TINCIONES

COLORANTESSustancias de origen químico biológico, generalmente tintes, pigmentos, reactivos u otros compuestos, empleados en la coloración de tejidos microorganismos para exámenes microscópicos, debiendo tener al menos, un grupo cromóforo que le proporcione la propiedad de teñir.

CLASIFICACIÓN SEGÚN SU ORIGEN

• NATURALES:  como la hematoxilina, el  carmín y la orceína.

• SINTETICOS O ARTIFICIALES: Se obtiene de la anilina o l alquitrán de hulla siendo todos derivados del benceno, el azul de metileno, la safranina, azul de anilina, el naranja G, etc..

CLASIFICACIÓNSEGUN SUS PROPIEDADES QUÍMICAS

La mayoría de los colorantes empleados en histología actúan como ácidos o bases y tienden a formar uniones salinas con radicales ionizables presentes en los tejidos.

colorantes ácidos : eosina cargado en forma negativa se unen a componentes celulares cargados positivamente.

• Acidofilos afinidad colorantes ácidos

• Unión grupos aminos de las proteínas

• Excelente colorante citoplasmático

CLASIFICACION

colorantes básicos: ejemplo el azul de metileno, colorante cargado positivamente, se une a componentes celulares cargados negativamente.

• Se denominan basófilos

• Unión al núcleo y ciertas regiones del citoplasma

CLASIFICACIONcolorantes neutros : son colorantes en los que la porción ácida y la básica colorean.

• Tiñen las partes básicas de una célula de un color y las partes ácidas de otro.

• Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro. Ej. el eosinato de azul de metileno.

CLASIFICACIÓNcolorantes indiferentes: tiñen aquellas estructuras o sustancias que los disuelven más fácilmente que el líquido en que están preparados. Un ejemplo es el colorante sudan, un colorante de lípidos.

TINCIÓNProceso por el cual las moléculas de un colorante se absorben a una superficie, cambiando el color de las células de los M.O para poder ser observados en el microscopio.

Las bacterias son casi incoloras no presentan contraste con el medio en el que se encuentran suspendidas.

De acuerdo ala reacción que ocurre, existen diferentes tipos de tinción:

 

TIPOS DE TINCIONESTinción negativa

Tinción simple

Tinción diferencial

Tinción de Gram

Tinción de acido- alcohol resistencia

Tinciones especiales

Tinción de capsulas

Tinción de esporas

TINCIÓN NEGATIVA• No es una tinción propiamente ya que no utiliza

colorantes con cromoforos.

• se tiñe es el fondo sobre el que están los microorganismos apareciendo los microorganismos sin teñir. Se emplea para ver la cápsula de S. pneumoniae  y Cryptococcus neoformans en 

• No hay reacción entre la estructura celular y los colorantes

• La frotis se realiza con una gota de solución de nigrosina o tinta china.

• A la luz solo se ve la formación de una película opaca.

• La fijación se realiza por calor ,se deja secar la preparación y se observan los microorganismos brillantes sobre un fondo oscuro

TINCION NEGATIVA

TINCION SIMPLE• proporciona información

acerca de la forma, tamaño y tipo de agrupación de los microorganismos.

• colorantes derivados de las anilinas, sales orgánicas intensamente pigmentadas que proceden del alquitrán.

• Utilización de colorantes básicos

• Cristal violeta, azul de metileno, safranina, fuchina básica y verde malaquita

TINCION SIMPLETECNICA• Poner sobre un portaobjetos una gota de

agua y una pequeña alícuota de un cultivo bacteriano con el asa de siembra estéril.

• Hacer el frotis, formando una película homogénea sobre el portaobjetos con el asa de siembra. Dejar secar.

• Fijar la preparación, pasando a través de la llama del mechero el portaobjetos.

• Cubrir con una película de colorante (cristal violeta o safranina) durante 1 minuto.

• Lavar el exceso de colorante con agua.

TINCION SIMPLE• Dejar secar al aire.

• Añadir una gota de aceite de inmersión.

• Observar con objetivo de inmersión (100 x).

TINCION SIMPLE

Tinción simple con cristal violeta de Staphylococcus aureus. Microscopio óptico de campo claro (100x). 

Tinción simple con safranina de Micrococcus luteus. Microscopio óptico de campo claro (100x).  

TINCIÓN DIFERENCIALpermiten dividir a las bacterias en grupos, de acuerdo a su reacción con los colorantes utiliza dos. Entre ellos la tinción de Gram y la de alcohol-ácido resistente son las más usadas.

TINCIÓN DIFERENCIALTinción de Gram:

Es la técnica de uso más común en microbiolo gía y permite dividir las bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram positivas y Gram negativas, de acuerdo a las propiedades físicas de la pared celu lar.

TINCIÓN DIFERENCIAL

TINCIÓN DIFERENCIAL

Tinción de Gram de Bacillus cereus (bacilos gram positivos). Microscopía de campo claro (100x).

Tinción de Gram de Escherichia coli (bacilos gram negativos). Microscopía de campo claro (100x

TINCIÓN DIFERENCIALJUSTIFICACION ALA RESPUESTA DE LOS M.O A ESTA TINCIÓN

• Estructura física y composición de la pared celular

• Bacterias gram positivas gruesa capa de péptidoglucano permite retención colorante

• Gram negativa delgada capa de péptidoglucano junto con la abundancia de lípidos en la membrana externa de la pared celular aumenta porosidad permitiendo perdida del colorante fundamental (decoloración)

TINCIÓN DIFERENCIAL

TINCIÓN DIFERENCIALCaracterísticas de la tinción de gram

• Permite la rápida evaluación de morfología y complejidad bacteriana

• Tincion rápida y económica

• En muertas es la primera prueba que se realiza para estudio microbiológico

• Forma ,tamaño, agrupación celular, tipo composición pared celular

TINCIÓN DIFERENCIAL

TINCIÓN DE ACIDO- ALCOHOL RESISTENCIA

• Coloración por el método de Zielhl– Neelsen:

se emplea para diferenciar microorganismos ácido-alcohol resistentes, principalmente el bacilo de la tuberculosis, de aquellos que no son ácido-alcohol resistentes.

TINCIÓN DE ACIDO- ALCOHOL RESISTENCIATécnica:

- frotis y fijación de la muestra

- fucsina concentrada de Zielhl por 3-5 minutos, calentando la preparación con la llama del mechero, evitando que la preparación se seque y/o el colorante hierva

- decolorar con alcohol-ácido (alcohol de 95º con 3% en volumen de ácido clorhídrico concentrado), hasta que desprenda el colorante

- lavar con agua

TINCIÓN DE ACIDO- ALCOHOL RESISTENCIA- azul de metileno por 2 minutos

- lavar con agua

- lavar con agua y secar al aire

- examinar al microscopio con objetivo de inmer sión

TINCIÓN DE ACIDO- ALCOHOL RESISTENCIA

Bacilos acido alcohol resistentes en color rojo o fucsia

TINCIÓN DE ACIDO- ALCOHOL RESISTENCIA• bacterias ácido alcohol resistentes importantes y

patógenas:

• Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae, microorganismos responsables de la tuberculosis y la lepra respectivamente.

• Estas bacterias pertenecen al Phyllum Actinobacteria, un grupo grande y complejo de bacterias gram positivas, caracterizadas por contener en sus paredes celulares un alto contenido lipídico, ceras con una gran diversidad de ácidos micólicos.

• Moleculas de 60 y 90 átomos de carbono

• La presencia de estos lípidos en la cara externa de la pared permite resistencia de químicos en su entorno.

TINCIÓN DE ACIDO- ALCOHOL RESISTENCIACARACTERÍSTICAS

• Permite distinguir M.O cuya coloración resiste la acción de alcoholes y ácidos suaves

• Identificación de bacterias patógenas como Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae

• Bacterias ácido–alcohol resistentes: color rojo.

• Bacterias no ácido–alcohol resistentes: color azul

TINCIONES ESPECIALESSirven para observar estructuras den tro o en el exterior de la célula bacteriana, como tam bién algunos microorganismos que dadas sus características especiales no se tiñen adecuadamente con técnicas rutinarias.

TINCIONES ESPECIALES Tinción de Esporas

• Esta tinción permite poner de manifiesto la endospora bacteriana, una forma de resistencia producida por algunos géneros de bacterias gram positivas.

• Endoesporas viven interior de los M.O

• Clostridium, Bacillus, Sporosarcina

• La morfología y disposición de la endospora en el interior del microorganismos tiene valor taxonómico

• En el caso de Clostridium tetani produce una espora terminal mas grande que el diámetro de la bacteria ( espora de formante) dando lugar a una espora conocida como palillo de tambor

TINCIONES ESPECIALES

TINCIONES ESPECIALESEL MÉTODO EMPLEADO SCHAEFFER FULTON

• se tiñe en caliente con el colorante verde malaquita, un colorante soluble en agua.

• El calor modifica la permeabilidad de la endospora y permite la entrada del colorante a través de las capas externas de la endospora.

• lavado con abundante agua produce la decoloración de las formas vegetativas así como de los extremos de las bacterias esporuladas, que se tiñen por último con un colorante de contraste, la safranina.

TINCIONES ESPECIALESTécnica

- frotis y fijación de la muestra

- cubrir frotis con papel filtro

- teñir con Verde Malaquita a emisión de va pores por 10 a 15 min.

- enfriar y lavar con agua

- aplicar Safranina por 30 segs a 1 min.

- lavar con agua y secar al aire

- ob ser var al mi crosco pio con objetivo de inmersión 

TINCIONES ESPECIALES

Tinción de esporas de Bacillus subtilis. La flecha indica esta estructura en verde. Microscopía de campo claro (100x

TINCIONES ESPECIALESTinción de capsulas

• La cápsula es una estructura que rodea externamente la pared de algunos microorganismos.

• protege a la célula del ambiente externo, proporcionando numerosas ventajas a los microorganismos que son capaces de sintetizarla.

• las bacterias patógenas la cápsula permite la adhesión al hospedador o protege de la fagocitosis.

• incrementa las posibilidades de sobrevivir en condiciones de desecación en bacterias que colonizan ambientes naturales.

• previenen el ataque de algunos virus

• proporcionan importantes ventajas al facilitar la adhesión a superficies sólidas.

TINCIONES ESPECIALES• El procedimiento

para la realización de la tinción de cápsulas es el mismo que se ha explicado para la tinción negativa. 

• Las cápsulas aparecen rodeando a las células como estructuras sin teñir sobre un fondo oscuro .

TINCIONES ESPECIALES• Capsulas se alteran con el calor por eso

no se utiliza en la técnica de tinción

• La capsula no tiene afinidad con los colorantes ordinarios

• Capsulas se aprecian como un halo transparente alrededor de la celula.

GRACIAS