Evaluacion de la resistencia a costra negra en materiales germoplasmicos de papa en invernadero

i

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LAAGRICULTURA

CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

PROYECTO DE TITULACIÓN PREVIO A LA OBTENCIÓN DELTÍTULO DE INGENIERO EN BIOTECNOLOGÍA

AUTOR: EDISON ANDRÉS GALARRAGA GALARZA

TEMA: EVALUACIÓN DE LA RESISTENCIA A COSTRA NEGRA(Rhizoctonia solani Kühn) AG3 AISLADA DE LA PROVINCIA DE

CARCHI EN MATERIAL GERMOPLÁSMICO DE PAPA A NIVELDE INVERNADERO.

DIRECTORA: ALMA KOCH, MSc.

CODIRECTOR: ANDRÉS IZQUIERDO, PhD.

SANGOLQUÍ, ABRIL 2015

ii

HOJA DE LEGALIZACIÓN DEL PROYECTO

ELABORADO POR

________________________Sr. Edison Andrés Galárraga Galarza

DIRECTORA DE LA CARRERA

________________________M.Sc. María Augusta Chávez

Sangolquí, Abril de 2015

iii

CERTIFICACIÓN

Alma Koch, MSc. Andrés Izquierdo, Ph.D.

Certifican que el trabajo titulado “Evaluación de la resistencia a costra negra(Rhizoctonia solani Kühn) AG3 aislada de la provincia de Carchi en materialgermoplásmico de papa a nivel de invernadero” fue realizado en su totalidad por elSr. Edison Andrés Galarraga Galarza, como requerimiento parcial a la obtención deltítulo de INGENIERO EN BIOTECNOLOGÍA, ha sido guiado y revisadoperiódicamente y cumple con las normas estatutarias establecidas por la Universidad delas Fuerzas Armadas-ESPE, en el Reglamento de Estudiantes.

El mencionado trabajo consta de un documento empastado y de un disco compacto, quecontiene los archivos en formato portátil de Acrobat (pdf). Autorizan a Edison AndrésGalarraga Galarza que lo entregue a la señora María Augusta Chávez, Ms.C, en sucalidad de Coordinadora de la Carrera.

Sangolquí, Abril 2015.

______________________ ______________________

ALMA KOCH, MSc. ANDRÉS IZQUIERDO, Ph.D.

DIRECTOR CODIRECTOR

iv

DECLARACIÓN DE RESPONSABILIDAD

Edison Andrés Galarraga Galarza

Declaro que:

El proyecto de grado denominado “Evaluación de la resistencia a costra negra

(Rhizoctonia solani Kühn) AG3 aislada de la provincia de Carchi en material

germoplásmico de papa a nivel de invernadero” ha sido desarrollado en base a una

investigación exhaustiva, respetando todos los derechos intelectuales de terceros,

conforme las citas que constan al pie de las páginas correspondientes, cuyas fuentes se

incorporan en la bibliografía. Consecuentemente este trabajo es de mi autoría.

En virtud de esta declaración, me responsabilizo del contenido, veracidad y alcance

científico del proyecto de grado en mención.


_____________________________

Edison Andrés Galárraga Galarza

v

AUTORIZACIÓN

Yo, Edison Andrés Galarraga Galarza

Autorizo a la Universidad de las Fuerzas Armadas-ESPE, la publicación en la biblioteca

virtual de la Institución del trabajo “Evaluación de la resistencia a costra negra

(Rhizoctonia solani Kühn) AG3 aislada de la provincia de Carchi en material

germoplásmico de papa a nivel de invernadero” cuyo contenido y criterios son de mi

exclusiva responsabilidad y autoría.


_____________________________


vi

DEDICATORIA

A Dios por ser muy bueno conmigo, por su infinito amor y misericordia.

A mis padres, que con mucha paciencia y amor me han sabido guiar y tener paciencia a

lo largo de mi carrera universitaria.

A mi abuelo, mi papi “Coke”, que me enseñado como a un hijo, me ha acompañado en

todos mis logros y los ha vuelto suyos; esta tesis va para ti mi viejo.


vii

AGRADECIMIENTOS

A Dios por darme la fuerza y oír todas mis oraciones, a mi familia por haber estado

conmigo siempre en las buenas y en las malas, los amo.

A mis profesores que de buena o mala manera han sabido guiarme a lo largo de mi vida

universitaria.

A Almita Koch, MSc. por haberme hecho parte de su familia microbiología y por

apoyarme durante el desarrollo de mi tesis. Siempre admiraré su paciencia y sus

conocimientos.

Al Doctor Andrés Izquierdo, PhD. por haber aceptado la codirección y brindarme sus

conocimientos.

A Jessy Maisincho por la ayuda y la paciencia brindada durante todo este tiempo,

muchas gracias.

Al Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones Agropecuarias (INIAP) por haberme

acogido durante la realización de mi tesis, una gran institución. Al Ing. Eloy Mora por

su, paciencia, confianza y apertura en el Departamento de Protección Vegetal de INIAP.

Al Ing. Pedrito Romero por su apertura, respaldo, confianza y conocimientos.

Al Ing. Geovanni Rodríguez mi colega y amigo, gracias por el apoyo y la confianza mi

amigo.

Al Ing. Javier Molina por haberme acompañado a lo largo de mi carrera, por brindarme

sus conocimientos y ser un amigo. Gracias a ti aprendí que “vale más un burro bien

dormido que un genio amanecido” (Molina, 2010).

A todos mis amigos: Pablo Espinosa, Alexandra Rueda, Alexandra reyes, Andrés

Almeida, Gabriela Fuentes, Wilson Castro, Isaac Armendáriz a todos en general, faltan

muchos pero a tod@s los llevaré siempre en el corazón.

DIOS, PATRIA Y LIBERTAD

viii

ÍNDICE DE CONTENIDOS

CERTIFICACIÓN………………………………………………………………………iii

DECLARACIÓN DE RESPONSABILIDAD…………………………………………..iv

AUTORIZACIÓN………………………………………………………………………..v

DEDICATORIA………………………………………………………………………...vi

AGRADECIMIENTOS………………………………………………………………...vii

CAPÍTULO 1 – INTRODUCCIÓN……………………………………………………...1

1.1. Justificación del problema…………………………………………………………1

1.2. Objetivos de la investigación……………………………………………………....3

1.3. Marco Teórico…………………………………………………………………….4

1.3.1. Importancia socio-económica……………………………………………..4

1.3.2. Consumo…………………………………………………………………...4

1.3.3. La papa (Solanum tuberosum L.)………………………………………….5

1.3.4. Genética de la papa………………………………………………………...5

1.3.5. Relevancia de la especie…………………………………………………...6

1.3.6 Distribución de la especie………………………………………………….7

1.3.7. Producción a nivel Nacional………………………………………………7

1.3.8. Particularidades del Cultivo………………………………………………9

ix

1.3.9. Morfología de la papa…………………………………………………….12

1.3.10. Fenología del Cultivo…………………………………………………...15

1.3.11. Enfermedades del cultivo de papa………………………………………15

1.3.12. Características de enfermedades por fitopatógenos……………………..16

1.3.13. Enfermedades fúngicas que afectan al cultivo de papa………………....18

1.3.14. Costra negra…………………………………………………………..…18

1.3.15. Morfología y citología de Rhizoctonia solani Kühn….……………...…20

1.3.16. Grupos de Anastomosis (AG)…………………………………………..22

1.3.17. Epidemiología…………………………………………………………..23

1.3.18. Ciclo de Vida de R. solani Kühn………………………………………..24

1.3.19. Síntomas de costra negra………………………………………………..25

1.3.20. Control de la enfermedad……………………………………………….28

CAPÍTULO 2 - MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………….29

2.1. Participantes………………………………………………….……..……………29

2.2. Zona de estudio……………………………………………………………….….29

2.3. Revisión bibliográfica……………………………………………………………29

2.4. Fase de campo-toma de muestras………………………………………………..30

2.5. Fase de laboratorio………………………………………………………………30

2.6. Aislamiento de Rhizoctonia solani Kühn……………………………………..…31

x

2.6.1. Preparación de medio de cultivo………………………………………….31

2.6.2. Desinfección de los explantes tubérculos de Solanum tuberosum……….31

2.6.3. Aislamiento………………………………………………………………32

2.6.4. Observación del cultivo al microscopio………………………………….32

2.6.5. Extracción de ADN de R. solani Kühn…………………………………..33

2.6.6 PCR anidada para la determinación del Grupo de Anastomosis 3 (AG3)...34

2.6.7. Amplificación de las regiones ITS1-5.8S-ITS2………………………….34

2.6.8. Amplificación de regiones específicas para AG-3……………………….35

2.6.9. Electroforesis en gel de agarosa………………………………………….36

2.6.10. Multiplicación de Rhizoctonia solani Kühn…………………………….36

2.6.11. Preparación del inóculo de R. solani Kühn……………………………..37

2.6.12. Inoculación de Tierra con germoplasmas……………………………….38

2.6.13. Control de Inóculo………………………………………………………39

2.6.14. Manejo del experimento………………………………………………...40

2.7. Método de evaluación………………………………………………………40

CAPÍTULO 3 – RESULTADOS………………………………………………………42

3.1. Aislamiento de Rhizoctonia solani Kühn………………………………………..42

3.2. Extracción de ADN de Rhizoctonia solani Kühn………………………………..43

3.3. Nested PCR para la confirmación de Rhizoctonia solani AG3……………….…44

xi

3.4. Preparación del Inóculo…………………………………………………………..46

3.5. Sintomatología aérea……………………………………………………………..47

3.6. Análisis estadístico……………………………………………………………….47

3.7. Porcentaje de emergencia………………………………………………………..48

3.8. Altura de las variedades inoculadas……………………………………………...48

3.9. Evaluación a la cosecha de los tubérculos……………………………………….51

3.10. Severidad de la infección……………………………………………………….52

3.11. Número de tubérculos…………………………………………………………..57

3.12. Rendimiento total en gramos……………………………………………………61

CAPÍTULO 4 – DISCUSIÓN……………………………………………………….…64

4.1. Aislamiento e identificación de Rhizoctonia solani Kühn……………………….65

4.2. Preparación del inóculo de Rhizoctonia solani Kühn……………………………66

4.3. Síntomas de R. solani Kühn……………………………………………………...67

4.4. Control de altura de la planta…………………………………………………….69

4.5. Evaluación de los tubérculos…………………………………………………….69

4.6. Severidad de la Infección………………………………………………………...70

4.7. Rendimiento……………………………………………………………………...71

4.8. Plagas y control del ensayo………………………………………………………71

CAPÍTULO 5 – CONCLUSIONES……………………………………………………74

xii

CAPÍTULO 6 –

RECOMENDACIONES………………………………………………………………..75

BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………………….76

ANEXO I………………………………………………………………………………..81

ANEXO II………………………………………………………………………………84

ANEXO III……………………………………………………………………………...85

xiii

LISTADO DE FIGURAS

Figura 1.1 Aporte de la producción de papas por provincias……………………………8

Figura 1.2 Flor de la planta de papa en invernadero…………………………………...15

Figura 1.3 Sintomatología de R. solani ………………………………………………..27

Figura 2.1 Dispensación de medio PDA en cajas petri dentro de una cámara de flujo

laminar…………………………………………………………………………………..31

Figura 2.2 Armada de PCR dentro de una cámara de flujo laminar…………………...36

Figura 2.3 Preparación de inóculo de R. solani………………………………………..37

Figura 2.4 Inoculación de tierra para la siembra de germoplasmas……………...…….39

Figura 2.5 Invernadero de la estación científica Santa catalina………………………..40

Figura 3.1 Cultivo aislado de Rhizoctonia solani Kühn en medio PDA en caja petri…42

Figura 3.2 Tinción de hifas de Rhizoctonia solani Kühn vista en el objetivo…………43

Figura 3.3 Electroforesis de la región ITS1-5,8-ITS2 con su control negativo………..45

Figura 3.4 Amplificación de la región específica para AG3 con su control negativo…46

Figura 3.5. A: Preparación del inóculo de Rhizoctonia solani Kühn en semillas de

avena…………………………………………………………………………………….47

Figura 3.6 Diagrama de barras para las alturas de las plantas con su error estándar….50

Figura 3.7 Necrosis en tallo de la variedad I-Rubí del cuarto bloque…………………52

Figura 3.8 Tubérculos con costra negra de la variedad mejorada I-Rubí………………54

Figura 3.9 Tubérculos del clon promisorio 12-4-170………………………………….55

xiv

Figura 3.10 Diagrama de cajas con sus media de la severidad de las variedades de papa

inoculadas……………………………………………………………………………….56

Figura 3.11. Diagrama de la variable número de tubérculos por variedad con sus

respectivas medias………………………………………………………………………58

Figura 3.12. Diagrama de bloques de la variable rendimiento en variedades inoculadas y

no inoculadas………………………………………………………………………..….63

xv

LISTADO DE TABLAS

Tabla 1.1 Composición química óptima del suelo para el cultivo de papa.……………10

Tabla 1.2 Aporte nutricional de papa fresca para consumo humano…………………..12

Tabla 2.1 Materiales germoplásmicos evaluados……….……………………………..38

Tabla 2.2 Criterio de Clive para la evaluación de tubérculos………………………….41

Tabla 3.1. Valores de concentración y absorbancias de ADN total extraído de

Rhizoctonia solani………………………………………………………………………44

Tabla 3.2 Análisis de varianza de la altura de las plantas……………………………...49

Tabla 3.3 Alturas promedio y pruebas de Tukey para la variable altura………………51

Tabla 3.4 Análisis de varianza del porcentaje de severidad de la infección de papas…53

Tabla 3.5 Resultados del análisis de tukey, rangos de los valores promedios del

porcentaje de infección de costra negra…………………………………………………57

Tabla 3.6 Análisis de varianza para la variable número de tubérculos de tratamientos

inoculados y testigo……………………………………………………………………..59

Tabla 3.7 Prueba de Tukey para la variable número de tubérculos…………………….60

Tabla 3.8 Análisis de varianza para la variable gramos por maceta de tratamientos

inoculados y testigo…………………………………………………………………….61

Tabla 3.9 Prueba de Tukey para la variable “rendimiento por maceta”……………….62

xvi

RESUMEN

La papa (Solanum tuberosum) es uno de los cultivos tradicionales de mayor importancia

económica en el Ecuador y el cuarto a nivel mundial. En el Ecuador se ha visto afectado

por Rhizoctonia solani Kühn, agente causal de la Rizoctoniosis o costra negra,

enfermedad fúngica que ataca a brotes, tallos, estolones, tubérculos, causa necrosis,

marchitez foliar y en ocasiones anula la germinación de la plántula. Puede acabar con

hasta el 25% de un cultivo en campos de agricultores. La búsqueda y selección de

variedades resistentes es de importancia crucial para hacer frente a problemas que

afectan directamente a los cultivos, sean estos de origen fitopatológico, físico-químico o

de carácter ambiental. Se buscaron variedades de papa con resistencia a costra negra

AG3.

R. solani AG3 fue aislada a partir de esclerocios de papa provenientes de la provincia de

Carchi. Se confirmó mediante biología molecular el grupo de anastomosis 3 (AG3) para

el género Rhizoctonia con primers específicos. Se evaluaron frente a R. solani veinte

materiales germoplásmicos proporcionados por INIAP, en los que se incluían variedades

mejoradas y clones promisorios. El material vegetal fue estudiado durante seis meses a

nivel de invernadero. Se evaluaron y seleccionaron los tubérculos a la cosecha mediante

el criterio de Clive (1971) en base al porcentaje de infección. Se encontró que la

variedad I-Puca Shungo y el clon promisorio 12-6-1 presentan Alta tolerancia ante R.

solani.

Palabras clave: costra negra, anastomosis, fitopatógenos, germoplásmico, resistencia.

xvii

ABSTRACT

The potato (Solanum tuberosum) is one of the traditional crops of major economic

importance in Ecuador and the fourth worldwide. In Ecuador, it has been affected by

Rhizoctonia solani Kühn, causal agent Rizoctoniosis or black scab, fungal disease that

attacks buds, stems, stolons, tubers, cause necrosis, leaf wilting and sometimes nullifies

seedling germination. R. solani can kill up to 25% of a crop in farmers' fields. The

search and selection of resistant varieties is crucial to address problems directly affecting

crops, these problems can be: phytopathological origin, physical-chemical or

environmental nature. Potato varieties were sought with black scab resistance AG3.

R. solani AG3 was isolated from sclerotia of potatoes from the province of Carchi.

Anastomosis group 3 (AG3) for the genus Rhizoctonia was confirmed by molecular

biology with specifics primers. Twenty potato seeds provided by INIAP, which includes

improved varieties and promising clones, were evaluated.

The plant material was studied for six months at the level of greenhouse. They were

evaluated and selected the harvested tubers by Clive criteria (1971) by the percentage of

infection. It was found that the variety I-Puca Shungo promising clone 12-6-1 present

high tolerance for R. solani.

Keywords: black crust, anastomosis, plant pathogens, potato-seed, resistance.

1

CAPÍTULO 1 – INTRODUCCIÓN

La papa (Solanum tuberosum) es uno de los cultivos de mayor importancia

económica en el Ecuador. Según la FAO, la producción se vincula a 82000 productores

en alrededor de 90 cantones. El cultivo del tubérculo abarca la mayor extensión de

terreno con un 5,5% del área total de cultivos de la serranía ecuatoriana (Paca, 2009).

La presencia de la enfermedad de la costra negra se ha incrementado en el país

durante los últimos años, llegando a causar hasta la muerte del 70% de las plántulas de

papa. Se han documentado pérdidas en campo que llegan hasta el 20% y que se han

reflejado en importantes pérdidas económicas (INIAP, 2005).

La búsqueda de variedades con tolerancia genética ha sido el objetivo del sector

agrícola durante los últimos años. El uso de productos químicos para el control de

fitopatógenos ha dado lugar a plagas secundarias, por lo que, el uso de semilla con

tolerancia a Rhizoctonia solani Kühn representaría menor costo en la producción del

tubérculo, disminuiría el uso de fungicidas y generaría menor impacto ambiental (Prado

et al., 2001).

1.1. Justificación del problema

Se estima que la producción global de papa genera 16.5 billones de dólares anuales.

El cultivo de papa es económicamente importante a nivel mundial. En el Ecuador, la

papa constituye el cuarto cultivo más importante por su producción, alto consumo,

aporte nutricional y por ser una fuente de ingresos para numerosos agricultores,

principalmente del sector rural. Representa el 7.4% del Producto Interno Bruto Agrícola

(PIBA) (Devaux et al., 2010).

2

En los últimos años, debido al incremento de tierras cultivadas, se han desarrollado

problemas fitosanitarios que han afectado directamente a los agricultores, situación

debida al mal manejo del cultivo, al desconocimiento de las causas de enfermedad y a la

falta de tecnología adecuada que permita controlar estos problemas oportunamente y así

evitar que se propague a otras zonas (INIAP, 2005).

Torres (1989), en su estudio acerca de las principales enfermedades fúngicas de la

papa relacionadas con la producción de tubérculos-semillas, indica que todas estas

enfermedades son de gran importancia, ya que pueden llegar a destruir cultivos enteros o

afectar en el rendimiento de la producción, restándole calidad al tubérculo, este es el

caso de la costra negra (Rhizoctonia solani Kühn). Se conocen en Ecuador más de 30

enfermedades fúngicas que afectan al cultivo de Solanum tuberosum siendo la

Rizoctoniosis o costra negra la más común en suelos paperos. R. solani se perpetúa en

cultivos por acciones mecánicas como la labranza, la utilización de implementos

agrícolas infectados, restos de tallos y hojas infectadas, y semillas con esclerocios.

Rhizoctonia solani Kühn ataca brotes, estolones y tubérculos, la mayor sintomatología

ocurre en el estado de plántula; causando efectos irreversibles para la planta, llegando a

causar una pérdida de casi el 70%. En el año 2005 (INIAP, 2005) en la Estación

Experimental de Santa Catalina (EESC), se obtuvieron porcentajes de incidencia y de

severidad del 81%; al realizar controles de calidad internos de semilla de papa categoría

registrada INIAP Fripapa. En consecuencia de las altas infecciones, la extracción de

semilla para la variedad I-Fripapa disminuyó considerablemente. Se obtuvieron valores

de 50% de extracción frente a 60-70% que se considera rentable.

3

Con estos antecedentes, enfocados en el impacto de pérdidas económicas para los

agricultores, es necesaria la generación permanente de nuevas variedades de papa que

posean una tolerancia alta o parcial a R. solani; conociendo que la semilla se considera

como el factor principal para una producción agrícola saludable.

1.2. Objetivos de la investigación

1.2.1. Objetivo general

Encontrar materiales germoplásmicos de papa tolerantes a costra negra, mediante la

evaluación de la severidad en sintomatología en parte aérea, en tallos, raíces y

tubérculos, para disponer de tubérculo semilla con una tolerancia moderada y alta a

Rhizoctonia solani Kühn.

1.2.2. Objetivos específicos

a) Aislar Rhizoctonia solani Kühn AG3 de esclerocios de papa provenientes de la

provincia de Carchi.

b) Identificar el comportamiento de diferentes materiales germoplásmicos de papa,

proporcionados por INIAP, frente a la enfermedad costra negra (Rhizoctonia solani

Kühn).

c) Seleccionar las variedades tolerantes a costra negra.

4

1.3. Marco Teórico

1.3.1. Importancia socio-económica

Se estima que 225000 personas subsisten directamente del cultivo de la papa,

115000 personas están involucradas indirectamente en actividades de comercialización,

transporte y procesamiento del tubérculo. En general, el 7% de la población

económicamente activa del país tienen a la papa como su principal fuente de ingreso. El

cultivo de la papa se caracteriza por su alto uso de mano de obra. Se emplean alrededor

de 150 jornales en cada hectárea por ciclo, es decir, en 49000 hectáreas cultivadas por

año se usan 7.5 millones de jornales anuales, un equivalente a 36.7 millones de dólares

de ingresos directos. Anualmente por cada hectárea cultivada se requiere una inversión

de 2500 dólares (Reinoso, 2011).

En los Andes, los países con mayor producción por hectárea sembrada son:

Colombia y Venezuela con 16 t/ha, mientras que los países con menor producción son

Bolivia y Ecuador con un promedio de 6 a 7 t/ha. En Ecuador se siembran comúnmente

30 cultivares, de los cuales, INIAP Gabriela y Superchola representan el 50% del área

sembrada (INIAP, 2002).

1.3.2. Consumo

La papa es uno de los alimentos de mayor consumo en la dieta de los habitantes de la

serranía ecuatoriana. Según el Instituto Autónomo de Investigaciones Agropecuarias

(INIAP) el consumo anual de una persona por ciudad es: 122 kg en Quito, 80 kg en

5

Cuenca y 50 kg en Guayaquil. Actualmente las industrias alimenticias utilizan 50000

toneladas al año, lo cual representa el 10% de la producción nacional (Andrade, 2002).

1.3.3. La papa (Solanum tuberosum L.)

Se conoce como papa o patata al tubérculo formado por engrosamiento de raíz de la

planta Solanum tuberosum L. Según Dimitri (1972), a la papa (Solanum tuberosum), le

corresponde la siguiente clasificación taxonómica: Reino Plantae; Subreino Antophyla;

División Angiosperma; Clase Dicotiledónea; Subclase Simpetalae; Orden Tubuflorae;

Familia Solanaceae; Género Solanum; Especie tuberosum.

Es una planta de altura por lo que sus cultivos se realizan desde los 2700 a 3400

msnm, y se desarrolla adecuadamente a una temperatura que oscila entre los 9 y 11°C.

Aunque el cultivo se encuentra en varios tipos de suelos, le van mejor aquellos de

textura arenosa, con buen drenaje y estructura suelta, es sensible a suelos compactos por

lo que se recomienda tener una profundidad de al menos 30 centímetros. Se desarrolla en

un rango de pH de 5.0 a 7.0 (Paca, 2009).

1.3.4. Genética de la papa

Existen alrededor de 4000 variedades de papa, variedad génica distribuida en más de

100 países alrededor del mundo. Esta gran diversidad genética ha sido preservada

mediante prácticas tradicionales de los agricultores. El cuidado de las semillas por parte

de los pequeños productores paperos de la región andina han permitido el

mantenimiento de la gran variedad de papas; que presentan adaptaciones a altura,

temperaturas y suelos (Borba, 2008).

6

El Ecuador posee una inmensa diversidad genética de papa. El Instituto Autónomo

de Investigaciones Agropecuarias (INIAP) ha identificado 393 variedades de papa, 232

pertenecen a variedades silvestres y 161 a variedades nativas. La gran diversidad de

materiales junto con germoplasmas modificados, han sido la respuesta a las limitaciones

del cultivo, dando resistencia a factores adversos como: heladas, condiciones

ambientales y fitopatógenos (Reinoso, 2011).

El flujo genético de la especie es alto entre variedades cultivadas y silvestres, con la

subespecie andigena y con especies hexaploides (EBN=4). El fenómeno genético en la

solanácea ha sido atribuido a la dispersión del polen, a la coexistencia geográfica y a la

relación taxonómica. Aparentemente la evolución de las especies de papa se originó a

partir del nivel diploide. El gametofito de la papa es 2n=12. El esporofito encontrado en

diferentes variedades puede ser: 2n=24 y 48; 2n=24, 36, 48 y 60. Solanum tuberosum

presenta alta heterocigosidad (he) que oscila entre 0.46 y 0.52 (Ortiz & Peloquin, 1994).

1.3.5. Relevancia de la especie

El cultivo de papa ocupa el cuarto lugar dentro de las plantaciones de mayor

importancia a nivel mundial; debido a su sabor y consistencia, a su alto aporte

nutricional y sus múltiples usos. El almidón es utilizado por industrias farmacéuticas,

textiles, de la madera y del papel, en la elaboración de pegamentos, piensos y etanol. En

Europa, a nivel industrial, es utilizada en la producción de vodka, whisky, almidón y

otras industrias la emplean como comidas rápidas (CONABIO, 2008).

7

A diferencia de otros cultivos, la papa se puede multiplicar de manera vegetativa a

través de tubérculos semilla. Este cultivo tiene un alto rendimiento y no requiere de

cuidados especiales (Estrada, 2000).

1.3.6 Distribución de la especie

La papa es una planta originaria de los Andes sudamericanos y se extiende desde

Colombia, pasando por Ecuador, Perú, Bolivia, Venezuela, Chile hasta Argentina. En el

Ecuador se distribuye en tres zonas geográficas: norte, centro y sur. El cultivo se

desarrolla en laderas irregulares en terrenos con una inclinación de hasta el 45%, en un

intervalo de 2400 a 3800 msnm. El cultivo se desarrolla en condiciones de subpáramo

húmedo (Hurtado & Román, 2002).

1.3.7. Producción a nivel Nacional

Las provincias de Carchi, Pichincha, Cotopaxi, Tungurahua y Chimborazo,

aportaron el 79.5% de la producción, las mayores extensiones de cultivo de papa

corresponden (Figura 1.1) en orden a: Carchi (26%), Chimborazo (15%), Cotopaxi

(15%), Tungurahua (14%) y Pichincha (11%) (Reinoso, 2011).

8

Figura 1.1: Aporte de la producción de papas por provincias (Reinoso, 2011).

La producción papera en el país se divide en tres zonas:

Zona Norte: Carchi e Imbabura

Carchi e Imbabura presentan el mayor índice de producción a nivel nacional, poseen

un rendimiento de 21.7 t/ha y produce el 40% de la cosecha anual en el país. El área

papera zonal comprende alturas entre los 2800 msnm a 3200 msnm y presenta un clima

frío característico de alta montaña, con temperaturas promedio de 11-12°C. En esta zona

las probabilidades de heladas son relativamente bajas (Pumisacho & Sherwood, 2002).

Zona centro: Pichincha, Cotopaxi, Tungurahua, Chimborazo y Bolívar

En la zona centro, la provincia de Chimborazo, a una altura comprendida entre los

2200-3600 msnm, tiene la mayor superficie dedicada al cultivo de la solanácea, sin

embargo, el rendimiento de la provincia es bajo (11 t/ha). La temperatura varía entre 6°

y 15°C. Existen tres zonas de producción papera: occidente, nororiente y cordillera

9

central. En la zona de occidente se encuentran los cantones Colta y Riobamba. El cantón

Chambo corresponde a la zona nororiental y el cantón Guano a la cordillera central. En

este último la siembra se puede dar todo el año. En la provincia de Chimborazo la

producción del tubérculo se da en diferentes tipos de suelo. Los más importantes:

Inceptisoles, Mollisoles, Entisoles y Afisoles (Pumisacho & Sherwood, 2002).

Zona Sur: Cañar, Azuay y Loja

La zona productora sur es la de menor importancia a nivel nacional. Tiene un

promedio de temperatura entre los 13°C y 15°C. La mayor producción se encuentra en la

provincia de Cañar, a una altura de 2000 msnm, presenta un rendimiento de 8-10 t/ha.

En las provincias de Azuay y Loja, la producción de papa es casi nula debido a las bajas

precipitaciones de la zona (Pumisacho & Sherwood, 2002).

1.3.8. Particularidades del Cultivo

1.3.8.1 Requerimientos de Suelo

En el cultivo de papa, su forma, apariencia y rendimiento depende de la textura y

naturaleza del suelo. La papa se produce en suelos bien drenados, que posean materia

orgánica y nutrientes en su composición. La planta de papa necesita de un suelo suelto,

inclinado, y con buen drenaje para evitar que el agua se empoce; preferentemente el

suelo debe ser profundo y fértil con un pH en un intervalo de 5.0 a 6.0 (Paca, 2009).

Dentro de los mejores suelos para el cultivo de la solanácea se encuentran: los

francos, franco-arenosos, franco-limosos y franco-arcillosos. Estos suelos se caracterizan

por ser de color oscuro, poseer una textura liviana y permitir el libre crecimiento de

10

raíces y estolones. La cantidad de materia orgánica adecuada en el suelo debe ser mayor

al 3.5% en la composición del terreno (Hurtado & Román, 2002).

En la sierra ecuatoriana el suelo predominante es de origen volcánico, con altas

concentraciones de aluminio. La ceniza volcánica forma un complejo entre materia

orgánica y minerales. Estas tierras tienen gran capacidad de retención de agua y alto

poder de fijación de fósforo (INIAP, 2002).

1.3.8.2. Composición química óptima

Según Hurtado & Román (2002), la composición química óptima del suelo apta para

el cultivo de papa se muestra en la Tabla 1.1.

Tabla 1.1 Composición química óptima del suelo para el cultivo de papa (Hurtado & Román, 2002).

Propiedades Químicas Rango óptimopH 5.5 - 6N Variable

P > 28 mg/kgK > 5 %

Ca++ 65%Mg++ 18%

Acidez total < 10 %Conductividad eléctrica < 4 dsm- 1

1.3.8.3. Intensidad lumínica

La cantidad de luz en un cultivo es de importancia para la floración y fructificación.

Durante el inicio del crecimiento del tubérculo tendrá un efecto marcado sobre su futuro

desarrollo, es fundamental en la síntesis de carbohidratos a través del proceso de

fotosíntesis (CORPOICA, 2000).

11

La intensidad lumínica es de gran importancia en los fotoperíodos requeridos por las

plantas; así, uno corto disminuirá el crecimiento vegetativo, pero a su vez acumulará

mayor cantidad de carbohidratos que aumentará la producción de tubérculos, y los

fotoperiodos largos favorecen el crecimiento. La cantidad óptima de horas luz para el

cultivo de papa son 12 horas al día (INTA, 2004).

1.3.8.4. Disponibilidad de agua

El efecto de la falta de humedad en el suelo afecta en el rendimiento final de los

cultivos, depende del estado fenológico de la planta al momento del déficit hídrico. La

disponibilidad de agua en el suelo es uno de los factores que influirán directamente en el

crecimiento del cultivo, en la fotosíntesis y en la absorción de nutrientes; si existe poca

disponibilidad de agua se producirá clorosis, marchitamiento foliar y por consiguiente la

disminución en el rendimiento. Un exceso de humedad ayuda al desarrollo de

enfermedades. La precipitación o cantidad mínima de agua requerida es de 600 mm,

distribuida en todo su ciclo vegetativo; las mayores demandas se dan en las etapas de

germinación y crecimiento de los tubérculos, por lo cual es necesario efectuar riegos

suplementarios en los períodos críticos o cuando no se presenta lluvia. Un rango óptimo

de precipitación para el cultivo de papa es de 800 a 1200 mm durante el ciclo (INIAP,

1984).

1.3.8.5. Temperatura

La papa es una planta termoperiódica, es necesario que exista una variación de por lo

menos 10°C entre la temperatura diurna y la nocturna. Si la diferencia es menor, el

crecimiento y tuberización se ven afectados. Cuando esta situación se da a menudo, a lo

12

largo del ciclo vegetativo, el rendimiento y la calidad son afectados, pues las

temperaturas altas son ideales para el crecimiento de tallos y hojas, pero no para los

tubérculos (Hurtado & Román, 2002).

La temperatura interviene directamente en la producción de brotes en los

germoplasmas, controla la utilización de nutrientes, la pérdida de agua e influye en las

etapas fenológicas del cultivo (INTA, 2004).

La papa requiere de condiciones que permitan su desarrollo como los climas

templados fríos y las altitudes que van desde los 2 500 a 3 500 metros, la temperatura

óptima para el cultivo es de 9 a 11ºC. El cultivo soporta hasta una temperatura máxima

de 18ºC y debe encontrarse libre de heladas y granizadas (INIAP, 2005).

Las plantas producen más follaje a temperaturas bajo los 29ºC. A estas temperaturas

se induce el desarrollo de tallos, el crecimiento de las hojas es atrofiado debido a la

reducción de la expansión del área foliar, los niveles de almidón son bajos en las hojas y

los estolones son más largos. Se retrasa el comienzo del crecimiento del tubérculo y se

demora el inicio del llenado del mismo. Las temperaturas elevadas favorecen el

desarrollo de plagas y enfermedades. La humedad ambiental excesiva empeora el ataque

de lancha negra y la aparición de otros fitopatógenos (Estrada, 2000; CORPOICA,

2000).

1.3.9. Morfología de la papa

El desarrollo de la planta puede ser producida a partir de un tubérculo semilla y de

semilla de papa. En el caso de ser producido por medio de un tubérculo, las raíces

13

tendrán formación en los brotes del mismo, mientras que el tallo se constituye de nudos

que se encuentran en los brotes del tubérculo (Piñeros, 2009).

El tamaño de la planta va desde los 0.4 a 1.4 m, poseen tallos leñosos y gruesos de

color verde o rojo púrpura. El follaje normalmente alcanza una altura entre 0.60 a 1 m.

Las hojas son compuestas y pignadas. Las hojas primarias de plántulas pueden ser

simples, pero una planta madura contiene hojas compuestas en par y alternadas, y

produce un tubérculo, la papa misma, con abundante contenido de almidón. Las hojas se

ordenan en forma alterna a lo largo del tallo, dando un aspecto frondoso al follaje,

especialmente en las variedades mejoradas (Solano, 2007).

El tubérculo de la papa es un tallo subterráneo en su totalidad, el cual funciona como

almacén. A medida que madura, la cantidad de elementos conductores reducen y no

existe una zona de cambium continuo. Sobre la superficie de la exodermis, se confinan

depresiones de la superficie, dentro de las cuales se ubican las yemas vegetativas, y

donde se originan tallos. La formación de tubérculos es consecuencia de la proliferación

del tejido de parenquimatoso que estimula el aumento de células. El tejido vascular de

los tallos, estolones y tubérculos toma inicialmente la forma de haces bicolaterales.

Mientras el tubérculo crece, se forman tubos cribosos, células acompañantes y elementos

del parénquima conductor. Los hidratos de carbono se almacenan dentro de las células

del parénquima de reserva; de la médula y la corteza en forma de gránulos de almidón

(Aucancela et al., 2012; EDIFARM & CIA, 2010).

El aporte nutricional de los tubérculos está dado por el contenido de macro y

micronutrientes y por la biodisponibilidad. En promedio 100 gramos de papa, porción

14

que consume un individuo adulto, contiene gran cantidad de micro y macro elementos

los cuales se muestran en la Tabla 1.2 El tubérculo contiene gran cantidad de Ca, P y

vitamina C. La vitamina C contenida en una papa es equivalente a la cantidad diaria que

necesita una persona (FAO, 2008).

Tabla 1.2 Aporte nutricional de papa fresca para consumo humano (FAO, 2008)

Componente ValorAgua 77 gFibra 1.80 g

Valor calórico 87 KcalProteína 1.87 g

Carbohidratos 20.13 gLípidos 0.10 g

Vitamina C 13 mgHierro 0.31 mgCalcio 5 mg

Fósforo 44 mg

Dependiendo de la variedad, las flores se localizan en racimos terminales al tallo.

Existen factores como el fotoperiodo, la temperatura y el clima que estimulan la

floración de la planta. El inicio del periodo de floración indica la tuberización, uno de

los estados fenológicos más importantes para la planta (Figura 1.2). Las flores llegan a

tener 4 cm de diámetro, poseen cinco pétalos (Pentámeras) unidos por los bordes

formando una corola (Borja et al., 2010).

15

Figura 1.2 Flor de la planta de papa en invernadero (Galárraga, 2014).

1.3.10. Fenología del Cultivo

La descripción fenológica del cultivo de papa se da en respuesta al comportamiento

fisiológico varietal frente a condiciones climatológicas, insumos agrícolas y programas

agronómicos. Las etapas fenológicas de la planta de papa se inicia con la germinación

del tubérculo semilla, pasando por varias fases fisiológicas de tipo vegetativo hasta

alcanzar la madurez fisiológica y termina con la tuberización, dependiendo la variedad.

(Yzarra & Martín, 2011; Borja et al., 2010).

1.3.11. Enfermedades del cultivo de papa

El suelo es el hábitat de muchos microorganismos, en su mayoría beneficiosos para

las plantas, una pequeña parte causan patologías. Los microorganismos causantes de

enfermedad en las plantas se los conoce como fitopatógenos y pueden ser: bacterias,

virus, hongos, insectos, maleza y nematodos. Los patógenos del suelo han sido

considerados como secundarios dentro de los problemas de los cultivares, pero, en las

últimas décadas por el mal manejo del suelo y de la semilla, su presencia ha ido

incrementando preocupantemente. Los fitopatógenos se encuentran en todos los suelos

15

















15

















16

de todas las zonas paperas del país, con mayor incidencia en zonas frías, húmedas y en

suelos donde es predominante el monocultivo (Jager et al., 1982).

La diseminación de los fitopatógenos entre cultivos es provocada por el uso de

semilla contaminada, por restos de material vegetal contaminado, por suelo infectado e

implementos agrícolas contaminados. Dentro de las principales enfermedades causadas

por hongos se encuentra el tizón temprano ocasionado por Alternaria solana, el tizón

tardío que es causado por Phytophthora infestans y el cancro de la papa provocado por

Rhizoctonia solani Kühn. Estas plagas en la actualidad son controladas mediante el uso

de fungicidas. No existe ningún control totalmente eficaz por lo que se ha optado por

combinar el control por medios químicos, la resistencia genética y el manejo cultural.

Hay que recordar que el tizón tardío fue el causante de la hambruna producida en Irlanda

durante los años 1845 y 1848, en donde hubo una epidemia ocasionada por P. infestans

en los cultivos de papa, y como consecuencia produjo la muerte de más de un millón de

personas, además de un alto porcentaje de emigración de los pobladores (Borba, 2008).

Entre los principales fitopatógenos de suelos paperos se encuentran: la costra negra,

el nematodo del quiste de la papa; que afectan directamente al rendimiento, la sarna y

roña que afectan la apariencia del tubérculo, así como la pérdida de valor comercial

(Aucancela et al., 2012).

1.3.12. Características de enfermedades por fitopatógenos

La gran cantidad de pérdidas económicas es consecuencia de las enfermedades que

contraen los cultivos de papas, independientemente de la manera de contagio. La

infección puede ser de diferentes tipos como: bacterial, viral, fúngico, por nematodos,

17

insectos, maleza u oomicetos, los mismos que pueden ser clasificados por la especie de

plaga o enfermedad (Pérez & Forbes, 2011).

En el caso de enfermedades bacterianas existen de tres clases que son las más

comunes en la zona andina, marchitez bacteriana, pudrición blanda, pierna negra o pie

negro y la sarna común. Las condiciones favorables para la plaga que se encuentran

comúnmente en las enfermedades bacterianas son campos infestados, semillas

infestadas; dependiendo de la enfermedad se pueden encontrar una mayor propagación

en climas cálidos y en campos anegados (Pérez & Forbes, 2011). En el caso de pie negro

y pudrición blanda, pueden ser infectados en el momento de almacenamiento del

tubérculo o en el suelo antes de ser cultivado. Los tubérculos son más propensos a

adquirir esta enfermedad en el proceso de transporte y cosecha, ya que pueden sufrir

cortes (Castro & Contreras, 2011).

La sintomatología de la sarna común no puede ser observada en la parte aérea de la

planta, debido a que no afecta la parte área sino que la enfermedad se ubica en el

tubérculo. En fases tempranas de la enfermedad se observa rajaduras en forma de

estrellada, las mismas que aumentan de tamaño según la edad del tubérculo, pueden

llegar alcanzar hasta 8 mm de diámetro, en los tubérculos se observan de diferentes

formas geométricas las cuales pueden cubrir la mayor parte de la epidermis (Mora et al.,

2011).

La virosis es uno de los tipos de enfermedades virales que se encuentran en la zona

andina. Los síntomas que se reflejan en el cultivo de papa son enanismo en la planta,

amarillento, deformación de hojas, rigidez, necrosis en nervaduras, entre otros. En

18

algunos casos no presentan síntomas. Las condiciones favorables en la que la plaga se

propaga son por medio de las semillas infectadas, uso de las semillas varias veces, entre

otras (Pérez & Forbes, 2011)

1.3.13. Enfermedades fúngicas que afectan al cultivo de papa

En climas de alta humedad y con alta precipitación, las plantas son propensas a

enfermedades causadas por hongos; una enfermedad fúngica es reconocida por la

producción de manchas o necrosis de consistencia seca en las hojas, tallos y tubérculos.

1.3.14. Costra negra

Rhizoctonia solani fue descrito por Julios Kühn en el año de 1858. Este hongo

pertenece a la clase Basidiomycete y se caracteriza por no producir esporas asexuales. R.

solani únicamente en condiciones especiales puede producir esporas sexuales

(basidiosporas). En la naturaleza R. solani se reproduce asexualmente y permanece

como micelio vegetativo, el cual forma estructuras de resistencia llamadas esclerocios,

masas de hifas entretejidas con superficies duras y resistentes que actúan como

propágulos. En la superficie del tubérculo R. solani asocia sus hifas con masas de tierra

dando el aspecto de una costra razón por la cual ha tomado vulgarmente el nombre de

costra negra. Su estado sexual es conocido como Thanatephorus cucumeris, se

desarrolla en ciertas condiciones de humedad y de alta temperatura. La forma sexual de

R. solani ha sido encontrado en cultivares de la provincia de Carchi, Tungurahua y

Chimborazo (Alba, 2006).

Rhizoctonia solani Kühn, se mantiene en el suelo por restos de plantas enfermas y

principalmente por implementos agrícolas utilizados en la labranza de la tierra de

19

cultivo. La costra negra se caracteriza por atacar a brotes, tallos, estolones y tubérculos,

causando necrosis, marchitez foliar, retardando su emergencia y en ocasiones anulando

la germinación de la plántula. En tallos, la necrosis estrangula el tejido frenando el

desarrollo y dando paso a la formación de tubérculos aéreos. En la epidermis de los

tubérculos maduros se forman los esclerocios, estructuras que ayudarán a la

conservación del hongo en el campo (Hooker, 1980; Agrios, 2002).

Rhizoctonia. Solani Kühn es un habitante natural del suelo y está presente en todas

las tierras paperas del mundo. Costra negra es una enfermedad persistente, muy

adaptable y versátil, es considerada de alta importancia ya que disminuye la calidad de

los tubérculos-semillas debido a la presencia de los esclerocios en la piel de los

tubérculos. Cuando la enfermedad afecta la base de la planta ocasiona cierto

enrollamiento de las hojas semejante a los síntomas de PLRV e interfiere en la

evaluación, puede ocasionar el descarte de plantas supuestamente infectadas con el virus

del enrollamiento (PLRV), cuando en realidad se trata de plantas afectadas por R. solani

(Agrios, 2002).

La presencia de la costra negra se ha incrementado en los últimos años en el país.

Según Martín & Torres (1989), R. solani puede llegar a causar la muerte de hasta el 70%

en plántulas. Fankhauser (1997) manifiesta que las pérdidas en campos de agricultores

están alrededor del 25% (INIAP, 2005).

Rhizoctonia solani Kühn puede atacar 250 especies de plantas, está presente en

campo y en las bodegas de almacenamiento de tubérculos donde se encuentra el material

20

vegetal que será utilizado como material de propagación. De las 250 especies

identificadas, 52 corresponden a plantas asociadas al cultivo de papa (Jager et al., 1982).

Costra negra se caracteriza por presentar tolerancia a la acidez, esta propiedad le

permite mayor supervivencia en condiciones de estrés. Se han documentado que ataques

moderados de este hongo pueden causar pérdidas de hasta 20% en los suelos negro

andinos del país. En el Ecuador R. solani ataca una gran diversidad de plantas,

incluyendo arvejas, habas, cebada y trigo. Se ha demostrado que existe una clara

especialización dentro de la población por determinados huéspedes. Existen formas no

patógenas del hongo que eventualmente actúan como antagonistas de las formas

patógenas (Torres, 1997).

1.3.15. Morfología y citología de Rhizoctonia solani Kühn

En el medio de cultivo, las hifas maduras de Rhizoctonia solani Kühn presenta

ramificaciones en ángulos de 90° y 45° a partir de la hifa principal, las cuales se forman

por la constricción de los septos. En la mayoría de las hifas principales se desarrolla una

nueva ramificación al final. Las hifas jóvenes tienen un aspecto transparente y se forman

a manera de “malla” cubriendo la superficie del medio de cultivo. En el campo existe

una variación de color entre hifas aéreas y subterráneas, las subterráneas tienden a

permanecer hialinas, mientras, las aéreas presentan colores amarillentos y marrones

debido a la acumulación de melanina dentro de las paredes celulares. R. solani posee

hifas binucleadas y se caracterizan por ser más finas que las multinucleadas. Su diámetro

oscila entre los 3 a 17 µm y la longitud celular varía entre 50 y 25 µm. Es importante

21

conocer que R. solani no presenta conexiones clamp, conidios, esclerocios diferenciados

dentro de la corteza y médula, tampoco se ha conocido de pigmentos diferentes al

marrón en el color en hifas (Marshall, 1980).

Los esclerocios de R. solani están formados por masas compactas de células

monilioides llamadas clamidiosporas o células escleróticas, se forman en la superficie de

los tejidos vegetales. Durante la formación de esclerocios no hay un patrón claro de

organización hifal. El color de los esclerocios va desde tonalidades marrones a rosáceas.

La forma y el tamaño del micelio varía según el tipo de Rhizoctonia. Los esclerocios de

los grupos de anastomosis 1-1c son pequeños y con formas redondas, mientras que los

esclerocios de otros grupos presentan formas irregulares que varían de 1 a 8 mm de

diámetro (Taheri, 2010).

Los aislados de Rhizoctonia solani Kühn pueden esporular en condiciones

ambientales especiales. Las células de las hifas cortas se bifurcan frecuentemente y

producen densas acumulaciones donde se forman los basidios, que pueden ser

cilíndricos, ovales o esféricos (Whitney, 1964).

En el citoplasma de R. solani se encuentran vacuolas alargadas ubicadas en los

extremos hifales. Se han encontrado grandes vacuolas en células maduras. En las células

monilioides, los esclerocios presentan depósitos con aceite. Dentro del citoplasma de

Rhizoctonia solani se pueden encontrar otros orgánulos celulares como: núcleo,

mitocondria, vacuolas, retículo endoplasmático, ribosomas, micro túbulos, lomasomas,

paredes de hifas, poros y septos (Marshall, 1980).

22

La pared celular, la constituye una simple capa de 80 Å de espesor, con la madurez

del tejido se forman capas adicionales, algunas llegan al espesor de 1 µm. La pared del

septo consta de dos zonas ricas en electrones. El septo puede contener de una a varias

lamelas de acuerdo a la edad celular (Whitney, 1964).

El retículo endoplasmático se encuentra en células jóvenes, se compone de dos capas

paralelas que forman un conjunto cerrado de cisternas porosas o de láminas apiladas.

Suele ser continuo con el parentosoma alrededor del poro del septo y luego se extiende

hacia el citoplasma (Marshall, 1980).

El número de núcleos depende de la Rhizoctonia, por ejemplo, en R. repens las

células son binucleadas. Las células de R. solani, R. zeae y R. oryzae son

multinucleadas. El número de núcleos en células viejas es bajo, lo cual ocurre debido a

la formación de septos en el citoplasma. Los núcleos son de forma oval y se pueden

observar los nucléolos claramente bajo el microscopio de contraste, la membrana

nuclear suele tener conexiones con el retículo endoplasmático (Taheri, 2010).

1.3.16. Grupos de Anastomosis (AG)

De acuerdo con observaciones realizadas in vitro por Carling et al. (2002) se

describe la habilidad de fusionar las hifas del fitopatógeno, a este fenómeno se lo conoce

como anastomosis. Se ha logrado clasificar a R. solani Kühn en 13 grupos de

anastomosis (AG), que se diferencian tanto morfológicamente y en su fisiología por

hospedero, además de características moleculares y secuencias de ADN (Anexo I).

El grupo de anastomosis 3 (AG3) son los más frecuentes en plantas de papa y son

asociados a lesiones que producen necrosis en el tejido, además, de la formación de

23

costras negras en los tubérculos, sus esclerocios pueden llegar a soportar variaciones de

temperaturas. El grupo de anastomosis 4 (AG4) es considerado el más patogénico; a

diferencia del grupo de anastomosis 3, no forma esclerocios, soporta altas temperaturas

y afecta otros cultivos asociados a la papa, también produce la pudrición de raíces; sin

embargo, de este mismo grupo se han encontrado aislamientos no patogénicos en papa

(Acosta et al., 2011).

Se han encontrado varios géneros de Rhizoctonia spp. que forman un grupo endófilo,

estos se asocian a raíces de orquídeas que viven en simbiosis, y son esenciales para la

germinación de semillas y el desarrollo de la planta (Mesa, 2011).

1.3.17. Epidemiología

Rhizoctonia solani Kühn está presente en el suelo de cultivo así como también en la

superficie del tubérculo en forma de esclerocios. El grupo de anastomosis 3 se mantiene

en el suelo en forma de esclerocios asociados a masas de tierra. El grupo de anastomosis

4 permanece como micelio en rastrojos (restos de tejidos de hospedantes). La

inoculación del suelo ocurre cuando un tubérculo-semilla enfermo con costra negra tiene

contacto con la tierra de cultivo; el inóculo se incrementa cuando no se hacen rotaciones

de cultivos como maíz, trigo o cebada; principalmente con el grupo de anastomosis 3

(AG3) en papa. Las condiciones favorables para el desarrollo del hongo se dan con

suficiente humedad del suelo y temperatura de alrededor de 18°C. Es solo en estas

condiciones en donde los esclerocios y los micelios del hongo proliferan y afectan

tejidos jóvenes, especialmente en el estado de plántula del cultivo (Acosta et al., 2011).

24

1.3.18. Ciclo de Vida de R. solani Kühn

Los esclerocios presentes en la tierra de cultivo son estimulados por exudados

producidos durante el crecimiento celular de las plantas y también por la

descomposición de restos de materia orgánica. Estas estructuras producen micelio que al

tener contacto con la planta ataca las primeras barreras externas del tejido vegetal; el

proceso de infección es promovido por la producción de diferentes enzimas

extracelulares (celulasas) que degradan la pared celular de la planta. El hongo continúa

su desarrollo en la superficie externa de la planta causando enfermedad por la formación

de laceraciones en el tejido vegetal que penetran a las células tomando nutrientes para

acelerar su metabolismo (Cotes, 2007).

Como el hongo destruye las células de la planta, las hifas continúan creciendo y

colonizando el tejido necrosado, muchas veces formando más esclerocios. El inóculo es

producido en el interior o exterior del tejido hospedero, ocurriendo sucesivamente

nuevos ciclos cuando los tubérculos están formados y el material vegetal está disponible

(Cotes, 2007).

Hofman & Jongebloed (1988) tras un estudio sobre la infección de plantas de papa,

señalaron la relación entre el desarrollo del micelio de R. solani Kühn en la superficie de

los brotes con la agresividad de la enfermedad. Observaron que bajo el micelio durante

la infección, las hifas pueden penetrar en las células de la epidermis del tejido, proceso

causado por la actividad enzimática del patógeno. La colonización del tejido de la planta

es inicialmente restringida a una o dos capas celulares bajo el micelio, la degradación de

la pared celular y la muerte de sus células es más común en la tercera y cuarta capa

25

celular; finalmente las lesiones pueden llegar hasta cerca de doce capas de células,

alcanzando los haces vasculares del tallo, llegando a diseminarse la infección al floema

y en casos agresivos también el xilema. Las lesiones que circundan un brote causan

necrosis, ocasionando la aparición de rebrotes jóvenes. Concluyeron que el tamaño de la

laceración causada por la infección de R. solani Kühn es proporcional al tamaño del

colchón de infección en la superficie de los brotes, indicando que el daño es producido

después de la penetración del hongo desde el colchón de infección; el tamaño de la

lesión constituye en el tallo un limitante para su crecimiento. Excepto durante la

colonización inicial de células externas, el micelio nunca se observa en tejido sano; por

lo tanto, el tejido colonizado de la planta se restringe a la parte directamente bajo el

colchón de infección. R. solani Kühn coloniza el tejido muerto después de pocos días,

donde puede utilizar los nutrientes liberados de zonas necrosadas para su crecimiento.

Brotes emergidos saludables pueden infectarse severamente y caerse (Hofman &

Jongebloed, 1988).

1.3.19. Síntomas de costra negra

El género Rhizoctonia se caracteriza por la formación de estructuras de resistencia

con redes hifales que unen el micelio con la planta. Esto ha dado origen a la clasificación

de muchos hongos en el género. Los síntomas típicos de la enfermedad de costra negra

en la papa incluyen: la muerte de brotes emergentes, necrosis de tallos subterráneos y

estolones, disminución del sistema radical, cambio de coloración a marrón en las raíces

y la formación de esclerocios en tubérculos maduros y en desarrollo (Tsor et al., 2001).

26

Rhizoctonia solani Kühn ataca a brotes y tallos a partir de esclerocios presentes en el

suelo o en la semilla. Es fácil identificar campos paperos en el país con pobre

emergencia debido a costra negra. En las raíces, los estolones y la parte baja del tallo, el

hongo forma lesiones alargadas, hundidas de color café rojizo. La infección trae consigo

la “poda” de estolones y raíces por necrosis, afectando directamente al volumen de raíz.

En cuadros más avanzados, la infección de raíces y tallos se expresa en la parte aérea

con un enrollamiento hacia la cara superior de las hojas. Se puede presentar clorosis

foliar y formación de tubérculos aéreos como producto de la acumulación de azúcares

que no pueden ser transportados a los tubérculos debido a la estrangulación del tallo. A

veces se observa una mancha de color blanquecina al pie del tallo (INIAP, 2005).

Los síntomas en los tubérculos se pueden parecer a los de la sarna de pradera, pero

difieren de estos últimos por tener esclerocios y rajaduras. Un ataque severo a las yemas

deforma los tubérculos y causa un fenómeno conocido como tubérculos en “formas de

muñecas”. Cuando el follaje madura y muere, el hongo forma esclerocios delgados y

negros en la superficie del tubérculo. Los síntomas son especialmente visibles después

de lavar el tubérculo (INIAP-CIP, 2002; Torres, 1997).

Esta enfermedad no siempre está asociada a reducciones de rendimientos, pero la

formación de esclerocios sobre los tubérculos reduce su calidad comercial, lo que

asociado con el desarrollo de tubérculos mal formados, alteraciones en el tamaño y en el

número de los mismos, resulta en pérdidas económicas considerables en el cultivo (Jager

et al., 1996).

27

Es importante destacar que las plántulas y tubérculos enfermos (Figura 1.3)

presentan:

Estrangulamiento del cuello de la planta

Una mancha algodonosa en el cuello de la planta

Retardo de desarrollo

Hojas superiores marchitas y enrolladas

Clorosis foliar

Formación de tubérculos aéreos

Tubérculos deformes

En la superficie de los tubérculos maduros se forman costras negras llamadas

esclerocios que son estructuras de reproducción de R. solani Kühn.

Figura 1.3. A: Esclerocios de R. solani Kühn en tubérculo maduro. B: Necrosis de raíz causada por R.solani Kühn (Galárraga, 2014).

28

1.3.20. Control de la enfermedad

La incidencia de costra negra puede disminuir significativamente si se mantiene

cuidadosamente el cultivo de la solanácea. Torres (1997) aconseja los siguientes

cuidados para los cultivos:

Usar material germoplásmico libre de esclerocios.

Evitar el monocultivo haciendo rotaciones con cultivos no hospedantes del

hongo, como los cereales.

Realizar la desinfección del material vegetal con fungicidas sistémicos, para

proteger a las plantas durante la emergencia.

Aplicar fungicidas al suelo en el momento de la siembra, disminuye los daños

pero no incrementa los rendimientos.

Sembrar el tubérculo de forma superficial para que la planta tenga una mayor

emergencia. La susceptibilidad de la planta a la infección disminuye con el

desarrollo del follaje.

La rotación con papa debe ser amplia, se aconseja realizarlo a 1:5 ciclos.

Acortar el tiempo en que los tubérculos permanecen en el suelo una vez cortado

el follaje.

No todos los esclerocios son viables. No es necesaria una desinfección de

semillas de papa para un cultivo si la semilla tiene menos de un 25%.

29

CAPÍTULO 2 - MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Participantes

El trabajo de tesis fue realizado por Edison Galárraga, con la dirección de Alma

Koch, MSc. y codirección de Andrés Izquierdo, PhD.

2.2. Zona de estudio

La investigación fue ejecutada en conjunto con el Instituto Nacional Autónomo de

Investigaciones Agropecuarias (INIAP). Se buscó evaluar el comportamiento de

diferentes materiales germoplásmicos de papa frente al fitopatógeno R. solani Kühn a

nivel de invernadero. Se utilizaron ocho variedades de papa de INIAP y doce clones

promisorios distribuidos en cuatro repeticiones y dos testigos aleatorizados en seis

bloques del invernadero.

El estudio molecular se realizó en los laboratorios de Microbiología de la

Universidad de las fuerzas Armadas-ESPE, campus Sangolquí, y en los invernaderos de

la Estación científica de Santa Catalina de INIAP, ubicada en Cutuglagua.

Duración de la Investigación

El proyecto de tesis fue desarrollado en el periodo de abril-diciembre del 2014.

2.3. Revisión bibliográfica

El proceso investigativo se inició con una revisión bibliográfica sobre el manejo de

Rhizoctonia solani Kühn en el laboratorio, su biología y manejo. También se

30

consultaron métodos de aislamiento del hongo a partir de esclerocios, métodos de

inoculación en tierra y la caracterización de la enfermedad tanto en la plántula como en

el tubérculo.

2.4. Fase de campo-toma de muestras

Se tomaron muestras de papa con Rizoctoniosis o costra negra de la localidad de

San Gabriel, Cantón Montúfar, provincia de Carchi, coordenadas 0.6, -77.81667, altura:

2900 msnm, el aislamiento del fitopatógeno se realizó en los laboratorios de

Microbiología de las Fuerzas Armadas (ESPE).

Las muestras se envolvieron en toallas de papel, se colocaron en un sobre de papel y

se rotularon respectivamente. Las muestras de los tubérculos con sintomatología de

costra negra se transportaron en un termo.

2.5. Fase de laboratorio

Esta fase se realizó en los Laboratorios de Microbiología de la Carrera de Ingeniería

en Biotecnología de la Universidad de las fuerzas Armadas (ESPE), que se encuentran

ubicados en Sangolquí, Av. El Progreso, s/n, Cantón Rumiñahui, provincia de Pichincha,

0º 18,81 S; 78º 26, 64 O; altitud: 2516 msnm.

31

2.6. Aislamiento de Rhizoctonia solani Kühn

2.6.1. Preparación de medio de cultivo

Se preparó medio PDA, usando 39 g de PDA (Difco®) por cada litro de agua

destilada, se esterilizó a una temperatura de 121°C durante 15 min, una vez que la

temperatura bajó a los 37°, se colocó 2 µL de cloranfenicol por cada litro de PDA, con el

fin de inhibir el crecimiento bacteriano, y se dispensó 25 mL en cada caja petri estéril

dentro de una cámara de flujo laminar (Figura 2.1) para evitar la contaminación

ambiental (Castellanos et al., 2007).

Figura 2.1 Dispensación de medio PDA en cajas petri dentro de una cámara de flujo laminar (Galárraga,2014).

2.6.2. Desinfección de los explantes tubérculos de Solanum tuberosum

Los tubérculos con esclerocios fueron lavados bajo agua corriente para eliminar el

exceso de tierra, se colocaron las muestras en un vaso de precipitación de 1000 mL

cubierto con una gasa, y se dejó caer el agua sobre el vaso durante una hora. Dentro de

31














31














32

la cámara de flujo laminar se cortaron las secciones que contenían esclerocios y se

realizó una desinfección con Hipoclorito de Sodio (NaClO) 0.5% durante 3 min. Se

lavaron tres veces en agua destilada estéril para eliminar los residuos de cloro.

Posteriormente se procedió con la ayuda de un bisturí y unas pinzas estériles a separar

los esclerocios del tubérculo para sembrarlos en medio PDA con cloranfenicol, este

último inhibe el crecimiento de bacterias presentes en el medio ambiente y en el

tubérculo (CIAT, 2008).

2.6.3. Aislamiento

Se incubaron los medios con los esclerocios a 22°C durante cinco días y según las

características morfológicas de cada colonia, se procedió a separar las cepas de

Rhizoctonia solani Kühn haciendo un corte con bisturí en el extremo más alejado de las

demás colonias existentes para garantizar la pureza del cultivo. Se realizó un pase de

medio en PDA con cloranfenicol y se dejó incubar. Se observaron las cajas todos los

días para diferenciar las colonias presentes (CIAT, 2008).

2.6.4. Observación del cultivo al microscopio

Se multiplicaron los medios con Rhizoctonia solani Kühn para luego observar al

microscopio y garantizar la pureza del cultivo. Se cortó un pedazo de cinta adhesiva

transparente y se pegó al micelio del hongo dentro de la caja petri. En un portaobjetos

se colocó una gota de azul de metileno y sobre esta un pedazo de cinta adhesiva con el

micelio del fitopatógeno. R. solani Kühn al microscopio muestra una estructura peculiar,

entre sus ramificaciones forma ángulos de 90°. No se observaron esporas asexuales, R.

33

solani forma esporas sexuales únicamente en condiciones especiales (Acosta et al.,

2011).

2.6.5. Extracción de ADN de R. solani Kühn

Para obtener el material genético se utilizó el protocolo de extracción de ADN en

hongos a partir de medio sólido de Goodwin & Lee (1993), modificado por Galárraga

(2014).

Se tomó aproximadamente 0.5 g de medio sólido, raspando el micelio con un bisturí

estéril y se colocó en vial de 1,5 mL. Se adicionó 200 µL de buffer de lisis (50mM Tris

HCL pH 7.2, 50 mM EDTA, 3% SDS y 1% de Mercaptoetanol) y se calentó al

microondas durante 10 s al máximo nivel.

Se adicionó 200 µL del buffer de lisis y se incubó a 80°C durante 10 min. Se enfrió

a 50°C, se adicionó también 12 µL de proteínasa K y se incubó a 50°C durante 30 min.

Se agregó v/v de etanol absoluto a la master mix y se centrifugó a 10000 g durante

10 min. Una vez centrifugado se tomó el sobrenadante y se transfirió a un tubo nuevo

colocando v/v de cloroformo alcohol isoamílico 24:1 y se centrifugó a 10000 g durante

10 min.

Se tomó el sobrenadante y se colocó en un nuevo tubo eppendorf adicionando 700

µL de isopropanol con 70 µL de acetato de sodio. La mezcla se dejó precipitar 20°C

durante toda la noche. Se centrifugó a 10000 g durante 10 min. Se adicionó 10 µL de

RNAsa (1mg/mL) dejando incubar a 37°C durante 30 min.

34

Se descartó el pellet y se realizaron dos lavados con etanol al 70%. Se eliminó el

etanol y se secó durante 10 min a 50°C en el Termo bloque, se resuspendió con 50 uL de

agua ultra pura.

2.6.6 PCR anidada para la determinación del Grupo de Anastomosis 3 (AG3)

Se realizó una nested PCR para la confirmación del grupo de anastomosis 3 para las

muestras aisladas desde esclerocios (Figura 2.2). En primera instancia se amplificó

regiones ITS (Internal Transcripts Spaces). Estos transcritos tienen un sin número de

ventajas como: un gran número de copias lo que facilita su amplificación (Van Tuinen et

al., 1999), representación de una huella informativa para cada hongo (Gardes & Bruns,

1993) y regiones conservadas (5.8S, 18S y 28S) lo que permite un fácil diseño de

primers (Henrion et al., 1994).

En la primera etapa se utilizaron los primers generalistas ITS1 e ITS4 para

amplificar un fragmento de ADN ribosomal de aproximadamente de 700 pb, con el fin

de lograr mayor especificidad. Con el producto de PCR obtenido al amplificar la región

ITS1-5.8S-ITS2 se utilizaron los primers Rs1F2 y Rs2R1 específicos para AG 3 que

amplifican un fragmento de alrededor de 500 pb (Lees, K. et al., 2002).

2.6.7. Amplificación de las regiones ITS1-5.8S-ITS2

En la primera PCR para la amplificación de las regiones ITS1-5.8S-ITS2 del ADN

ribosomal de R. solani Kühn se utilizó: el primer forward ITS1 (5´-

TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3´) y el primer reverse ITS4 (5´-

TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´). Amplifican un fragmento de un tamaño

35

aproximado de 700 pb. La reacción de PCR con un volumen final de 25 µL contenía: 1X

buffer de PCR, 1.5 mM de MgCl2, 0.2 mM de dNTP´s, 10 mM de cada primer, una

unidad de Taq DNA polimerasa y 1,5 µL de ADN. Los ciclos de amplificación

utilizados fueron modificados de Fernández (2011) como se describe a continuación: un

ciclo inicial de desnaturalización a 95 °C por 2 min; seguido de 35 ciclos de 95 °C por

45 s, 63 °C por 60 s y 72 °C por 90 s; con un ciclo final de extensión de 72 °C por 5 min

(Fernández, 2011; White et al., 1990).

2.6.8. Amplificación de regiones específicas para AG-3

La segunda PCR para la confirmación del grupo de anastomosis 3 (AG-3) utilizó los

iniciadores forward Rs1F2 (5′-TTGGTTGTAGCTGGTCTATTT-3′) y reverse Rs2R1

(5′TATCACGCTGAGTGGAACCA-3′). La reacción de PCR con un volumen final de

25 µL contenía: 1X buffer de PCR, 2 mM de MgCl2, 0.2 mM de dNTP´s, 0.3 mM de

cada primer, una unidad de Taq DNA polimerasa y 2 µL del producto de PCR de la

primera fase. Los ciclos de amplificación a utilizarse fueron: un ciclo inicial de

desnaturalización a 95 °C por 2 min; seguido de 35 ciclos de 95 °C por 45 s, 63 °C por

60 s y 72 °C por 90 s; con un ciclo final de extensión de 72 °C por 5 min (Fernández,

2011).

36

Figura 2.2 Armada de PCR dentro de una cámara de flujo laminar (Galárraga, 2014).

2.6.9. Electroforesis en gel de agarosa

Los productos de PCR se corrieron en un gel de agarosa al 2%, para lo cual se pesó

1.6 g de agarosa (DifcoTM) por cada 80 mL de TBE 1X, se calentó en estufa con

agitación y se llevó al microondas donde fue calentada a máxima potencia durante

cortos intervalos de tiempo para evitar que hierva y se derrame. Diluida la agarosa, se

dejó enfriar y se colocó el SYBR® Green (InvitrogenTM) 1.5X como fluoróforo para la

visualización de ADN una vez corrida la muestra.

Las muestras se corrieron a 300mA y 100V durante una hora en un ambiente libre de

luz.

2.6.10. Multiplicación de Rhizoctonia solani Kühn

Se realizaron cortes de aproximadamente 0.5 cm en el cultivo madre aislado y se

transfirieron a cajas petri con medio PDA fresco, se sellaron con parafilm y se incubaron

a 24°C.

36










luz.




a 24°C.

36










luz.




a 24°C.

37

La multiplicación de los cultivos se realizó con el fin de tener suficiente material

biológico para la siembra en semillas de avena, que sirven como medio de soporte en la

inoculación de macetas con tierra, en donde se sembró el material germoplásmico de

variedades INIAP y clones promisorios, para determinar su resistencia ante costra negra.

2.6.11. Preparación del inóculo de R. solani Kühn

El inóculo de R. solani Kühn se preparó en semilla de avena previamente

autoclavada. El método utilizado fue tomado de Paulitz & Schroeder, 2005 y

modificado. Se utilizó una proporción de 2:1 entre avena y agua. En Erlenmeyers de 1 L

se distribuyó la mezcla y se autoclavó dos veces a 121°C durante 15 minutos. Una vez

enfriada la mezcla ya estéril, en una cámara de flujo laminar, se procedió a colocar 5 g

de cultivo de R. solani Kühn de siete días en cada Erlenmeyer (Figura 2.3). El inóculo

permaneció en los Erlenmeyers durante 18 días en un ambiente de 24°C sin luz.

Se realizaron dos hidrataciones al inóculo, dentro de una cámara de flujo, cada una

de 100 mL (Paulitz & Schroeder, 2005).

Figura 2.3 A: cortes en el medio PDA con R. solani. B: Preparacion del inóculo dentro de una cámara deflujo laminar (Galárraga, 2014).

38

2.6.12. Inoculación de Tierra con germoplasmas

Las germoplasmas (20 germoplasmas distintos entre variedades INIAP y clones

promisorios) de papa fueron lavados con agua corriente y secados a la sombra, para

después ser sembrados y tapados con una parte de tierra estéril. Se realizaron cuatro

repeticiones con dos tratamientos testigos (sin inóculo) (Tabla 2.1).

Tabla 2.1 Materiales germoplásmicos evaluados (Galárraga, 2014)

N° Variedad Tipo1 INIAP-ESTELA Variedad mejorada2 INIAP-FRIPAPA Variedad mejorada3 INIAP-PUCA

SHUNGOVariedad mejorada

4 INIAP-NATIVIDAD

Variedad mejorada

5 INIAP-SUPERCHOLA

Variedad mejorada

6 INIAP-VICTORIA Variedad mejorada7 INIAP-YANA

SHUNGOVariedad mejorada

8 RUBI Variedad mejorada9 07-32-15 Clon promisorio

10 12-2-6 Clon promisorio

11 12-2-18 Clon promisorio12 12-3-3 Clon promisorio13 12-4-71 Clon promisorio14 12-4-46 Clon promisorio15 12-4-170 Clon promisorio16 12-6-1 Clon promisorio17 12-6-24 Clon promisorio18 97-25-3 Clon promisorio19 98-2-6 Clon promisorio20 98-38-12 Clon promisorio

39

Se utilizaron 20 g de avena con R. solani para inocular 3 Kg de tierra autoclavada

(una parte de arena de río y tres partes de arena de zanja). Se inoculó un total de 120

macetas con una capacidad de 3 Kg cada una (Figura 2.4).

Figura 2.4 A: Inoculación de tierra para la siembra de germoplasmas. B: Materiales inoculados eninvernadero (Galárraga, 2014).

2.6.13. Control de Inóculo

Se realizó un control de inóculo a los 90 días de haber empezado el experimento en

el invernadero. Se tomó 100 g de muestra de suelo a una profundidad de 10 cm dentro

de la maceta. Se mezclaron con 2.5 L de agua, se dejó reposar la suspensión durante 30

s y se filtró. Se colocaron entre dos capas de papel estéril y se secó. Se colocó la tierra en

platos petri con PDA más cloranfenicol y se incubó 48 h a 24°C. Se traspasó el hongo a

un nuevo medio con PDA se incubaron 48 h a 24°C. Se observó el micelio al

microscopio.

40

2.6.14. Manejo del experimento

Luego de la siembra, se hizo un riego y posteriormente se mantuvo el sustrato en

capacidad de campo. A los 47, 62 y 77 días se realizaron fertilizaciones con 20-19-19-

0.5 MgO (Nitrofosca foliar). Los controles de plagas y enfermedades se realizaron de

acuerdo a la exigencia del cultivo.

El ensayo se mantuvo durante seis meses en condiciones de invernadero en la

estación experimental “Santa Catalina” de INIAP en la parroquia Cutuglagua del cantón

Quito (Figura 2.5).

Figura 2.5 A: Invernadero de la estación científica Santa catalina donde se realizó el ensayo. B:Disposición de los bloques en el invernadero (Galárraga, 2014).

2.7. Método de evaluación

El diseño estadístico que se utilizó fue en bloques al azar con un arreglo factorial

con cuatro repeticiones y dos tratamientos testigo. Las evaluaciones se realizaron

41

semanalmente tomando datos de la altura de las plantas, y de la sintomatología aérea de

costra negra (hojas deformes y amarillentas, defoliación, plantas marchitas y muertas).

Se midió el porcentaje de emergencia a los 25, 32 y 49 días después de la siembra. A

la cosecha se evaluó el porcentaje de daño de raíz y base de tallo (Clive, 1971), el

porcentaje de esclerocios en el tubérculo y el rendimiento expresado en kg/maceta (ver

Tabla 2.2).

= 0 ∗ + 1 ∗ + 2 ∗ + 3 ∗ + 4 ∗4 ∗ é ∗ 100Tabla 2.2 Criterio de Clive para la evaluación de tubérculos (Clive, 1971).

Escala Infección

(%)

Reacción

0 0 Sana

1 1 a10 Muy ligera

2 11 a 25 ligera

3 26 a 50 Moderada

4 > 51 Severa

Se realizó un ANOVA y pruebas de medias con diferencia mínima de significancia

además de un análisis de Tukey para cada variable para poder seleccionar los materiales

germoplásmicos que presentan tolerancia a R. solani.

42

CAPÍTULO 3 – RESULTADOS


El aislamiento de R. solani a partir de esclerocios de tubérculos infectados fue

conseguido en medio PDA con cloranfenicol (Figura 3.1). Para obtener un cultivo puro

se hicieron constantes traspasos de medio realizando cortes en los extremos del micelio

(Castellanos et al., 2007).

Figura 3.1 Cultivo aislado de Rhizoctonia solani Kühn en medio PDA en caja petri (Galárraga, 2014).

Se observó al microscopio la morfología del micelio del hongo con la técnica de

tinción de azul de lactofenol (Figura 3.2) para la comprobación morfológica del género

Rhizoctonia (French, 1982).

El cultivo puro de Rhizoctonia solani Kühn se caracterizó por tener un color blanco

en el micelio joven. A medida que maduraba, se tornó de un color marrón. R. solani se

42













42













43

caracteriza por formar esclerocios a través de la fusión de hifas, en este proceso se pudo

observar la segregación de una sustancia de color ambar previo a la formación de los

esclerocios. Estas estructuras son capaces de sobrevivir a la deshidratación y a

temperaturas bajas en condiciones de campo (Torres, 1997).

Figura 3.2 Tinción de hifas de Rhizoctonia solani Kühn vista en el objetivo de 40X. A: Se observaramificación de la hifa principal en angulo de 90°. B: Se observa constricción de septos y ramificaciones

de hifas jóvenes (Galárraga, 2014).

3.2. Extracción de ADN de Rhizoctonia solani Kühn

La metodología de Goodwin & Lee (1993) modificada por Galárraga (2014)

permitió la extracción de ADN en concentraciones elevadas y sin contaminación de

compuestos fenólicos que interfieran con los demás procedimientos.

La concentración promedio de las muestras procesadas presentó un valor de 1676

ng/µL y una pureza promedio de 1.87; lo que sugiere que el protocolo empleado fue

aceptable para este tipo de muestras (Tabla 3.1).

44

Las concentraciones óptimas necesarias para una PCR rodean los valores de 15

ng/µL, por lo que se realizó alícuotas con agua destilada grado PCR y se conservaron las

muestras a -20°C para su posterior uso. Las muestras de material genético pueden

conservarse a -20°C durante periodos intermedios de tiempo, luego se debe conservar a -

80°C, temperatura en la cual puede mantenerse durante años (Goodwin & Lee, 1993).

Tabla 3.1. Valores de concentración y absorbancias de ADN total extraído de Rhizoctonia solani

Kühn con el método de extracción a partir de medio sólido de Goodwin & Lee (1993).

Muestra Concentración(ng/µL)

A(260/230)

A(260/280)

M1-1 357,8 1,9 1,897

M1-2 1853 2,26 1,875M1-3 3339 1,46 1,678

M2-1 950,8 2,05 1,875M2-2 2994 1,775 1,75

M2-3 563 2,03 2,16

La cuantificación fue realizada en el equipo Nanodrop® y los resultados dados por

el sistema se muestran en el ANEXO II.

3.3. Nested PCR para la confirmación de Rhizoctonia solani AG3

3.3.1. Amplificación de Regiones ITS1-5,8S-ITS2

La amplificación de la región ITS1-5,8S-ITS2 del ADN de Rhizoctonia solani Kühn

obtenido de esclerocios de Solanum tuberosum mostró buena integridad de bandas, sin

productos inespecíficos y sin la amplificación del control negativo (Figura 3.3). La

región ITS1-5,8S-ITS2 mostró un tamaño aproximado de 700 pb (Hidalgo et al., 1997).

45

Figura 3.3 Electroforesis de la región ITS1-5,8-ITS2 con su control negativo C (-).Gel de agarosa al2% teñido con 0,05 µg/mL (v/v) de SYBR® Safe gel stain. Corrida a 100V por 1 h. MM: Marcador de

peso molecular 100 bp (Invitrogen ®) (Galárraga, 2014).

3.3.2. PCR específica para Grupo de Anastomosis 3 (AG3) de Rhizoctonia solani

Kühn

Para la confirmación del Grupo de Anastomosis 3 (AG3) se utilizaron los productos

de PCR de la amplificación de las regiones ITS1-5,8S-ITS2. Los primers utilizados

Rs1R2 y Rs2R1, forward y reverse respectivamente, fueron diseñados por Lees et al.

(2002). Las muestras de Rhizoctonia solani Kühn fueron positivas al grupo de

anastomosis 3 (AG3), presentando bandas de aproximadamente 500 pb, lo cual reporta

Lees et. al (2002) en sus ensayos. No se presentaron amplificaciones de productos

inespecíficos ni del control negativo C (-) (Figura 3.4).

46

Figura 3.4 Amplificación de la región específica para AG3 con su control negativo C (-).Gel deagarosa al 2% teñido con 0,05 µg/mL (v/v) de SYBR® Safe gel stain. Corrida a 100V por 1 h. MM:

Marcador de peso molecular 100 bp (Invitrogen ®) (Galárraga, 2014)..

3.4. Preparación del Inóculo

La semilla de avena fue humedecida dentro de una cámara de flujo laminar con

agua estéril, conforme requerían las condiciones del medio (Figura 3.5-A). Al principio

se cubrieron los Erlenmeyers con parafilm pero a la segunda semana se colocaron

tapones de algodón con gasa estériles para mantener la aireación del inóculo. El inóculo

estuvo listo a los 29 días (Figura 3.5-B) y en ese tiempo se realizaron alrededor de cinco

humidificaciones de 100 mL cada una.

47

Figura 3.5. A: Preparación del inóculo de Rhizoctonia solani Kühn en semillas de avena. B: InoculoR. solani a los 29 días (Galárraga, 2014).

3.5. Sintomatología aérea

Dentro de invernadero el comportamiento de Rhizoctonia solani Kühn fue distinto al

comportamiento de campo descrito por Acosta et al. (2011). Los cuatro bloques del

invernadero presentaron marchitez foliar a partir de los 45 días de empezado el ensayo.

La sintomatología de costra negra fue enmascarada por otras enfermedades originadas

del tubérculo semilla, además, de plagas secundarias y no pudo ser evaluada. Se observó

marchitez foliar en tratamientos testigo, este es el caso de los materiales

germoplásmicos: I-Victoria, 98-2-6, 12-4-170 y I-Rubí. Como control de plagas y con el

fin de fortalecer las plantas hasta la tuberización se utilizó nitrofosca foliar (20-19-19-

0,5 MgO). Durante el ensayo no se observó la formación de tubérculos aéreos en

ninguno de los bloques.

3.6. Análisis estadístico

Con los datos obtenidos de las mediciones y de la cosecha de los tubérculos se

realizó un análisis de normalidades para ver el comportamiento de los datos. Una vez

48

identificado el tipo de datos (paramétricos o no paramétricos) se procedió a realizar un

análisis comparativo de Tukey para encontrar la significancia de los datos y así poder

clasificar las variedades según su sintomatología. Se agruparon las variedades en:

altamente tolerantes (AT), tolerantes (T), parcialmente tolerantes (PT) o susceptibles

(S). Se utilizó el software estadístico INFOSTAT.

3.7. Porcentaje de emergencia

Todas las variedades de todos los tratamientos mostraron una emergencia del 100%

a partir de los ocho días de cultivo a excepción de la variedad mejorada I-Superchola la

cual mostró un 83.3% de emergencia, la primera repetición de este tratamiento mostró

pudrición del tubérculo por Erwinia carotovora.

3.8. Altura de las variedades inoculadas

Se realizaron controles periódicos de la altura de las plantas a partir de los tres

meses de iniciado el ensayo. El análisis de varianza para la altura de la planta presentó

una baja significación estadística de la diferencia de alturas entre los tratamientos

inoculados respecto a los tratamientos testigo. La media de la altura fue 41.83 cm y el

coeficiente de variación para la altura de las plantas fue de 30.05% como se muestra en

la Tabla 3.2.

49

Tabla 3.2 Análisis de varianza de la altura de las plantas de papa del ensayo de evaluación de laresistencia ante Rhizoctonia solani Kühn.

F.V. GL CM FcTOTAL 117TRATAMIENTOS 38 284.90 *ERROR 79 151.54X (%) 41.83CV (%) 30.05

La media aritmética del promedio de altura para los 40 tratamientos fue analizada

estadísticamente mediante un análisis de Tukey. La variedad I-Rubí resultó ser la de

menor tamaño en ambos tratamientos (Figura 3.6).

En los tratamientos inoculados, la menor altura de planta, se presentó en la variedad

mejorada I-Rubí con un valor de 20.25 cm. En rangos de alturas compartidas (AB) se

encontraron el resto de tratamientos con un rango de 28.75 cm (clon promisorio 12-6-1)

a 55.50 cm (variedad mejorada I-Puca) (Tabla 3.6).

En los tratamientos testigos con la menor altura de planta, se presentó la variedad

mejorada I-Rubí con 21 cm de altura de planta mientras que el resto de variedades

mostraron rangos compartidos (AB) con un promedio de 27.50 cm (Variedad mejorada

I-Estela) hasta 61.50 cm (Clon promisorio 07-32-15), la mayor altura para este

tratamiento la tiene el clon promisorio 12-3-3 con un valor promedio de 65.50 cm (Tabla

3.3).

50

Figura 3.6 Diagrama de barras para las alturas de las plantas con su error estándar (Galárraga,

2014).

Las alturas de todos los tratamientos incluyendo inoculados y testigos se mostraron

similares. Los tratamientos testigo mostraron una mínima diferencia estadística en su

altura a comparación con los bloques inoculados.

51

Tabla 3.3 Alturas promedio y pruebas de Tukey para la variable altura de planta en el ensayo deevaluación de la resistencia ante Rhizoctonia solani Kühn.

TRATAMIENTOS INOCULADOS TRATAMIENTOS TESTIGOSPROMEDIOS RANGOS PROMEDIOS RANGOS

I-RUBI 20.25 A* I-RUBI 21.00 A*

12-6-1 28.75 AB I-ESTELA 27.50 AB

I-VICTORIA 31.50 AB I-VICTORIA 33.00 AB

12-4-46 33.50 AB I-FRIPAPA 33.00 AB

98-2-6 34.25 AB 12-2-18 33.00 AB

I-FRIPAPA 35.25 AB 98-38-12 35.00 AB

I-NATIVIDAD 35.75 AB 12-6-1 36.50 AB

I-SUPERCHOLA 35.75 AB I-YANASHUNGO

38.50 AB

12-2-6 36.50 AB SUPERCHOLA 40.00 AB

I-YANA SHUNGO 38.50 AB 98-2-6 40.50 AB

I-ESTELA 40.00 AB I-NATIVIDAD 45.00 AB

98-38-12 44.50 AB 12-2-6 45.50 AB

12-4-170 45.25 AB 12-6-24 47.50 AB

12-2-18 45.75 AB 12-4-46 47.50 AB

12-3-3 46.00 AB 12-4-170 55.50 AB

12-6-24 46.25 AB 97-25-3 55.50 AB

12-4-71 47.00 AB 12-4-71 56.00 AB

07-32-15 48.50 AB I-PUCA SHUNGO 56.00 AB

97-25-3 51.25 AB 07-32-15 61.50 AB

I-PUCA SHUNGO 55.50 AB 12-3-3 65.50 B

3.9. Evaluación a la cosecha de los tubérculos

La evaluación de los tubérculos se realizó a los seis meses de comenzado el ensayo

en invernadero. Se cortó el follaje una semana antes de la cosecha con el fin de acelerar

la madurez de los tubérculos, garantizando la acumulación de materia seca, factor

importante en la calidad del tubérculo.

A la cosecha de los tubérculos se observó que los veinte materiales inoculados,

mostraron similar sintomatología en todos los bloques, la necrosis de raíz, fue el factor

52

común en todas las variedades. El 80% de las raíces y tallos de los tratamientos

inoculados se encontraban necrosadas por R. solani. Este síntoma se observó con mayor

intensidad en la variedad I-Rubí del cuarto bloque (Figura 3.7-A) y en el clon promisorio

97-25-3 del segundo bloque (Figura 3.7-B).

Figura 3.7 A: Necrosis en tallo de la variedad I-Rubí del cuarto bloque a los cinco meses deiniciado el ensayo. B: Necrosis de tallo en el clon promisorio 97-25-3 del segundo bloque a los 135 días

del cultivo (Galárraga, 2014).

Se encontró la formación de tubérculos en forma de muñecos en las variedades: I-

Estela, I-Victoria y en el clon promisorio 12-2-6. En las variedades: I-Fripapa, I-

Superchola, I-Yana Shungo, I-Rubí, y en los clones 98-2-6 y 98-38-12 se encontró

síntomas de sarna causados por la bacteria Streptomyces scabies. Los tratamientos

testigo no presentaron sintomatología en los tubérculos y mostraron buena apariencia.

En el ANEXO III se describe la sintomatología presentada por maceta de cada

variedad por cada bloque.

3.10. Severidad de la infección

Se utilizó el criterio de Clive para la evaluación y clasificación de los tubérculos

según la sintomatología de costra negra. Se realizó un análisis de varianza y se encontró

53

un coeficiente de variación (C.V.) de 39.16% y una media de infección de esclerocios de

22.50% en variedades inoculadas, una suma de cuadrados de 351.74 y un valor de

contraste (FC) de baja significancia (≤ 0.05) (Tabla 3.4).

Tabla 3.4 Análisis de varianza del porcentaje de severidad de la infección de papas del ensayo de

evaluación de la resistencia ante Rhizoctonia solani Kühn.

F.V. GL CM FcTOTAL 79TRATAMIENTOS 19 351.74 *REPETICIONES 3 60.64ERROR 57 77.66X (%) 22.52C.V. (%) 39.16

Para el análisis de Tukey del porcentaje de infección del tubérculo (Tabla 3.8) se

encontraron cuatro rangos de significancia los cuales relacionaron y clasificaron los

materiales germoplásmicos evaluados según la tolerancia presentada. Los resultados

muestran que al menos uno de los tratamientos inoculados fue diferente a los demás. En

el primer rango compartido (AB), se encuentran 17 de los materiales germoplásmicos

evaluados. La variedad mejorada I-Rubí presentó el valor más alto de infección con

34.78%, seguido por el clon 97-25-3 con 33.10%, I-Fripapa con 30.13% y el clon 98-38-

12 con 29.30% de severidad (Figura 3.8). El clon promisorio 12-2-6 obtuvo el menor

valor dentro de este rango con un promedio de infección de 14.38%, mostrando una

tolerancia parcial (TP) a Rhizcotonia solani Kühn.

54

Figura 3.8 Tubérculos con costra negra de la variedad mejorada I-Rubí. A: I-Rubí primera repetición. B:I-Rubí segunda repetición. C: I-Rubí tercera repetición. D: I-Rubí cuarta repetición (Galárraga, 2014).

Los más bajos niveles de infección por costra negra se encontraron dentro del rango

compartido CD. El clon promisorio 12-4-170 obtuvo un valor de 6,93% de infección en

tubérculos (Figura 3.9-A). El clon promisorio 12-6-1 obtuvo un valor de 5.62% de

severidad en el tubérculo, mostrando una tolerancia moderada (TM) a costra negra

(Figura 3.9-B). La variedad mejorada I-Puca es considerada como altamente tolerante

(AT) a costra negra con un valor de 0.00% de severidad (Figura 3.9- C).

55

Figura 3.9 A: Tubérculos del clon promisorio 12-4-170, primer bloque. B: Tubérculos del clonpromisorio 12-6-1, primer bloque. C: planta y tubérculos de la variedad 3 correspondiente a I-Puca, cuarto

bloque (Galárraga, 2014).

De los 20 materiales germoplásmicos en estudio: la variedad (I-Puca) presentó alta

tolerancia; dos se mostraron tolerantes (clones promisorios: 12-4-170 y 12-6-1); nueve

se presentaron parcialmente tolerantes y ocho fueron encontrados susceptibles (Tabla

3.5). Las variedades más susceptibles a Rhizoctonia solani Kühn fueron: I-Rubí, seguido

del clon promisorio 97-25-3 e I-Fripapa. Ninguno de los testigos presentó

sintomatología (Figura 3.10).

56

Figura 3.10 Diagrama de cajas con sus media de la severidad de las variedades de papa inoculadas(Galárraga, 2014).

Las variedad y clones promisorios: I-Estela, 98-2-6, I-Yana Shungo, 12-3-3, mostraron

Suceptibilidad (S) a Rhizoctonia solani Kühn con una media de 28.67% de severidad.

Estas variedades mostraron gran número de esclerocios en el tubérculo y altos niveles de

necrosis en raíz.

57

Tabla 3.5 Resultados del análisis de tukey, rangos de los valores promedios del porcentaje deinfección de costra negra en tubérculos de papa. Tipo de resistencia: alta resistencia (AR), resistencia ®,

resistencia parcial (RP) o susceptibilidad (S).

TRATAMIENTOS INOCULADOS TRATAMIENTOS TESTIGO

VARIEDAD % DEINFECCIÓN

RANGO TIPO DERESISTENCIA

VARIEDAD %INF

RUBI 34.78 A S RUBI 0.00

97-25-3 33.10 A S 97-25-3 0.00

I-FRIPAPA 30.13 A S I-FRIPAPA 0.00

98-38-12 29.30 AB S 98-38-12 0.00

12-3-3 29.15 AB S 12-3-3 0.00

I-YANASHUNGO

28.63 ABC S I-YANA SHUNGO 0.00

98-2-6 28.60 ABC S 98-2-6 0.00I-ESTELA 28.33 ABC S I-ESTELA 0.00

I-NATIVIDAD 25.00 ABC PT I-NATIVIDAD 0.0012-6-24 24.75 ABC PT 12-6-24 0.0012-2-18 24.53 ABC PT 12-2-18 0.0012-4-71 24.38 ABC PT 12-4-71 0.00

I-SUPERCHOLA 23.03 ABCD PT I-SUPERCHOLA 0.0007-32-15 22.33 ABCD PT 07-32-15 0.00

I-VICTORIA 19.10 ABCD PT I-VICTORIA 0.0012-4-46 18.03 ABCD PT 12-4-46 0.0012-2-6 14.38 ABCD PT 12-2-6 0.00

12-4-170 6.93 BCD T 12-4-170 0.0012-6-1 5.62 CD T 12-6-1 0.00

I-PUCA SHUNGO 0.00 D AT I-PUCA SHUNGO 0.00

3.11. Número de tubérculos

En el análisis de varianza del número de tubérculos por tratamiento, no se

encontraron diferencias estadísticas significativas entre los tratamientos. Se encontró un

coeficiente de variación (C.V.) de 50.08% y una media de producción de 7.91 tubérculos

por maceta (Tabla 3.6). Para los tratamientos testigo se observó coeficientes de variación

de 38.60%, una media de producción de 9.90 tubérculos por maceta, una suma de

cuadrados de 5.97 para los tratamientos inoculados y de 3.18 para los tratamientos no

58

inoculados. Se encontró que en ambos tratamientos la variable número de tubérculos con

respecto al estado de la planta (inoculada y no inoculada) no tienen relación (Figura

3.11).

Figura 3.11. Diagrama de la variable número de tubérculos por variedad con sus respectivas medias(Galárraga, 2014)

59

Tabla 3.6 Análisis de varianza para la variable número de tubérculos de tratamientos inoculados ytestigo del ensayo de evaluación de la resistencia ante Rhizoctonia solani Kühn.

INOCULADO

F.V. GL CM FcTOTAL 79

TRATAMIENTOS 19 48.37 *REPETICIONES 3 5.97

ERROR 57 15.60X (%) 7.91

CV (%) 50.08TESTIGOS

F.V. G.L. CM FcTOTAL 37

TRATAMIENTOS 18 39.10 *REPETICIONES 1 3.18

ERROR 18 15.30X (%) 9.90

CV (%) 38.60

El análisis de Tukey para la variable número de tubérculos asoció dos rangos de

significancia. En el primer rango (A) se encontraron doce variedades, ocupando el

primer lugar con mayor número de tubérculos el clon promisorio 12-6-24 con un

promedio de 17.5 por tratamiento seguido de: I-Natividad con 13.88, I-Victoria con

11.50, el clon 97-25-3 con 10.75 e I-Rubí y el clon 98-38-12 ambos con un promedio de

8.75 tubérculos por maceta. La variedad con menos producción en este rango es el clon

promisorio 12-2-6 con un promedio de 6,43 tubérculos por tratamiento. El segundo

rango (B) agrupó ocho variedades. El clon promisorio 98-2-6 presentó la mayor

producción con un promedio de 6,25 tubérculos por tratamiento. La más baja producción

la obtuvo el clon promisorio 12-4-170 con un promedio de 3 y el clon 12-6-1 con 3.45

tubérculos por tratamiento.

60

En los tratamientos testigo se observó tres rangos de significancia. En el primer

rango (A) se destacan: el clon promisorio 12-6-24 con un promedio de 20.50 tubérculos

por tratamiento y la variedad mejorada I-Natividad con un promedio de 15.50

tubérculos. El segundo rango compartido (BC), agrupó a 17 germoplasmas en los que

incluyen las variedades: I-Victoria, I-Superchola, I-Friapa, I-Yana Shungo, I-Estela e I-

Puca Shungo. En el último rango (C), la variedad I-Yana Shungo con un promedio de

4.50 tubérculos por tratamiento (Tabla 3.7).

Tabla 3.7 Prueba de Tukey para la variable número de tubérculos del ensayo de evaluación de laresistencia ante Rhizoctonia solani Kühn.

TRATAMIENTOSINOCULADOS

TRATAMIENTOSTESTIGOS

VARIEDAD PROMEDIO RANGO VARIEDAD PROMEDIO RANGO12-6-24 17.50 A 12-6-24 20.50 AI-NATIVIDAD 13.88 AB I-NATIVIDAD 15.50 ABI-VICTORIA 11.50 ABC 12-4-46 15.00 BC97-25-3 10.75 ABC 97-25-3 14.50 BCI-RUBI 8.75 ABC I-SUPERCHOLA 14.00 BC98-38-12 8.75 ABC 98-2-6 13.00 BC12-4-71 8.50 ABC 12-2-18 13.00 BC07-32-15 8.25 ABC I-VICTORIA 11.00 BCI-SUPERCHOLA 7.75 ABC 12-4-71 9.50 BC12-2-18 7.50 ABC 12-2-6 8.50 BCI-FRIPAPA 7.25 ABC 12-4-170 8.00 BCI-ESTELA 7.25 ABC 98-38-12 8.00 BC12-2-6 6.25 BC I-ESTELA 8.00 BC98-2-6 6.25 BC 12-3-3 7.00 BC12-3-3 6.00 BC RUBI 6.50 BCI-YANASHUNGO

6.00 BC I-FRIPAPA 5.50 BC

12-4-46 4.50 BC 07-32-15 5.50 BCI-PUCASHUNGO

4.75 BC I-PUCASHUNGO

5.50 BC

12-6-1 3.45 BC 12-6-1 5.00 BC12-4-170 3.00 C I-YANA

SHUNGO4.50 C

61

3.12. Rendimiento total en gramos

En la Tabla 3.8, se muestra el análisis de varianza para los tratamientos inoculados y

testigos. El coeficiente de variación fue de 54,88% para los tratamientos inoculados y

de 36,93% para los tratamientos testigo. Los promedios de rendimiento en gramos por

maceta fueron de 69,55 g en los tratamientos inoculados y de 95,55 g en los tratamientos

testigo. Existe una relación con significación estadística entre la variable rendimiento

respecto al estado de la planta (inoculada y no inoculada).

Tabla 3.8 Análisis de varianza para la variable gramos por maceta de tratamientos inoculados ytestigo del ensayo de evaluación de la resistencia ante Rhizoctonia solani Kühn.

TRATAMIENTOS INOCULADOSF.V. GL CM FcTOTAL 79TRATAMIENTOS 19 57.20 *REPETICIONES 3 545.16ERROR 57 1404.16X (%) 69.55CV (%) 54.88

En la prueba de Tukey para la variable de producción (g/maceta) se encontraron dos

rangos de significancia distinguidos (Tabla 3.9). El primer rango (A), presentó 19

variedades, el clon promisorio 98-38-12 obtuvo el mayor rendimiento promedio con

120,18 gramos por maceta. La variedad mejorada I-Puca tuvo el menor rendimiento con

13,51 gramos por maceta. El segundo rango (AB), abarcó 19 variedades, el rendimiento

más alto se lo tuvo la variedad mejorada I-Fripapa con 118,58 gramos por maceta. El

menor rendimiento presentó el clon 12-6-1 con 11,80 gramos por maceta (Figura 3.12).

62

Los tratamientos testigo se distribuyeron en cuatro rangos de significancia. El

primer rango (A) presentó 15 variedades en el clon promisorio 98-2-6 obtuvo un

rendimiento de 192 gramos por maceta. En el segundo (AB) se agruparon 17

tratamientos. El clon promisorio 98-38-12 y la variedad mejorada I-Natividad tuvieron

los mejores rendimientos, con 163,75 y 141,95 gramos por maceta respectivamente.

El tercer rango (BCD) abarcó 13 tratamientos. La variedad mejorada I-Rubí obtuvo

el mayor rendimiento con un promedio de 140 gramos, el más bajo rendimiento lo

obtuvo el clon promisorio12-3-3 con 60.50 gramos. El último rango (D) presentó cuatro

materiales germoplásmicos, la de menor rendimiento fue el clon promisorio 12-6-1 con

un promedio de 10.25 gramos por maceta seguido de los materiales vegetales: I-Puca

Shungo con 15.50 g, el clon 12-2-6 con 22.50 g y el clon 12-4-170 con 30.50 g por

maceta (Tabla 3.9).

Los materiales inoculados tuvieron un rendimiento menor en comparación a los no

inoculados. Existió una reducción de rendimiento de casi un 30% en los tratamientos

inoculados.

Tabla 3.9 Prueba de Tukey para la variable “rendimiento por maceta” del ensayo de evaluación de la

resistencia ante Rhizoctonia solani Kühn.

TRATAMIENTO INOCULADO TRATAMIENTO TESTIGOVARIEDAD PROMEDIO RANGO VARIEDAD PROMEDIO RANGO98-38-12 120.18 A 98-2-6 192.00 AI-FRIPAPA 118.58 A 98-38-12 163.75 BI-NATIVIDAD 115.70 AB I-NATIVIDAD 141.95 BCRUBI 112.95 ABC I-RUBI 140.00 BCD98-2-6 111.63 ABC I-VICTORIA 138.25 BCDI-ESTELA 96.85 ABCD I-ESTELA 128.75 BCD12-6-24 85.13 ABCD I-FRIPAPA 120.20 BCD

CONTINÚA

63

I-YANASHUNGO

78.50 ABCD I-YANASHUNGO

119.85 BCD

12-4-71 76.75 ABCD 07-32-15 111.25 BCD07-32-15 74.75 ABCD 12-2-18 106.25 BCDI-VICTORIA 68.63 ABCD I-SUPERCHOLA 90.50 BCD97-25-3 65.38 ABCD 12-6-24 86.50 BCD12-2-18 63.13 ABCD 12-4-46 85.25 BCDI-SUPERCHOLA

51.33 ABCD 12-4-71 80.00 BCD

12-2-6 45.63 ABCD 97-25-3 67.25 BCD12-3-3 27.63 ABCD 12-3-3 60.50 BCD12-4-170 27.50 BCD 12-4-170 30.50 CD12-4-170 22.93 AB 12-2-6 22.50 CDI-PUCASHUNGO

13.51 AB I-PUCASHUNGO

15.50 CD

12-6-1 11.80 B 12-6-1 10.25 D

Figura 3.12. Diagrama de bloques de la variable rendimiento en variedades inoculadas y no inoculadas(Galárraga, 2014).

64

CAPÍTULO 4 – DISCUSIÓN

Prado et al. (2001) manifiesta que la utilización de variedades resistentes a

fitopatógenos se considera primordial en el manejo integrado de costra negra en el

campo, debido a que representa menor costo de producción, además de que su

utilización genera bajo impacto ambiental por la disminución de fungicidas para el

control de Rhizoctonia solani Kühn.

El cancro de la papa o costra negra ocasiona lesiones, principalmente a nivel de

tallos, raíces y tubérculos. Aucancela et al. (2012) corrobora que R. solani afecta la

apariencia del tubérculo y consecuentemente causa la pérdida de valor comercial. Torres

(1997) reporta pérdidas de hasta el 20% de cultivos por R. solani. Estos son algunos de

los argumentos por los que se ha buscado en esta investigación, materiales

germoplásmicos que presenten mayor resistencia al hongo causante de la costra negra.

Según INIAP-DNPV (2009) el uso de semilla sana se considera el componente más

importante para reducir las enfermedades causadas por fitopatógenos de suelo y afirma

que es posible reducir su incidencia hasta un 20%. INIAP-DNPV (2010) explica que

mediante el uso de semilla sana sumado a la rotación de cultivos se pueden disminuir las

infecciones hasta un 28%. La utilización de una semilla de calidad y con tolerancia a

costra negra, reducirá en gran porcentaje las pérdidas económicas del sector papero del

país.

En este ensayo se evaluaron frente a costra negra veinte germoplasmas de papa de

diferentes procedencias genéticas. Dentro del grupo de germoplasmas a evaluarse se

incluían variedades mejoradas que han sido el resultado de cruces con líneas nativas que

65

han permanecido hasta la actualidad (I-Puca Shungo e I-Yana Shungo). Siempre los

agricultores han sido un factor importante en la domesticación, la selección y

mejoramiento de las variedades de cultivos importantes para el hombre, un buen ejemplo

es la papa (Estrada, 2000).

4.1. Aislamiento e identificación de Rhizoctonia solani Kühn

El cultivo utilizado en este ensayo fue aislado a partir de tubérculos que presentaban

esclerocios del fitopatógeno. Según Chavarro (2011) los cultivos de R. solani jóvenes

en medio PDA se caracterizan por tener el micelio de un color blanco, y que a medida

que envejece se torna de un color café claro y empieza a formar esclerocios. El cultivo

aislado siempre contó con esas características. Es importante durante el aislamiento

utilizar antibióticos que controlen el crecimiento de bacterias en el medio, en nuestro

caso se utilizó cloranfenicol. Agrios (2002) recomienda el uso de cloranfenicol al

0,005% en medio PDA para aislar fitopatógenos de suelo.

Giovannini et al. (2005) afirma que Rhizoctonia solani Kühn visto al microscopio

presenta ramificaciones en ángulo recto, constricción de ramificaciones y la formación

de un septo cerca del punto de origen. De acuerdo con estos criterios la cepa aislada

concordó con las características y se la identificó como R. solani Kühn. De acuerdo a la

capacidad de fusionar hifas, R. solani se clasifica en grupos de anastomosis, los grupos

más recurrentes según Giovanini et al. (2005) son los: AG3, AG4, AG5 y AG8, siendo

el grupo de anastomosis 3 (AG3) el más patogénico. Este grupo se caracteriza por

formar estructuras de resistencia fusionando sus hifas con masas de tierra o materia

66

orgánica. En medio de cultivo PDA de la cepa aislada se pudo constatar la formación de

esclerocios a partir de la segunda semana de la siembra (Cotes, 2007).

Sumado a la confirmación morfológica de las colonias se realizó una PCR de

confirmación de grupo de anastomosis, según Lees et al. (2002) la región genética que

confirma el grupo de anastomosis 3 (AG3) se encuentra alrededor de los 500 pb. En el

ensayo se obtuvieron bandas de alrededor de 500 pb que confirmó que el fitopatógeno

aislado se trató de R. solani AG3.

Al realizar la amplificación de las regiones ITS1-5,8S-ITS2 las temperaturas de

ciclos propuestas por White et al. (1990) de un ciclo a 95°C por 3 min, seguido de 35

ciclos a 55°C durante 30 s, 72°C por 2 min, 95°C por 30 s y un ciclo final de extensión

por 10 min a 72°C no amplificaron de buena manera, por lo que se procedió a realizar

pruebas de variación de temperaturas, y se tuvo que la mayor amplificación para la

región ITS1-5,8S-ITS2 se obtiene con un ciclo inicial de desnaturalización a 95°C por 2

min; seguido de 35 ciclos de 95°C por 45 s, 63°C por 60 s y 72°C por 90 s; con un ciclo

final de extensión de 72°C por 5 min, temperaturas que coinciden con la amplificación

de la región AG3 propuesta por Fernández (2011).

4.2. Preparación del inóculo de Rhizoctonia solani Kühn

Carling et al. (2002) menciona que el grupo AG3 de Rhizoctonia es uno de los

grupos de anastomosis más dañinos para la planta, debido a la formación acelerada de

esclerocios y la colonización agresiva de tallos y raíces, esto se corroboró durante la

etapa de multiplicación de los cultivos. Se observaron condiciones de crecimiento

aceleradas y con formación temprana de esclerocios. Como en el ensayo se utilizarían

67

germoplasmas experimentales y se tendrían que evaluar hasta su cosecha, se optó por

utilizar 20 g de inóculo en avena por cada 3 Kg de tierra y no 20 g por cada 1 Kg como

lo propone Farah et al. (2008). Con la modificación de la cantidad de inóculo por Kg de

tierra se obtuvieron buenos resultados, las plantas enfermaron y se pudo seleccionar los

materiales germoplásmicos con tolerancia a costra negra. Wharton et al. (2007) afirma

que el inóculo en semilla de avena es tan dañino como el proveniente de suelo en el

campo, si los órganos de la planta se desarrolla en proximidad al inóculo.

4.3. Síntomas de R. solani Kühn

Durante las primeras instancias del trabajo de invernadero se presentaron pocas

características aéreas de costra negra. Se pudo observar algunas hojas de la base que

presentaban clorosis en varios tratamientos. Tsor et al. (2001) describe algunas de las

características de la colonización de Rhizoctonia solani Kühn e incluye la clorosis foliar

como un síntoma visible en etapas tempranas de la colonización del tejido del

hospedero. I-Estela e I-Rubí fueron las variedades que mostraron una clorosis foliar

temprana durante los primeros 45 días a partir de la siembra, se observó también un

cambio en la coloración de la base del tallo hasta presentar una necrosis de color marrón

con severos daños a nivel de epidermis. En el resto de materiales los síntomas de

clorosis foliar fueron enmascarados por plagas secundarias que presentaron similar

sintomatología. La necrosis en tallo es característica en una planta de papa con la

enfermedad de costra negra. La zonas necrosadas tuvieron un color amarillento en sus

primeras instancias, después de colonizado todo el tejido del área afectada se volvió de

color marrón. En condiciones avanzadas de la enfermedad puede presentar superficies

blanquecinas con el micelio de Rhizoctonia solani Kühn (INIAP, 2005).

68

La sintomatología de costra negra, a nivel de campo, incluye síntomas como: la

formación de tubérculos aéreos, la presencia de hojas enrolladas hacia el envés en las

partes superiores, estrangulamiento del cuello de la planta, tubérculos deformes y

esclerocios en la superficie del tubérculo (Aucancela et al., 2012). En el ensayo a nivel

de invernadero no se manifestó toda la sintomatología descrita por Aucancela et

al.(2012). No se observó la formación de tubérculos aéreos, enrollamiento de hojas

característico de la Rizoctoniosis, ni una clara estrangulación de tallo, pero a la cosecha

se encontró que R. solani había colonizado tejidos radicales y de tallo en todos los

tratamientos evaluados como los describe el ANEXO III. La presencia o ausencia de

algunos de los síntomas de costra negra en los materiales evaluados dependen de la

tolerancia y del comportamiento del cultivar (Mesa, 2011).

Las raíces y estolones pueden ser infectados por R. solani en cualquier etapa

fenológica de la planta, pero la mayor incidencia ocurre en etapas tempranas del

desarrollo Wharton et. al. (2007) menciona que la tolerancia de la variedad incrementa

después de la emergencia del brote, limitando la colonización de los tejidos. La

severidad de la infección por R. solani depende principalmente de la tolerancia genética

de la variedad infectada.

A la cosecha se observó tallos y raíces necrosadas en los 20 tratamientos con

inóculo y solo en la variedad I-Rubi fue evidente la presencia de manchas algodonosas

sobre la base del tallo, evidencia de la fase sexual de R. solani, Tsor (2001) menciona

que las basidiosporas y el micelio formado en esta fase sexual no causa daño a la planta.

69

4.4. Control de altura de la planta

Durante el ensayo se realizaron controles periódicos de altura a partir de los tres

meses de la siembra. Los datos obtenidos fueron sometidos a un análisis estadístico en

INFOSTAT en el cual se identificó que la variable altura no presentó una diferencia

significativa entre tratamientos inoculados y tratamientos testigo. Se observaron

variedades que en ambos tratamientos fueron las más pequeñas, este es el caso de I-Rubi

con una altura promedio de 20,25 cm y 21 cm en los tratamientos inoculados y testigo

correspondientemente. INIAP (2005) corrobora que la variedad I-Rubi se caracteriza por

ser una variedad semirastrera y de baja altura. A pesar del fenotipo de la variedad, las

plagas secundarias pudieron afectar el crecimiento de las plantas ya que los áfidos y

Oidium afectan directamente a las hojas, por ende, a la fotosíntesis; afectando el

metabolismo. I-Puca Shungo se destacó por su gran altura en todos los bloques. Se

tuvieron valores promedio de 55,50 cm y 65,50 cm en los tratamientos inoculados y

testigos correspondientemente. Andrade et al. (1995) manifiesta que el factor altura

puede deberse a aspectos genéticos de los materiales y no a la presencia de costra negra.

4.5. Evaluación de los tubérculos

I-Estela, I-Yana Shungo, I-Rubí y el clon promisorio 12-2-6, presentaron tubérculos

en forma de muñecos. Giovanini (2005) describe que esta deformidad es característica

de un estado avanzado de la enfermedad de costra negra y que estos se producen por

inhibición del crecimiento de las aéreas de tejido colonizado por costra negra. En las

variedades: I-Fripapa, I-Superchola, I-Yana Shungo, I-Rubí, y en los clones promisorios

98-2-6 y 98-38-12 se encontró síntomas de sarna causados por la bacteria Streptomyces

scabies. Pérez & Forbes (2011) afirma que la sarna que afecta a la papa se transmite en

70

el tubérculo semilla y que es asociada a la enfermedad de costra negra, en este ensayo se

pudo observar que nueve de las veinte variedades presentaron síntomas de sarna a la

cosecha (ANEXO III).

4.6. Severidad de la Infección

En ocho de los materiales evaluados se observaron altos porcentajes de severidad.

Existen materiales germoplásmicos que se encuentran en una escala de 3 según el

criterio de clasificación de Clive (1971) con un porcentaje de infección de hasta 35%, el

análisis estadístico de este parámetro junto con los criterios de clasificación utilizados en

el ensayo (Tabla 2.2) hacen es factible la clasificación de materiales por la tolerancia

presentada.

Mediante los análisis de varianza y las prueba de Tukey realizadas se encontró que

existió alta significancia estadística que relacionan la variedad inoculada y la severidad.

Mediante los parámetros de severidad ante costra negra dados por Clive (1971) se logró

separar las variedades que presentaron tolerancia de las susceptibles, esto basándose en

una clasificación de los tubérculos dependiendo del porcentaje de infección y la reacción

presentada, se agrupó los materiales germoplásmicos en cuatro categorías: altamente

tolerantes (AT), tolerantes (T), parcialmente tolerantes (PT) y susceptibles (S). Los

materiales tolerantes encontrados en esta investigación deben ser probados en campo

para continuar con la selección de un tubérculo semilla con resistencia a costra negra.

Los datos analizados en INFOSTAT y la sintomatología observada en invernadero

declaran a la variedad I- Puca Shungo como altamente tolerante. La variedad I-Rubí se

la encontró susceptible ante Rhizoctonia solani Kühn, el análisis realizado junto a las

71

características de sintomatología aérea descritas por Tsor et al. (2001) se confirma la

relación entre sintomatología aérea y severidad de la colonización del tubérculo.

4.7. Rendimiento

Después de realizar el análisis estadístico de la variable rendimiento por maceta se

encontró que el coeficiente de variación (C.V.) fue de 50.08% y una media de

producción de 7.91 tubérculos por tratamiento. Se observó que para los tratamientos

testigo, el coeficiente de variación dió un valor de 38.60% y una media de producción de

9.90. El análisis de Tukey reporta una diferencia estadística significativa en la variable

número de tubérculos con respecto al inóculo. En el ensayo se encontraron reducciones

de rendimiento de hasta un 28%. INIAP (2005) reporta perdidas de rendimiento de hasta

un 30% en cultivares del país, indicando que R. solani AG3 es causante de grandes

pérdidas económicas del sector papero, además, Jager et al. (1996) corrobora que las

enfermedades del suelo afectan a la pérdida de valor comercial de los tubérculos como

se observa en los datos de severidad obtenidos en este estudio.

4.8. Plagas y control del ensayo

Se observó en primeras instancias la muerte de una plántula del segundo bloque de

la variedad Superchola y se encontró que el tubérculo estaba en putrefacción por

Erwinia carotovora spp. carotovora.

Existieron plagas no esperadas que afectaron a la sintomatología aérea. Una de estas

fue el Oidium, que ingresó al invernadero en plantas contaminadas provenientes de otro

ensayo. En cuestión de 30 días, a pesar de haber eliminado el foco de contaminación, ya

72

había contaminado algunas plantas del tercer bloque del invernadero. En cuestión de

cinco meses todos los bloques se encontraban con sintomatología de oídium. Castillo

(2008) describe la sintomatología como un micelio enteramente superficial que atacan

órganos jóvenes que se manifiesta en forma de manchas blanquecinas pulvurulentas, las

manchas causan lesión en las hojas semejantes a los de una quemazón, conforme ha

avanzado la enfermedad, produce el secamiento y marchitez de la planta. Se realizaron

tres fumigaciones con NIMROD, un fungicida sistémico preventivo y curativo para el

control de Oidium.

Un factor crítico durante la aparición de síntomas aéreos fue los síntomas de virosis

en las hojas de la mayoría de variedades. Esto posiblemente fue transmitido por vectores

que se encontraban en el tubérculo antes de la siembra. INIAP-DNVP (2009) aconseja el

uso de semilla sana para evitar enfermedades durante el crecimiento de la planta de

papa. En los bloques del invernadero se hizo evidente una gran presencia de áfidos que

se extendió a partir del segundo mes desde la siembra. Según Hooker (1980) los áfidos

son vectores para la transmisión de virus y describe que la sintomatología se presenta

fundamentalmente en las hojas jóvenes de la parte apical, y que toman una coloración

pálida, amarillenta; pudiendo llegar a enrollarse hacia arriba. Las características de

infección de virus estuvieron presentes en el ensayo, enmascarando la sintomatología

aérea de costra negra, debido al similar marchitamiento y enrollamiento de hojas. A

pesar de estos factores imprevistos, se realizaron tres fertilizaciones foliares para ver si

los síntomas desaparecían o cuales persistían, las plantas mejoraron el aspecto pero

volvieron a decaer enseguida.

French (1982) aconseja que para una buena investigación fitopatológica se necesita

tener conocimiento del origen del sujeto de estudio (en este caso los materiales

73

germoplásmicos), también menciona que si se va a trabajar con un fitopatógeno en

especial se debe esterilizar la tierra del experimento, y tener cuidado en la preparación

del inóculo, enfatiza que el control de enfermedades y plagas comunes se puede llevar a

cabo durante todo el ciclo experimental. Todas esas medidas fueron tomadas a lo largo

del ensayo en el invernadero. Se cree también que la sintomatología aérea como

tubérculos aéreos y el estrangulamiento del cuello de la planta, no fueron observados

con claridad debido a las condiciones de estrés de las plantas, Castellanos (2007) indica

que el comportamiento de Rhizoctonia solani Kühn es diferente en campo, laboratorio e

invernadero; esto debido a que en campo puede existir mayor humedad y una

temperatura favorable para el desarrollo del micelio. Las plantas en el invernadero

estuvieron libres de estrés climático; las variaciones de temperatura y de humedad de los

materiales evaluados en el ensayo estuvieron controlados.

La presencia de plagas secundarias en el ensayo no intervino con la selección de los

materiales germoplásmicos. Castillo (2008) afirma que Oidium es una enfermedad que

afecta solo a partes aéreas de la planta, no existe influencia sobre la tuberización. A

pesar de que la sintomatología aérea fue enmascarada, los bloques del invernadero se

mantuvieron hasta la cosecha con la ayuda de fungicidas foliares.

Hooker (1980) menciona que la virosis puede afectar a los rendimientos solo cuando

es una infección secundaria, en el caso del ensayo los áfidos fueron los vectores de la

enfermedad y esta ocurrió durante el desarrollo de las plantas, por ende se trató de una

infección primaria y no influenció en la producción de los bloques. La clasificación de

los materiales germoplásmicos se basó en la severidad de la infección como lo describe

Clive en sus criterios de selección.

74

CAPÍTULO 5 – CONCLUSIONES

Rhizoctonia solani Kühn AG3 fue aislada a partir de esclerocios de papa infectada

con costra negra.

Se encontró que la variedad I-Puca shungo presenta tolerancia a Rhizoctonia solani

Kühn con un porcentaje de infección del 0%. Las variedades 12-6-1 y 12-4-170

presentan una tolerancia moderada a costra negra con porcentajes de infección de

5.62% y 6.93% respectivamente.

La variable altura no mostró diferencias en el comportamiento de tratamientos

inoculados respecto al grupo control.

Los materiales inoculados con Rhizoctonia solani Kühn presentaron una

disminución en el rendimiento de hasta un 28% en comparación con sus tratamientos

testigo.

75

CAPÍTULO 6 – RECOMENDACIONES

Se recomienda realizar pruebas de campo para poner a prueba la resistencia de las

variedades seleccionadas. El comportamiento de Rhizoctonia solani Kühn en las

variedades evaluadas puede ser diferente en condiciones de campo. Las condiciones

ambientales en este ensayo fueron controladas y la inoculación fue homogénea.

Existen muchas variedades nativas que pueden presentar resistencia a costra negra.

Deberían ser puestas a prueba como se lo ha hecho con variedades de INIAP en este

ensayo. Variedades nativas han permanecido hasta hoy en día por presentar resistencia

fitopatógenos de suelo y a factores de estrés climático. El estudio de variedades con

resistencia genética a fitopatógenos es de gran importancia. Se pueden disminuir

impactos ambientales del uso de fungicidas mediante su uso.

Se debería ampliar el estudio molecular de la interacción patógeno-huésped para R.

solani Kühn, así se lograría conocer los factores moleculares y genes que le dan

resistencia a especies nativas de papas. Los genes de resistencia a costra negra podrían

ser utilizados en cultivos asociados a Rhizoctonia solani para el control de la

enfermedad.

76

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81

ANEXO I

Grupos de anastomosis para Rhizoctonia solani Kühn (Chavarro, 2011)

AG1-1 A (= AG tipo1)

Crece rápidamente, 30 mm/día a 28-30ºC. Su óptimo es a 30ºC

AG 1 IC (AG1 TIPO 3)

Patógeno virulento que se cría en climas fríos, causa camping off a zanahoria, alforfón,

lino soja y pino

AG 1 inespecífico

Patógeno de remolacha azucarera, col, repollo, judías y soja.

AG2-1

Este grupo tiene crecimiento lento (13mm/día a 25ºC). Son patógenos de cultivos de

invierno formando esclerocios rojos en forma de anillo. Causa camping off en

crucíferas, fresa, tabaco japonés, tulipán y en trébol subterráneo

AG2-2IIIB

Es un grupo que crece a altas temperaturas (óptimo aproximadamente 30ºC). Son

patogénicos de arroz, jengibre, gladiolos, césped, trigo, remolacha azucarera, batata y

provoca camping off en plántulas de árboles, crisantemos y batata china.

AG2-2IV

Patógeno de remolacha azucarera, césped

82

AG2-2-2 (inespecífico)

AG3

Crece unos 12mm/día a 25ºC. Patógeno de patata, tomate y tabaco.

AG-4

Se define como tipo “pratícola”. Según algunos autores representa a algunas especies (R.

pratícola.).

Se suele aislar del suelo con plantas infectadas en países de clima húmedo. Ataca a

tomate, guisante, espinaca, patata. Camping off en pinos y otros hospedantes en estado

de plántula, cebolla, guisante, patata y judía.

Hay aislados no patógenos que protegen a rabanitos, zanahoria, algodón, patata y trigo

de camping off, estimulando el crecimiento de la planta.

AG-5

Patógenos débiles de patata, césped, judía, soja y azuki. Algunos se micorrizan con

orquídeas

AG-6

No son patógenos, algunos micorrizan a orquídeas.

AG-7

No son patógenos.

AG-8

Patógeno de cereales.

83

AG-9

Patógeno de crucíferas, patata pero menos patogénicos que AG-3.

AG-10

Probablemente no son patógenos

AGBI

No son patógenos.

AGUNK

Patógeno de de arroz, no se fusionan con ningún grupo.

84

ANEXO II

Resultados de la cuantificación de ADN de Rhizoctonia solani Kühn

85

ANEXO III

Síntomas observados en veinte materiales de papa evaluados en invernadero

(Galárraga, 2014)

N° Variedad Bloque Sintomatología de Tubérculos

1 I-ESTELA 1 Tubérculos en forma de muñecos

2 Raíces necrosadas

3 Necrosis café oscura en raízprincipal

4 Necrosis raíz-Tubérculos en formade muñecos

2 I-FRIPAPA 1 Necrosis de raíz

2 Raíces necrosadas – síntomas desarna en tubérculos

3 Necrosis café oscura en raízprincipal – síntomas sarna

4 Necrosis raíz – síntomas de sarna

3 I- PUCA SHUNGO 1 Necrosis de raíz

2 Necrosis de raíz

3 Necrosis de raíz

4 Necrosis raíz principal

4 I-NATIVIDAD 1 Necrosis de raíces



4 Necrosis de raíces

5 I-SUPERCHOLA 1 No presentó necrosis raíz

2 Planta no brotó


4 Síntomas de sarna

6 I-VICTORIA 1 Necrosis en raíz

2 Necrosis en raíz - tubérculos enforma de muñecos



7 I-YANA SHUNGO 1 Necrosis en raíz

2 Necrosis en raíz

3 Tubérculos en forma de muñecos

86

4 Tubérculos forma de muñecos –Síntomas de sarna

8 RUBI 1 Necrosis en raíz – Síntomas desarna

2 Tubérculos en forma de muñecos


4 Necrosis de raíz

9 07-32-15 1 Necrosis en tallo y raíces

2 Necrosis en tallo y raíces



10 12-2-6 1 Tubérculos pequeños y en forma demuñecos

2 Tubérculos pequeños y en forma demuñecos

3 Tubérculos pequeños y en forma demuñecos

4 Necrosis de raíz

11 12-2-18 1 Necrosis en raíz

2 Necrosis en raíz

3 Necrosis en raíz

4 Necrosis en raíz

12 12-3-3 1 Raíz necrosada – Tubérculos enforma de muñecos y podridos

2 Raíz necrosada – Tubérculos enforma de muñecos y podridos


4 Raíz necrosada


2 Necrosis en raíz

3 Necrosis en raíz

4 Necrosis en raíz

14 12-4-46 1 Raíz y tallo necrosado

2 Raíz y tallo necrosado


4 Necrosis en tallo – sin tubérculos



3 Necrosis raíz – no hay producción

4 Necrosis de raíz


2 Necrosis de raíz

3 Necrosis de raíz

4 Necrosis de raíz

87

17 12-6-24 1 Necrosis raíz coloración caféoscuro

2 Necrosis raíz coloración caféoscuro



18 97-25-3 1 Necrosis raíz coloración caféoscuro



4 Necrosis raíz coloración caféoscuro – síntomas de sarna

19 98-2-6 1 Necrosis raíz



4 Necrosis raíz

20 98-38-12 1 Necrosis raíz – Síntomas de sarna

2 Necrosis raíz – Síntomas de sarna

3 Necrosis raíz – Síntomas de sarna

4 Necrosis raíz

Evaluacion de la resistencia a costra negra en materiales germoplasmicos de papa en invernadero

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