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Evaluación de la resistencia a los antihelmínticos en rumiantes en Argentina

Caracostantogolo J.1, Castaño R. 1, Cutullé Ch. 1, Cetrá B. 2, Lamberti R. 3, Olaechea F. 4 Plorutti F.5, Ruiz M. 1, Schapiro J1., Martínez M.1, Balbiani G.1, Castro M. 1, Morici G. 1 y Eddi, C. 6 1 Area de Parasitología Inst. de Patobiología CICVyA INTA Castelar ARGENTINA 2 EEA INTA Mercedes, ARGENTINA 3 Cat. Parasitologia y Enf. Parasitarias Carr. de Veterinaria Univ. Nac. de La Pampa, ARGENTINA 4 EEA INTA Bariloche, ARGENTINA 5 GOT INTA Salado Norte, ARGENTINA 6 Dirección de Producción y Sanidad Animal, FAO, Roma

La industria de la carne en Argentina se caracteriza por sus sistemas de producción extensiva sobre pasturas. El uso de tratamientos antihelmínticos para evitar pérdidas debidas a la parasitosis subclínica es muy frecuente y no está sujeto a control profesional. No se hace diagnóstico previo al tratamiento y la elección del antiparasitario obedece a razones comerciales más que a la indicación del médico veterinario.

Los grupos químicos antiparasitarios son los mismos que se comenzaron a utilizar en las décadas del 70 y del 80 (imidazotiazoles, benzimidazoles y lactonas macrocíclicas). La alta eficacia y acción endectocida de las avermectinas fue la razón para que, a pocos años de su lanzamiento al mercado, se convirtieran en los productos más utilizados para el control de los parásitos. Esta circunstancia se hizo más marcada aún, a partir de la comercialización de formulaciones genéricas. En oportunidad de llevarse a cabo el PCT/RLA/2364 “Resistencia antihelmíntica en parásitos gastrointestinales de ovinos”, desarrollado en 1994-1995, el 43 por ciento de los establecimientos muestreados en Argentina, tenía nematodos gastrointestinales resistentes. Los resultados del proyecto PCT/RLA/2364 permitieron establecer a la resistencia a los antihelmínticos como un problema que debía ser considerado por las autoridades de sanidad animal, la industria y los sectores de la producción. Dado que para Argentina la producción de carne bovina es la principal actividad ganadera, los resultados del estudio de prevalencia de la resistencia en ovinos solo tuvieron impacto sobre una porción de los productores y de los profesionales ligados a la cría de ovinos que estaban en condiciones de entender el problema. Recientemente, Anziani y col. (2000) y Fiel y col. (2000) reportaron resistencia de Cooperia spp. En bovinos, a las lactonas macrocíclicas, las drogas antiparasitarias de uso más difundido en la actualidad. La realización de este proyecto, permitió a las autoridades sanitarias de Argentina, llenar un vacío crítico en el conocimiento de la prevalencia de resistencia en bovinos y una actualización de la problemática en ovinos. 2. OBJETIVOS DEL PROYECTO El principal propósito de este proyecto fue asegurar y mejorar la producción ovina y bovina en Argentina demorando la resistencia a los antihelmínticos en los nematodos gastrointestinales de los rumiantes. Los objetivos específicos fueron: - La determinación de la prevalencia de la resistencia a los antihelmínticos en bovinos y

ovinos en Argentina. - La evaluación de alternativas para el control de los nematodos gastrointestinales para

demorar o suprimir la resistencia a los antihelmínticos.

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3. RESULTADOS Los resultados de este proyecto fueron: - El conocimiento del nivel de importancia de la resistencia a los antihelmínticos en

rumiantes en Argentina mediante la determinación de la prevalencia de la resistencia en ovinos y bovinos.

- La transferencia de conocimientos para el control de la resistencia a los antihelmínticos

a veterinarios y productores con el objeto de demorar el establecimiento de la resistencia a los antihelmínticos.

4. RESUMEN DE ACTIVIDADES DESARROLLADAS

De acuerdo con el plan de trabajo, se desarrollaron las siguientes actividades:

- Identificación de los grupos de trabajo - Redacción de los procedimientos operativos estándar - Difusión de la existencia del Proyecto en medios de comunicación

especializados - Adquisición del equipamiento e insumos de laboratorio - Muestreo de establecimientos para determinación de resistencia a los

antiparasitarios internos - Puesta a punto de técnicas in vitro (Ensayo de eclosión de huevos) y de

PCR para determinación de resistencia a benzimidazoles e ivermectina respectivamente

- Búsqueda de alternativas de manejo de antiparasitarios - Dictado de Charlas para Productores y Veterinarios. - Dictado de Cursos para Veterinarios. - Producción de un CD con las herramientas para determinar la presencia

de resistencia a los antihelmínticos. - Producción de un video para productores - Producción de un video para Médicos Veterinarios - Seminario de comunicación de resultados a la Industria Farmacéutica - Producción de un fascículo en la serie de publicaciones de FAO

referente a las tareas desarrolladas por el Proyecto. 5. RESUMEN DE RESULTADOS 5.1 Determinación de la prevalencia de la resistencia a los antihelmínticos en rumiantes Se llevó a cabo mediante la aplicación de la Técnica de Reducción de Huevos en Materia Fecal. Ninguno de los campos muestreados tenía antecedentes de resistencia. Las cifras muestran que sólo el 38% de los rodeos ovinos están parasitados por nematodos gastrointestinales susceptibles; en tanto que el 62% restante de los establecimientos, tiene resistencia a algunos de los grupos químicos en uso. La mayoría de los casos, reúnen resistencia a ivermectina y a benzimidazoles. En bovinos, la resistencia ya está presente en el 60% de los rodeos estudiados y la mayoría de ellos (55%) es resistente al grupo ivermectina. La mayor parte de los géneros gastrointestinales de ovinos y bovinos presentaron resistencia a las drogas usadas.

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5.2 Técnicas para determinación in vitro de resistencia a los antihelmínticos

Se estandarizaron dos técnicas: IEH (Inhibición de la Eclosión de Huevos o EHA, en inglés) para detectar resistencia a bencimidazoles y una técnica de PCR que puede distinguir entre parásitos susceptibles y resistentes a ivermectina (en adultos y en larvas). 5.3 Evaluación de las alternativas para el control de los nematodos gastrointestinales que demorarán o suprimirán la resistencia a los antihelmínticos

El uso de medidas alternativas para el control de los parásitos fue testeado en la Provincia de corrientes. Se evaluaron: la técnica de FAMACHA (Malan y Van Wyk, 1992), la administración de partículas de óxido de cobre y el efecto de naftalophos sobre poblaciones con resistencia múltiple. 5.4 Transferencia de los resultados del TCP a veterinarios y productores a través de

seminarios y simposios

Se organizaron treinta charlas para productores y veterinarios y se dictaron cuatro cursos de dos días de duración para médicos veterinarios 6. CONCLUSIÓN

El Proyecto ha contribuido al conocimiento general del problema de la resistencia a los antihelmínticos.

El mejoramiento de la capacidad y el entrenamiento fueron dos componentes esenciales de este Proyecto. Los profesionales del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, del SENASA y de los grupos colaboradores asociados con el Proyecto, aumentaron significativamente su capacidad técnica para el manejo, diagnóstico, prevención y control de los helmintos gastrointestinales en el contexto de la resistencia a las drogas antiparasitarias.

7. RECOMENDACIONES Las recomendaciones de los participantes en este proyecto están plasmadas en el siguiente resumen, que corresponde a lo discutido en el Seminario de comunicación de resultados:

En marzo de 2005, con la presencia de los Dres. Carlos Eddi y Flavio Echevarría y la asistencia de los grupos de trabajo y de representantes de la Industria Farmacéutica, se llevó a cabo un Seminario para presentación de los resultados y su discusión. A continuación, se provee un resumen de lo discutido en el mismo: 7.1 Respecto al diagnóstico de resistencia

Ninguna técnica es suficientemente sensible hasta el momento, antes que alrededor del 25% de los helmintos sean resistentes. Esto dificulta aún la predicción de la aparición de resistencia y medidas tempranas para evitarla antes de este nivel. A campo:

• El test de oro sigue siendo la evaluación de la reducción de recuento de huevos.

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• Para su uso a campo es necesario insistir en su estandarización 7.2 Respecto al entrenamiento de profesionales

• Debe asegurarse la difusión de técnicas parasitológicas y sus estándares de procedimientos entre los laboratorios de diagnóstico (cultivos e interpretaciones).

• Las sospechas de resistencia pueden fundarse tempranamente si se realizan frecuentemente las evaluaciones en el campo.

7.2.1 En cuanto a las técnicas in vitro

Todavía están en proceso de homologación, y en nuestro país sólo se están aplicando en helmintos en Castelar, en el marco de este proyecto. Entre las dificultades mayores se destacan: Las pruebas de eclosión de huevos, sólo permiten evaluar respecto a bencimidazoles y deben hacerse mayores estudios para medir su repetibilidad y aplicabilidad con pooles de cepas (que generan las consultas de campo). Para cepas ya aisladas resultan más fáciles de llevar a cabo.

Las técnicas destinadas a evaluar la evolución de L3, se sugieren mas promisorias, por poder distinguir fácilmente entre géneros, y por ser aplicables a varios grupos químicos. 7.2.2 En cuanto a las técnicas de biología molecular

• Si bien la tecnología para realizar PCR, y RAPD-PCR, es disponible en varios laboratorios de Argentina, aún estamos lejos de contar con primers y experiencias suficientes para su uso rutinario en la definición temprana de cepas resistentes.

• Se discute su aplicabilidad en el monitoreo de la evolución de la susceptibilidad a nuevas drogas (en el futuro)

• Las muestras de campo no son monogenéricas • Se precisan ceparios de especies susceptibles para contar con controles en los

laboratorios de referencia (también para evaluaciones in vitro) 7.3 Respecto a la aplicación de los conocimientos a situaciones de campo

Se asume que el mensaje de los técnicos no debe hacer suponer que dejamos de interesarnos en el control de los parásitos y su impacto en la producción.

Se sugiere que la comunidad de ganaderos no utiliza y no valora suficientemente los servicios veterinarios en todos sus niveles y ello se evidencia en la escasa consulta (datos censales sobre productores que utilizan dichos servicios, hablan del 1 al 26%, y difícilmente ello incluya la consulta sobre la elección y uso de antiparasitarios)

Los asistentes a este seminario ven al Veterinario como el factor de mayor impacto en el control futuro de la resistencia a antiparasitarios y a otras drogas.

• La participación del veterinario en el control parasitológico y en el monitoreo de la susceptibilidad de los parásitos a las drogas no es ajeno al contexto de toda la intervención del profesional.

• Se ha sugerido en esta reunión definir un programa en torno a las “Buenas Prácticas profesionales”, en un entorno de “Buenas Prácticas ganaderas”

• Se propone crear un mensaje que convoque a actores aún ausentes o por lo menos no vinculados efectivamente al progreso de las definiciones en estos temas,

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especialmente, Organismos de contralor (SENASA), Corporaciones (Colegios de Veterinarios y Cámaras industriales de elaboradores de productos) se identifican como los más importantes. No porque no se hayan contactado, sino porque es necesaria una presencia más fuerte en un programa que haga efectivas las “buenas prácticas”.

• Como en otros países, la corresponsabilidad de un veterinario debería ser obligatoria en todo establecimiento de producción animal. No obstante la promulgación de normas formales no alcanza y debe además estimularse la aceptación voluntaria de ese corresponsable.

• Se trata de crear un verdadero mercado de servicios y productos que den calidad a la gestión.

• Deberían haber registros en los campos sobre el uso de drogas (tipo de drogas, fecha y oportunidad de aplicación, categorías tratadas, respaldo de diagnósticos, etc.) –Tal vez estos comentarios deberían orientarse a un manual de buenas prácticas. Se definió esto como parte de un proceso de “profesionalización del uso de medicamentos” en veterinaria.

Debemos lograr además que los veterinarios se pongan a la altura de nuevos roles (técnica y operativamente) 7.4 Respecto a la comercialización de productos antiparasitarios

• Se declaró que es demasiado alto el número de productos con controles pre-comercialización insuficientes

• La normativa de SENASA, en la aprobación y seguimiento de productos debe actualizarse

• Son excesivas las libertades de comercialización de productos veterinarios • Los precios son demasiado bajos (el tema debe analizarse más profundamente) • Se sugirió realizar una reunión con participación formal de todos los actores

institucionales (privados y oficiales) y resolver sobre estos ítems. 8. ACTIVIDADES Y RESULTADOS DEL PROYECTO 8.1. Identificación de los grupos de trabajo

Se escogió a los grupos de trabajo que intervinieron en este proyecto en base a su actividad en Parasitología y su capacidad operativa acorde a las necesidades.

Los grupos de profesionales que tuvieron a su cargo la realización del muestreo de establecimientos fueron dieciséis, según el siguiente detalle: Dra. Bibiana Cetrá y Tec. Marisa Pereira, Domingo Aguilar (INTA Mercedes, Corrientes) Dr. Miguel Buffarini (INTA Gral. Villegas, Buenos Aires) Dres. Christian Cutullé, Raquel Castaño, Tec. Gabriel Balbiani, Mirta Castro, Romina Schütz (INTA Castelar) Dr. Carlos Descarga (INTA Marcos Juárez, Córdoba) Dr. Carlos Entrocasso (INTA Balcarce, Buenos Aires) Dr. Roberto Lamberti (Fac. Cs.Vet., Univ. Nac. de La Pampa, La Pampa) Dr. Carlos Luciani (INTA Colonia Benitez, Chaco) Dr. César Mattos (SENASA, Santa Fe) Dr. Daniel Medus (INTA Concepción del Uruguay) Dr. Fermín Olaechea (INTA Bariloche) Dr. Federico Plorutti (INTA Chascomús, Buenos Aires) Dr. Jorge Romero (CEDIVE – Univ. Nac. de La Plata, Buenos Aires) Dr. Carlos Rossanigo (INTA San Luis, San Luis) Dr. Pedro Steffan y Dr. César Fiel (Fac. Cs. Vet., Univ. Nac. del Centro, Buenos Aires)

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Dres. Martín Correa Luna y Leticia Calvente (INTA Venado Tuerto, Santa Fe) Dr. Victor Suárez (INTA Anguil, La Pampa) 8.2. Redacción de los procedimientos operativos estándar

Para que todos los grupos de trabajo operaran del mismo modo, la Coordinación Nacional del Proyecto redactó los procedimientos operativos estándar para el muestreo y el procesamiento de muestras (Ver Apéndice I). Las fuentes para estos, fueron los trabajos de Fiel y col. (2001) y Eddi et al. (1994). 8.3. Difusión de la existencia del Proyecto en medios de comunicación especializados

Durante el mes de Marzo de 2003 se concurrió a entrevistas televisivas y radiales en programas especializados en temas del agro y se comunicó en forma adecuada la existencia y los objetivos del Proyecto. También hubo gacetillas sobre el EL PROYECTO en INTA informa y en otros medios electrónicos de difusión. 8.4. Muestreo de establecimientos para determinación de resistencia a los

antiparasitarios internos Bovinos Para la determinación de la prevalencia nacional de resistencia antihelmíntica en bovinos se muestrearon al azar 95 establecimientos provenientes de las provincias de Buenos Aires, Córdoba, Corrientes, Chaco, Entre Ríos, La Pampa, Neuquén, Río Negro, San Luis y Santa Fe. La mayor cantidad de campos muestreados provinieron de la provincia de Buenos Aires, donde se concentra la mayor cantidad de cabezas de ganado bovino (INDEC, 2001).

En los muestreos de bovinos se evaluaron tres grupos antihelmínticos diferentes:

levamisol (8 mg/Kg., fosfato de levamisol 22,3%), bencimidazol (5 mg/Kg., fenbendazol 10%) e ivermectina (200 µg/Kg., ivermectina 1%). Todos los grupos, incluyendo al grupo control sin tratamiento, estaban formados por 15 animales con una carga homogénea de HPG. La carga de HPG mínima de los bovinos para poder ser incluidos en el ensayo debía ser de 100. El método in vivo utilizado para el diagnóstico de resistencia antihelmíntica fue el Test de Reducción de Conteos de Huevos (TRCH). En Apéndice I están descriptos los procedimientos utilizados, los criterios de selección de los animales intervinientes, la formación de grupos homogéneos en cuanto a la carga de HPG, las instrucciones para el llenado de las planillas acompañantes de las muestras y para el envío de las muestras.

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Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1: Resistencia antihelmíntica en bovinos CAMPOS

MUESTREADOS SUSCEPTIBLES RLEV RBZD RIVM HPG INSUF

Buenos Aires (38) 9 2 2 19 9

Córdoba (8) 4 1 0 3 1 Corrientes (8) 4 1 3 3 0 Chaco (2) 0 0 0 2 0 Entre Ríos (5) 0 0 2 4 1 La Pampa (12) 8 0 0 4 0 Neuquén (1) 1 0 0 0 0 Río Negro (1) 0 0 0 1 0 San Luis (1) 0 1 0 0 0 Santa Fe (9) 2 0 0 2 5 TOTAL (85) 28/69 (41%) 5/69 (7%) 7/69 (10%) 38/69 (55%) 16/85 (19%)RLEV: Resistencia a levamisol RBZD: Resistencia a bencimidazol RIVM: Resistencia a ivermectina HPG INSUF: Establecimientos con animales con HPG insuficiente para la realización del

ensayo.

De los 85 establecimientos muestreados, 16 fueron desechados por no reunir la cantidad mínima de animales con HPG suficiente para la realización del TRCH. La determinación de la prevalencia se hizo sobre 69 establecimientos donde el 41% tenían parásitos susceptibles al tratamiento con todas las drogas utilizadas, el 7% tenía resistencia al levamisol, el 10% a bencimidazol y un 55% tenía parásitos resistentes al tratamiento con ivermectina.

Ocho establecimientos tenían parásitos resistentes a más de una droga antiparasitaria; tres de ellos eran de Buenos Aires, uno de Córdoba, dos de Corrientes y dos de Entre Ríos. Hubo un solo establecimiento (Bov025 El Rocío, Mercedes, Corrientes) con resistencia múltiple a todas las drogas evaluadas.

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Representación gráfica de los muestreos bovinos realizados

Total de campos muestreados (n=85) Total de campos RLEV (n=5)

Total de campos RBZD (n=7) Total de campos RIVM (n=38)

Ovinos La determinación de la prevalencia nacional de resistencia antihelmíntica en ovinos se realizó con los mismos procedimientos utilizados para los bovinos. Se muestrearon al azar 35 establecimientos provenientes de las provincias de Buenos Aires, Corrientes, Chubut, La Pampa, Santa Cruz y Tierra del Fuego. El 80% de los establecimientos muestreados provinieron de las provincias de Buenos Aires y Entre Ríos.

En la realización de los muestreos colaboraron los mismos grupos de trabajo que participaron de los muestreos bovinos y se evaluaron los mismos antiparasitarios. En los establecimientos de Corrientes se evaluó, además, el closantel.

Todos los grupos, incluyendo al grupo control sin tratamiento, estaban formados por 15 animales con una carga homogénea de HPG. La carga de HPG mínima de los ovinos para poder ser incluidos en el ensayo debía ser de 200.

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Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla 2.

Tabla 2: Resistencia antihelmíntica en ovinos CAMPOS

MUESTREADOS SUSCEPTIBLES RLEV RBZD RIVM RCLO HPG INSUF

Buenos Aires (19) 6 2 7 7 0 3

Corrientes (9) 0 5 9 9 5 0 Chubut (3) 2 1 1 0 0 0

La Pampa (2) 2 0 0 0 0 0 Santa Cruz (1) 1 0 0 0 0 0

Tierra del Fuego (1) 1 0 0 0 0 0

TOTAL (35) 12/32 (38%) 8/32 (25%)

17/32 (53%)

16/32 (50%)

5/32 (16%*)

3/35 (9%)

De los 35 establecimientos muestreados, sólo 3 fueron desechados por no reunir la

cantidad mínima de animales con HPG suficiente para la realización del TRCH. La determinación de la prevalencia se hizo sobre 32 establecimientos donde el 38% tenían parásitos susceptibles al tratamiento con todas las drogas utilizadas, el 25% tenía resistencia al levamisol, el 53% a bencimidazol, un 50% a ivermectina y un 16% tenía Haemonchus contortus resistente a closantel.

El closantel fue evaluado solamente en los establecimientos de la provincia de Corrientes. Cinco de los nueve establecimientos de esta provincia (56%) tenía Haemonchus contortus resistente a esta droga. Dieciséis establecimientos tenían parásitos resistentes a más de una droga antiparasitaria. En la tabla de debajo se detallan los tipos de resistencia múltiple diagnosticados en ovinos. Tabla 3: Resistencia múltiple en ovinos RLEV RFBZ RFBZ RIVM RLEV RFBZ RIVM RFBZ RIVM

RCLO RLEV RFBZ RIVM RCLO

Ovi009 (Chubut)

Ovi004 (Bs. As.) Ovi003 (Corrientes)

Ovi002 (Corrientes)

Ovi012 (Corrientes)

Ovi016 (Bs. As.)


Ovi008 (Corrientes)

Ovi031 (Corrientes)


Ovi011 (Corrientes)

Ovi029 (Corrientes)

Ovi033 (Bs. As.) Ovi034 (Bs. As.) Dos establecimientos en Corrientes (Ovi012 y Ovi031 ) tenían resistencia múltiple a todas las drogas incluyendo al closantel.

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8.5. Puesta a punto de técnicas in vitro (IEH, Inhibición de la eclosión de huevos) y de

PCR para determinación de resistencia a benzimidazoles e ivermectina respectivamente

Puesta a punto de la técnica de EHA (Egg Hatch Assay, Prueba de Eclosión de Huevos)

En el laboratorio del Área de Parasitología de INTA Castelar, desde 1997 se mantienen tres aislamientos de parásitos ovinos (uno susceptible al tratamiento con bencimidazol e ivermectina, otro resistente al tratamiento con bencimidazol y otro resistente a ivermectina) y una cepa pura de Haemonchus contortus susceptible. Para la futura comparación de los resultados de resistencia antihelmíntica obtenidas con la prueba de campo del test de reducción del HPG (TRCH o TRCH, Faecal Egg Count Reduction Test) se puso a punto la prueba de eclosión de huevos (IEH o EHA, Egg Hatch Assay). La puesta a punto de esta técnica tiene por objeto efectuar comparaciones de los resultados de campo obtenidos a través del TRCH. Hasta el presente, a pesar de las desventajas que presenta el TRCH en cuanto a su celeridad y precocidad en la obtención de un resultado diagnóstico, sigue siendo a campo la prueba de diagnóstico de resistencia por excelencia. La determinación del grado de correlación entre ambas técnicas permitiría emplear la IEH como método de screening en el diagnóstico de resistencia a los bencimidazoles y como método evaluatorio de los aislamientos y cepas mantenidos en el laboratorio. La IEH consiste en incubar huevos de parásitos durante 48 horas a 25-27 °C y 80% de humedad relativa ambiente, en concentraciones crecientes de tiabendazol (TBZ, Sigma© T5535. Thiabendazole 50 g. Plant Cell Culture Tested. Batch # 113K1292) y determinar el porcentaje de larvas que eclosiona. Una limitante importante para la realización de esta técnica, son las condiciones de envío y el tiempo transcurrido desde la obtención de la muestra de materia fecal hasta su procesamiento en el laboratorio ya que el efecto del TBZ varía de acuerdo al grado de evolución de los huevos (huevos sin desarrollar con mórula versus huevos desarrollados con larva en su interior) dando lugar a resultados erróneos en la determinación del porcentaje de eclosión. La eficacia del TBZ para afectar la eclosión larval disminuye a medida que aumenta el desarrollo de los huevos. Por eso es importante que las muestras lleguen al laboratorio lo más pronto posible (no más de 72 h desde el momento de extracción) y en buenas condiciones (4 °C y en anaerobiosis). En Apéndice II se detallan los procedimientos efectuados. Técnicas moleculares para detección de resistencia a Ivermectina

Obtención de marcadores moleculares para la detección de resistencia antihelmíntica que determinen en forma precoz diferencias a nivel ADN entre cepas de parásitos susceptibles y resistentes a la ivermectina. Técnicas moleculares empleadas 1- PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) 2- RAPD-PCR (Amplificación al azar de sectores polimórficos del ADN)

Se estableció la metodología de extracción de ADN en huevos, larvas y nematodes adultos que permite un mejor rendimiento del material genético.

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Se diseñaron y construyeron primers para la amplificación de sectores génicos involucrados en la resistencia a la IVM (HcGluCl) y (HcPgp).

Se amplificaron sectores génicos que codifican para (HcGluCl) y (HcPgp) en huevos, larvas y adultos.

Se estableció un patrón de bandas a partir de ADN genómico de larvas de H. contortus que nos permite diferenciar cepas susceptibles y resistentes a la ivermectina. Para establecer el mismo se probaron 5 oligonucleótidos de secuencia aleatoria (RAPDs) de los cuales 1 de ellos mostró buena repetibilidad.

Este patrón puede considerarse una herramienta útil para la diferenciación entre cepas resistentes y susceptibles. No obstante pueden presentarse bandas producto de variabilidad genética no debida a la resistencia sino a otros factores. Para disminuir la posibilidad de encontrar este tipo de bandas en los patrones, se decidió amplificar sectores génicos implicados en la resistencia a la ivermectina, como ser aquellos que codifican para la subunidad α de los canales de cloro para el glutamato (GluClα) y para la glicoproteína P (Gp P). Posteriormente los productos de estas amplificaciones se sometieron a la amplificación por medio de RAPDs. De esta manera se pudo establecer con buena repetibilidad un patrón de bandas para una cepa pura de H. contortus susceptible a partir del sector génico que codifica para GluClα. A futuro se espera establecer un patrón de bandas para cepas resistentes utilizando los mismos oligonucleótidos y de esta manera poder diferenciar unas de otras.

En Apéndice III se detallan los procedimientos efectuados. 8.6. Búsqueda de alternativas de manejo de antiparasitarios

El uso de medidas alternativas para el control de los parásitos fue testeado en la Provincia de corrientes. La aplicación de la técnica de FAMACHA (Ver Apéndice V) redujo la necesidad de tratamiento en 60% de los ovinos, pero fue evaluada a la salida de una temporada muy seca y debería ser probada nuevamente dado que los animales estaban en condición desfavorable y la cantidad de larvas de Haemonchus contortus en las pasturas pudo ser menor de lo normal debido a la falta de humedad. También se evaluó el efecto de la administración de partículas de oxido de cobre, obteniendo una reducción del HPG por alrededor de 6 semanas. Esta reducción se produce principalmente por una disminución del número de huevos de Haemonchus contortus que salen con la materia fecal.

En cuanto a químicos diferentes a los usados en la actualidad, se evaluó el efecto de naftalophos con resultados de muy buena eficacia para reducir la cantidad de huevos en materia fecal de ovinos. Su precio es comparativamente muy elevado y no se comercializa en Argentina. 8.7. Asesoramiento por parte del Consultor Externo El Dr. Flavio Echevarría de EMBRAPA Bagé (Brasil) concurrió en dos oportunidades a INTA Castelar para estudiar los resultados del Proyecto y hacer recomendaciones para su mejor avance. Dictado de Charlas para Productores y Veterinarios

Se dictaron 30 charlas para productores y veterinarios en distintas localidades del país. La concurrencia a estas charlas llegó a 900 asistentes aproximadamente. 8.10. Dictado de Cursos para Veterinarios

Se dictaron 4 cursos de 2 días de duración para Médicos Veterinarios en las ciudades de Balcarce (Pcia de Buenos Aires), Mercedes (Pcia de Corrientes), Villa Mercedes (Pcia de San Luis) y Castelar (Pcia de Buenos Aires). A los mismos, asistieron 120

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Profesionales dedicados al asesoramiento sanitario de productores, laboratorios de diagnóstico veterinario y docencia universitaria. 8.11. Producción de un CD con las herramientas para determinar la presencia de

resistencia a los antihelmínticos Se editó un CD para distribuir entre los profesionales que tomaron los cursos mencionados más arriba, conteniendo los procedimientos operativos estándar, una planilla de Excel para el manejo del muestreo de establecimientos, un libro electrónico para la identificación de larvas de parásitos gastrointestinales por el método del Dr. Román Niec, y las presentaciones de los oradores del Curso. 8.12. Producción de un video para productores

Se editó un video para productores explicando el problema de la resistencia a los antiparasitarios y mostrando la importancia de manejar estos productos bajo control profesional veterinario. 8.13. Producción de un video para Médicos Veterinarios Se editó un video para Médicos Veterinarios en el que se presenta el paso a paso de las técnicas de laboratorio para determinación de resistencia por el método de TRCH y se muestran las herramientas para un control de los parásitos adecuado a la presencia de resistencia.

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APÉNDICE I RESISTENCIA A LOS ANTIHELMÍNTICOS EN RUMIANTES GUÍA DE PROCEDIMIENTOS PARA MUESTREO DE ESTABLECIMIENTOS BOVINOS

La evaluación de la prevalencia de la resistencia a los antihelmínticos se llevará a cabo en 100 establecimientos de bovinos y 100 de ovinos. Se empleará una técnica de diagnóstico in vivo: el Test de Reducción de Conteo de Huevos (TRCH).

Básicamente se estudiará la resistencia a los tres principios activos antihelmínticos más utilizados en nuestro país: levamisol, fenbendazol e ivermectina.

Para la dosificación de los animales, se emplearán formulaciones obtenidas de laboratorios elaboradores del mercado local, con su correspondiente certificado de analisis químico y físico-químico.

Para evitar que los resultados se relacionen a las marcas comerciales de los productos empleados, estos serán enviados por la Coordinación Nacional a los lugares de utilización, desprovistos de rótulos u otra característica de envases que permitirían su identificación. Solamente se conocerá su principio activo y su dosificación.

Los antiparasitarios serán aplicados por los Coordinadores o los integrantes de sus grupos de trabajo. Evaluación de la prevalencia de resistencia a los antihelmínticos

Se llevará a cabo mediante la realización del Test de Reducción de Conteo de Huevos (TRCH) para lo cual se organizarán las tareas en tres jornadas de trabajo de campo y dos jornadas de trabajo de laboratorio por cada establecimiento muestreado. Primera jornada de campo Primer Muestreo de Materia Fecal, Identificación y Pesaje

Se emplearán animales jóvenes, menores de un año de edad, que no hayan sido

desparasitados en los últimos 60 días anteriores al muestreo y que en ese período hayan sido mantenidos sobre pasturas contaminadas. 1) En cada establecimiento escogido se identificará con caravanas a 100 animales jóvenes, se les extraerá muestra de materia fecal (40-60 g por cada animal) y se los pesará o se calculará su peso individual. Los datos se anotarán en la Planilla de primer muestreo (hoja 2 de las 4 que se llenará para cada establecimiento).. 2) Las muestras se extraerán directamente del recto en bolsas de polietileno perfectamente identificadas con el numero del animal. Se extraerá el aire de la bolsa y se anudará la misma en el punto más cercano posible a su contenido. Serán transportadas al laboratorio refrigeradas tan rápidamente como sea posible. Las muestras podrán ser almacenadas a 4 °C, pero nunca deben congelarse. 3) Una vez identificados, muestreados y pesados, los 100 animales volverán a su potrero original. 4) Se explicará al encargado del establecimiento que en los próximos días, cuando se cuente con el resultado del laboratorio, si los animales están suficientemente parasitados, habrá que juntarlos nuevamente para hacer el tratamiento. Este momento, puede aprovecharse para llenar la Planilla de manejo del establecimiento (hoja 1 de las 4 que habrá que llenar para cada establecimiento)

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Primera Jornada de Laboratorio: HPG y Formación de Grupos 1) Conteo de huevos por gramo (H.p.g.) de materia fecal. Se utilizará la técnica de Mc Master modificada Se colocan 3 g de materia fecal en un mortero, se mezclan gradualmente con 57 cm3 de solución sobresaturada de cloruro de sodio (densidad 1200) (dilución: 1/20). Se vierte el contenido en un vaso de precipitado y se coloca sobre agitador magnético. Con pipeta Pasteur y tetina se toma contenido del vaso en agitación y se carga la cámara de conteo (cámara INTA) que tiene 4 retículos de 0,5 cm3 de capacidad cada uno, lo que da un volumen total de 2 cm3 con la precaución que no quede excesiva cantidad de burbujas de aire, para lo cual resulta práctico humedecer la cámara antes de su llenado. Se deja reposar unos minutos y se transfiere al microscopio para su lectura. Se cuentan todos los huevos de nematodes de los cuatro retículos y se multiplican por el factor 10, lo que permite expresar el resultado en huevos por gramo (HPG) de materia fecal. 2) Formación de grupos: Los animales seleccionados para la realización del TRCH deberán tener conteos mínimos de 100 H.p.g. Se formarán 4 grupos de 15 animales cada uno sobre la base de los conteos de H.p.g de forma tal que se asegure una distribución homogénea para cada uno de ellos. A tal fin se proveerá un archivo de EXCEL que, con sólo volcar los datos de la Planilla de primer muestreo, permitirá hacer los grupos con muy poco esfuerzo e imprimir la Planilla de tratamiento (hoja 3 de las 4 a llenar) y la Planilla de Segundo Muestreo (hoja 4 de las 4 que hay que llenar) que serán utilizadas por la persona encargada de estas tareas. Segunda Jornada de Campo Tratamiento de los cuatro grupos formados en base al HPG. Se considerará como DÍA 0 de la prueba. 1) Es conveniente avisar al encargado del campo el día anterior al tratamiento para que, por la tarde, junte los animales de modo que, en el momento de la dosificación, tengan un período de ayuno cercano a las 12 horas. 2) El tratamiento que corresponda a cada grupo, será asignado al azar, pero siempre se respetará la siguiente denominación: Grupo 1: Control no tratado; Grupo 2: Levamisol; Grupo 3: Fenbendazol y Grupo 4: Ivermectina. 3) La persona encargada de aplicar el tratamiento a los animales, concurrirá al establecimiento con la Planilla de Tratamiento que deberá tildar a medida que aplica cada dosis. Solamente el Grupo 3 Fenbendazol, será dosificado por vía oral, los restantes grupos tratados, recibirán su dosis por vía inyectable subcutánea. 4) Se aconseja sujetar a cada animal en el cepo de modo de asegurar su identificación y aplicarle el antiparasitario que corresponda a su grupo con menor posibilidad de errores. Se puede hacer una marca con pintura en la frente de cada animal para favorecer su identificación durante el segundo muestreo. 5) Si hubiera alguna modificación en los grupos o en los tratamientos se anotará en el titulo OBSERVACIONES de la Planilla de Tratamiento. 6) Una vez aplicado el antiparasitario, los animales volverán a sus potreros de origen. 8) Dejar avisado al encargado del establecimiento que dentro de dos semanas se volverá para sacar muestra de materia fecal de los mismos animales, pero indicar que el encierre se

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haga en el mismo momento que se llegue a hacer el muestreo, para que los animales no vacíen su tubo digestivo por horas de encierre previo. Tercera Jornada de Campo En esta oportunidad, se extraerá muestra de materia fecal a los animales de los cuatro grupos, del mismo modo que se hizo en la Primera Jornada de Campo y se llevaran al laboratorio para determinar el HPG y hacer los cultivos. 1) 14 días después del día del tratamiento, la persona encargada de esta tarea, concurrirá al establecimiento, con la Planilla para segundo muestreo en la que constaran los 4 grupos experimentales con los números de los animales que los componen y espacio para que el laboratorio anote el HPG y el resultado de los cultivos. 2) Se extraerá muestra de materia fecal del recto a cada uno de los animales que componen los 4 grupos experimentales. Esta vez es muy importante que las muestras sean abundantes, ya que el sobrante de materia fecal, después de hacer el HPG y los cultivos, se va a usar para probar las técnicas de LDA y PCR. Las bolsas de polietileno conteniendo la muestra, serán perfectamente identificadas con el número del animal. Se extraerá el aire de la bolsa y se anudará la misma en el punto más cercano posible a su contenido. 3) Se tildará cada número de caravana en la planilla para confirmar y se anotará cualquier modificación en OBSERVACIONES. 4) Una vez extraídas las muestras, los animales serán devueltos a sus potreros. 5) Se indicará al encargado del establecimiento que el trabajo con los animales ha concluido y que en el término de 20 días tendrá el resultado de la prueba de resistencia. 6) Las muestras serán transportadas refrigeradas al laboratorio tan rápidamente como sea posible. Las muestras podrán ser almacenadas a 4 °C, no deben congelarse. 7) Se entregará la planilla de segundo muestreo al laboratorista, junto con las muestras. Segunda Jornada de Laboratorio

Se determinará el HPG de cada muestra tomada durante el segundo muestreo y se harán cultivos en pool para cada uno de los cuatro grupos experimentales de modo de poder indicar la participación porcentual de cada género en la composición de la muestra.

Se enviará la materia fecal sobrante de cada animal de cada grupo a Jorge Caracostantogolo para probar las técnicas de LDA y PCR en INTA Castelar. 1) Anotar cada valor de HPG en la Planilla de segundo muestreo. 2) Diagnóstico de los géneros parasitarios actuantes en base a coprocultivos.

a) Se realizarán coprocultivos en pool por grupo (tomando 4 a 5 g de cada muestra). b) Se practicará la técnica de Corticelli-Lai (1963) para que los huevos desarrollen hasta

L3.

c) Se emplearán las claves de Niec (Niec, 1968) para la identificación de las L3.

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d) En base al número de las larvas halladas de cada género en una muestra del cultivo,

se obtendrá el porcentaje de cada genero para cada grupo de tratamiento, incluido el grupo control no tratado.

3) Al cumplirse los 10 a 12 días de iniciados los cultivos, se anotará el porcentaje de cada género para cada grupo en la parte inferior de la Planilla de segundo muestreo. RESISTENCIA A LOS ANTIHELMÍNTICOS EN RUMIANTES. GUÍA DE PROCEDIMIENTOS PARA MUESTREO DE ESTABLECIMIENTOS OVINOS

La evaluación de la prevalencia de la resistencia a los antihelmínticos se llevará a cabo en 100 establecimientos de bovinos y 100 de ovinos. Se empleará una técnica de diagnóstico in vivo: el Test de Reducción de Conteo de Huevos (TRCH).

Básicamente se estudiará la resistencia a los tres principios activos antihelmínticos más utilizados en nuestro país: levamisol, fenbendazol e ivermectina.

Para la dosificación de los animales, se emplearán formulaciones obtenidas de laboratorios elaboradores del mercado local, con su correspondiente certificado de analisis químico y físico-químico.

Para evitar que los resultados se relacionen a las marcas comerciales de los productos empleados, estos serán enviados por la Coordinación Nacional a los lugares de utilización, desprovistos de rótulos u otra característica de envases que permitirían su identificación. Solamente se conocerá su principio activo y su dosificación.

Los antiparasitarios serán aplicados por los Coordinadores o los integrantes de sus grupos de trabajo. Evaluación de la prevalencia de resistencia a los antihelmínticos Se llevará a cabo mediante la realización del Test de Reducción de Conteo de Huevos (TRCH) para lo cual se organizarán las tareas en tres jornadas de trabajo de campo y dos jornadas de trabajo de laboratorio por cada establecimiento muestreado. Primera jornada de campo Primer Muestreo de Materia Fecal, Identificación y Pesaje Se emplearán animales jóvenes, de 5 a 6 meses de edad, que no hayan sido desparasitados en los últimos 60 días anteriores al muestreo y que en ese período hayan sido mantenidos sobre pasturas contaminadas. 1) En cada establecimiento escogido se identificará con caravanas a 100 animales jóvenes, se les extraerá muestra de materia fecal (20 a 30 g por cada animal) y se los pesará o se calculará su peso individual. Los datos se anotarán en la Planilla de primer muestreo (hoja 2 de las 4 que se llenará para cada establecimiento). 2) Las muestras se extraerán directamente del recto en bolsas de polietileno perfectamente identificadas con el numero del animal. Se extraerá el aire de la bolsa y se anudará la misma en el punto más cercano posible a su contenido. Serán transportadas al laboratorio refrigeradas tan rápidamente como sea posible. Las muestras podrán ser almacenadas a 4 °C, pero nunca deben congelarse. 3) Una vez identificados, muestreados y pesados, los 100 animales volverán a su potrero original.

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4) Se explicará al encargado del establecimiento que en los próximos días, cuando se cuente con el resultado del laboratorio, si los animales están suficientemente parasitados, habrá que juntarlos nuevamente para hacer el tratamiento. Este momento, puede aprovecharse para llenar la Planilla de manejo del establecimiento (hoja 1 de las 4 que habrá que llenar para cada establecimiento). Primera Jornada de Laboratorio HPG y Formación de Grupos 1) Conteo de huevos por gramo (HPG) de materia fecal. Se utilizará la técnica de Mc Master modificada Se coloca 1 g de materia fecal en un mortero, se mezclan gradualmente con 59 cm3 de solución sobresaturada de cloruro de sodio (densidad 1200) (dilución: 1/60). Se vierte el contenido en un vaso de precipitado y se coloca sobre agitador magnético. Con pipeta Pasteur y tetina se toma contenido del vaso en agitación y se carga la cámara de conteo (cámara INTA) que tiene 4 retículos de 0.5 cm3 de capacidad cada uno, lo que da un volumen total de 2 cm3 con la precaución que no quede excesiva cantidad de burbujas de aire, para lo cual resulta práctico humedecer la cámara antes de su llenado. Se deja reposar unos minutos y se transfiere al microscopio para su lectura. Se cuentan todos los huevos de nematodes de los cuatro retículos y se multiplican por el factor 30, lo que permite expresar el resultado en huevos por gramo (HPG) de materia fecal. Para minimizar el efecto dilutorio que tiene una mayor proporción de agua en la materia fecal, sobre el número final de HPG se aplicarán los siguientes factores de corrección (Skerman y Hillard, 1966) 1. Materia fecal normal (boñigas sueltas) factor: 1 2. Boñigas pegadas, factor: 1.5 3. Materia fecal semiblanda (sin boñigas), factor: 2 4. Materia fecal liquida (diarrea), factor: 3 El conteo de HPG obtenido (número de huevos contados x factor de dilución de la muestra) se lo multiplica por 1, 1.5, 2 o 3, dependiendo de la consistencia de la muestra y se obtiene el HPG final. 2) Formación de grupos: Los animales seleccionados para la realización del TRCH deberán tener conteos mínimos de 200 H.p.g. Se formarán 4 grupos de 15 animales cada uno sobre la base de los conteos de H.p.g de forma tal que se asegure una distribución homogénea para cada uno de ellos. A tal fin se proveerá un archivo de EXCEL que, con sólo volcar los datos de la Planilla de primer muestreo, permitirá hacer los grupos con muy poco esfuerzo e imprimir la Planilla de tratamiento (hoja 3 de las 4 a llenar) y la Planilla de Segundo Muestreo (hoja 4 de las 4 que hay que llenar) que serán utilizadas por la persona encargada de estas tareas. Segunda Jornada de Campo Tratamiento de los cuatro grupos formados en base al HPG. Se considerará como DÍA 0 de la prueba. 1) Es conveniente avisar al encargado del campo el día anterior al tratamiento para que, por la tarde, junte los animales de modo que, en el momento de la dosificación, tengan un período de ayuno cercano a las 12 horas. 2) El tratamiento que corresponda a cada grupo, será asignado al azar, pero siempre se respetará la siguiente denominación: Grupo 1: Control no tratado; Grupo 2: Levamisol; Grupo 3: Fenbendazol y Grupo 4: Ivermectina.

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3) La persona encargada de aplicar el tratamiento a los animales, concurrirá al establecimiento con la Planilla de Tratamiento que deberá tildar a medida que aplica cada dosis. Solamente el Grupo 3 Fenbendazol, será dosificado por vía oral, los restantes grupos tratados, recibirán su dosis por vía inyectable subcutánea. 4) Se aconseja sujetar a cada animal individualmente, de modo de asegurar su identificación y aplicarle el antiparasitario que corresponda a su grupo con menor posibilidad de errores. Se puede hacer una marca con pintura en la frente de cada animal para favorecer su identificación durante el segundo muestreo. 5) Si hubiera alguna modificación en los grupos o en los tratamientos se anotará en el titulo OBSERVACIONES de la Planilla de Tratamiento 6) Una vez aplicado el antiparasitario, los animales volverán a sus potreros de origen 8) Dejar avisado al encargado del establecimiento que dentro de doce días se volverá para sacar muestra de materia fecal de los mismos animales, pero indicar que el encierre se haga en el mismo momento que se llegue a hacer el muestreo, para que los animales no vacíen su tubo digestivo por horas de encierre previo. Tercera Jornada de Campo: En esta oportunidad, se extraerá muestra de materia fecal a los animales de los cuatro grupos, del mismo modo que se hizo en la Primera Jornada de Campo y se llevarán al laboratorio para determinar el HPG y hacer los cultivos. 1) Doce (12) días después del día del tratamiento, la persona encargada de esta tarea, concurrirá al establecimiento, con la Planilla para segundo muestreo en la que constarán los 4 grupos experimentales con los números de los animales que los componen y espacio para que el laboratorio anote el HPG y el resultado de los cultivos. 2) Se extraerá muestra de materia fecal del recto a cada uno de los animales que componen los 4 grupos experimentales. Las bolsas de polietileno conteniendo la muestra, serán perfectamente identificadas con el número del animal. Se extraerá el aire de la bolsa y se anudará la misma en el punto más cercano posible a su contenido. 3) Se tildará cada número de caravana en la planilla para confirmar y se anotará cualquier modificación en OBSERVACIONES. 4) Una vez extraídas las muestras, los animales serán devueltos a sus potreros. 5) Se indicará al encargado del establecimiento que el trabajo con los animales ha concluido y que en el término de 20 días tendrá el resultado de la prueba de resistencia. 6) Las muestras serán transportadas refrigeradas al laboratorio tan rápidamente como sea posible. Las muestras podrán ser almacenadas a 4 °C, no deben congelarse. 7) Se entregará la planilla de segundo muestreo al laboratorista, junto con las muestras. Segunda Jornada de Laboratorio Se determinará el HPG de cada muestra tomada durante el segundo muestreo y se harán cultivos en pool para cada uno de los cuatro grupos experimentales de modo de poder indicar la participación porcentual de cada género en la composición de la muestra.

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1) Anotar cada valor de HPG en la Planilla de segundo muestreo. 2) Diagnóstico de los géneros parasitarios actuantes en base a coprocultivos.

e) Se realizarán coprocultivos en pool por grupo (tomando 4 a 5 g de cada muestra). f) Se practicará la técnica de Corticelli-Lai (1963) para que los huevos desarrollen hasta

L3.

g) Se emplearán las claves de Niec (Niec, 1968) para la identificación de las L3. h) En base al número de las larvas halladas de cada género en una muestra del cultivo,

se obtendrá el porcentaje de cada genero para cada grupo de tratamiento, incluido el grupo control no tratado.

4) Al cumplirse los 10 a 12 días de iniciados los cultivos, se anotará el porcentaje de cada género para cada grupo en la parte inferior de la Planilla de segundo muestreo.

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APÉNDICE II PROCEDIMIENTOS PARA LA TÉCNICA IN VITRO IEH (INHIBICIÓN DE LA ECLOSIÓN

DE HUEVOS o EHA, EGG HATCH ASSAY) Puesta a punto de la técnica de IEH (Inhibición de la Eclosión de Huevos) En el laboratorio del Área de Parasitología de INTA Castelar, desde 1997 se mantienen tres aislamientos de parásitos ovinos (uno susceptible al tratamiento con bencimidazol e ivermectina, otro resistente al tratamiento con bencimidazol y otro resistente a ivermectina) y una cepa pura de Haemonchus contortus susceptible. Para la futura comparación de los resultados de resistencia antihelmíntica obtenidas con la prueba de campo del test de reducción del HPG (TRCH) se puso a punto la prueba de eclosión de huevos (IEH). La puesta a punto de esta técnica tiene por objeto efectuar comparaciones de los resultados de campo obtenidos a través de TRCH. Hasta el presente, a pesar de las desventajas que presenta el TRCH en cuanto a su celeridad y precocidad en la obtención de un resultado diagnóstico, sigue siendo a campo la prueba de diagnóstico de resistencia por excelencia. La determinación del grado de correlación entre ambas técnicas permitiría emplear la IEH como método de screening en el diagnóstico de resistencia a los bencimidazoles y como método evaluatorio de los aislamientos y cepas mantenidos en el laboratorio. La EHA consiste en incubar huevos de parásitos durante 48 horas a 25-27 °C y 80% de humedad relativa ambiente, en concentraciones crecientes de tiabendazol (TBZ, Sigma© T5535. Thiabendazole 50 g. Plant Cell Culture Tested. Batch # 113K1292) y determinar el porcentaje de larvas que eclosiona. La parte más crítica de la prueba IEH es el aislamiento de la cantidad necesaria de huevos de nematodes para la realización del ensayo. Para poder efectuar la IEH se necesita un mínimo de 25.000 huevos de nematodes contenidos en un volumen de 10 ml, esto es equivalente a una concentración de aproximadamente 100 huevos por cada 40 µl de suspensión de agua. Para la determinación del mínimo de huevos presentes en una muestra de materia fecal que llega al laboratorio para su procesamiento, se realizan 10 (diez) HPG y se determina su promedio, desvío estándar y coeficiente de variación. Estos tres parámetros permiten saber si en la materia fecal que se está procesando existe la cantidad mínima de huevos necesarios para continuar con el ensayo y a su vez calcular los gramos de materia fecal necesaria para obtener esa cantidad de huevos (100 huevos/40 µl de agua). Aislamiento de los huevos 1. Determinar la cantidad de huevos presentes en un gramo de materia fecal (HPG) en

base al promedio del procesado de 10 muestras. 2. Calcular la cantidad de materia fecal (MF) necesaria para obtener una determinada

cantidad de huevos en un volumen final de 10 ml. 3. Diluir 20 veces cada gramo de materia fecal. Por ejemplo, si proceso 5 g de MF, tengo

que diluirlo en 100 ml. 4. Filtrar esta dilución en coladores: primero por el tamiz de 60 meshes (250 µm de

apertura entre hilos, segundo por el tamiz de 80 meshes (177 µm de apertura entre hilos, tercero por el tamiz de 200 meshes (74 µm de apertura entre hilos y cuarto por el tamiz de 500 meshes (25 µm de apertura entre hilos). Nota: por este último tamiz pasa el líquido pero los huevos quedan retenidos en él.

5. Enjuagar el tamiz recolectando el líquido (es allí donde están los huevos). 6. Si el volumen que contiene los huevos es mucho entonces dejar sedimentar durante 1

hora en heladera, luego sifonar y descartar el sobrenadante. 7. Llenar tantos tubos de centrífuga como sea necesario y centrifugar a 2000 RPM durante

10 minutos.

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8. Descartar el sobrenadante, agregar un poco de solución sobresaturada de azúcar, tapar el tubo y agitarlo para romper el sedimento formado

9. Llenar el tubo con sc sobresaturada y centrifugar a 1000 RPM durante 5 minutos. 10. Completar el tubo inyectando solución sobresaturada por debajo del nivel y formar un

menisco de convexidad. Poner un cubre (ideal 22 x 32 mm; sino el cuadrado de 32 mm) y dejar durante 15 minutos.

11. Enjuagar los cubreobjetos y juntar el líquido en uno o dos tubos de centrífuga. Centrifugar nuevamente a 1000 RPM durante 5 minutos. Sifonar y descartar sobrenadante hasta quedar con un volumen de 10 ml.

12. Contar los huevos recolectados en 10 muestras de 40µl. Sacar el promedio y calcular en base a lo que habría en 10 ml.

Preparación de las diluciones de trabajo Se prepararon 6 (seis) diluciones de trabajo: una con agua destilada (control) y las restantes concentraciones de tiabendazol (TBZ) que fueron diluidas con el agua destilada de la siguiente manera: Concentraciones de TBZ

TBZ Volumen 200 µg/ ml 10 ml 150 µg/ ml 10 ml (7,5 ml de 200 µg/ ml + 2,5 ml de agua destilada) 100 µg/ ml 10 ml (5 ml de 200 µg/ ml + 5 ml de agua destilada) 50 µg/ ml 10 ml (2,5 ml de 200 µg/ ml + 7,5 ml de agua destilada) 25 µg/ ml 10 ml (1,25 ml de 200 µg/ ml + 8,75 ml de agua destilada)

Vi x Ci = Vf x Cf

Vi = Vf x Cf Ci

Donde: Vi: es volumen inicial Ci: es concentración inicial de la droga Vf: es el volumen final (la cantidad de solución que yo quiero obtener de una determinada

concentración de droga). Cf: es concentración final de la droga a utilizar para preparar el resto de las concentraciones. Cálculo de las diluciones finales Donde el numerador es el volumen de la dilución de trabajo y el denominador es el volumen total de líquido (volumen de la solución de huevos + volumen de la dilución de trabajo) que se va a examinar en lupa estereoscópica a 50X. 40 µl x 25 µg/ml = 12,5 µg/ml 80 µl 40 µl x 50 µg/ml = 25 µg/ml 80 µl

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40 µl x 100 µg/ml = 50 µg/ml 80 µl 40 µl x 150 µg/ml = 75 µg/ml 80 µl 40 µl x 200 µg/ml = 100 µg/ml 80 µl Cálculo del porcentaje de eclosión Pasadas 48 h de incubación de los huevos con las distintas diluciones de TBZ, se procede a la determinación del porcentaje de eclosión larval (L1, larva de primer estadío) usando la siguiente fórmula:

% de eclosión: (L1 / L1 + huevos) x 100 Una limitante importante para la realización de esta técnica, son las condiciones de envío y el tiempo transcurrido desde la obtención de la muestra de materia fecal hasta su procesamiento en el laboratorio ya que el efecto del TBZ varía de acuerdo al grado de evolución de los huevos (huevos sin desarrollar con mórula versus huevos desarrollados con larva en su interior) dando lugar a resultados erróneos en la determinación del porcentaje de eclosión. La eficacia del TBZ para afectar la eclosión larval disminuye a medida que aumenta el desarrollo de los huevos. Por eso es importante que las muestras lleguen al laboratorio lo más pronto posible (no más de 72 h desde el momento de extracción) y en buenas condiciones (4 °C y en anaerobiosis).

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Resultados obtenidos Tabla 1: Valores promedio de HPG y de la cantidad de huevos recuperados de cada aislamiento (CAB, RBZD y RIVM) y cepa (HAE)

HPG CAB

Huevos CAB

recuperados

40 µl

HPG RBZD

Huevos RBZD

recuperados

40 µl

HPG RIVM

Huevos RIVM recuperados

40 µl HPG HAE

Huevos HAE

recuperados

40 µl 1 3820 125 760 100 460 94 520 113 2 6220 118 560 93 880 79 520 122 3 7900 129 120 112 680 56 400 105 4 9900 138 280 95 1240 85 520 101 5 7480 144 20 90 600 87 400 96 6 7920 142 300 111 780 68 480 105 7 6880 132 120 97 740 82 480 119 8 9620 114 80 93 480 75 580 108 9 7220 145 340 91 980 67 540 127

10 7080 125 80 104 560 70 460 111 Σ 74040 1312 2660 986 7400 763 4900 1107

MA 7404 131,2 266 98,6 740 76,3 490 110,7 DS 1710,0

7 10,90 237,96

7,99 242,76

11,31 58,31

9,72 CV 23,1 8,31 89,46 8,1 32,81 14,83 11,9 8,78

CAB (Cabildo): Aislamiento de parásitos susceptibles al tratamiento con bencimidazol e ivermectina.

RBZD: Aislamiento de parásitos resistentes al tratamiento con bencimidazol. RIVM: Aislamiento de parásitos resistentes al tratamiento con ivermectina. HAE: Cepa de parásitos susceptibles al tratamiento con bencimidazol e ivermectina. La tabla de arriba muestra los valores promedio de HPG y la respectiva recuperación de huevos después de efectuar el proceso de aislamiento de los mismos. Una vez realizados estos cálculos, los huevos de cada cepa/aislamiento fueron incubados en una placa cuadriculada Proqvit® a 25-27 °C durante 48 horas. Para asegurar la humedad necesaria para el desarrollo de los huevos, cada una de las placas Proqvit® fueron puestas dentro una placa de Petri. Pasadas las 48 h de incubación, se procedió a la lectura en una lupa estereoscópica a 50X. Para mejorar la visualización de los huevos y/o larvas, a cada gota que contenía los huevos y el TBZ, se le añadió una gota de lugol.

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Los huevos fueron incubados y enfrentados con las distintas diluciones de acuerdo al siguiente esquema:

Tabla 2: Esquema de trabajo

Diluciones de trabajo Placa PROQVIT®

Sc con huevos

Dilución de trabajo Dilución final

Control (agua destilada) 2 gotas 40 µl 40 µl 0 µg/ml

25 µg/ml (agua destilada) 2 gotas 40 µl 40 µl 12,5 µg/ml

50 µg/ml (agua destilada) 2 gotas 40 µl 40 µl 25 µg/ml




Lectura de las placas

Tabla 3: Porcentaje de eclosión del aislamiento CAB FINAL % Eclosión Diluciones

Finales L1 Huevos Por repetición

Promedio

73 22 76,84 Control (agua destilada) 110 19 85,27

81,06

1 97 0,00 12,5 µg/ml TBZ 0 78 0,00

0,00

0 131 0,00 25 µg/ml TBZ 0 125 0,00

0,00

0 92 0,00 50 µg/ml TBZ 0 147 0,00

0,00

1 115 0,86 75 µg/ml TBZ 0 145 0,00

0,43

0 133 0,00 100 µg/ml TBZ 0 101 0,00

0,00

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En los resultados obtenidos se puede observar que hay un efecto marcado del TBZ impidiendo la eclosión larval en el aislamiento CAB, susceptible al tratamiento con bencimidazol. En los controles se observa que 81% de las larvas eclosionaron de los huevos mientras sólo una larva pudo eclosionar en la dilución final de 75 µg/ml de TBZ.

Tabla 4: Porcentaje de eclosión del aislamiento RBZD FINAL % Eclosión Diluciones


Promedio


91,73

29 61 32,22 12,5 µg/ml TBZ 25 46 35,21

33,72

30 65 31,58 25 µg/ml TBZ 35 51 40,70

36,14

30 47 38,96 50 µg/ml TBZ 24 70 25,53

32,25

17 78 17,89 75 µg/ml TBZ 25 46 35,21

26,55

20 66 23,26 100 µg/ml TBZ 22 50 30,56

26,91

En esta tabla se observa que los efectos del TBZ, impidiendo la eclosión larval, son mucho menos marcados con respecto a lo que se observa en la tabla anterior (aislamiento CAB). El porcentaje de eclosión en los controles es de casi el 92% mientras que en el resto de las diluciones con TBZ, los porcentajes oscilaron alrededor del 30%.

Tabla 5: Porcentaje de eclosión del aislamiento RIVM FINAL % Eclosión Diluciones


Promedio


69,94

4 95 4,04 12,5 µg/ml TBZ 2 75 2,60

3,32

4 84 4,55 25 µg/ml TBZ 4 64 5,88

5,21

3 59 4,84 50 µg/ml TBZ 6 78 7,14

5,99

5 89 5,32 75 µg/ml TBZ 6 76 7,32

6,32

6 71 7,79 100 µg/ml TBZ 8 85 8,60

8,20

En esta tabla se observa que hay efecto del TBZ sobre el aislamiento resistente a ivermectina (RIVM) pero no tan marcado como en el caso del aislamiento CAB ya que el porcentaje de eclosión en las distintas concentraciones de TBZ varía de 3,32 a 8,20%.

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Tabla 6: Porcentaje de eclosión del aislamiento HAE

FINAL % Eclosión Diluciones Finales L1 Huevos Por

repeticiónPromedi

o 63 30 67,74 Control

(agua destilada) 85 34 71,43 69,59

0 126 0,00 12,5 µg/ml TBZ 0 108 0,00

0,00

0 99 0,00 25 µg/ml TBZ 0 116 0,00

0,00

0 140 0,00 50 µg/ml TBZ 0 105 0,00

0,00

1 106 0,93 75 µg/ml TBZ 1 112 0,88

0,91

2 113 1,74 100 µg/ml TBZ 0 135 0,00

0,87

Al igual que lo observado para el aislamiento susceptible (CAB), se observa un marcado efecto del TBZ. Si bien en los controles el porcentaje de eclosión no es muy alto (69,59%), este porcentaje es bien diferente a los observados en el resto de las diluciones de TBZ donde el porcentaje de eclosión máximo que puede observarse es de 0,91%. Resumiendo, estos resultados preliminares indican la potencialidad de esta técnica para constitutirse en una alternativa de diagnóstico para evaluar la resistencia a bencimidazoles que está presente en un 47% de los establecimientos ovinos y en un 10% de los establecimientos bovinos del país.

Esto sería el primer paso para determinar a futuro el grado de repetibilidad de la misma y analizar el grado de correlación que pudiera existir con respecto al TRCH. Al mismo tiempo, la utilización de esta técnica para el diagnóstico a campo está limitado a un solo grupo químico y además está condicionado con los requerimientos de rapidez y buena conservación de las muestras a evaluar.

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APÉNDICE III PROCEDIMIENTOS PARA TÉCNICAS MOLECULARES

Técnicas moleculares empleadas 1- PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) 2- RAPD-PCR (Amplificación al azar de sectores polimórficos del ADN) I) Se estableció la metodología de extracción de ADN en huevos, larvas y nematodes adultos que permite un mejor rendimiento del material genético.

Para la optimización de metodologías de procesamiento de ADN en trichostrongylideos en diferentes estadíos del ciclo de vida se emplearon huevos, larvas y adultos de cepas parasitarias de bovinos y ovinos mantenidas en el laboratorio de Parasitología del Instituto de Patobiología del INTA Castelar.

Se sometieron muestras a la acción de 2 formulaciones diferentes de buffers de lisis (A y B). La extracción de ADN para cada una de las muestras lisadas se llevó a cabo mediante tres metodologías: a) Utilizando fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y precipitación con etanol (Liu et al., 2004). b) Aislamiento utilizando ClNa 4,5 M (Pongratz, 2001) c) Por medio del kit comercial Wizard® Genomic DNA Purification Kit de Promega.

Se determinó que independientemente del buffer de lisis empleado la metodología de purificación de ADN que permite un mayor rendimiento del material genético es la extracción utilizando fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y precipitación con etanol, seguido del aislamiento con ClNa 4,5 M.

II) A partir de ADN genómico de L3 de Haemonchus contortus se estableció un patrón diferencial de bandas de amplificación con RAPDs entre una cepa susceptible y otra resistente a la IVM.

Para llevar a cabo este ensayo se purificó ADN de larvas infectivas proveniente de cepas de referencia mantenidas in vivo por el Área de Parasitología del Instituto de Patobiología del INTA Castelar, mediante la técnica de extracción fenólica. La cepa de referencia susceptible a la IVM estaba compuesta exclusivamente por el género Haemonchus contortus, mientras que en la cepa resistente a la IVM se hallaron los siguientes géneros parasitarios: Haemonchus contortus 93,7% y Teladorsagia circumcincta 6,3%.

Las muestras de ADN se sometieron a una reacción de RAPD-PCR utilizando 20 oligos de secuencias aleatorias de 10 bases cada uno, con sus respectivos controles negativos para cada cepa (Bandi et al., 1993). Los oligos empleados pertenecían a las series RAPDs A y B de Biodynamics. De los 20 primers se seleccionaron sólo los 5 en los que se observó amplificación efectiva para continuar los ensayos de repetibilidad. La secuencias de los oligos se detalla a continuación:

A01 CCC AAG GTC C A08 ACG CAC AAC C A10 ACG GCG TAT G B09 ATG GCT CAG C B10 CAG GCA CTA G

En 8 repeticiones se observó que solamente el oligo A08 conservó el mismo patrón de amplificación diferencial de bandas para las cepas susceptible y resistente: Se observó una banda para la cepa susceptible y cuatro para la resistente. Figura 1.

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S R III) Se diseñaron y construyeron primers para la amplificación de sectores génicos involucrados en la resistencia a la IVM (HcGluCl) y (HcPgp).

La amplificación de sectores génicos involucrados en la resistencia a la IVM para su posterior estudio mediante RAPDs se consideró importante ya que al analizarse sólo estas regiones se evitaría la variabilidad genética producida por factores ajenos a la resistencia. Los genes sospechados de estar implicados, ya sea por presentar mutaciones o sobreexpresión, son aquellos que codifican para la subunidad α de los canales de cloro para el glutamato (GluClα) y para la glicoproteína P (Gp P) (Geary et al., 1999).

Para la amplificación del gen que codifica para la subunidad GluClα se diseñaron primers mediante la aplicación del programa OLIGO 6 y utilizando información de secuencias genómicas provenientes del GenBank online acceso AF119791.

Para la amplificación del gen que codifica para la Gp P, se diseñaron primers mediante la aplicación del programa OLIGO 6 y utilizando información de secuencias genómicas provenientes del GenBank online acceso AF003908.

Estos primers correspondieron al género parasitario Haemonchus contortus y las características para cada uno de los pares se detallan a continuación: Para GluClα 1) HcGluCl91F (forward) 5’ GTGCCCGACACTTTCTTCCAG 3’ 2) HcGluCl91R (reverse) 5’ TACACGAGCCGGGACAGAATC 3’ Longitud del producto de amplificación: 483 bp Posición: 358-820 Para Gp P: 1) HcPgpF (forward) 5’ CTGCCGACTTCACCAAACGAC 3’ 2) HcPgpR (reverse) 5’ CCGCAACGTCCCAAACAAAT 3’ Longitud del producto de amplificación: 805 bp Posición: 1573-2358 IV) Amplificación de sectores génicos que codifican para (HcGluCl) y (HcPgp) en huevos, larvas y adultos.

Se determinaron en forma empírica las proporciones de cada uno de los componentes de la mezcla de reacción para la amplificación por PCR y las condiciones de termociclado.

MP

MP: Marcador de pares bases de 1Kb. S: Cepa susceptible R: Cepa resistente Flechas: indican la amplificación del oligo A08 de 1 y 4 bandas para S y R respectivamente

Figura 1

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La temperatura de annealing para cada par de primers se obtuvo mediante la ejecución de PCR en gradiente de temperaturas tomando como referencia la temperatura óptima de annealing calculada en forma teórica.

Se logró la amplificación exitosa de regiones génicas codificantes de la subunidad proteica GluClα utilizando como templado ADN de huevos, larvas y adultos del género Haemonchus contortus. Figura 2.

Figura 2: Amplificación de ADN purificado de larvas susceptibles a la IVM con primers HcGluCl91. MP: Marcador de pares de bases de 1Kb. 1: Muestra 2: Control positivo 3: Control negativo

En el caso de la amplificación del sector que codifica para la Gp P se obtuvo la banda esperada de 800bp, pero además en condiciones óptimas de annealing amplificó una banda inespecífica de 400bp, lo que condiciona este producto para su posterior análisis con RAPDs. V) Se estableció un patrón de bandas de amplificación con RAPDs en una cepa susceptible a la IVM de Haemonchus contortus a partir de productos de amplificación de (HcGluCl91).

Productos de amplificación de sectores génicos que codifican para la subunidad GluClα se sometieron a una reacción de RAPD-PCR utilizando 6 oligos: A03, A05, A08, A10, B09 y B10.

En 7 repeticiones provenientes de productos de la misma cepa pero diferentes aislamientos de ADN se pudo establecer el siguiente patrón de bandas para cada oligo: A03: 1 banda de 1500 bp A05: 1 banda de 200 bp A08: 3 bandas de 300, 500 y 800 bp A10: 1 banda de 500 bp B09: 4 bandas de 400, 500, 800 y 1400 bp B10: 1 banda de 700 bp

MP 1 2 3

500bp

10000bp

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La importancia de la determinación de métodos para purificar ADN a partir de distintos estadíos parasitarios que nos permitan obtener un mayor rendimiento del material genético radica el mejor aprovechamiento del material cuando la muestra es escasa. Se comprobó que la metodología más adecuada fue la extracción utilizando fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y precipitación con etanol.

Se estableció un patrón de bandas a partir de ADN genómico de larvas de H. contortus que nos permite diferenciar cepas susceptibles y resistentes a la ivermectina. Para establecer el mismo se probaron 5 oligonucleótidos de secuencia aleatorea (RAPDs) de los cuales 1 de ellos mostró buena repetibilidad.

Este patrón puede considerarse una herramienta útil para la diferenciación entre cepas resistentes y susceptibles. No obstante pueden presentarse bandas producto de variabilidad genética no debida a la resistencia sino a otros factores. Para disminuir la posibilidad de encontrar este tipo de bandas en los patrones, se decidió amplificar sectores génicos implicados en la resistencia a la ivermectina, como ser aquellos que codifican para la subunidad α de los canales de cloro para el glutamato (GluClα) y para la glicoproteína P (Gp P). Posteriomente los productos de estas amplificaciones se sometieron a la amplificación por medio de RAPDs. De esta manera se pudo establecer con buena repetibilidad un patrón de bandas para una cepa pura de H. contortus susceptible a partir del sector génico que codifica para GluClα. A futuro se espera establecer un patrón de bandas para cepas resistentes utilizando los mismo oligonucleótidos y de esta manera poder diferenciar unas de otras.

No fue posible realizar un patrón a partir de la amplificación del sector génico codificante para la Gp P, debido a que este producto presenta una banda de amplificación inespecífica. Para aumentar la especificidad de los primers se procederá a aumentar el número de bases de los mismos.

MP 1 2 3 4 5 6

1500 bp 1000 bp 500 bp 200 bp

Figura 3 MP: Marcador de pares de bases de 100 bp. 1: Amplificación con A03 2: Amplificación con A05 3: Amplificación con A08 4: Amplificación con A10 5: Amplificación con B09 6: Amplificación con B10 7: Control negativo

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APÉNDICE V CARTA DE COLORES PARA LA APLICACIÓN DEL METODO FAMACHA CONFECCIONADA EN LA EXPERIENCIA REALIZADA EN MERCEDES CORRIENTES

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9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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