

pneumophila) multiplies intracellularly in human monocytes. J. Clin. Invest.;

66: 441-450.

94. Horwitz M A, Silverstein S C,. 1981. Activated human monocytes inhibit the

intracellular multiplication of Legionnaires' disease bacteria. J. Exp. Med.; 154:

1618-1635.

95. Horwitz M A,. 1984. Phagocytosis of the Legionnaires’ disease bacterium

(Legionella pneumophila) occurs by a novel mechanism: engulfment within a

pseudopod coil. Cell; 36: 27-33.

96. Howard S T, Rhoades E, Recht J, Pang X, Alsup A, Kolter R, et al.,. 2006.

Spontaneous reversion of Mycobacterium abscessus from a smooth to a rough

Bibliografía

100

morphotype is associated with reduced expression of glycopeptidolipid and

reacquisition of an invasive phenotype. Microbiology; 152: 1581-1590.

97. Huard R C, de Oliveira-Lazzarini L C, Butler W R, van Soolingen D, Ho J L.,

2003. PCR-based method to differentiate the subspecies of the Mycobacterium

tuberculosis complex on the basis of genomic deletions. J. Clin. Microbiol.; 41:

1637-1650.

98. Isaacs A, Lindenmann J,. 1988. Classics in oncology. Virus interference: I. The

interferon. CA Cancer J. Clin.; 38: 280-290.

99. Joly S, Organ C C, Johnson G K, McCray Jr. P B, Guthmiller J M,. 2005.

Correlation between β-defensin expression and induction profiles in gingival

keratinocytes. Mol. Immunol.; 42: 1073-1084.

100. Jones G S, Amirault H J, Andersen B R,. 1990. Killing of Mycobacterium

tuberculosis by neutrophils: a nonoxidative process. J. Infect. Dis.; 162: 700-

704.

101. Kasahara K, Sato I, Ogura K, Takeuchi H, Kobayashi K, Adachi M,. 1998.

Expression of chemokines and induction of rapid cell death in human blood

neutrophils by Mycobacterium tuberculosis. J. Infect. Dis.; 178: 127-137.

102. Katoch V M,. 2004. Infections due to non-tuberculous mycobacteria (NTM).

Indian J. Med. Res.; 120: 290-304.

103. Kaufmann S H E,. 2002. Protection against tuberculosis: cytokines, T cells, and

macrophages. Ann. Rheum. Dis.; 61: 54-58.

104. Kawahara T, Lambeth J D,. 2007. Molecular evolution of Phox-related regulatory

subunits for NADPH oxidase enzymes. BMC Evol. Biol.; 7: Open Access

BioMed Central. http://www.biomedcentral.com/1471-2148/7/178.

105. Keane J, Balcewicz-Sablinska M K, Remold H G,. Chupp G L, Meek B B, Fenton

M J, et al.,. 1997. Infection by Mycobacterium tuberculosis promotes human

alveolar macrophage apoptosis. Infect. Immun.; 65: 298-304.

106. Khader S A, Pearl J E, Sakamoto K, Gilmartin L,. Bell G K, Jelley-Gibbs D M, et

al.,. 2005. IL-23 compensates for the absence of IL-12p70 and is essential for

the IL-17 response during tuberculosis but is dispensable for protection and

antigen-specific IFN-γ responses if IL-12p70 is available. J. Immunol.; 175:

788-795.

107. King A E, Fleming D C, Critchley H O D, Kelly R W,. 2003. Differential

expression of the natural antimicrobials, beta-defensins 3 and 4, in human

endometrium. J. Reprod. Immunol.; 59: 1-16.

Bibliografía

101

108. Kisich K O, Higgins M, Diamond G, Heifets L,. 2002. Tumor necrosis factor

alpha stimulates killing of Mycobacterium tuberculosis by human neutrophils.

Infect. Immun.; 70: 4591-4599.

109. Knowles M R,. Boucher R C,. 2002. Mucus clearance as a primary innate defense

mechanism for mammalian airways. J. Clin. Invest.; 109: 571-577.

110. Kobayashi K, Allred C, Castriotta R, Yoshida T,. 1985. Strain variation of Bacillus

Calmette-Guérin-induced pulmonary granuloma formation is correlated with

anergy and the local production of migration inhibition factor and interleukin-1.

Am. J. Pathol.; 119: 223-235.

111. Koch R,. 1982. The etiology of tuberculosis. Rev. Infect. Dis.; 4: 1270-1274.

112. Korbel D S, Schneider B E, Schaible U E,. 2008. Innate immunity in tuberculosis:

myths and truth. Microbes Infect.; 10: 995-1004.

113. Latvala S, Pietilä T E, Veckman V, Kekkonen R A, Tynkkynen S, Korpela R, et

al.,. 2008. Potentially probiotic bacteria induce efficient maturation but

differential cytokine production in human monocyte-derived dendritic cells.

World J. Gastroenterol.; 14: 5570-5583.

114. LeBien T W, Tedder T F,. 2008. B lymphocytes: how they develop and function.

Blood; 112: 1570-1580.

115. Lee I, Skinner M A, Guo H-b, Sujan A, Pierce M,. 2004. Expression of the

vacuolar H+-ATPase 16-kDa subunit results in the triton X-100-insoluble

aggregation of β1 integrin and reduction of its cell surface expresión. J. Biol.

Chem.; 279: 53007–53014.

116. Lee J S, Lee J Y, Son J W, Oh J H, Shin D M, Yuk J M, et al.,. 2007. Expression

and regulation of the CC-chemokine ligand 20 during human tuberculosis.

Scand. J. Immunol.; 67: 77-85.

117. Lehmann J, Retz M, Harder J, Krams M, Kellner U, Hartmann J, et al., 2002.

Expression of human beta-defensins 1 and 2 in kidneys with chronic bacterial

infection. BMC Infect. Dis. Open access. http://www.biomedcentral.com/1471-

2334/2/20.

118. Liébana E, Aranaz A, Francis B, Cousins D,. 1996. Assessment of genetic markers

for species differentiation within the Mycobacterium tuberculosis complex. J.

Clin. Microbiol.; 34: 933-938.

119. Lin Y, Gong J, Zhang M, Xue W, Barnes P F,. 1998. Production of monocyte

chemoattractant protein 1 in tuberculosis patients. Infect. Immun.; 66: 2319-

2322.

Bibliografía

102

120. Linehan S A, Martínez-Pomares L, Gordon S,. 2000. Macrophage lectins in host

defense. Microbes Infect.; 2: 279-288.

121. Liu J, Fujiwara T M, Buu N T, Sanchez F O, Cellier M, Paradis A J, et al.,. 1995.

Identification of polymorphisms and sequence variants in the human

homologue of the mouse natural resistance-associated macrophage protein

gene. Am. J. Hum. Genet.; 56: 845-853.

122. Lodoen M B, Lanier L L,. 2006. Natural killer cells as an initial defense against

pathogens. Curr. Opin. Immunol.; 18: 391-398.

123. Lowenstein C J, Padalko E,. 2004. iNOS (NOS2) at a glance. J. Cell Sci.; 117:

2865-2867.

124. Ma J, Chen T, Mandelin J, Ceponis A, Miller N E, Hukkanen M, et al,. 2003.

Regulation of macrophage activation. CMLS Cell. Mol. Life Sci.; 60: 2334-

2346.

125. MacMicking J D, North R J, LaCourse R, Mudgett J S, Shah S K, Nathan C F,.

1997. Identification of nitric oxide synthase as a protective locus against

tuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.; 94: 5243-5248.

126. Majeed M, Perskvist N, Ernst J D, Orselius K, Stendahl O,. 1998. Roles of calcium

and annexins in phagocytosis and elimination of an attenuated strain of

Mycobacterium tuberculosis in human neutrophils. Microb. Pathog.; 24: 309-

320.

127. Mantovani A,. 1999. The chemokine system: redundancy for robust outputs.

Immunol. Today; 20: 254-257.

128. Marra A, Horwitz M A, Shuman H A,. 1990. The HL-60 model for the interaction

of human macrophages with the Legionnaires´ disease bacterium. J. Immunol.;

144: 2738-2744.

129. Martineau A R., Newton S M., Wilkinson K A., Kampmann B, Hall B M.,

Nawroly N, et al.,. 2007. Neutrophil-mediated innate immune resistance to

mycobacteria. J. Clin. Invest.; 117: 1988-1994.

130. Martinez J M, Afshari C A, Bushel P R, Masuda A, Takahashi T, Walker N J,.

2002. Differential toxicogenomic responses to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-

dioxin in malignant and non-malignant human airway epithelial cells. Toxicol.

Sci.; 69: 409-423.

131. May M E, Spagnuolo Philip J,. 1987. Evidence for activation of a respiratory burst

in the interaction of human neutrophils with Mycobacterium tuberculosis Infect.

Immun.; 55: 2304-2307.

Bibliografía

103

132. McCarthy D M, San Miguel J F, Freake H C, Green P M, Zola H, Catovsky D, et

al.,. 1983. 1,25-dihydroxyvitamin D3 inhibits proliferation of human

promyelocytic leukaemia (HL60) cells and induces monocyte-macrophage

differentiation in HL60 and normal human bone marrow cells. Leuk. Res.; 7:

51-55.

133. McDonough K A, Kress Y, Bloom B R,. 1993. Pathogenesis of tuberculosis:

Interaction of Mycobacterium tuberculosis with macrophages. Infect. Immun.;

61: 2763-2773.

134. McGarvey J, Bermudez L E,. 2002. Pathogenesis of nontuberculuos mycobacteria

infections. Clin. Chest Med.; 23: 569-583.

135. McMurray D N,. 2001. Disease model: pulmonary tuberculosis. Trends Mol. Med.;

7: 135-137.

136. Mellman I, Fuchs R, Helenius A,. 1986. Acidification of the endocytic and

exocytic pathways. Annu. Rev. Biochem.; 55: 663-700.

137. Michael A L,. 2002. Implications of tuberculosis in African wildlife and livestock.

Ann. N. Y. Acad. Sci.; 969: 251–255.

138. Milburn H J,. 2001. Primary tuberculosis. Curr. Opin. Pulm. Med.; 7: 133-141.

139. Miller B H, Fratti R A, Poschet J F, Timmins G S, Master S S, Burgos M, et al.,.

2004. Mycobacteria inhibit nitric oxide synthase recruitment to phagosomes

during macrophage infection. Infect. Immun.; 72: 2872-2878.

140. Miyakawa Y, Ratnakar P, Rao A G, Costello M L, Mathieu-Costello O, Lehrer R I,

et al.,. 1996. In vitro activity of the antimicrobial peptides human and rabbit

defensins and porcine leucocyte protegrin against Mycobacterium tuberculosis.

Infect. Immunol.; 64: 926-932.

141. Mostowy S, Behr M A,. 2005. The origen and evolution of Mycobacterium

tuberculosis. Clin. Chest Med.; 26: 207-216.

142. Mostowy S, Cousins D, Behr M A,. 2004. Genomic interrogation of the Dassie

bacillus reveals it as a unique RD1 mutant within the Mycobacterium

tuberculosis complex. J. Bacteriol.; 186: 104-109.

143. Mostowy S, Cousins D, Brinkman J, Aranaz A, Behr M A,. 2002. Genomics

deletions suggest a phylogeny for the Mycobacterium tuberculosis complex. J.

Infect. Dis.; 186: 74-80.

Bibliografía

104

144. Müller A, Hacker J, Brand B C,. 1996. Evidence for apoptosis of human

macrophage-like HL-60 cells by Legionella pneumophila infection. Infect.

Immun.; 64: 4900-4906.

145. Nakachi N, Matsunaga K, Klein T W, Friedman H, Yamamoto Y,. 2000.

Differential effects of virulent versus avirulent Legionella pneumophila on

chemokine gene expression in murine alveolar macrophages determined by

cDNA expression array technique. Infect. Immun.; 68: 6069-6072.

146. N’Diaye E N, Darzacq X, Astarie-Dequeker C, Daffé M, Calafat J, Maridonneau-

Parini I,. 1998. Fusion of azurophil granules with phagosomes and activation of

the tyrosine kinase Hck are specifically inhibited during phagocytosis of

mycobacteria by human neutrophils. J. Immunol.; 161: 4983-4991.

147. Netea M G, Van der Meer J W M, Kullberg B J,. 2004. Toll-like receptors as an

escape mechanism from the host defense. Trends Microbiol.; 12: 484-488.

148. Nicholson S, Bonecini-Almeida M G, Lapa e Silva J R, Nathan C, Xie Q-w,

Mumford R, et al.,. 1996. Inducible nitric oxide synthase in pulmonary alveolar

macrophages from patients with tuberculosis J. Exp. Med.; 183: 2293-2302.

149. Nordenfelt P, Bauer S, Lönnbro P, Tapper H,. 2009. Phagocytosis of Streptococcus

pyogenes by All-trans retinoic acid-differentiated HL-60 cells: roles of

azurophilic granules and NADPH oxidase. PLoS ONE; 4: e7363.

www.plosone.org; 4: e7363.

150. Nziramasaga P, Shah P M, Stille W,. 1993. Control of intracellular growth of

Mycobacterium fortuitum by human monocytes in vitro. J. Chemother.; 5: 103-

106.

151. Ogata K, Linzer B A, Zuberi R I, Ganz T, Lehrer R I, Cantazaro A, 1992. Activity

of defensisns from human neutrophilic granulocytes against Mycobacterium

avium-Mycobacterium intracellulare. Infect. Immun.; 60: 4720-4725.

152. Olleros M L, Guler R, Vesin D, Parapanov R, Marchal G, Martinez-Soria E, et al.,.

2005. Contribution of transmembrane tumor necrosis factor to host defense

against Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin and Mycobacterium

tuberculosis infections. Am. J. Pathol.; 166: 1109-1120.

153. Othieno C, Hirsch C S, Hamilton B D, Wilkinson K, Ellner J J, Toosi Z,. 1999.

Interaction of Mycobacterium tuberculosis-induced transforming growth factor

β1 and interleukin-10. Infect. Immun.; 67: 5730-5735.

154. Ottenhoff T H M, Verreck F A W, Hoeve M A, van de Vosse E,. 2005.Control of

human host immunity to mycobacteria. Tuberculosis (Edinb); 85: 53-64.

Bibliografía

105

155. Pai R K, Convery M, Hamilton T A, Boom W H, Harding C V,. 2003. Inhibition of

IFN-γ-induced class II transactivator expression by a 19-kDa lipoprotein from

Mycobacterium tuberculosis: A potential mechanism for immune evasion. J.

Immunol.;171: 175-184.

156. Paul S, Laochumroonvorapong P, Kaplan G,. 1996. Comparable growth of virulent

and avirulent M. tuberculosisin human macrophages in vitro. J. Infect. Dis.;

174: 105-112.

157. Pearlman E, Jiwa A H, Engleberg N C, Eisenstein B I,. 1988. Growth of Legionella

pneumophila in a human macrophage-like (U937) cell line. Microb. Pathog.; 5:

87-95.

158. Pérez-Cañadillas J M, Zaballos A, Gutiérrez J, Varona R, Roncal F, Albar J P,. et

al.,. 2001. NMR solution structure of murine CCL20/MIP-3α, a chemokine that

specifically chemoattracts immature dendritic cells and lymphocytes through its

highly specific interaction with the β-chemokine receptor CCR6. J. Biol.

Chem.; 276: 28372-28379.

159. Perskvist N, Long M, Stendahl O, Zheng L,. 2002. Mycobacterium tuberculosis

Promotes apoptosis in human neutrophils by activating caspase-3 and altering

expression of Bax/Bcl-xL via an oxygen-dependent pathway. J. Immunol.; 168:

6358-6365.

160. Pestka S, Krause C D, Walter M R,. 2004. Interferons, interferon-like cytokines,

and their receptors. Immunol. Rev.; 202: 8-32.

161. Phadke A P, Akangire G,. Park S J, Lira S A, Mehrad B,. 2007. The role of CC

chemokine receptor 6 in host defense in a model of invasive pulmonary

aspergillosis. Am. J. Respir. Crit. Care Med.; 175: 1165-1172.

162. Piersimoni C, Scarpano C,. 2008. Pulmonary infections associated with non-

tuberculous mycobacteria in immunocompetent patients. Lancet Infect. Dis.; 8:

323-334.

163. Pieters J,. 2001. Entry and survival of pathogenic mycobacteria in macrophages.

Microbes Infect.; 3: 249-255.

164. Pinner M,. 1935. Atypical acid-fast microorganisms: III. Chromogenic acid-fast

bacilli from human beings. Am. Rev. Tuberc.; 32: 424-439.

165. Plaffl M W,. 2001. A new mathematical model for relative quantification in real-

time RT-PCR. Nucleic Acids Res.; 29: 2002-2007.

Bibliografía

106

166. Pokkali S, Das S D,. 2009. Augmented chemokine levels and chemokine receptor

expression on immune cells during pulmonary tuberculosis. Hum. Immunol.;

70: 110-115.

167. Prabhakar S, Qiao Y, Hoshino Y, Weiden M, Canova A, Giacomini E, et al.,. 2003.

Inhibition of response to alpha interferon by Mycobacterium tuberculosis.

Infect. Immun.; 71: 2487-2497.

168. Quesniaux V, Fremond C, Jacobs M, Parida S, Nicolle D, Yeremeev V, et al.,. 2004. Toll-like receptor pathways in the immune responses to mycobacteria.


169. Raja A,. 2004. Inmunology of tuberculosis. Indian J. Med. Res.; 120: 213-232.

170. Reis e Sousa C, Sher A, Kaye P,. 1999. The role of dendritic cells in the induction

and regulation of immunity to microbial infection. Curr. Opin. Immunol.; 11:

392-399.

171. Rhoades E R, Cooper A M, Orme I M,. 1995. Chemokine response in mice

infected with Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun.; 63: 3871-3877.

172. Riedel D D, Kaufmann S H E,. 1997. Chemokine secretion by human

polymorphonuclear granulocytes after stimulation with Mycobacterium

tuberculosis and lipoarabinomannan. Infect. Immun.; 65: 4620-4623.

173. Rivas-Santiago B, Sada E, Hernández-Pando R, Tsutsumi V,. 2006. Péptidos

antimicrobianos en la inmunidad innata de enfermedades infecciosas. Salud

Publica Mex.; 48: 62-71.

174. Rivas-Santiago B, Schwander S K, Sarabia C, Diamond G, Klein-Patel M E,

Hernández-Pando R, et al.,. 2005. Human β-defensin 2 is expressed and

associated with Mycobacterium tuberculosis during infection of human alveolar

epithelial cells. Infect. Immun.; 73: 4505-4511.

175. Rivas-Santiago B, Vieyra-Reyes P, Araujo Z,. 2005. Respuesta de inmunidad

celular en la tuberculosis pulmonar. Invest. Clín.; 46: 391-412.

176. Rivera-Marrero C A, Stewart J, Shafer W M, Roman J,. 2004. The down-regulation

of cathepsin G in THP-1 monocytes after infection with Mycobacterium

tuberculosis is associated with increased intracellular survival of bacilli. Infect.

Immun.; 72: 5712-5721.

177. Robinson S P, Patterson S, English N, Davies D, Knight S C, Reid D L,. 1999.

Human peripheral blood contains two distinct lineages of dendritic cells. Eur. J.

Immunol.; 29: 2769-2778.

Bibliografía

107

178. Rockett K A, Brookes R, Udalova I, Vidal V, Hill A V S, Kwiatkowski D,. 1998.

1,25-dihydroxyvitamin D3 induces nitric oxide synthase and suppresses growth

of Mycobacterium tuberculosis in a human macrophage-like cell line. Infect.

Immun.; 66: 5314-5321.

179. Rodgers M R, Blackstone B J, Reyes A L, Covert T C,. 1999. Colonisation of point

of use water filters by silver resistant non-tuberculous mycobacteria. J. Clin.

Pathol.; 52: 629-632.

180. Rodríguez-Bayarri M J, Madrid san Martín F,. 2004. Tuberculosis pulmonar como

enfermedad profesional. Arch. Bronconeumol.; 40: 463-472.

181. Rojas-Espinosa O, Dannenberg Jr A M,. Sternberger L A, Tsuda T,. 1974. The role

of cathepsin D in the pathogenesis of tuberculosis. Am. J. Pathol.; 74: 1-18.

182. Rook G A W, Hernandez-Pando R, Dheda K, Seah G T,. 2004. IL-4 in

tuberculosis: implications for vaccine design. Trends Immunol.; 25: 483-488.

183. Rugeles M T, Rincón B, Rugeles C, Montoya C J, Hernández M, Estrada C, et al.,.

2004. Normal expression of IFN-γR in four patients with uncommon

mycobacterial infection phenotypes. Braz. J. Med. Biol. Res.; 37: 1353-1363.

184. Runyon E H,. 1959. Anonymous mycobacteria in pulmonary disease. Med. Clin.

North. Am.; 43: 273– 290.

185. Sadek M I, Sada E, Toossi Z, Schwander S K, Rich E A,. 1998. Chemokines

induced by infection of mononuclear phagocytes with mycobacteria and present

in lung alveoli during active pulmonary tuberculosis Am. J. Respir. Cell Mol.

Biol.; 19: 513-521.

186. Salgame P,. 2005. Host innate and Th1 responses and the bacterial factors that

control Mycobacterium tuberculosis infection. Curr. Opin. Immunol.; 17: 374-

380.

187. Samper S, Martín C, Pinedo A, Rivero A, Blázquez J, Baquero F, et al.,. 1999.

Transmission between HIV-infected patients of multidrug-resistant tuberculosis

caused by Mycobacterium bovis. AIDS; 11: 1237-1242.

188. Sanders J W, Walsh A D, Snider R L, Sahn E E,. 1995. Disseminated

Mycobacterium scrofulaceum infection: a potentially treatable complication of

AIDS. Clin. Infect. Dis.; 20: 549–556.

189. Saukkonen J J, Bazydlo B, Thomas M, Strieter R M, Keane J, Kornfeld H,. 2002.

β-chemokines are induced by Mycobacterium tuberculosis and inhibit its

growth. Infect. Immun.; 70: 1684-1693.

Bibliografía

108

190. Saunders B M, Briscoe H, Britton W J,. 2004. T cell-derived tumour necrosis

factor is essential, but not sufficient, for protection against Mycobacterium

tuberculosis infection. Clin. Exp. Immunol.; 137: 279-287.

191. Schierloh P, Yokobori N, Alemán M, Landoni V, Geffner L,. Musella R M, et al.,.

2007. Mycobacterium tuberculosis-induced gamma interferon production by

natural killer cells requires cross talk with antigen-presenting cells involving

toll-like receptors 2 and 4 and the mannose receptor in tuberculous pleurisy.

Infect. Immun.; 75: 5325-5337.

192. Schutyser E, Struyf S, Menten P, Lenaerts J P, Conings R, Put W, et al.,. 2000.

Regulated production and molecular diversity of human liver and activation-

regulated chemokine/macrophage inflammatory protein-3α from normal and

transformed cells. J. Immunol.; 165: 4470-4477.

193. Scott-Algood H M, Lin P L, Flynn J L,. 2005. Tumor necrosis factor and

chemokine interactions in the formation and maintenance of granulomas in

tuberculosis. Clin. Infect. Dis.; 41: S189-S193.

194. Searle S, Bright N A, Roach T I A, Atkinson P G P, Barton C H, Meloen R H, et

al.,. 1998. Localisation of Nramp1 in macrophages: modulation with activation

and infection. J. Cell. Sci.; 111: 2855-2866.

195. Shiloh M U, Nathan C F,. 2000. Reactive nitrogen intermediates and the

pathogenesis of Salmonella and mycobacteria. Curr. Opin. Microbiol.; 3: 35-42.

196. Sibille Y, Reynolds H Y,. 1990. Macrophage and polymorphonuclear neutrophils

in lung defense and injury. Am. Rev. Respir. Dis.; 141: 471-501.

197. Siebert S, Amos N, Fielding C A, Wang E C Y, Aksentijevich I, Williams B D, et

al.,. 2005. Reduced tumor necrosis factor signaling in primary human

fibroblasts containing a tumor necrosis factor receptor superfamily 1A mutant.

Arthritis Rheum.; 52: 1287-1292.

198. Singhal A, Jaiswal A, Arora V K, Prasad H K,. 2007. Modulation of gamma

interferon receptor 1 by Mycobacterium tuberculosis: a potential immune

response evasive mechanism. Infect. Immun.; 75: 2500-2510.

199. Skeiky Y A W, Sadoff J C,. 2006. Advances in tuberculosis vaccine strategies. Nat.

Rev. Microbiol.; 4: 469-476.

200. Smith I,. 2003. Mycobacterium tuberculosis pathogenesis and molecular

determinants of virulence. Clin. Microbiol. Rev.; 16: 463-496.

201. Sperandio B, Regnault B, Guo J, Zhang Z, Stanley Jr S L, Sansonetti P J, et al.,.

2008. Virulent Shigella flexneri subverts the host innate immune response

Bibliografía

109

through manipulation of antimicrobial peptide gene expression. J. Exp. Med.;

205: 1121-1132.

202. Sreevatsan S, Pan X, Stockbauer K E, Connell N D, Kreiswirth B N, Whittam T S,

et al.,. 1997. Restricted structural gene polymorphism in the Mycobacterium

tuberculosis complex indicates evolutionarily recent global dissemination. Proc.

Natl. Acad. Sci. U.S.A.; 94: 9869-9874.

203. Stewart J N, Rivera H N, Karls R, Quinn F D, Roman J, Rivera-Marrero C A,.

2006. Increased pathology in lungs of mice after infection with an α-crystallin

mutant of Mycobacterium tuberculosis: changes in cathepsin proteases and

certain cytokines. Microbiology; 152: 233-244.

204. Tailleux L (a), Neyrolles O, Honoré-Bouakline S, Perret E, Sanchez F, Abastado J

P, et al.,. 2003. Constrained intracellular survival of Mycobacterium

tuberculosis in human dendritic cells. J. Immunol.; 170: 1939-1948.

205. Tailleux L (b), Schwartz O, Herrmann J L, Pivert E, Jackson M, Amara A, et al.,.

2003. DC-sign is the major Mycobacterium tuberculosis receptor on human

dendritic cells. J. Exp. Med.; 197:121–127.

206. Takahashi K, Hasegawa Y, Abe T, Yamamoto T, Nakashima K, Imaizumi K, et

al.,. 2008. Slc11a1 (formerly NRAMP1) polymorphisms associated with

multidrug-resistant tuberculosis. Tuberculosis (Edinb); 88: 52-57.

207. Thorne K J I, Oliver R C, Barrett A J,. 1976. Lysis and killing of bacteria by

lysosomal proteinases. Infect. Immun.; 14: 555-563.

208. Tomimori K, Uema E, Teruya H, Ishikawa C, Okudaira T, Senba M, et al.,. 2007.

Helicobacter pylori induces CCL20 expression. Infect. Immun.; 75: 5223-5232.

209. Trinchieri G,. 2003. Interleukin-12 and the regulation of innate resistance and

adaptive immunity. Nat. Rev. Immunol.; 3: 133-146.

210. Turner J, Frank A A, Brooks J V, Gonzalez-Juarrero M, Orme I M,. 2001. The

progression of chronic tuberculosis in the mouse does not require the

participation of B lymphocytes or interleukin-4. Exp. Gerontol.; 36: 537-545.

211. Ulrichs T, Kosmiadi G A, Trusov V, Jörg, S, Pradl L, Titukhina M, et al.,. 2004.

Human tuberculous granulomas induce peripheral lymphoid follicle-like

structures to orchestrate local host defence in the lung. J. Pathol.; 204: 217-228.

212. van Crevel R, Ottenhoff T H M, van der Meer J W M,. 2002. Innate immunity to

Mycobacterium tuberculosis. Clin. Microbiol. Rev.; 15: 294-309.

Bibliografía

110

213. van Embden J D A, van Gorkom T, Kremer K, Jansen R, van der Zeijst B A M,

Shouls L M,. 2000. Genetic variation and evolutionary origin of the direct

repeat locus of Mycobacterium tuberculosis complex bacteria. J. Bacteriol.;

182: 2393-2401.

214. van Soolingen D, Hoogenboezem T, de Haas P E W, Hermans P W M, Koedam M

A, Teppema K S, et al.,. 1997. A novel pathogenic taxon of the Mycobacterium

tuberculosis complex, canetti: characterization of an exceptional isolate from

Africa. Int. J. Syst. Bacteriol.; 47: 1236-1245.

215. van Soolingen D, van der Zanden A G M, de Haas P E W, Noordhoek G T, Kiers

A, Foudraine N A, et al. 1998. Diagnosis of Mycobacterium microti infections

among humans by using novel genetic markers. J. Clin. Microbiol.; 36: 1840–

1845.

216. Vasiljeva O, Turk B,. 2008. Dual contrasting roles of cysteine cathepsins in cancer

progression: Apoptosis versus tumour invasion. Biochimie; 90:380-386.

217. Verhoeckx K C M, Bijlsma S, de Groene E M, Witkamp R F, van der Greef J,

Rodenburg R J T,. 2004. A combination of proteomics, principal component

analysis and transcriptomics is a powerful tool for the identification of

biomarkers for macrophage maturation in the U937 cell line. Proteomics; 4:

1014–1028.

218. Verreck F A W, de Boer T, Langenberg D M L, Hoeve M A, Kramer M, Vaisberg

E, et al.,. 2004. Human IL-23-producing type 1 macrophages promote but IL-

10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria. Proc.

Natl. Acad. Sci. U.S.A.; 101: 4560-4565.

219. Vignais P V,. 2002. The superoxide-generating NADPH oxidase: structural aspects

and activation mechanism CMLS, Cell. Mol. Life Sci.; 59: 1428-1459.

220. Wallace R J, Jr, O’Brien R, Glassroth J, Raleigh J, Dutt A,. 1990. Diagnosis and

treatment of disease caused by nontuberculous mycobacteria. Am. Rev. Respir.

Dis.; 142: 940–953.

221. Wallis R S, Jonson J L,. 2001. Adult tuberculosis in the 21st century: pathogenesis,

clinical features, and management. Curr. Opin. Pulm. Med.; 7: 124-132.

222. Watanabe H, Adachi R, Hirayama A, Kasahara T, Suzuki K,. 2003. Triphenyltin

enhances the neutrophilic differentiation of promyelocytic HL-60 cells.

Biochem. Biophys. Res. Commun.; 306: 26-31.

Bibliografía

111

223. Weinberger M, Berg S L, Feuerstein I M, Pizzo P A, Witebsky F G,. 1992.

Disseminated infection with Mycobacterium gordonae: report of a case and a

critical review of the literature. Clin. Infect. Dis.; 14: 1229-1239.

224. Wells A Q,. 1953. Mycobacterium tuberculosis var. muris. J. Gen. Microbiol.;

9:149

225. Wolinsky E,. 1979. Nontuberculous mycobacteria and associated diseases. Am.

Rev. Respir. Dis.; 119: 107-159.

226. World Health Organization. WHO report 2009: Global tuberculosis control:

Epidemiology, strategy, financing. Genova, Switzerland.

WHO/HTM/TB/2009.411.

227. Wu Z, Hoover D M, Yang D, Boulègue C, Santamaria F, Oppenheim J J, et

al..2003. Engineering disulfide bridges to dissect antimicrobial and chemotactic

activities of human β-defensin 3. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.; 100: 8880-

8885.

228. Wyllie S, Seu P, Goss J A,. 2002. The natural resistance-associated macrophage

protein 1 Slc11a1 (formerly Nramp1) and iron metabolism in macrophages.


229. Yadav M, Schorey J S,. 2006. The β-glucan receptor dectin-1 functions together

with TLR2 to mediate macrophage activation by mycobacteria. Blood; 108:

3168-3175.

230. Yamauchi K, Akbar S M F, Horiike N, Michitaka K, Onji M,. 2002. Increased

serum levels of macrophage inflammatory protein-3α in chronic viral hepatitis:

prognostic importance of macrophage inflammatory protein-3α during

interferon therapy in chronic hepatitis C. J. Viral Hepat.; 9: 213-220.

231. Yang C S, Lee H M, Lee J Y, Kim J A, Lee S J, Shin D M, et al.,.2007. Reactive

oxygen species and p47phox activation are essential for the Mycobacterium

tuberculosis-induced pro-inflammatory response in murine microglia. J.

Neuroinflammation; 4: Open Access BioMed Central.

http://www.jneuroinflammation.com/content/4/1/27.

232. Yang C S, Shin D M, Kim K H, Lee Z W, Lee C H, Park S G, et al.,. 2009.

NADPH oxidase 2 interaction with TLR2 is required for efficient innate

immune responses to mycobacteria via cathelicidin expresion. J. Immunol.;

182: 3696–3705.

Bibliografía

112

233. Yang D, Chen Q, Hoover D M, Staley P, Tucker K D, Lubkowski J, et al.,. 2003.

Many chemokines including CCL20/MIP-3α display antimicrobial activity. J.

Leukoc. Biol.; 74: 448-455.

234. Yew W W, Leung C C,. 2007. Update in tuberculosis 2006. Am. J. Respir. Crit.

Care Med.; 175: 541-546.

235. Zhang S Y, Boisson-Dupuis S, Chapgier A, Yang K, Bustamante J, Puel A, et al.,.

2008. Inborn errors of interferon (IFN)-mediated immunity in humans: insights

into the respective roles of IFN-α/β, IFN-γ, and IFN-λ in host defense.

Immunol. Rev.; 226: 29-40.

236. Zlotnik A, Yoshie O,. 2000. Chemokines: A new classification system and their

role in immunity. Immunity; 12: 121-127.

237. Zumárraga M J, Martin C, Samper S, Alito A, Latini O, Bigi F, et al.,. 1999.

Usefulness of spoligotyping in molecular epidemiology of Mycobacterium

bovis-related infections in South America. J. Clin. Microbiol.; 37: 296-303.

ANEXOS

113

Anexo 1: Publicación: Human phagocytes lack the ability to kill Mycobacterium gordonae, a

non-pathogenic mycobacteria. (PDF).

“Actividad antimicrobiana y expresión génica diferencial ...

Documents

Transcript of “Actividad antimicrobiana y expresión génica diferencial ...