Evidência sorológica de infecção por riquétsias do grupo da febre maculosa e ... ·...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA

Instituto de Ciências Biomédicas

Programa de Pós-Graduação em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Evidência sorológica de infecção por riquétsias do grupo da febre

maculosa e Rickettsia bellii em pequenos mamíferos na área

periurbana de Uberlândia, Minas Gerais.

Marcella Gonçalves Coelho

Uberlândia - MG

Fevereiro - 2013

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA

Instituto de Ciências Biomédicas

Programa de Pós-Graduação em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Evidência sorológica de infecção por riquétsias do grupo da febre

maculosa e Rickettsia bellii em pequenos mamíferos na área

periurbana de Uberlândia, Minas Gerais.

Dissertação apresentada ao Colegiado do

Programa de Pós-graduação em

Imunologia e Parasitologia Aplicadas

como requisito parcial para obtenção do

título de Mestre.

Marcella Gonçalves Coelho

Orientador: Prof. Dr. Matias Pablo Juan Szabó

Uberlândia - MG

Fevereiro - 2013

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Sistema de Bibliotecas da UFU, MG, Brasil. C672e 2013

Coelho, Marcella Gonçalves, 1990- Evidência sorológica de infecção por riquétsias do grupo da febre maculosa e Rickettsia bellii em pequenos mamíferos na área periurbana de Uberlândia, Minas Gerais / Marcella Gonçalves Coelho. -- 2013. 68 f. : il. Orientador: Matias Pablo Juan Szabó. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Uberlândia, Pro- grama de Pós-Graduação em Imunologia e Parasitologia Aplicadas. Inclui bibliografia. 1. Imunologia - Teses. 2. Parasitologia - Teses. 3. Rickettsioses em animais - Teses. 4. Febre maculosa - Teses. I. Szabó, Matias Pablo Juan. II. Universidade Federal de Uberlândia. Programa de Pós-Gradua-ção em Imunologia e Parasitologia Aplicadas. III. Título.

CDU: 612.017

Dedico este trabalho aos meus pais, Marcos e Valéria, ao meu irmão, Matheus, e ao meu namorado, Esdras. Com muito amor, carinho, e sabedoria, estão sempre ao meu lado, me apoiando e incentivando, em uma caminhada para o sucesso.

MUITO OBRIGADA!!!

Agradecimentos...Agradecimentos...Agradecimentos...Agradecimentos...

Primeiramente agradeço a Deus, Ele que me guiou por toda minha vida e neste trabalho, e me protegeu e afastou os perigos do trabalho em campo.

Aos meus pais, irmão e ao meu namorado, que são peças fundamentais na minha vida.

Ao professor Matias pela orientação na realização deste trabalho, auxiliando em todos os momentos, pelo exemplo de profissionalismo e pela oportunidade.

Aos colegas da turma de mestrado, que dividimos muitas risadas, alegrias, momentos de desesperos, e companheirismo, momentos que marcaram e que ajudaram a cada um a reconhecer que é capaz de superar desafios, e que nada é impossível.

Aos colegas do Laboratório de Ixodologia (LABIX), Vanessa, Monize, Jean, Vinícius, Marlene, Grazi, Carol, Tathi, Aline, Sarah, Ana Helena, Khelma, Adha, Elis, Jamile e Guilherme. Em especial a Vanessa que desde o início deste trabalho me auxiliou em todas as etapas, planejamento, campo e análise de dados; ao Jean pela parceria nas campanhas; e ao Vinícius e Carol, pela ajuda no campo.

Aos colegas do Laboratório de Ecologia de Mamíferos (LEMA), prof. Natália Leiner, Jenifer, Ana Letícia, Stefanny, Thomás, Gabriel, Graziella, que me receberam de “braços abertos”, pela parceria em diversas campanhas na Fazenda do Glória e na Reserva do Panga, e empréstimo de algumas armadilhas.

Ao pessoal do Centro de Controle de Zoonoses de Uberlândia que me ajudou no trabalho de campo, Jean, Lázaro, Joel, Darci, Amaral e Luís. E a Cristiane, Elenice e Alcides, que me receberam no Laboratório de Sorologia.

A professora Elba, ao Alex, Sócrates Neto, João e Joaquim, do Laboratório de Hantaviroses e Rickettsioses, e Laboratório de Biologia e Parasitologia de

Mamíferos Silvestres Reservatórios do Instituto Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), na parceria das campanhas de captura dos pequenos mamíferos.

Ao pessoal do Laboratório de Doenças Parasitária da Universidade de São Paulo (VPS-USP) pelo auxílio no laboratório e o fornecimento de antígenos de Rickettsia sp.. Em especial ao professor Marcelo Labruna, Jonas, Amália, Tatiana e a Júlia. Aos laboratórios de Imunoparasitologia, Biologia Molecular e o Laboratório do Centro de Referência Nacional em Hanseníase pela utilização dos equipamentos em diversas etapas do estudo.

Às secretárias da Pós-graduação, Lucélia e Lucileide. Obrigada por tudo, pela orientação nas burocracias, na solução de problemas e pelo apoio.

A CAPES pela concessão da bolsa de Mestrado, e ao CNPq e FAPEMIG (Rede Mineira) pelo apoio financeiro aos projetos vinculados.

A todos que de alguma forma contribuíram para este trabalho, e a todas as dificuldades que enfrentei, elas foram o degrau para meu crescimento.

Obrigada!!!Obrigada!!!Obrigada!!!Obrigada!!!

LISTA DE ABREVIAÇÕES

BOD Demanda biológica de oxigênio

BSF Brazilian Spotted Fever

CEUA Comissão de Ética na Utilização de Animais

FITC Fluoresceína isotiocianato

FMB Febre Maculosa Brasileira

g gravidade

G1 grupo 1

G2 grupo 2

IBAMA Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais

Renováveis

IgG Imunoglobulina G

mL mililitro

MSF Mediterranean Spotted Fever

PAIRS possível antígeno indutor da reação sorológica

PBS solução salina tamponada com fosfato

RIFI reação de imunofluorescência indireta

RMSF Rocky Mountain Spotted Fever

GFM Grupo da Febre Maculosa (Spotted Fever Group)

SISBIO Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade

TG Grupo Tifo (Typhus Group)

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Localização geográfica do município de Uberlândia, MG. A) Brasil, em destaque o estado de Minas Gerais. B) Município de Uberlândia em destaque. ........................................ 23

Figura 2. Locais de captura de pequenos mamíferos e de coleta de carrapatos, no município de Uberlândia, MG, 2011-2012. ............................................................................................... 25

Figura 3. Brinco de identificação do roedor. ........................................................................... 27

Figura 4. Coleta de sangue por punção da veia caudal............................................................ 27

Figura 5. Vistoria do roedor a procura de carrapatos fixados (esquerda). Carrapatos fixados no roedor (direita) (Uberlândia, MG, 2011-2012). ................................................................... 30

Figura 6. Coleta de carrapatos no ambiente por arraste (Uberlândia, MG, 2011-2012). ........ 30

Figura 7. Distribuição de pequenos mamíferos soropositivos para Rickettsia spp. do grupo da febre maculosa e R. bellii, e possível antígeno indutor da reação sorológica (PAIRS), no município de Uberlândia, de julho de 2011 a agosto de 2012. ................................................. 40

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Disposição das armadilhas, localização e tipo de vegetação nos locais de captura de pequenos mamíferos e de coleta de carrapatos, entre os meses de julho de 2011 a agosto de 2012, no município de Uberlândia, MG. .................................................................................. 24

Tabela 2. Cronograma, número de armadilhas usadas por campanha e o esforço amostral, nas campanhas de capturas de pequenos mamíferos realizadas entre os meses de julho de 2011 a agosto de 2012, no município de Uberlândia, MG. .................................................................. 28

Tabela 3. Número, prevalência e intensidade média de carrapatos por espécie de hospedeiros, capturados e recapturados de julho de 2011 a agosto de 2012, no município de Uberlândia, MG. ........................................................................................................................................... 35

Tabela 4. Número de carrapatos por espécie de hospedeiros capturados e recapturados de julho de 2011 a agosto de 2012, no município de Uberlândia, MG. ........................................ 36

Tabela 5. Relação das espécies de carrapatos por espécie de pequenos mamíferos capturados e recapturados de julho de 2011 a agosto de 2012, no município de Uberlândia, MG. ........... 37

Tabela 6. Carrapatos coletados no ambiente nos locais de captura de pequenos mamíferos entre os meses de dezembro de 2011 a agosto de 2012, no município de Uberlândia, MG. ... 38

Tabela 7. Percentual de amostras de soro reativas para Rickettsia spp. do grupo da febre maculosa e Rickettsia bellii em pequenos mamíferos capturados de julho de 2011 a agosto de 2012 no município de Uberlândia, MG. ................................................................................... 41

Tabela 8. Relação do possível antígeno indutor da reação sorológica (PAIRS) com as espécies de pequenos mamíferos capturados de julho de 2011 a agosto de 2012 no município de Uberlândia, MG. .................................................................................................................. 41

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 14

2. OBJETIVOS .................................................................................................................... 21

2.1. Geral ........................................................................................................................... 21

2.2. Específicos ................................................................................................................. 21

3. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................... 23

3.1. Área de estudo ........................................................................................................... 23

3.2. Captura de pequenos mamíferos ................................................................................ 26

3.3. Coleta de carrapatos ................................................................................................... 29

3.4. Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para detecção de anticorpos anti-riquétsias em roedores e marsupiais ..................................................................................... 31

3.5. Licenças ..................................................................................................................... 32

4. RESULTADOS ................................................................................................................ 34

4.1. Roedores silvestres e marsupiais capturados ............................................................. 34

4.2. Carrapatos coletados .................................................................................................. 34

4.3. Sorologia para riquétsias ............................................................................................ 39

5. DISCUSSÃO .................................................................................................................... 43

6. CONCLUSÕES ............................................................................................................... 49

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 51

APÊNDICE ............................................................................................................................. 62

Apêndice 1. Fotos dos carrapatos coletados no ambiente e nos pequenos mamíferos capturados no município de Uberlândia, MG, 2011-2012. ................................................... 63

Apêndice 2. Título de anticorpos contra riquétsias do grupo da febre maculosa e Rickettsia

bellii, e possível antígeno indutor da reação sorológica (PAIRS) em marsupiais do município de Uberlândia, MG, 2011-2012. .......................................................................... 64


bellii, e possível antígeno indutor da reação sorológica (PAIRS) em pequenos roedores do município de Uberlândia, MG, 2011-2012. .......................................................................... 65

ANEXO .................................................................................................................................... 67

Anexo 1. Parecer CEUA ....................................................................................................... 68

RESUMO

Riquetsiose é uma doença causada em humanos por bactérias do gênero Rickettsia, e tem

como principais vetores os carrapatos, que são considerados também reservatórios de

riquétsias do grupo da febre maculosa no Brasil. Frequentemente os estágios imaturos de

carrapatos vetores de riquetsioses têm pequenos mamíferos como hospedeiros, e sabe-se que

algumas espécies de pequenos mamíferos são hospedeiros amplificadores para Rickettsia sp..

O objetivo deste trabalho foi determinar a sororreatividade contra cinco espécies de riquétsias

e a fauna de carrapatos de pequenos mamíferos na região periurbana de Uberlândia, MG,

Brasil. Foram capturados, entre julho de 2011 a agosto de 2012, 416 animais representando

13 espécies de roedores silvestres e marsupiais. Destes, 48 estavam infestados com carrapatos

dos gêneros Amblyomma e Ixodes, e 70 (16,8%) dos animais foram soropositivos para

Rickettsia spp.. Nossos resultados indicam a circulação de quatro espécies de riquétsias, R.

rickettsii, R. parkeri, R. rhipicephali e R. bellii, próximo à área urbana do município de

Uberlândia. As duas primeiras espécies são consideradas patogênicas ao homem,

evidenciando a necessidade de se realizar uma investigação mais minuciosa tanto para a

confirmação das espécies de bactérias circulantes, quanto para a compreensão do ambiente

que mantém as riquétsias nos locais de detecção.

Palavras-chave: Rickettsia, pequenos mamíferos, carrapatos, sorologia, Uberlândia

ABSTRACT

Rickettsiosis is a human disease caused by bacteria of the genus Rickettsia, and its main

vector ticks (Ixodidae), which are also considered reservoirs of the Spotted Fever Group

rickettsiae in Brazil. Small mammals are frequent hosts for immature stages of rickettsial

diseases vector ticks, and it is known that some species of small mammals are hosts amplifiers

for Rickettsia sp..The aim of this study was to determine seropositivity against five species of

Rickettsia and tick fauna of small mammals captured in periurban region of Uberlândia, MG,

Brazil. For this purpose, 416 small mammals representing 13 species of wild rodents and

marsupials were captured between the months of July 2011 to August 2012. Of these, 48 were

infested with ticks of the genus Amblyomma and Ixodes, and 70 (16.8%) of the animals were

seropositive for Rickettsia spp.. Our results indicate the circulation of four species of

Rickettsia, R. rickettsii, R. parkeri, R. rhipicephali and R. bellii, in the periurban area of

Uberlândia. The first two Rickettsia species are considered pathogenic to man and thus a more

thorough investigation to confirm the species of bacteria and epidemiological aspects related

to these Rickettsia spp. is the detection locations.

Keywords: Rickettsia, small mammals, ticks, serology, Uberlândia

13

Introdução

14

1. INTRODUÇÃO

Riquétsias são bactérias gram negativas e parasitos intracelulares obrigatórios,

pertencentes à classe Alphaproteobacteria, família Rickettsiaceae, e representam potencial

risco à saúde humana (GILLESPIE et al., 2008; SCHORN et al., 2011), pois muitas espécies

são patogênicas ao homem (GEHRKE et al., 2009; ROZENTAL et al., 2009). O gênero

Rickettsia é subdividido em dois grupos principais, o grupo da febre maculosa (GFM)

(“Spotted Fever Group” - SFG) e grupo tifo (TG – “Typhus Group”), além de duas espécies

genética e antigenicamente distintas destes grupos, R. bellii e R. canadensis (LABRUNA et

al., 2007; FOURNIER, RAOULT, 2009).

O GFM é o grupo de maior importância para saúde pública, sendo que muitas

espécies são patogênicas ao homem e ocasionam infecções de brandas a letais conhecidas

como riquetsioses (GEHRKE et al., 2009; ROZENTAL et al., 2009). De forma geral,

riquetsiose é uma doença transmitida para o ser humano por meio da picada do carrapato

infectado com riquétsia, e caracteriza-se por quadro clínico composto de cefaléia, febre,

erupções com manchas e formação de pápulas, agravando para hemorragia e disfunção

múltipla dos órgãos (RYDKINA, 1999; ANGERAMI et al., 2009).

Entre os principais agentes etiológicos de riquetsioses, podemos citar a R. conorii, o

agente causador da Febre Maculosa do Mediterrâneo (MSF - Mediterranean Spotted Fever )

(LEVIN, KILLMASTER, ZEMTSOVA, 2012) e R. rickettsii, a espécie mais patogênica e

causadora da Febre Maculosa das Montanhas Rochosas (“Rocky Mountain Spotted Fever” -

RMSF) ou Febre Maculosa Brasileira (FMB) (“Brazilian Spotted Fever” - BSF). Em verdade

o agente da RMSF é o mesmo da FMB, a diferença entre as duas reside nas espécies de

carrapatos envolvidas na transmissão da bactéria e o local de ocorrência; a primeira na

15

América do Norte e a segunda, no Brasil (GUEDES et al., 2005; GEHRKE et al., 2009;

LABRUNA, 2009; ROZENTAL et al., 2009).

Riquétsias do GFM tem como principal vetor e reservatório no Brasil, os carrapatos

pertencentes à família Ixodidae, com destaque para o gênero Amblyomma (LABRUNA, 2009;

SABATINI et al., 2010). A exemplo, os carrapatos vetores da R. rickettsii são variados,

diferindo de acordo com a área geográfica que habitam. Na América do Sul, em especial a

região sudeste do Brasil, o vetor mais importante é o Amblyomma cajennense (popularmente

conhecido como “carrapato-estrela”), (GUEDES et al., 2005; LABRUNA, 2009;

ANGERAMI et al., 2009), enquanto na região da grande São Paulo, o Amblyomma

aureolatum é o principal vetor (LABRUNA, 2009).

Os carrapatos tem importante papel na manutenção da Rickettsia no ambiente

selvagem, sendo que a infecção nos carrapatos por esta bactéria é transmitida para outras

gerações pela transmissão transovariana, e de um estágio para outro pela transmissão

transestadial. Estes dois tipos de transmissão possibilitam a infecção de diversas gerações e

em todos os estágios (DEL FIOL et al., 2010). Outro modo de transmissão é a horizontal,

quando o carrapato ao parasitar hospedeiro com riquetsemia, se infecta (GILLESPIE et al.,

2008; TIJSSE-KLASEN et al., 2011).

Entretanto, vários estudos no sudeste brasileiro demonstram a baixa prevalência de

infecção de populações de carrapatos por R. rickettsii. A espécie A. cajennense demonstra ser

parcialmente refratária a infecção por R. rickettsii, no estudo Guedes e colaboradores (2005) a

população deste carrapato apresentou taxa de infecção em torno de 1%, e outro estudo, uma

amostra com 3.545 espécimes, nenhum A. cajennense estava infectado (PACHECO et al.,

2009). Outro exemplo é a patogenicidade de R. rickettsii ao carrapato vetor A. aureolatum,

este é um vetor eficiente na transmissão da FMB, sendo que a manutenção da infecção por R.

rickettsii neste vetor se mantém por até quatro gerações por meio da transmissão transestadial

16

e transovariana, porém, a infecção interfere na sobrevivência e desempenho reprodutivo das

fêmeas infectadas (LABRUNA et al., 2011).

Outro elemento envolvido na manutenção da Rickettsia no ambiente é o hospedeiro

vertebrado, por atuar como amplificador da taxa de infecção de carrapatos durante a

riquetsemia. Neste período de alguns dias, o hospedeiro amplificador infecta muitos

carrapatos, permitindo a transmissão horizontal (LABRUNA, 2009; LABRUNA et al., 2011).

Segundo Labruna (2009), para serem considerados hospedeiros amplificadores de riquétsias

os hospedeiros devem atender a cinco requisitos: o hospedeiro vertebrado deve ser abundante

na área de endemicidade da Rickettsia; ser hospedeiro para o carrapato vetor; ser susceptível a

Rickettsia spp.; desenvolver a riquetsemia a um grau que possibilite a infecção dos carrapatos

que o parasitar; e por fim, que suas crias não sejam resistentes a primeira infecção por

riquétsia.

Os hospedeiros vertebrados que funcionam como amplificadores, também influenciam

na distribuição das espécies de vetores, por exemplo, o hospedeiro amplificador sabidamente

conhecido para R. rickettsii é a capivara, sendo este parasitado, principalmente, por carrapatos

da espécie A. cajennense e Amblyomma dubitatum (LABRUNA, 2009).

Pequenos roedores são muitas vezes considerados hospedeiros sentinelas por terem o

contato com Rickettsia spp. e soroconverterem, mas seu papel como potencial amplificador

deve ser investigado (FRANKE et al., 2010; SCHEX et al., 2011) considerando a grande

diversidade de espécies e a ixodofauna associada, pois sabe-se que na América do Norte

algumas espécies de pequenos roedores são hospedeiros amplificadores para R. rickettsii, a

exemplo Microtus pennsylvanicus, Pitymus pinetorum, Peromyscus leucopus e Sigmodon

hispidus (BURGDORFER, FRIEDHOFF, LANCASTER JR, 1966; BURGDORFER, 1977).

Estes pequenos mamíferos são hospedeiros importantes para os estágios imaturos de diversas

17

espécies de carrapatos, notadamente do gênero Ixodes spp. e Amblyomma spp. (LABRUNA,

2009; FRANKE et al., 2010; GUGLIELMONE, NAVA, 2011).

A FMB é considerada uma doença reemergente, com os primeiros relatos em 1920,

posterior queda na década de 50, e acentuado registro da patogenia a partir da década de 80.

Entretanto, a classificação de doença reemergente deve ser vista com cautela, uma vez que as

notificações de casos de febre maculosa no Brasil se tornaram obrigatórias a partir do ano

2001, além da disponibilidade de técnicas diagnósticas mais sensíveis e específicas

colaborarem com o aumento no reconhecimento de casos antes não diagnosticados

(LABRUNA, 2009). A detecção de anticorpos reativos contra Rickettsia spp. é uma

metodologia de diagnóstico amplamente utilizada por ser de baixo custo, e permite determinar

a circulação de espécies de riquétsias em uma dada região através do inquérito sorológico em

hospedeiros sentinelas (SAITO et al., 2008).

Até o ano 2000, R. rickettsii era a única espécie do GFM conhecida na América do

Sul, posteriormente sete novas espécies foram descritas, sendo algumas patogênicas como a

R. felis, R. parkeri, e R. massiliae (LABRUNA, 2009). A atual atenção a estas espécies se

deve à descoberta recente de sua patogenicidade (LABRUNA et al., 2011). Exemplo disso foi

o relato do primeiro caso de doença humana causada por R. parkeri nos Estados Unidos em

2004, seis décadas após o seu isolamento no carrapato Amblyomma maculatum (PADDOCK

et al., 2004). Recentemente foi relatado no Brasil um caso de infecção humana por R. parkeri

(SPOLIDORIO et al., 2010) e, há a suspeita de que esta espécie seja o agente etiológico de

inúmeros casos de febre maculosa mais branda (não letal) no sul do país (ANGERAMI et al.,

2009). A infecção por R. parkeri é caracterizada pela escara de inoculação “tache noir”,

linfadenopatia, febre e úlceras na mucosa oral (SILVA et al., 2011).

Outra espécie constantemente detectada é a R. bellii, sua ocorrência é relatada no

Brasil e na Argentina tendo diversas espécies de carrapatos como vetores (LABRUNA, 2009),

18

em El Salvador infectando Amblyomma sabanerae (BARBIERI, ROMERO, LABRUNA,

2012) e no Peru em Amblyomma varium (OGRZEWALSKA et al., 2012). Rickettsia bellii é

espécie com patogenicidade desconhecida para os hospedeiros vertebrados e carrapatos, e

apresenta alta taxa de transmissão transovariana e transestadial (HORTA et al., 2006). Sua

importância está na coinfecção dos carrapatos com riquétsias patogênica, pois R. bellii parece

interferir no mecanismo de transmissão destas riquétsias e, consequentemente no

estabelecimento de infecções por espécies patogênicas (BURGDORFER, 1988; MACALUSO

et al., 2002).

Duas outras espécies de riquétsias são ainda pouco conhecidas quanto a

patogenicidade para humanos e animais, R. rhipicephali e R. amblyommii. Ambas foram

descritas no Brasil, e R. amblyommii encontra-se também na Argentina e Guiana Francesa.

Altas taxas de infecção destas espécies são encontradas no vetor, sugerindo possíveis espécies

não patogênicas para carrapatos (LABRUNA, 2009). Com relação à doença humana não há

relato de casos de infecção humana, porém, há dúvidas sobre a patogenicidade da R.

amblyommii ao homem (NICHOLSON, MASTERS, WORMSER, 2009).

A saber, nenhuma pesquisa com riquétsias foi realizada na região do Triângulo

Mineiro, que está localizada em Minas Gerais, o 2º estado com maior número de casos de

Febre Maculosa no Brasil entre 1997 a 2011 de acordo com o Sistema de Informação de

Agravos de Notificação do Ministério da Saúde (2011). E a forma mais abrangente para se

iniciar uma investigação neste contexto é avaliar a sororreatividade de hospedeiros

importantes, para se definir a possível circulação e regiões afetadas.

Neste trabalho, a infecção por riquétsias em pequenos mamíferos da região periurbana

de Uberlândia, Minas Gerais, foi investigada através da detecção de anticorpos e titulação dos

níveis séricos por meio de testes sorológicos. Este trabalho é justificado pela noção de que

pequenos mamíferos são hospedeiros importantes para os estágios imaturos dos carrapatos,

19

especialmente dos gêneros Ixodes spp. e Amblyomma spp. (LABRUNA, 2009; FRANKE et

al., 2010; GUGLIELMONE, NAVA, 2011), e ao fato de serem hospedeiros amplificadores

para riquétsias nos EUA (BURGDORFER, FRIEDHOFF, LANCASTER JR, 1966;

Burgdorfer, 1977). Além disso, carrapatos são os principais vetores e reservatórios no Brasil

para riquétsias do GFM, com destaque para o gênero Amblyomma (LABRUNA, 2009;

SABATINI et al., 2010). Finalmente sabe-se que em áreas periurbanas a ação antrópica pode

acidentalmente favorecer a circulação de determinadas espécies de patógenos, hospedeiros e

vetores (COMER, PADDOCK, CHILDS, 2001).

20

Objetivos

21

2. OBJETIVOS

2.1. Geral

Avaliar a sororreatividade contra riquétsias e a fauna de carrapatos de pequenos mamíferos

na região periurbana de Uberlândia, MG, Brasil.

2.2. Específicos

- Avaliar a sororreatividade de marsupiais e pequenos roedores da região peri-urbana de

Uberlândia, Minas Gerais, contra antígenos de R. rickettsii, R. parkeri, R. rhipicephali, R.

amblyommii e R. bellii.

- Identificar as espécies de carrapatos e possíveis vetores de riquétsias nos pequenos

mamíferos da região periurbana de Uberlândia, Minas Gerais.

22

Materiais & Métodos

23

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Área de estudo

O estudo foi realizado no município de Uberlândia (18° 54′S e 48° 15’O), estado de

Minas Gerais, sudeste do Brasil (Figura 1). Esta região é caracterizada por clima tropical com

duas estações bem definidas (verão quente/úmido e inverno frio/seco) e vegetação

característica de cerrado (IBGE, 2010). A coleta de material foi realizada em nove locais do

município, no entorno da área urbana, com vegetação caracterizada por Cerrado nativo

(RIBEIRO, WALTER, 2008) e áreas com alterações antrópicas (Tabela 1; Figura 2).

Figura 1. Localização geográfica do município de Uberlândia, MG. A) Brasil, em destaque o estado de Minas Gerais. B) Município de Uberlândia em destaque.

A) B)

24

Tabela 1. Disposição das armadilhas, localização e tipo de vegetação nos locais de captura de pequenos mamíferos e de coleta de carrapatos, entre os meses de julho de 2011 a agosto de 2012, no município de Uberlândia, MG.

Grupo* Local de captura Coordenadas geográficas

Vegetação

G1 (Grade)

Fazenda do Glória 18° 57’S 48° 12’O Interior da Mata Seca Semidecídua.

Reserva do Panga 19° 09’S 48° 23’O Cerrado sentido restrito.

G2 (Transecto)

Fazenda do Glória 18° 57’S 48° 12’O Borda da Mata Seca Semidecídua.

Fazenda Veadinho 18° 57’S 48° 03’O Área com plantação de capim e

cana-de-açúcar.

Fazenda da Fernanda 18°57’S 48°04’O Mata Seca Semidecídua.

Instituto Federal 18°46’S 48° 17’O Borda de Mata Seca Semidecídua e

plantação de cana-de-açúcar.

Chácaras Eldorado 18°59’S 48°26’O Área com braquiaria próxima a

domicílios e a represa.

Chácara Bálsamo 19°01’S 48°11’O Vereda

Condomínio Morada do Sol 18°53’S 48°21’O Mata Seca Semidecídua.

Estrada para Campo Florido 19°00’S 48°19’O Cerrado sentido restrito.

* Os grupos 1 e 2 apresentam metodologia diferentes Caracterização da vegetação de acordo com Ribeiro e Walter (2008).

25

Figura 2. Locais de captura de pequenos mamíferos e de coleta de carrapatos, no município de Uberlândia, MG, 2011-2012. a) Fazenda do Glória; b) Reserva do Panga; c) Fazenda Veadinho; d) Fazenda da Fernanda; e) Instituto Federal; f) Chácaras Eldorado; g) Chácara Bálsamo; h) Condomínio Morada do Sol; i) Estrada para Campo Florido. (Fonte: a,c,d, h: Marcella G. Coelho; e,f, g,i: Jean E. Limongi; b: Gabriel P. Lopes)

a c

d e f

g h i

b

26

3.2. Captura de pequenos mamíferos

As campanhas para capturas dos pequenos mamíferos foram realizadas de julho de

2011 a agosto de 2012 em nove localidades no entorno do município de Uberlândia, estas

localidades foram divididas em dois grupos, grupo 1 (G1) e grupo 2 (G2), de acordo com a

disposição das armadilhas no espaço, em grade ou transecto (Tabela 1). Nas localidades do

grupo 1 (Fazenda do Glória e a Reserva do Panga) as armadilhas de captura foram dispostas

em grade (grid), e nas localidades do grupo 2 (Fazenda do Glória, Fazenda Veadinho,

Fazenda da Fernanda, Instituto Federal, Chácaras Eldorado, Chácara Bálsamo, Condomínio

Morada do Sol e Estrada para Campo Florido) foram dispostas em transectos lineares,

totalizando um esforço de captura de 8840 armadilhas x noite (Tabela 2).

Na Fazenda do Glória e a Reserva do Panga, as armadilhas foram dispostas em grades

com 40 e 35 estações de captura, respectivamente, por 4 noites consecutivas. Cada estação era

constituída por duas armadilhas do tipo Sherman, a menor (25 x 8 x 9 cm) era colocada na

árvore a aproximadamente 1,5 metros do solo, e a maior (31 x 8 x 9 cm) no solo. Nas

localidades do grupo 2 as armadilhas foram dispostas em transectos lineares com 20 estações

e uma armadilha por estação, durante 5 noites consecutivas. Nos transectos havia 5

armadilhas do tipo Tomahawk (40 x 12 x12 cm) e 15 do tipo Sherman (30 x 7 x 9 cm).

Para as capturas as armadilhas foram iscadas com massa constituída de banana, paçoca

(doce de amendoim) e aveia, com reposição diária. Os animais capturados foram colocados

em sacos de tecido de algodão e anestesiados com associação anestésica 9:1 de cetamina

(Cloridrato de Cetamina 10% - Syntec) e acepran (Acepromazina 1% - Vetnil) na dosagem de

0,005 mL para cada 10 gramas do peso corpóreo. Sob efeito anestésico os pequenos

mamíferos foram identificados com base em caracteres morfológicos externos (BONVICINO,

DE OLIVEIRA, D’ANDREA, 2008) e marcados com brincos de identificação para permitir

27

seu reconhecimento no caso de recaptura (Figura 3). Foram coletados dos animais 0,5 a 1 ml

de amostras de sangue por punção da veia caudal ou punção cardíaca (Figura 4), após a

retração do coágulo, as amostras foram centrifugadas a 5000 g por 10 minutos e o soro

transferido para outro tubo e armazenado a -20ºC até o uso. No caso de animais recapturados

somente a primeira amostra de sangue foi analisada.

Os animais do grupo 1 eram soltos nas estações de captura após a recuperação da

anestesia, ao passo que todos os animais do grupo 2 foram sacrificados e enviados para o

Museu Nacional da UFRJ (Universidade Federal do Rio de Janeiro).

Figura 3. Brinco de identificação do roedor.

Figura 4. Coleta de sangue por punção da veia caudal.

28

Tabela 2. Cronograma, número de armadilhas usadas por campanha e o esforço amostral, nas campanhas de capturas de pequenos mamíferos realizadas entre os meses de julho de 2011 a agosto de 2012, no município de Uberlândia, MG.

Grupo Área Número de armadilhas/campanha

Esforço amostral (armadilhas x noite)

2011 2012 Jul Ago Set Out Nov Dez Jan Fev Mar Abr Maio Jun Jul Ago

G1 (grade)

Fazenda do Glória 80 - 80 - 80 80 80 80 80 80 80 - - - 2880

Reserva do Panga - - - - - 70 70 70 70 - - 70 - - 1400

G2 (transecto)

Fazenda do Glória - - - - - 40 - - 20 - - - - 20 400

Fazenda Veadinho - - - - - 60 - - 40 - - - - 40 700 Fazenda da Fernanda - - - - - 20 - - 20 - - - - 20 300

Instituto Federal - - - - - 40 - - 20 - - - - 20 400

Chácaras Eldorado - - - - - - - - 40 - - - - 40 400 Chácara Bálsamo - - - - - 40 - - 40 - - - - 40 600

Condomínio Morada do Sol - - - - - 40 - - - - 60 - - - 680

Estrada para Campo Florido - - - - - 40 - - 40 - 60 - - 40 1080

Total

8840

28

29

3.3. Coleta de carrapatos

Os roedores e marsupiais capturados foram minuciosamente examinados e seus

carrapatos coletados com pinça (Figura 5). Carrapatos ainda pouco alimentados foram

armazenados em álcool isopropílico, e aqueles ingurgitados foram mantidos vivos em estufa

BOD a 27°C, umidade relativa de, aproximadamente, 80% e fotoperíodo de 12/12h, para

sofrerem ecdise. Este procedimento visou à obtenção de ninfas ou adultos de carrapatos, para

as quais existem chaves de identificação (ONOFRIO et al., 2006a; ONOFRIO et al., 2006b;

MARTINS et al., 2010). Na análise dos carrapatos estão incluídas amostras coletadas nos

animais recapturados, uma vez que o intuito maior era conhecer a diversidade de espécies de

vetores nos pequenos mamíferos da região periurbana de Uberlândia.

Carrapatos do ambiente foram coletados em todas as localidades do estudo, por arraste

(Figura 6) como descrito por Terassini et al. (2010), com flanelas claras de 1 x 2 m arrastadas

sobre a vegetação por 100 metros em trilhas, sempre no horário de 8 às 10 horas. Todos os

carrapatos coletados desta maneira foram armazenados em álcool isopropílico 100%.

30

Figura 5. Vistoria do roedor a procura de carrapatos fixados (esquerda). Carrapatos fixados no roedor (direita) (Uberlândia, MG, 2011-2012).

Figura 6. Coleta de carrapatos no ambiente por arraste (Uberlândia, MG, 2011-2012).

31

3.4. Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para detecção de anticorpos

anti-riquétsias em roedores e marsupiais

Para detecção e avaliação de títulos sorológicos de anticorpos anti-riquétsia, foi

realizada a reação de imunofluorescência indireta (RIFI). Utilizou-se antígenos de cinco

espécies de riquétsias isoladas no Brasil: R. rickettsii cepa Taiaçu, R. parkeri cepa At24, R.

amblyommii cepa Ac37, R. rhipicephali cepa HJ5, R. bellii cepa Mogi das Cruzes, em lâminas

recobertas com os antígenos conforme descrito por Labruna et al. (2007).

A RIFI foi realizada de acordo com trabalhos prévios (HORTA et al., 2004; LABRUNA

et al., 2007; PACHECO et al., 2007). De forma resumida, os soros diluídos a 1:64 em solução

salina tamponada com fosfato (PBS; pH 7,4) foram aplicados às lâminas contendo os

antígenos fixados e incubados por 30 minutos a 37°C em câmara úmida, seguida por duas

lavagens de 10 minutos com tampão de lavagem (PBS com Triton X-100). Após a secagem

das lâminas foi instilado conjugado apropriado, seguido de incubação a 37°C por 30 minutos.

Na sequência, as lâminas foram lavadas duas vezes por 10 minutos com tampão de lavagem

acrescido de Azul de Evans. Após a secagem, à temperatura ambiente e protegidas da luz,

recobriram-se as lâminas com glicerina tamponada (pH 9,0) e lamínula. A reação foi avaliada

sob microscópio de imunofluorescência (ZEISS – SCOPE A1) em aumento de 40x. Cada

lâmina preparada com soros teste era acompanhada de soros controle sabidamente positivo e

negativo. Os soros que foram considerados positivos (título ≥ 64) na triagem foram titulados.

Para isso, as amostras foram diluídas em série na razão dois e avaliadas por RIFI para

obtenção da maior diluição reativa, definindo o título daquele soro.

Considerando a diversidade de espécies de roedores capturados, todos os soros destes

animais foram testados na triagem com dois anticorpos secundários: 1- Anti-imunoglobulina

G de rato (conjugado anti-rato) (Sigma, IgG de cabra conjugado a FITC) e 2- Anti-

32

imunoglobulina G de camundongo (anti-camundongo) (Sigma, IgG de ovelha conjugado a

FITC), com exceção dos soros de Mus musculus que foram testados somente com conjugado

anti-camundongo. Na triagem, o conjugado de melhor reatividade foi considerado para a

titulação. Os soros dos marsupiais foram testados com anti-imunoglobulina G de gambá (IgG

de coelho conjugado a FITC) produzido pelo Centro de Controle de Zoonoses de São Paulo

(CCZ/SP).

3.5. Licenças

Os procedimentos descritos foram aprovados pela Comissão de Ética na Utilização de

Animais (CEUA) da Universidade Federal de Uberlândia (Nº 071/11) (Anexo 1). Licenças

para a captura dos pequenos mamíferos foram expedidas pelo Instituto Brasileiro do Meio

Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA) via Sistema de Autorização e

Informação em Biodiversidade (SISBIO), sob nº 22629-1 e nº 13373-1, e licença para coleta

de ixodídeos sob nº 10762-1.

33

Resultados

34

4. RESULTADOS

4.1. Roedores silvestres e marsupiais capturados

Com esforço amostral de 8840 armadilhas x noite, foram capturados 416 animais.

Destes, 48 são da ordem Marsupialia, representada por duas espécies; Didelphis albiventris e

Gracilinanus agilis; e 368 animais da ordem Rodentia, com uma espécie da subfamília

Murinae (Mus musculus) e dez espécies da subfamília Sigmodontinae (Calomys sp.,

Cerradomys sp., Euryoryzomys sp., Hylaeamys megacephalus, Necromys lasiurus, Nectomys

sp., Oecomys bicolor, Oligoryzomys sp., Oxymycterus sp., Rhipidomys macrurus).

4.2. Carrapatos coletados

Dos 416 mamíferos capturados, 48 estavam infestados (Tabela 3). Foram coletados

carrapatos em todos os estágios parasitários de animais capturados e recapturados na mesma

semana e em outras campanhas; 41 espécimes de larvas de Amblyomma sp. e 29 de Ixodes sp.,

destas haviam 5 ingurgitadas que sofreram ecdise, 13 espécimes de ninfas de A. dubitatum e

56 de Ixodes sp., das quais 14 ingurgitadas que sofreram ecdise foram identificadas como

Ixodes loricatus, e os seis adultos de Ixodes loricatus (Tabela 4 e 5).

Das nove localidades pesquisadas apenas cinco apresentaram carrapatos no ambiente,

totalizando 48 espécimes, sendo 29 larvas de Amblyomma sp., nove ninfas e dez adultos de A.

cajennense (Tabela 6).

Fotos dos carrapatos coletados nos hospedeiros e no ambiente encontram-se no

Apêndice 1.

35

Tabela 3. Número, prevalência e intensidade média de carrapatos por espécie de hospedeiros, capturados e recapturados de julho de 2011 a agosto de 2012, no município de Uberlândia, MG.

Ordem Espécie de mamíferos nº mamíferos capturados

nº mamíferos infestados*

nº carrapatos

Prevalência (%)

Intensidade média

Marsupialia Didelphis albiventris 8 3 19 37,5 6,3

Gracilinanus agilis 40 7 16 17,5 2,3

Rodentia Calomys sp. 32 0 0 - -

Cerradomys sp. 13 0 0 - -

Euryoryzomys sp. 1 0 0 - -

Hylaeamys megacephalus 35 21 47 60 2,2

Mus musculus 2 0 0 - -

Necromys lasiurus 166 4 4 2,4 1

Nectomys sp. 1 0 0 - -

Oecomys bicolor 11 0 0 - -

Oligoryzomys sp. 16 6 41 37,5 6,8

Oxymycterus sp. 5 0 0 - -

Rhipidomys macrurus 86 7 8 8,1 1,1

Total 416 48 135 11,54 2,8 * Os dados referem-se somente as capturas e recapturas mensais, os animais infestados e recapturados na mesma campanha não foram considerados para o cálculo de prevalência e intensidade média.

36

Tabela 4. Número de carrapatos por espécie de hospedeiros capturados e recapturados de julho de 2011 a agosto de 2012, no município de Uberlândia, MG.

Ordem Espécie N° capturados/ N° infestados*

N° de carrapatos

Estágio evolutivo

Larva Ninfa Adulto Marsupialia Didelphis albiventris 8/3 22 14 3 5

Gracilinanus agilis 40/7 19 12 6 1

Rodentia Calomys sp. 32/0 - - - -

Cerradomys sp. 13/0 - - - -

Euryoryzomys sp. 1/0 - - - -

Hylaeamys megacephalus 35/21 50 12 38 -

Mus musculus 2/0 - - - -

Necromys lasiurus 166/4 4 3 1 -

Nectomys sp. 1/0 - - - -

Oecomys bicolor 11/0 - - - -

Oligoryzomys sp. 16/6 41 24 17 -

Oxymycterus sp. 5/0 - - - -

Rhipidomys macrurus 86/7 9 5 4 -

Total 416/48 145 70 69 6 * Os dados referem-se aos animais capturados e recapturados na mesma campanha e em campanhas diferentes.

37

Tabela 5. Relação das espécies de carrapatos por espécie de pequenos mamíferos capturados e recapturados de julho de 2011 a agosto de 2012, no município de Uberlândia, MG.

Espécie de mamíferos

Número do

indivíduo

Larva Ninfa Adulto Ixodes

sp.† Amblyomma

sp.

Ixodes sp.

Ixodes

loricatus*

Amblyomma

dubitatum

Ixodes

loricatus

Amblyomma

dubitatum

D. albiventris 1

2

D. albiventris 1 ®

1

D. albiventris 1 ®

2

D. albiventris 1 ®

1

D. albiventris 2

1

D. albiventris 2 ®

1

D. albiventris 3

14

G.agilis 4 1

4

G.agilis 4 ® 3

G.agilis 5 2

1

G.agilis 5 ® 2

G.agilis 6

1

G.agilis 7 1

G.agilis 8 2

G.agilis 9 1

G.agilis 10

1

H. megacephalus 11

1

H. megacephalus 12

1

H. megacephalus 13

1

1

H. megacephalus 13®

1

H. megacephalus 14

2

H. megacephalus 14® 1

H. megacephalus 15 1

H. megacephalus 16

1

H. megacephalus 16 ®

1

H. megacephalus 17

1

H. megacephalus 18

1

H. megacephalus 19

1 1

H. megacephalus 20

2


1



11 1


1


H. megacephalus 23

2

H. megacephalus 24

1


2

H. megacephalus 26

1


38

Continuação Tabela 5.

† Todas as larvas coletadas, inclusive as larvas ingurgitadas que sofreram ecdise; * Ninfas de Ixodes sp. ingurgitadas que sofreram ecdise e foram identificadas com Ixodes loricatus; ® Recaptura.

Tabela 6. Carrapatos coletados no ambiente nos locais de captura de pequenos mamíferos entre os meses de dezembro de 2011 a agosto de 2012, no município de Uberlândia, MG.

Local de coleta Data Espécie Estágio evolutivo

Larva Ninfa Adulto Reserva do Panga fev/12 Amblyomma cajennense - - 3

Condomínio Morada do Sol fev/12 Amblyomma cajennense - - 2 Estrada para Campo Florido mar/12 Amblyomma cajennense - - 1

Reserva do Panga mar/12 Amblyomma cajennense - - 3 Reserva do Panga jun/12 Amblyomma cajennense - - 1 Fazenda do Glória ago/12 Amblyomma sp. 29 - - Fazenda Veadinho ago/12 Amblyomma cajennense - 9 -

Total 29 9 10


Número do

indivíduo

Larva Ninfa Adulto Ixodes

sp.† Amblyomma

sp.

Ixodes sp.

Ixodes loricatus*

Amblyomma

dubitatum

Ixodes loricatus

Amblyomma

dubitatum


2



H. megacephalus 31

1

N. lasiurus 32

1

N. lasiurus 33

1

N. lasiurus 34

1

N. lasiurus 35

1

Oligoryzomys sp. 36

2

Oligoryzomys sp. 37

1

Oligoryzomys sp. 38

1

Oligoryzomys sp. 39

9

Oligoryzomys sp. 40

1

Oligoryzomys sp. 41

23

4

R. macrurus 42 1

R. macrurus 43

2

R. macrurus 44 1

R. macrurus 45 1

R. macrurus 45 ® 1

R. macrurus 46

1

R. macrurus 47 1

R. macrurus 48

1

Total 29 41 42 14 13 6 0

39

4.3. Sorologia para riquétsias

Animais soropositivos foram encontrados em oito locais (Figura 7). Do total de 416

soros testados contra cinco antígenos de Rickettsia spp., 70 (16,8%) foram positivos para pelo

menos um antígeno, destes 19 (27,1%) são marsupiais e 51 (72,8%) roedores (Tabela 7). Das

amostras positivas, 46 (65,7%) foram reativas para uma espécie de Rickettsia sp., oito

(11,4%) para duas espécies, cinco (7,1%) para três e cinco espécies, e seis (8,6%) para as

quatro espécies de riquétsias testadas.

Para 37 animais soropositivos, foi definido o possível antígeno indutor da reação

sorológica (PAIRS), ou seja, soro com título pelo menos quatro vezes superior para uma

espécie de riquétsia frente a todas as outras testadas, sendo considerada reação homóloga para

este antígeno (Horta et al., 2004; Pacheco et al. 2007) (Apêndice 2 e 3). Nesta análise foram

detectados nove animais soropositivos para R. rickettsii, quatro para R. parkeri e R.

rhipicephali, e vinte para R. bellii (Tabela 8).

A sorologia dos roedores foi realizada com dois anticorpos secundários optando pelo de

melhor reatividade para a titulação. Dos 51 soros positivos, 28 foram titulados com conjugado

anti-rato e 23 com anti-camundongo.

40

Figura 7. Distribuição de pequenos mamíferos soropositivos para Rickettsia spp. do grupo da febre maculosa e R. bellii, e possível antígeno indutor da reação sorológica (PAIRS), no município de Uberlândia, de julho de 2011 a agosto de 2012. Fazenda do Glória (FG); Reserva do Panga (RP); Fazenda Veadinho (FV); Fazenda da Fernanda (FF); Instituto Federal (IF); Chácaras Eldorado (CE); Chácara Bálsamo (CB); Condomínio Morada do Sol (CMS); Estrada para Campo Florido (CF); Os números entre parênteses referem-se (Nº de animais capturados por área/ Nº de animais soropositivos por área); RND (Espécie de Rickettsia não definida).

(Fonte: Google Earth)

41

Tabela 7. Percentual de amostras de soro reativas para Rickettsia spp. do grupo da febre maculosa e Rickettsia bellii em pequenos mamíferos capturados de julho de 2011 a agosto de 2012 no município de Uberlândia, MG.

Ordem Espécie N° capturados/ N° soro positivo

Prevalência soros positivos (%)

Marsupialia Didelphis albiventris 8/3 37,5

Gracilinanus agilis 40/16 40

Rodentia Calomys sp. 32/1 3,1

Cerradomys sp. 13/4 30,8

Euryoryzomys sp. 1/1 100

Hylaeamys megacephalus 35/2 5,7

Mus musculus 2/0 -

Necromys lasiurus 166/18 10,8

Nectomys sp. 1/1 100

Oecomys bicolor 11/0 -

Oligoryzomys sp. 16/1 6,2

Oxymycterus sp. 5/3 60

Rhipidomys macrurus 86/20 23,2

Total 416/70 16,8 Tabela 8. Relação do possível antígeno indutor da reação sorológica (PAIRS) com as espécies de pequenos mamíferos capturados de julho de 2011 a agosto de 2012 no município de Uberlândia, MG.

Espécie de mamíferos N° soro positivo

PAIRS R.

rickettsii

R.

parkeri

R.

rhipicephali

R.

bellii RND

Didelphis albiventris 3 1 - - 2 - Gracilinanus agilis 16 - 1 1 9 5

Calomys sp. 1 - - - - 1

Cerradomys sp. 4 1 - - 1 2 Euryoryzomys sp. 1 - - - - 1

Hylaeamys megacephalus 2 - - 1 - 1 Mus musculus 0 - - - - -

Necromys lasiurus 18 4 1 1 1 11 Nectomys sp. 1 - - - - 1

Oecomys bicolor 0 - - - - - Oligoryzomys sp. 1 - 1 - - - Oxymycterus sp. 3 1 - 1 - 1

Rhipidomys macrurus 20 2 1 - 7 10 Total 70 9 4 4 20 33

RND: Espécie de Rickettsia não definida

42

Discussão

43

5. DISCUSSÃO

As infestações por carrapatos nos pequenos mamíferos observadas neste estudo foram

às esperadas, uma vez que dos D. albiventris capturados, três estavam parasitados por estágios

imaturos de Amblyomma sp. e adultos de I. loricatus. Estes achados corroboram com dados

anteriores que relatam marsupiais do gênero Didelphis como hospedeiros de estágios imaturos

do gênero Amblyomma (LABRUNA, 2009) e adultos de I. loricatus (SCHUMAKER et al.,

2000). A outra espécie de marsupial, G. agilis, estava infestada com imaturos de Ixodes sp.,

parasitismo já relatado anteriormente neste gênero (MARQUES et al., 2004), e um adulto de

I. loricatus, que se constitui no primeiro relato desta espécie de adulto de carrapato neste

hospedeiro.

Das 11 espécies de roedores silvestres capturados, quatro espécies estavam infestadas

por carrapatos (H. megacephalus, N. lasiurus, Oligoryzomys sp. e R. macrurus). Nestes

animais foram coletadas larvas de Ixodes spp. e Amblyomma spp., e ninfas de A. dubitatum e

Ixodes sp. Estes achados confirmam a importância de pequenos mamíferos como hospedeiros

para fases imaturas dos ixodídeos (MARQUES et al., 2004). A adequação destes hospedeiros

para o ciclo de vida dos carrapatos foi reforçada pela coleta de carrapatos ingurgitados ou

semingurgitados, e que em sua maioria, sofreram muda.

Merece menção também a ligação estabelecida entre roedores e marsupiais no ciclo de

vida de carrapatos; nos roedores foram encontradas larvas e ninfas de Ixodes sp. (algumas

identificadas como I. loricatus após sofrerem muda para adulto), e adultos de I. loricatus

foram coletados em marsupiais D. albiventris. Este fato reforça as observações de Nava e

Guglielmone (2012), os quais ressaltam que roedores e marsupiais compartilham o mesmo

habitat e, consequentemente, as mesmas espécies de carrapatos. Este compartilhamento de

44

carrapatos abre caminho para a transmissão de microorganismos de uma espécie hospedeira

para outra.

Capivara (Hydrochaeris hydrochaeris) é considerada hospedeiro amplificador do agente

da FMB, a R. rickettsii, em áreas endêmicas (LABRUNA, 2009; SOUZA et al., 2009). A

capivara é também hospedeiro primário para todos os estágios parasitários do carrapato A.

dubitatum. Entretanto de maneira geral, os estágios imaturos apresentam uma menor

especificidade, e como consequência alimentam-se também em outros hospedeiros

(LABRUNA, PINTER, TEIXEIRA, 2004). Em nosso trabalho, espécimes de A. dubitatum

foram coletados em pequenos mamíferos na Fazenda do Glória, onde há relatos da presença

de capivaras (ALVES, 2010), na Chácara Bálsamo, e nas Chácaras Eldorado.

Do carrapato A. dubitatum foram detectadas e/ou isoladas as riquétsias, R. belli, R.

parkeri e Rickettsia sp. cepa Pampulha (LABRUNA et al., 2004; HORTA et al., 2007;

PACHECO et al., 2009; ALMEIDA et al., 2011). Assim, podemos conjecturar que se esta

espécie de carrapato estiver infectada com Rickettsia spp. pode vir a participar do ciclo de

transmissão de riquétsias a outros hospedeiros. As observações em nosso trabalho das formas

imaturas de carrapatos A. dubitatum parasitando roedores sigmodontíneos e marsupiais, indica

a necessidade de estudos destes mamíferos na epidemiologia da FMB. O estudo destas

relações é importante principalmente em áreas endêmicas e onde há capivaras, pois não há

informação precisa sobre a origem das riquétsias que depois são amplificadas na infecção de

capivaras, para centenas a milhares de carrapatos (LABRUNA, 2009).

A presença de A. cajennense nos ambientes estudados é resultado que deve ser

analisado com cautela, já que esta espécie é considerada o principal vetor e também um

reservatório da R. rickettsii no Brasil, e seus estágios imaturos são muito agressivos ao ser

humano (ROZENTAL et al., 2009; LABRUNA, 2009). Apesar de ser o principal vetor para

R. rickettsii, o A. cajennense não é um bom hospedeiro para esta riquétsia, em consequência

45

da patogenicidade da bactéria aos carrapatos em que observa-se uma baixa prevalência da

bactéria em populações deste carrapato em áreas endêmicas no sudeste brasileiro

(LABRUNA, 2009; SOARES et al., 2011). Em nosso trabalho o parasitismo dos pequenos

mamíferos por A. cajennense não pôde ser comprovado. Não foi observada nenhuma ninfa

deste carrapato nos animais, porém não podemos descartar a infestação por larvas deste

carrapato em função da não identificação das espécies. Merece menção, entretanto, que nos

trabalhos em que se realizou a identificação de larvas e ninfas de pequenos mamíferos, após

alimentação em laboratório para obtenção das ninfas e adultos correspondentes, ou pela

identificação molecular, a infestação por A. cajennense sempre foi baixa (Ramos

comunicação pessoal). No conjunto estas observações sugerem a pequena participação de

pequenos roedores na alimentação e eventual infecção por riquétsias de imaturos de A.

cajennense, mesmo que o carrapato seja muito prevalente no ambiente.

Devido a grande diversidade de espécies de roedores capturadas, decidiu-se utilizar na

triagem dos soros, dois anticorpos secundários (anti-rato e anti-camundongo), optando pelo de

melhor reatividade para a titulação. Analisando a distância filogenética entre as espécies de

roedores capturadas com as espécies usadas na preparação dos anticorpos, Rattus rattus e Mus

musculus, verificamos que a distância filogenética é semelhante e, por isso, o uso de qualquer

um dos conjugados não influenciaria no resultados. Isso foi confirmado pelos 51 soros de

roedores positivos, destes 28 foram titulados com conjugado anti-rato e 23 com anti-

camundongo. Porém, em análise qualitativa das reações de imunofluorescência, o conjugado

anti-rato apresentou melhor reatividade.

Observou-se em nosso trabalho uma prevalência média de 16,8% na sororreatividade

contra riquétsias em pequenos mamíferos de Uberlândia. Ademais, animais sororeativos

foram capturados em oito das nove localidades estudadas, sugerindo uma distribuição ampla

de Rickettsia spp. na área periurbana de Uberlândia. A sororreatividade em pequenos

46

mamíferos contra Rickettsia spp. foi descrita em vários estudos e indica que estes vertebrados

são hospedeiros sentinelas (LABRUNA, 2009; MILAGRES et al., 2010), o que possibilita a

avaliação epidemiológica de uma área, e a estimativa do risco de infecção humana.

Infelizmente o teste sorológico RIFI não permite distinguir a espécie de riquétsia responsável

pela produção do anticorpo, devido à ocorrência de reação cruzada com os antígenos das

diversas espécies de riquétsias. Esta reação ocorre devido à presença de epítopos semelhantes

em diferentes espécies do gênero Rickettsia (SAITO et al., 2008), entretanto, os títulos de

anticorpos homólogos são mais elevados do que os títulos de anticorpos heterólogos. Por este

motivo, se o título de anticorpos contra determinada espécie de riquétsia for pelo menos

quatro vezes superior as demais, ela pode ser considerada a espécie homóloga e responsável

pela infecção que estimulou o sistema imune do hospedeiro (LA SCOLA, RAOULT, 1997;

HORTA et al., 2004).

Nestas condições nossos resultados indicam a circulação de quatro espécies de

riquétsias, R. rickettsii, R. parkeri, R. rhipicephali e R. bellii, próximo à área urbana do

município de Uberlândia (Figura 7). Dentre as riquétsias, a R. bellii foi a mais prevalente,

notadamente em marsupiais. Esta maior prevalência se justifica pela presença em nossa

amostragem de carrapatos, o A. dubitatum e I. loricatus, e hospedeiros marsupiais

sabidamente associados a transmissão e infecção por esta espécie de riquétsia (PACHECO et

al., 2009; SZABÓ et al., 2013 – no prelo).

Por outro lado, as espécies R. rickettsii e R. parkeri são consideradas patogênicas ao

homem (LABRUNA, 2009) e, por isso, sua presença na região deverá ser confirmada por

métodos moleculares ou isolamento. Porém deve-se ressaltar que, de forma geral os títulos de

anticorpos encontrados foram baixos na maioria das amostras, sugerindo infecções brandas ou

antigas, sem a presença de um foco ativo de multiplicação de riquétsias.

47

Pequenos mamíferos são de suma importância para ecologia de alguns patógenos, a

exemplo, para o Borrelia burgdorferi, o agente etiológico da Doença de Lyme. Levi e

colaboradores (2012) confirmaram o modelo teórico que ilustra a redução dos predadores de

pequenos mamíferos e, consequentemente, o aumento desta população, como fator de

influência direta no aumento de prevalência da Doença de Lyme, isso porque os pequenos

mamíferos são os hospedeiros para as fases imaturas do carrapato vetor da B. burgdorferi.

Esta importante participação dos pequenos mamíferos na cadeia de transmissão da B.

burgdorferi, nos alerta para uma investigação mais minuciosa por meio de técnicas

moleculares, para a confirmação das espécies de riquétsias circulantes no município, visto que

há espécies de roedores e marsupiais soropositivos para riquétsias e há carrapatos vetores

associados a estes mamíferos na área periurbana.

Portanto, a área periurbana, uma área que está em constante modificação devido à ação

antrópica, tem como resultado a aproximação do homem ao ambiente natural, da fauna e seus

patógenos. Neste cenário, há um desequilíbrio ecológico na relação parasito-hospedeiro

(Queirogas, 2010), o que favorece a transmissão acidental de patógenos ao homem. Neste

sentido, constante vigilância epidemiológica deve ocorrer no município de Uberlândia, para

que medidas preventivas possam ser definidas.

48

Conclusões

49

6. CONCLUSÕES

- Pequenos mamíferos da região de Uberlândia são infestados por larvas de Amblyomma

spp. e Ixodes spp., ninfas de A. dubitatum, Ixodes spp. e I. loricatus, e adultos de I. loricatus;

- Roedores e marsupiais soropositivos contra Rickettsia spp. foram detectados no

município de Uberlândia, com reação homóloga contra quatro espécies, R. rickettsii, R.

parkeri, R. rhipicephali e R. bellii;

- Amblyomma cajennense foi coletado no ambiente, resultado importante, visto que esta

espécie é considerada o principal vetor e também um reservatório da R. rickettsii no Brasil, e

seus estágios imaturos são muito agressivos ao ser humano;

- Este trabalho possibilitou conhecer a situação do município de Uberlândia com relação

à circulação de Rickettsia spp., sendo o passo inicial para mais estudos na região. E um alerta

as autoridades que devem manter constante vigilância epidemiológica.

50

Referências Bibliográficas

51

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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62

Apêndice

63

Apêndice 1. Fotos dos carrapatos coletados no ambiente e nos pequenos mamíferos capturados no município de Uberlândia, MG, 2011-2012.

Larva de Ixodes sp. (visão ventral) Ninfa de Ixodes sp. (visão dorsal e ventral)

Macho e fêmea Ixodes loricatus (visão dorsal e ventral)

Larva (esquerda) e ninfa (direita) de Amblyomma dubitatum (Visão dorsal e ventral)

Gnatossoma de uma ninfa de Amblyomma dubitatum (esquerda), e ninfa de Ixodes sp.

Macho e fêmea Amblyomma cajennense (visão dorsal e ventral)

64


bellii, e possível antígeno indutor da reação sorológica (PAIRS) em marsupiais do município de Uberlândia, MG, 2011-2012.


Título final por antígeno PAIRS R.

rickettsii

R.

parkeri

R.

amblyommii

R.

rhipicephali

R.

bellii

Didelphis albiventris 256 - - - - R. rickettsii

Didelphis albiventris - - - - 128 R. bellii

Didelphis albiventris 128 256 - - 1024 R. bellii

Gracilinanus agilis - 64 - - - * Gracilinanus agilis - - - - 64 * Gracilinanus agilis - - - - 128 R. bellii

Gracilinanus agilis - - - - 128 R. bellii

Gracilinanus agilis - - - - 64 * Gracilinanus agilis - - - - 128 R. bellii



Gracilinanus agilis - - - 128 - R. rhipicephali



Gracilinanus agilis - 64 - - - * Gracilinanus agilis - - - - 128 R. bellii

Gracilinanus agilis - - - - 64 * Gracilinanus agilis - - - - 128 R. bellii

Gracilinanus agilis 64 256 - - - R. parkeri

- : soro não reativo no título 64 ou superior * : Espécie de Rickettsia não definida

65


bellii, e possível antígeno indutor da reação sorológica (PAIRS) em pequenos roedores do município de Uberlândia, MG, 2011-2012.

Espécie de mamíferos Título final por antígeno

PAIRS R.

rickettsii

R.

parkeri

R.

amblyommii

R.

rhipicephali

R.

bellii

Calomys sp. - - - - 64 * Cerradomys sp. - - - - 128 R. bellii

Cerradomys sp. - - - - 64 * Cerradomys sp. 128 - - - - R. rickettsii

Cerradomys sp. 512 256 256 256 64 * Euryoryzomys sp. 64 64 - 64 - *

Hylaeamys megacephalus - - - 256 - R. rhipicephali

Hylaeamys megacephalus 64 128 128 64 - * Necromys lasiurus 64 - - - - * Necromys lasiurus - - - - 256 R. bellii

Necromys lasiurus 128 - - - - R. rickettsii

Necromys lasiurus - 128 - - - R. parkeri


Necromys lasiurus - - - - 64 * Necromys lasiurus 128 - - - - R. rickettsii

Necromys lasiurus 64 - - - - * Necromys lasiurus 64 - - - - * Necromys lasiurus - - - 128 - R. rhipicephali


Necromys lasiurus 64 - - 128 - * Necromys lasiurus 128 - - 64 - * Necromys lasiurus 512 128 64 - - * Necromys lasiurus 256 256 256 256 - * Necromys lasiurus 128 128 64 64 - * Necromys lasiurus 256 256 64 256 - * Necromys lasiurus 512 256 128 256 - *

Nectomys sp. 128 128 64 128 64 * Oligoryzomys sp. - 128 - - - R. parkeri

Oxymycterus sp. 128 - - - - R. rickettsii

Oxymycterus sp. - 64 - 256 - R. rhipicephali

Oxymycterus sp. 512 512 256 512 512 * Rhipidomys macrurus - - - - 64 * Rhipidomys macrurus - - - - 128 R. bellii

Rhipidomys macrurus - - - - 256 R. bellii

Rhipidomys macrurus - 128 - - - R. parkeri

Rhipidomys macrurus 128 - - - - R. rickettsii



66

Continuação apêndice 3.

Espécie de mamíferos Título final por antígeno

PAIRS R.

rickettsii

R.

parkeri

R.

amblyommii

R.

rhipicephali

R.

bellii


Rhipidomys macrurus - - - - 64 * Rhipidomys macrurus - - - - 128 R. bellii

Rhipidomys macrurus - - - - 64 * Rhipidomys macrurus 64 64 - - - * Rhipidomys macrurus - - - 64 512 R. bellii

Rhipidomys macrurus 64 - 64 - - * Rhipidomys macrurus 256 - - 64 - R. rickettsii

Rhipidomys macrurus 1024 512 - 512 - * Rhipidomys macrurus 64 128 64 - - * Rhipidomys macrurus 64 64 128 64 - * Rhipidomys macrurus 2048 2048 1024 2048 1024 * Rhipidomys macrurus 2048 2048 512 2048 512 *

- : soro não reativo no título 64 ou superior * : Espécie de Rickettsia não definida

67

Anexo

68

Anexo 1. Parecer CEUA

Evidência sorológica de infecção por riquétsias do grupo da febre maculosa e ... ·...

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