Explicación de TP Nº 3

Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR)

Química Biológica Patológica

Bioq. Mariana L. Ferramola2012

Definición de PCR

Es la amplificación enzimática de un fragmento de interés (DNA) localizado entre dos oligonucleótidos (cebadores).

Permite generar cantidades ilimitadas de una secuencia de interés.

Componentes del sistema de PCR

ADN molde

Oligonucleótidos (cebadores o primers)

Polimerasa termoestable

Solución buffer

dNTPs (dATP; dCTP; dTTP; dGTP)

Máster Mix

Componentes del sistema de PCR: ADN molde

El ADN molde puede ser de cadena sencilla o doble, circular o lineal. En caso de desear amplificar una secuencia de ARN

se debe utilizar primeramente una transcriptasa reversa.

Deben tenerse en cuenta los posibles contaminantes presentes en el ADN molde, que pudieran disminuir la eficiencia de reacción:

Urea SDS Acetato de sodio Agarosa Fenol

La cantidad de ADN molde a utilizar depende de la muestra de partida. Demasiada cantidad de ADN puede inhibir la reacción de PCR.

Componentes del sistema de PCR: ADN molde

Componentes del sistema de PCR: cebadores

Longitud de la región complementaria al ADN molde de entre 18-25pb.

Deben ser específicos. No deben presentar auto-complementariedad. No deben ser complementarios entre ellos. El contenido de G+C debe estar entre el 40-60%. El Tm de los oligos no debe diferir en más de 5ºC. La diferencia entre el Tm de los oligos y del amplicón no

debe superar los 10ºC. Su concentración debe ser de entre 0.1-1μM

(concentraciones excesivas pueden dar lugar a inespeficidad de amplificación).

Componentes del sistema de PCR: polimerasa termoestable

Las ADN polimerasas termoestables presentan las siguientes características:

Polimerizan en dirección 5’→ 3’.Necesitan de un extremo 3’-OH libre para comenzar la polimerización.Incorporan dNTPs por complementariedad en una cadena que sirve de molde.Necesitan la presencia de Mg para funcionar.Son capaces de resistir altas temperaturas por períodos considerables.

Componentes del sistema de PCR: polimerasa termoestable

ADN polimerasa Vida media (95ºC)

A) B) C)

Taq (Thermus aquaticus) 40 + - -

Vent (Thermococcus litoralis) 400 - + -

Pfu (Pyrococcus furiosus) 120 - + -

Tth (Thermus thermophilus) 20 + - +

A) Actividad exonucleasa 5’ → 3’.B) Actividad exonucleasa 3’ → 5’.

C) Actividad de transcriptasa inversa.

Existe una variedad de enzimas con características diferentes, según la finalidad de la PCR a realizar.

Componentes del sistema de PCR: solución buffer y MgCl

Se utiliza un buffer Tris-HCl, de pH 8,4 (tº amb).

La concentración de MgCl influye directamente en la actividad de la polimerasa, y es uno de los parámetros a ajustar:

Si la concentración de Mg2+ es deficiente, ↓ la eficiencia de la enzima.

Si la concentración de Mg2+ es excesiva, ↑ la polimerización inespecífica.

La concentración ideal de MgCl varía entre 0,5-5mM,

dependiendo de:

Conc de ADN molde de partida.

Conc. y longitud de cebadores.

Conc. de dNTPs.Long. del amplicón.

Componentes del sistema de PCR: dNTPs

Generalmente se utilizan concentraciones equimolares de los 4 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) en concentraciones que

varían entre 200 – 250 μM de c/u.

Concentraciones mayores a 4mM inhiben la PCR por quelación de Mg2+.

Protocolo típico de una reacción de PCR.

1º) Desnaturalización (94 – 95ºC; 5 min)2º) Desnaturalización (94 – 95ºC; 30 seg – 1 min)3º) Hibridación (tº específica para c/par de cebadores; 30 seg)4º) Elongación (72ºC; 30 seg – 3 min, dependiendo del tamaño del amplicón)5º) Elongación (72ºC, 5 min)

Los pasos 2, 3 y 4 constituyen un

ciclo de PCR y se repiten entre 25-

35 veces.

Etapas de un ciclo de PCR.

94ºC

Tm Primers

72ºC

(min)

Etapas de una PCR: Mezcla inicial

Etapas de un ciclo de PCR: Desnaturalización

Etapas de un ciclo de PCR: Hibridación

Etapas de un ciclo de PCR: Elongación

Reacción de PCR: esquema de amplificación exponencial

Pérdida de eficiencia de PCR

Factores que llevan a la pérdida de eficiencia de PCR

luego de varios ciclos:

Disminución de actividad de la polimerasa.

Disminución de la disponibilidad de dNTPs y

cebadores.Disminución de la

disponibilidad de Mg2+, para el funcionamiento de la

enzima.

[AD

N]

Nº de ciclo

Fase lag

Fase exponencial

Fase de meseta

Tipos de PCR.

• PCR-semicuantitativa• PCR-cuantitativa (PCR-en tiempo

real)• RT-PCR

• PCR-multiplex.• PCR-anidada.

• PCR-aleloespecífica.• PCR-mutagénesis dirigida.

PCR cuantitativa: PCR en Tiempo Real

Permite cuantificar el producto obtenido a partir de cada muestra mientras se lleva a cabo la amplificación.

El equipo se compone de un termociclador y un lector de fluorescencia, adosados a un equipo de recolección de datos (ordenador).

Para la cuantificación se establece un valor de corte

(valor umbral) de fluorescencia emitida por las muestras. Una muestra con mayor concentración inicial de ADN blanco necesitará menos ciclos para alcanzar

dicho valor umbral.

RT-PCR Se parte de una muestra de ARN. Se realiza primero una transcripción reversa, para obtener

DNA copia y luego se realiza la reacción de PCR.

PCR multiplex

Permite amplificar distintos blancos a la vez en una muestra. Se utilizan 2, 3 o más pares de cebadores.

PCR anidada Consiste en amplificar un blanco con un par de cebadores, y en

una reacción posterior amplificar una fracción interna del fragmento previamente amplificado.

Aumenta la especificidad de amplificación.

PCR alelo específica

Se diseñan cebadores que hibridan específicamente con el alelo wild type o con el mutado.

Permite la identificación de individuos que presenten dos alelos normales, de portadores de mutación, y de individuos con dos alelos mutados.

Mutagénesis dirigida por PCR

Consiste en introducir una modificación en la secuencia del amplicón obtenido mediante el diseño de un cebador que contenga dicha mutación.