Universidad de La Salle Universidad de La Salle

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Ingeniería de Alimentos Facultad de Ingeniería

1-1-2006

Evaluación de la producción de ácido láctico elaborado a partir de Evaluación de la producción de ácido láctico elaborado a partir de

la fermentación del suero lácteo la fermentación del suero lácteo

Camilo Andrés Cabra Julio Universidad de La Salle, Bogotá

Fabián Rico Rodríguez Universidad de La Salle, Bogotá

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Citación recomendada Citación recomendada Cabra Julio, C. A., & Rico Rodríguez, F. (2006). Evaluación de la producción de ácido láctico elaborado a partir de la fermentación del suero lácteo. Retrieved from https://ciencia.lasalle.edu.co/ing_alimentos/430

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EVALUACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE ÁCIDO LÁCTICO ELABORADO A PARTIR DE LA FERMENTACIÓN DEL SUERO LÁCTEO

CAMILO ANDRÉS CABRA JULIO FABIÁN RICO RODRÍGUEZ

UNIVERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS

BOGOTÁ D. C. Febrero de 2006

EVALUACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE ÁCIDO LÁCTICO ELABORADO A PARTIR DE LA FERMENTACIÓN DEL SUERO LÁCTEO

Presentado por CAMILO ANDRÉS CABRA JULIO

FABIÁN RICO RODRÍGUEZ

Trabajo de grado para optar al título de Ingeniero de Alimentos

Directora Ing. LENA PRIETO CONTRERAS

Ms. Educación

UNIVERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS

BOGOTÁ D. C. Marzo de 2006

Nota de aceptación

___________________________ ___________________________ ___________________________ ___________________________ ___________________________ ___________________________

___________________________ Firma del director de tesis

___________________________ Firma del jurado 1

___________________________ Firma del jurado 2

Bogotá D. C., Febrero de 2006

LEY DE RESPONSABILIDAD

Articulo 42 del reglamento estudiantil

Parágrafo 2: el estudio, análisis, investigación y

propuestas ideológicas sustentadas por un

estudiante en su trabajo de grado no comprometen

de ninguna forma a la universidad, en salvaguarda

de los derechos fundamentales.

CONTENIDO

Pag

INTRODUCCIÓN OBJETIVOS 1. MARCO DE REFERENCIA 1.1 FERMENTACIÓN 1.1.1 Historia de las fermentaciones 1.1.2 Era moderna de la fermentación industrial 1.1.3 Fermentaciones continuas y discontinuas 1.1.4 Fermentaciones en medio sólido 1.2 ESCALADO DE FERMENTACIONES 1.3 BACTERIAS ACIDOLÁCTICAS (LAB) 1.4 MICROORGANISMO Lactobacillus plantarum 1.5 SUERO DE LECHE 1.5.1 Suero seco 1.5.2 Suero ácido seco 1.5.3 Suero condensado 1.5.4 usos del suero en alimentos 2. METODOLOGÍA DE LA EXPERIMENTACIÓN 2.1 SELECCIÓN Y ACTIVACIÓN DEL MICROORGANISMO 2.2 PRE-EXPERIMENTACIÓN: CURVA DE CRECIMIENTO 2.3 FERMENTACIÓN DE 1 L

xviii

xx

2122222324303334373841414242

43444545

2.3.1 Evaluación de tres medios de cultivo 2.3.1.1. Análisis y manejo del suero lácteo empleado 2.3.1.2. Composición de los medios de cultivo

experimentales 2.3.1.3. Elaboración de los fermentadores de 1 L 2.3.1.4. Control de pH 2.3.1.5. Control de ausencia de oxígeno 2.3.2 Cuantificación de las variables de fermentación 2.3.2.1. Cuantificación de proteínas 2.3.2.2. Cuantificación de lactosa 2.3.2.3. Cuantificación de ácido láctico 2.3.3 Análisis estadístico para la selección del mejor medio 2.4 FERMENTACIÓN DE 5 L 2.4.1 Protocolos de operación del fermentador 2.4.1.1. Esterilización del vaso 2.4.1.2. Preparación del medio 2.4.1.3. Protocolo de inoculación 2.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO PARA LA FERMENTACIÓN DE

5 L 2.6 PROCEDIMIENTO DE LA PROPUESTA DE ESCALADO 3. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 3.1 CARACTERÍSTICAS DEL SUERO LÁCTEO EMPLEADO 3.2 CARACTERÍSTICAS DE LA CEPA SELECCIONADA 3.3 PRE-EXPERIMENTACIÓN: CURVA DE CRECIMIENTO 3.4 CONDICIONES DE LA FERMENTACIÓN DE 1 L 3.5 CUANTIFICACIÓN DE LAS VARIABLES DEPENDIENTES 3.5.1 Comportamiento de las variables dependientes en el

medio de cultivo M1 3.5.2 Comportamiento de las variables dependientes en el

4646

464850515151525353555555565657

59

606061626566

6668

medio M2 3.5.3 Comportamiento de las variables dependientes en el

medio M3 3.6 ANÁLISIS ESTADÍSTICO PARA LA SELECCIÓN DEL

MEJOR MEDIO DE FERMENTACIÓN 3.6.1 Proteínas 3.6.2 Azúcares 3.6.3 Ácido láctico 3.7 RESULTADOS DE LA FERMENTACIÓN EN 5 L PARA EL

MEJOR MEDIO 3.8 ANÁLISIS ESTADÍSTICO PARA EL ESCALADO DE LA

FERMENTACIÓN LÁCTICA 3.8.1 Proteínas 3.8.2 Azúcares 3.8.3 Ácido láctico 4. PROPUESTA DE ESCALADO PARA FUTURAS

FERMENTACIONES LÁCTICAS 4.1 CARACTERÍSTICAS DEL BIORREACTOR BIOFLO 110 4.2 PARTES DE UN BIORREACTOR 4.2.1 Cabina de control. 4.2.2 Vaso 4.2.3 Sistema de control de temperatura 4.2.4 Sistema de agitación 4.2.5 Sistema controlador de oxigeno disuelto (D.O.). 4.2.6 Sensor controlador de pH 4.2.7 Bombas peristálticas o gravitatorias 4.2.8 Válvula para toma de muestras con colector 4.2.9 Tubo de cosecha 4.2.10 Aro aspersor de gases

70

73737576

78

80808182

85858586868686878787878787

4.2.11 Placas deflectoras 4.3 DIMENSIONES Y CONDICIONES DE OPERACIÓN DEL

BIORREACTOR 4.4 PROPUESTA DE ESCALADO DEL BIOrREACTOR A

VOLUMEN DE 10 L 4.4.1 Diámetro del impulsor del biorreactor de 10L 4.4.2 Velocidad del impulsor del biorreactor de 10 L 4.4.3 Caudal de CO2 en el biorreactor de 10 L 4.4.4 Volumen de aire por volumen de medio por minuto

(v.v.m) en el reactor de 10 L 4.4.5 Velocidad de la punta del impulsor del biorreactor de 10

L 4.4.6 Número de Reynolds en el biorreactor de 10 L 4.4.7 Dimensionamiento del vaso para el biorreactor de 10 L 4.5 ESTIMACIÓN DE COSTOS DE LA FERMENTACIÓN

LÁCTICA ESTUDIADA 4.5.1 Costos de la fermentación de 1 L 4.5.2 Costos para la fermentación de 5 L 4.5.3 Costos para la propuesta de fermentación de 10 L CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFÍA ANEXOS

88

90

90919192

92

929293

94949799

103

105

106

109

LISTA DE FIGURAS

Pag

Figura 1. Crecimiento de microorganismo en cultivo discontinuo

Figura 2. Ciclo de fermentación discontinuo

Figura 3. Influencia de la velocidad de dilución en las

concentraciones de biomasa ( x ) y substrato ( s ) en el estado

estacionario y productividad de biomasa ( cP' )

Figura 4. Fermentadores en substrato sólido. (a) Tambor rotatorio.

(b) sistema de cubeta. (c) sistema de flujo de aire forzado

Figura 5. Las vías de la homofermentación y la heterofermentación

Figura 6. Procesamiento del lactosuero

Figura 7. Procedimiento para realizar el trabajo

Figura 8. Sistema generador de CO2 para crear atmósfera de

anaerobiosis

Figura 9. Esquema del fermentador de 1 L

Figura 10. Características del Lactobacillus plantarum ssp

Figura 11. Curva de crecimiento del lactobacillus plantarum ssp

Figura 12. Linealización de la fase logarítmica

Figura 13. Variación del pH a través del tiempo

Figura 14. Comportamiento de las variables en el medio M1

Figura 15. Comportamiento de las variables en el medio M2

Figura 16. Comportamiento de las variables en el medio M3

Figura 17. Comportamiento de las variables en el medio M2 en 5 L

2526

28

32364043

49506163646668707279

LISTA DE TABLAS

Pag

Tabla 1. Rangos de operación de los fermentadores

Tabla 2. Clasificación del género Lactobacillus

Tabla 3. Características generales del Lactobacillus plantarum

Tabla 4. Algunas características del suero de queso

Tabla 5. Clasificación de sueros lácteos

Tabla 6. Composición de algunos sueros fluidos y secos

Tabla 7. Formulación de los 3 diferentes medios de cultivo

Tabla 8. Matriz de datos para las variables del diseño experimental

ANAVA de una sola vía

Tabla 9. Matriz de datos para las variables del diseño experimental

ANAVA de una sola vía en las fermentaciones de 1 L y 5 L

Tabla 10. Análisis muestra de suero lácteo

Tabla 11. Curva de Crecimiento L. plantarum ssp

Tabla 12. Velocidad de crecimiento del microorganismo

Tabla 13. Variación del pH a través del tiempo (h)

Tabla 14. Variación del contenido de proteína vs tiempo para el

medio M1

Tabla 15. Variación del contenido de azúcar vs tiempo el medio M1

Tabla 16. Variación del contenido de ácido láctico vs tiempo el

medio M1

Tabla 17. Variación del contenido de proteína vs tiempo para el

medio M2

Tabla 18. Variación del contenido de azúcar vs tiempo para el medio

33373839394147

55

5860626365

6767

67

69

M2

Tabla 19. Variación del contenido de ácido láctico vs tiempo para el

medio M2

Tabla 20. Variación del contenido de proteína vs tiempo para las

muestras M3.1 y M3.2

Tabla 21. Variación del contenido de azúcar vs tiempo para las

muestras M3.1 y M3.2

Tabla 22. Variación del contenido de Ácido láctico vs tiempo para

las muestras M3.1 y M3.2

Tabla 23. Matriz de datos del diseño experimental ANAVA de una

sola vía para presencia de proteína

Tabla 24. Matriz de datos del diseño experimental ANAVA de una

sola vía para consumo de azúcares

Tabla 25. Matriz de datos del diseño experimental ANAVA de una

sola vía para producción de ácido láctico

Tabla 26. Variación de las cantidades de Proteína, azúcares y ácido

láctico para las fermentaciones de 1 L y 5 L

Tabla 27. Componentes del biorreactor

Tabla 28. Características del biorreactor (cm)

Tabla 29. Dimensiones del biorreactor de 10 L

Tabla 30. Materiales para fermentación de 1 L

Tabla 31. Reactivos para fermentación de 1 L

Tabla 32 Servicios industriales para fermentación de 1 L

Tabla 33. Costo de personal para fermentación de 1 L

Tabla 34. Costo por el uso de materiales y equipos durante la

fermentación de 1 L

Tabla 35. Resumen de costos de la fermentación de 1 L

Tabla 36. Reactivos para fermentación de 5 L

Tabla 37. Costo por uso de materiales y equipos de laboratorio para

la fermentación de 5 L

69

69

71

71

71

74

75

77

7988909394959595

969797

98

Tabla 38. Materiales para fermentación de 5 L

Tabla 39. Servicios industriales para fermentación de 5 L

Tabla 40. Mano de obra para fermentación de 5 L

Tabla 41. Resumen de costos para fermentación de 5 L

Tabla 42. Costo por uso de materiales y equipos de laboratorio para

la fermentación de 10 L

Tabla 43. Materiales para fermentación de 10 L

Tabla 44. Reactivos para fermentación de 10 L

Tabla 45. Servicios industriales para la fermentación de 10 L

Tabla 46. Costo de personal para la fermentación de 10 L

Tabla 47. Resumen de costos para la fermentación de 10 L

99999999

100101101101102102

LISTA DE ANEXOS

Pag

ANEXO 1. CURVA PATRÓN PARA CUANTIFICACIÓN DE

PROTEÍNA

ANEXO 2. CURVA PATRÓN PARA CUANTIFICACIÓN DE

AZÚCARES

ANEXO 3. CURVA PATRÓN PARA CUANTIFICACIÓN DE

ÁCIDO LÁCTICO

ANEXO 4. FERMENTACIÓN DE 5 L EN EL BIOFLO 110

110

111

112

113

GLOSARIO

Absorbancia (ABS). Medida de la cantidad de radiación absorbida por un cuerpo.

Antrona. Método analítico espectrofotométrico altamente sensible usado para

determinación de azúcares como hexosas, aldopentosas y ácidos hexouronicos.

Bacterias ácido lácticas (LAB). Género de bacterias capaces de transformar

carbohidratos a través de procesos fermentativos generando como producto

principal ácido láctico y otros productos como dióxido de carbono etanol y/o ácido

acético.

Biorreactor. Conjunto de elementos los cuales facilitan condiciones controladas

para el crecimiento de microorganismos como son temperatura, pH, oxígeno

disuelto y agitación para llevar a cabo procesos de producción de células o

productos de las mismas.

Curva de crecimiento. Gráfica por medio de la cual se puede apreciar las

distintas fases del crecimiento microbiano a través del tiempo.

Oxigeno disuelto (D.O.). Cantidad de oxigeno disuelto expresada en forma

porcentual.

Escalado. Técnica a través de la cual un proceso puede ser llevado a una menor

o a una mayor escala de trabajo con el fin de estudiar su comportamiento.

Equipo de venoclisis. Sistema de sonda que facilita la administración de fluidos

en la medicina.

Factores de crecimiento. Variables que se deben tener en cuenta para el

desarrollo y crecimiento de microorganismo en un medio específico, algunos de

estos son pH, temperatura, concentración de oxígeno, micro y macronutrientes.

Fase logarítmica. Parte de la curva de crecimiento en la cual el microorganismo

crece en forma exponencial y aprovecha más rápidamente los recursos del medio.

Heterofermentación. Tipo de fermentación la cual tiene como principales

productos ácido láctico, dióxido de carbono, etanol y/o ácido acético.

Homofermentación. Tipo de fermentación de la cual como resultante principal se

obtiene ácido láctico y trazas de dióxido de carbono, etanol y/o ácido acético.

Incubación. Proceso mediante el cual se propicia el crecimiento de un

microorganismo en un medio específico a condiciones de temperatura dadas.

Inoculación. Es la adición en forma aséptica de un microorganismo a un medio de

crecimiento para su posterior desarrollo.

Lowry. Método analítico capaz de detectar cantidades muy pequeñas de proteína

basado en análisis espectrofométrico.

NAD+ y NADH. Nicotinamin adenosin dinucleótido, coenzima que participa en una

reacción de oxidación aceptando un ión hidruro de la molécula dadora. El NADH formado es un importante transportador de electrones en la fosforilación oxidativa.

Suero lácteo. Es el producto resultante de la coagulación de la caseína por medio

ácido, térmico o enzimático.

INTRODUCCIÓN

Uno de los principales problemas de la industria quesera en Colombia es el

manejo del suero lácteo, ya que en las pequeñas industrias, por falta de tecnología

no se puede dar un uso adecuado sin afectar el medio ambiente. Con el fin de dar

una salida viable a este problema se realizó este estudio en el cual se propuso

como objetivo evaluar un método que permita producir ácido láctico a partir de

suero de leche. Ya que éste ácido es utilizado ampliamente en diferentes

industrias y debido a que en el suero se dispone de componentes adecuados para

ser enriquecidos y obtener un buen sustrato.

En las industrias colombianas el ácido láctico, sus sales y sus ésteres son

ampliamente usados en alimentos, farmacia, curtiembres, entre otros; y es

importante anotar que en Colombia no se produce industrialmente este compuesto

por lo que es necesario importarlo, principalmente de países europeos, desde los

cuales “al 2002 llegaban 30’663.365.00 kg de ácido láctico, equivalentes a US

$41’505.172.00 y 5’207.955.00 kg de sales y ésteres de ácido láctico,

correspondientes a US $14’054.865”1.

Sumado a lo mencionado anteriormente, el ácido láctico podría ser utilizado

también en la industria de alimentos como un suplemento nutricional en forma de

lactato como fuente biodisponible de algunos micronutrientes como calcio (Ca),

hierro (Fe) y sodio (Na) entre otros, logrando suplir las necesidades de estos

elementos en la dieta de personas que posean alguna de estas insuficiencias.

Por consiguiente, en este trabajo de grado se evaluó la producción de ácido láctico

por Lactobacillus plantarum ssp. en tres diferentes medios de cultivo preparados a 1 PROEXPORT, Colombia. Importaciones del mundo. [En línea]. http://www.proexport.com.co (Consulta 23 noviembre, 2004).

partir de suero enriquecido con diferentes nutrientes y micronutrientes, en

condiciones controladas de temperatura, pH y anaerobiosis en fermentadores con

capacidad de 1 L elaborados por los autores, buscando a través de un diseño

experimental diferencias estadísticamente significativas en cuanto a presencia de

proteína, consumo de azúcares y producción de ácido láctico.

Además de esto, se realizó un escalado de la fermentación con mejor medio para

producción de ácido láctico hasta un volumen de 5 L, llevada a cabo en el

biorreactor Bioflo 110 modular fermentor and bioreactor, en el cual se evaluó el

comportamiento de las variables en relación a la fermentación llevada a cabo con

el mismo medio en un volumen de 1 L. Por último se elaboró una propuesta de

escalado de la fermentación para manejar un volumen de 10 L con el fin de

estudiar las posibles variaciones debidas al cambio de escala.

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL Evaluar la producción de ácido láctico mediante la fermentación de suero

lácteo con una cepa bacteriana acido láctica, como una alternativa al

aprovechamiento de residuos de la industria alimentaria en Colombia.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS Realizar una caracterización del microorganismo a trabajar y del sustrato en el

cual se desarrollará la fermentación láctica.

Determinar las condiciones de laboratorio necesarias para la fermentación

láctica, como: pH, temperatura, y agitación.

Cuantificar el ácido láctico producido en forma de lactato a partir del medio

resultante de la fermentación.

Proponer criterios de dimensiones del biorreactor para futuros escalados según

los resultados obtenidos en la experimentación de la fermentación láctica.

Estimar los costos de la fermentación láctica a partir de suero lácteo

suministrado por una industria quesera.

1. MARCO DE REFERENCIA “La industria láctea representa un importante sector dentro de la industria

alimentaria y su contribución material en términos de contaminación de las aguas

receptoras es significativo, lo que hace necesario y obligatorio el tratamiento

previo de sus desechos líquidos antes de verterlos”.2 Los procesos en los cuales

se hace uso de bioingeniería podrían facilitar el proceso de descontaminación

realizado directamente por el generador de desechos y a su vez aprovechar un

subproducto para la obtención de una materia prima ampliamente usada en

diversas industrias; el ácido láctico, sus sales y sus ésteres son ampliamente

usados en alimentos, farmacia, curtiembres, entre otros.

En el presente capítulo se muestran algunas generalidades de los procesos de

fermentación, haciendo una breve explicación de lo que el término significa,

además de un recuento de su proceso evolutivo, desde la antigüedad donde se

elaboraban diferentes productos fermentados sin saber que ocurría durante el

proceso, hasta los más modernos procesos de fermentación usados actualmente

en diferentes áreas como la medicina, los alimentos, la agricultura, entre otros.

Además se menciona los tres diferentes tipos de fermentaciones que se utilizan y

los modelos matemáticos que explican su comportamiento; las características

generales de las bacterias que pertenecen al género Lactobacillus, así como las

características del microorganismo Lactobacillus plantarum ssp. que se usó para

realizar las fermentaciones. Por último se presentan las generalidades del suero

lácteo, sus principales usos y las presentaciones en las que se puede encontrar a

nivel comercial.

2 BAENA, S. y Otros. Aguas residuales de la industria láctea: II. Contribución al manejo de los residuos líquidos de la industria láctea. La importancia de la minimización y el reciclaje. En: Ambiente y desarrollo. Bogotá. Vol2. no.2,3 (may-sep, 1994); p. 93-101.

1.1 FERMENTACIÓN Aunque en el caso de los alimentos no todas las fermentaciones son deseadas,

existe una gran variedad de alimentos en los que estas fermentaciones

constituyen un método eficaz para su conservación, y pese a que actualmente

existen métodos de conservación de alimentos más eficaces que la fermentación,

ésta última sigue siendo ampliamente usada ya que produce cambios agradables

en los alimentos. Además de las fermentaciones con el fin de conservar los

alimentos, existen también fermentaciones por medio de las cuales se busca

obtener compuestos tales como aditivos, antibióticos, enzimas, y hasta biomasa,

por lo que la industria de las fermentaciones se ha convertido en una industria de

gran versatilidad. En cuanto al término fermentación Potter y Hotchkiss 3 dicen:

“El término fermentación se aplicó por primera vez a la producción de vino hace más de

1.000 años. La acción burbujeante era debida a la conversión de azúcar en dióxido de

carbono. Cuando la reacción quedó definida gracias a los estudios de Gay-Lussac,

fermentación vino a significar la degradación del azúcar en alcohol y dióxido de carbono.

Posteriormente, Pasteur demostró la relación de las levaduras en esta reacción, con lo

que la palabra Fermentación quedó asociada con microorganismos y, más tarde, con

enzimas”.

1.1.1 Historia de las fermentaciones. Las fermentaciones han desempeñado un

papel importante en el desarrollo humano, y han tenido tal incidencia en la cultura

de diferentes pueblos que ésta se considera por muchos como un arte. Las

técnicas de fermentación han sido usadas durante muchos siglos para la

elaboración de productos como el vino, la cerveza, el yogurt, salsas fermentadas,

pan, entre muchos otros productos.

3 POTTER, Norman y HOTCHKISS, Joseph. Ciencia de los Alimentos. Zaragoza: Acribia, 1995. p. 293.

Aunque las técnicas de fermentación de alimentos eran muy rudimentarias, éstas

eran realizadas a nivel casero y no se conocían las verdaderas causas que la

producían; pasaron a través de muchas generaciones, conservándose hoy en día

y aplicándolas en la producción de alimentos a gran escala. Se ha demostrado

que “desde el punto de vista farmacéutico, los quesos, la carne, y el pan

enmohecidos se han empleado en la medicina popular durante miles de años para

curar heridas y tratar las infecciones. Retrospectivamente, los efectos beneficiosos

de tales tratamientos se debían indudablemente a su actividad antibiótica”4. Pues,

como se sabe actualmente, los microorganismos que inducen la fermentación

producen sustancias antibióticas que inhiben la competencia por el alimento frente

a otros tipos de microorganismos.

1.1.2 Era moderna de la fermentación industrial. Tal vez fue desde que se

observaron los primeros microorganismos a través del microscopio que comenzó

el verdadero desarrollo de la tecnología de las fermentaciones, pues después de

este momento se comenzó a entender que la fermentación era llevada a cabo por

microorganismos; más adelante se descubriría que en estas fermentaciones

intervenían las enzimas producidas por los microorganismos. A partir de este

punto, un sin número de microorganismos fueron estudiados para comprender su

metabolismo y las aplicaciones que estos podrían tener más adelante en

diferentes áreas como la industria alimentaria, química y en la medicina en la

producción de fármacos. Además de los procesos mencionados anteriormente, las

técnicas de fermentación se utilizaron también en el cultivo de células animales y

vegetales, buscando composiciones de diferentes medios de cultivo, diseño de

biorreactores para la replicación de virus, lo que marcó el inicio del desarrollo de

vacunas por medio de éstas técnicas.

En el caso específico de las fermentaciones en la industria alimentaria, éstas

tuvieron un gran crecimiento, de ésta industria podemos mencionar el uso de 4 WARD, Owen P. Biotecnología de la fermentación: Principios, productos y procesos. Zaragoza: Acribia. 1989. p. 1-2

cultivos starter y enzimas para elaboración de productos lácteos, fabricación

industrial de enzimas y aditivos para diferentes industrias como panadería y de

bebidas alcohólicas, haciendo de esta manera que los productos estuviesen al

alcance de la mayoría de las personas. Del mismo modo, las fermentaciones

también sirvieron para el propósito de producir a gran escala ácidos orgánicos

tales como el ácido láctico, ácido cítrico, ácido acético, entre otros; y para

producción de alcoholes y cetonas y más recientemente aminoácidos,

biopolímeros, vitaminas y una gran variedad de productos industriales que

abarcan un gran porcentaje del mercado industrial.

1.1.3 Fermentaciones continuas y discontinuas Las fermentaciones continuas

son aquellas en las cuales se alimenta en forma continua medio al biorreactor,

simultáneamente se retira igual cantidad de medio fermentado, este tipo de

proceso se utiliza en la mayoría de fermentaciones a nivel industrial y puede

considerarse como un sistema abierto, caracterizándose de este que la formación

de producto se da en su mayoría después de la fase de crecimiento exponencial,

este tipo de fermentación suele ser la más eficaz en términos de productividad,

existen dos tipos principales de fermentadores continuos los de mezcla completa y

los de flujo de pistón.

Las fermentaciones discontinuas son aquellas en las que todo el substrato se

añade al comienzo de la fermentación; dentro de las fermentaciones discontinuas

se encuentran las fermentaciones discontinuas alimentadas a intervalos a lo largo

del proceso y así se elimina los efectos de represión por las fuentes de carbono

utilizables rápidamente, reduciendo la viscosidad del medio y los efectos de los

constituyentes tóxicos, logrando que la etapa de formación de producto sea lo más

larga posible, las fermentaciones discontinuas pueden considerarse como un

sistema cerrado, excepto para la aireación, que contiene una cantidad limitada de

medio, en el que el inoculado pasa a través de un número de fases, las cuales se

muestran en la Figura 1.

Figura 1. Crecimiento de microorganismo en cultivo discontinuo. Fuente: WARD, Owen. Biotecnología de la fermentación

En la figura anterior se puede observar el crecimiento de un microorganismo en un

cultivo discontinuo, que puede dividirse en 4 fases; en la primera fase (de retardo)

el microorganismo se adapta a los nutrientes disponibles en el medio, por lo que

su crecimiento es lento, en la segunda fase (exponencial) el microorganismo ya

dispone de las enzimas necesarias para utilizar el medio por lo que experimenta

un rápido crecimiento que tiene un comportamiento exponencial, en la tercera fase

(desaceleración) el microorganismo se multiplica lentamente debido a que el

sustrato no es suficiente para mantener todas las funciones bioquímicas del

microorganismo, en la última fase (estacionaria) el sustrato no es suficiente para el

crecimiento del microorganismo por lo que la cantidad de éstos se mantiene

constante.

La principal desventaja de éstas cuando se utilizan para la obtención de productos

asociados al crecimiento, es que la formación eficiente de producto tiene lugar

únicamente durante una fracción del ciclo de fermentación. Los sistemas de

fermentación alimentados a intervalos se utilizan ampliamente a nivel industrial y

se adaptan a procesos en los cuales el producto se forma luego de la fase

exponencial como se muestra en la Figura 2.

Figura 2. Ciclo de fermentación discontinuo. Fuente: WARD, Owen. Biotecnología de la fermentación

En un cultivo discontinuo, la concentración de biomasa por unidad de tiempo (t)

es:

)( sSXx RR −=− γ

Donde: x = concentración celular en el tiempo (t)

XR = inóculo o concentración celular inicial

γ = rendimiento para el substrato limitante (g de biomasa/g de substrato

consumido)

S = concentración de substrato en el tiempo t

SR = concentración inicial del medio

Por tanto

sSXx

R

R

−−

=γ

La cantidad de biomasa alcanzada en la fase estacionaria depende teóricamente

de la concentración inicial del substrato limitante del crecimiento y de la eficacia

del organismo para convertir el substrato en material celular. Por tanto,

suponiendo que el substrato limitante del crecimiento sea S = 0 en la fase

estacionaria

R

R

SXx −

=γ

En una fermentación continua de mezcla completa en una sola etapa, la adición

de substrato a una velocidad adecuada combinada con la eliminación a una

velocidad volumétrica igual de medio de cultivo del recipiente produce un estado

estacionario en el que la formación de biomasa está en equilibrio con la pérdida de

células. En estas condiciones:

La velocidad de crecimiento especifico (µ) viene controlada por la velocidad

de dilución (D) puesto que µ = D

La concentración de substrato en estado estacionario, S en el quimiostato

viene determinada por la velocidad de dilución (D), según la ecuación:

DDKs s

−=

maxµ

Si las cinéticas siguen el modelo de Monod y la velocidad de dilución D<µmax , es

menor que la velocidad especifica.

La concentración de biomasa en el estado estacionario, X viene

determinada por las variables operacionales, concentración inicial del

medio(SR) y velocidad de dilución (D) según la ecuación

⎥⎦

⎤⎢⎣

⎡−

−=D

DKSX SR

maxµ

La Figura 3 describe el efecto de la velocidad de dilución (D) en las condiciones de

substrato y biomasa en estado estacionario y en la productividad de biomasa.

Como se ve, a medida que la velocidad de dilución (D) se aproxima a la máxima

velocidad especifica (µmax), la concentración residual del substrato limitante

necesaria para soportar el aumento de la velocidad de crecimiento se eleva, y por

tanto la concentración de substrato también aumenta (hasta el limite superior s =

SF) mientras que la de biomasa disminuye. Cuando se emplea un sistema de

cultivo continuo, por ejemplo en el proceso de fermentación industrial de

producción de proteínas de organismos unicelulares, la cantidad de células

producidas por unidad de tiempo (velocidad de producción) y por unidad de

substrato utilizado (γ) deben ser máximas.

Figura 3. Influencia de la velocidad de dilución en las concentraciones de biomasa ( x ) y substrato ( s ) en el estado estacionario y productividad de biomasa ( cP' ). Fuente: WARD, Owen. Biotecnología de la fermentación

En estado estacionario, la velocidad de producción será igual al producto de la

velocidad de flujo por la concentración celular. Para que la producción la velocidad

de dilución D(h-1), que representa el flujo del medio en el quimostato por unidad de

volumen de líquido contenido se define como:

D = F/V

Donde:

V = volumen (m3)

F = velocidad de flujo (m3h-1)

El cambio de biomasa con el tiempo, suponiendo que todas las células son

viables, puede expresarse como:

dx/dt = crecimiento – producción

= µx – Dx

En estado estacionario la concentración de células en el reactor es constante, por

tanto:

dx/dt = 0

µx = Dx

µ =D

Cuando la velocidad de dilución D<0,9µmax, la velocidad de producción celular en

la fermentación está exactamente equilibrada con la velocidad de producción

celular, y en estado estacionario esta condición se cumple (X = constante). Por

otro lado, cuando el valor de la velocidad de dilución (D) es similar al de

D<0,9µmax, la producción de células en el efluente es superior a su velocidad de

producción por crecimiento en el fermentador y se produce el colapso, siendo

dx/dt negativo.

La velocidad especifica (µ) está relacionado con la concentración de substrato (s)

mediante la ecuación de Monod

sKs

s += maxµµ

En estado estacionario, la velocidad especifica (µ) = velocidad de dilución (D), y

para el modelo cinético de Monod de crecimiento celular

sKsD

s += maxµ

Donde, S es la concentración de substrato residual en estado estacionario

DDKs s

−=

maxµ

Como D µmax, entonces S SR

La concentración de biomasa en el quimostato en estado estacionario para el caso

de una alimentación estéril (XRo XF = 0), viene dado por

)( sSx R −= γ

Por tanto

⎥⎦

⎤⎢⎣

⎡−

−=D

DKSx sR

maxµγ

Cuando D µmax, X 0

La velocidad de dilución (D) deberá ser alta, aunque no tanto que exceda la

velocidad específica µmax o se produzca la perdida de material. La productividad

máxima, combinando una producción elevada con una utilización de substrato

eficaz, se obtiene a una velocidad de flujo igual a la máxima velocidad de

producción, o ligeramente inferior, y con la mayor concentración de substrato

posible prácticamente en el flujo de alimentación. De acuerdo con Ward5:

“En los procesos de producción de algunos metabolitos primarios, se pueden adoptar

medidas similares para optimizar las condiciones del quimostato. Sin embargo, en el caso

de metabolitos secundarios, en el que el producto no va asociado al crecimiento, no se

puede utilizar un único quimostato de mezcla perfecta, sino que deben emplearse

quimostatos multietapas para permitir que prevalezcan distintas condiciones

medioambientales en las etapas separadas, si las condiciones óptimas para el

crecimiento y la formación de producto son diferentes. Los quimostatos que incorporan

procesos de reciclado de biomasa concentrada para incrementar la concentración de

biomasa en el reactor han encontrado aplicaciones industriales en la producción de

alcohol y en el tratamiento de efluentes.

En los reactores de flujo pistón, el cultivo fluye por un reactor tubular sin mezcla en

contracorriente. En la entrada del reactor se van añadiendo continuamente las células y el

medio, por lo que la composición del medio, la concentración de biomasa y las

concentraciones de producto varían con la longitud del reactor de una forma análoga a los

cambios ocurridos a lo largo del tiempo en un fermentador discontinuo. Usualmente debe

incorporarse un sistema de reciclado de la biomasa para obtener un inóculo continuo en

la entrada”.

1.1.4 Fermentaciones en medio sólido. Las fermentaciones en substratos

sólidos, utilizadas para el cultivo de microorganismos en materiales sólidos que

contiene o no una cantidad limitada de agua libre, se emplean en la obtención de

enzimas fúngicos por cultivos en superficie y en la producción de champiñones así

como en otras aplicaciones.

Los substratos utilizados más comúnmente son el salvado de trigo, los granos de

cereal, las legumbres, la madera y la paja. Los microorganismos que crecen bien

5 WARD; Ibid., p. 47-52

en las fermentaciones en substratos sólidos son usualmente organismos que

pueden tolerar una actividad de agua baja (Aw).

Los microorganismos tienen respuestas distintas frente a la actividad de agua, de

forma que por ejemplo, con una Aw inferior a 0,95 se inhibe el crecimiento

bacteriano, en tanto que los hongos y las levaduras pueden crecer a una Aw de

aproximadamente 0,7. Las fermentaciones en substrato sólido se llevan a cabo de

diferentes formulas dependiendo de si los microorganismos utilizados son los

nativos o cultivos aislados puros. La elaboración del compostaje para la

producción de champiñones implica las actividades sucesivas de un amplio rango

de poblaciones de microorganismos nativos que van desde las bacterias

mesófilas, las levaduras y hongos termofílicos y los actinomicetos. El proceso

tradicional Koji para la fermentación de granos y habas de soja y los procesos

similares para la producción de enzimas industriales a partir de hongos, ambos

con cultivos de Aspergillus orizae y especies relacionadas, son ejemplos de

fermentaciones en substratos sólidos que utilizan cultivos fúngicos puros.

Puesto que la mayoría de las fermentaciones en substratos sólidos son aerobias,

las condiciones de fermentación deben diseñarse de forma que la transferencia de

oxigeno y eliminación de CO2 del substrato sean eficaces. Debido a las elevadas

concentraciones de substrato por unidad de volumen, el calor generado también

por unidad de volumen durante la fermentación es usualmente mucho mayor que

en las fermentaciones líquidas, y el contenido menor de humedad hace más difícil

su eliminación. La elección del tamaño de partícula del substrato es de

importancia crítica para optimizar los espacios vacíos interpartículas que faciliten

la transferencia de gases y calor. La eliminación de calor puede verse facilitada

incrementando la aireación del sistema.

Entre las ventajas de los sistemas de fermentación en substratos sólidos en las

fermentaciones industriales se encuentran la mayor productividad y simplicidad de

la técnica, los menores costos de inversión, la reducción del consumo energético,

el menor volumen de aguas residuales producidas y la ausencia de problemas

debidos a la formación de espuma, aunque también tienen limitaciones, como la

acumulación de calor, la contaminación bacteriana, los problemas de aumento de

escala y la dificultad de controlar el nivel de humedad del substrato.

Como ejemplos de diseño de fermentadores con substratos sólidos se pueden

citar los sistemas de agitación continua lenta (como los tambores rotatorios), los

sistemas de cubetas y los de flujo de aire, en los que se insufla aire acondicionado

a lo largo del lecho del substrato en una cámara de cultivo (ver Figura 4), los

tambores rotatorios están equipados usualmente con una entrada y una salida

para la circulación de aire humidificado y con frecuencia contienen deflectores o

secciones para agitar el contenido. Los fermentadores de cubetas tienen capas de

substrato de 1-2 pulgadas de espesor apiladas en cámaras que generalmente

están ventiladas con aire humidificado. En las cámaras de cultivo con circulación

forzada de aire se controla la temperatura del lecho ajustándose a la del flujo de

aire reciclado.6

Figura 4. Fermentadores en substrato sólido. (a) Tambor rotatorio. (b) sistema de cubeta. (c) sistema de flujo de aire forzado. Fuente: WARD, Owen. Biotecnología de la fermentación

6 WARD; Ibid, p 65-66

1.2 ESCALADO DE FERMENTACIONES Uno de los problemas que comúnmente se presentan en el área de las

fermentaciones es el cambio de escala, esto se debe a los cambios en los

resultados que puede generar el escalado de laboratorio a planta piloto y de ésta

a escala industrial o viceversa, por lo que es necesario realizar un análisis

cuidadoso de las escalas y las variables que afectan la fermentación, ya sean

fisicoquímicas y/o biológicas.

“A escala de laboratorio se buscan nuevos productos, se estudian mecanismos de

control y mejoran cepas de producción; en planta piloto se estudian efectos de

aireación temperatura y control de pH, y los fermentadores de producción se trata

de aumentar la productividad”7. La Tabla 1 muestra algunos valores que son los

comúnmente usados en las técnicas de escalado.

Tabla 1. Rangos de operación de los fermentadores Escala del

fermentador Potencia de

trabajo Capacidad del fermentador

Velocidad de agitación

Escala pequeña 8 – 10 W/L 3 L 200-2000 rpm Escala piloto 3 – 5 W/L 10 L 200 – 1200 rpm

Escala industrial

1 – 3 W/L 50 L 200 L 500 L

100 – 800 rpm 50 – 400 rpm 50 – 300 rpm

Fuente: QUINTERO, Rodolfo. Ingeniería bioquímica: Teoría y aplicaciones

Cuando una fermentación es satisfactoria a nivel de laboratorios genera cambios

imprevisibles al aumentar el volumen del fermentador en el cual se lleva a cabo la

reacción. “La metodología del cambio de escala se fundamenta en la selección de

una estrategia con el propósito de predecir el comportamiento de las variables no

controladas y su consecuencia sobre el diseño global del proceso”8. El propósito

de efectuar escalados en las fermentaciones es mantener constantes todas las 7 QUINTERO, Rodolfo. Ingeniería bioquímica: Teoría y aplicaciones. 1ª ed. México: Alambra. 1981.p 97 – 114 8 DUARTE, Alberto. Operaciones de transferencia de momentum & manejo de sólidos: aplicaciones. Bogotá: Universidad Nacional de Colmbia, 1998. 269 p

condiciones del proceso sin importar el volumen al cual se trabaja buscando

rendimientos similares. De acuerdo con Duarte9:

“El diseño de un reactor está limitado por la capacidad del sistema para transferir masa y

calor. La transferencia de calor se realiza en las superficies que limitan el sistema y la

transferencia de de masa ocurre en todo el volumen útil del reactor. Entre los criterios de

cambio de escala relacionados con agitación mezcla, de fluidos, están potencia por

unidad de volumen, tiempo de mezcla y velocidad de la punta del impulsor. La aplicación

de estos criterios requiere un profundo conocimiento del proceso y particularmente del

paso limitante en la obtención del producto”.

Los principales criterios relacionados con el cambio de escala son “el aumento del

número de Reynolds con la escala, la variación de los tiempos de mezclado y

homogenización entre 80 y 100 s y la velocidad de punta del impulsor es

prácticamente independiente del volumen del bioreactor y varía entre 5 y 6 m/s”10.

1.3 BACTERIAS ACIDOLÁCTICAS (LAB) Dentro de la industria alimentaria, el papel que desempeñan las bacterias

acidolácticas es de gran importancia, debido a que una gran variedad de alimentos

son preparados y preservados haciendo uso de éstas bacterias; entre los

alimentos preparados podemos citar como ejemplos más representativos algunos

productos lácteos (como el yogurt y el kumis), productos cárnicos madurados y

productos fermentados a base de hortalizas (como la chucruta). Las técnicas de

fermentación que hacen uso de bacterias acidolácticas son tan antiguas como el

mismo arte de la fermentación, aunque hace un par de siglos que se conoce de su

incidencia en los cambios que sufren los alimentos; así como de la gran variedad

de bacterias que son capaces de utilizar los alimentos para su desarrollo

otorgándoles características sensorialmente agradables que incitan a su consumo

9 Ibid, 270 p 10 DUARTE; Ibid, 270 p

y producción a gran escala. Una breve descripción del género de las bacterias

acidolácticas podría ser la dada por Adams Moss11:

“El término bacterias acidolácticas no tiene significación taxonómica, aunque se ha

demostrado que desde el punto de vista filogénico las LAB están emparentadas.

Comparten varias características comunes: son bacilos o cocos gram (+) asporógenos; la

mayoría son organismos aerotolerantes que carecen de citocromos y de porfirinas y por

esta razón son catalasa negativa y oxidasa negativa. Algunas captan el oxigeno por

mediación de las oxidasas de la flavoproteína, oxidación que se utiliza para producir H2O2

y/o para oxidar de nuevo el NADH producido durante la deshidrogenación de los

azúcares”.

Las bacterias acidolácticas son capaces de obtener su energía a partir de la

fermentación de los carbohidratos para producir principalmente ácido láctico. A

partir de la forma como éstos microorganismo realizan la fermentación se pueden

dividir las bacterias acidolácticas en homofermentativas y heterofermentativas. De

las bacterias homofermentativas se puede decir que utilizan la molécula de

glucosa para producir energía desdoblándola en dos moléculas de ácido láctico. A

diferencia de las bacterias homofermentativas, las heterofermentativas obtienen su

energía a partir de la glucosa obteniendo a partir de ella una molécula de ácido

láctico, una molécula de etanol o ácido acético y una molécula de dióxido de

carbono (CO2).

La reacción por medio de la cual se expresa la producción de ácido láctico a partir

de la lactosa es

molkJG

OHATPOHCPiADPOHC

/1.25

444240

2363112412

−=∆

++↔++

11 ADAMS, M.R. y MOSS, M.O. Microbiología de los Alimentos. Zaragoza: Acribia, 1997. p. 321-324

La Figura 5 muestra de manera más detallada las dos rutas metabólicas que se

describieron anteriormente.

Figura 5. Las vías de la homofermentación y la heterofermentación. Fuente: ADAMS y MOSS. Microbiología de los alimentos.

Dentro de las bacterias acidolácticas se destaca el género Lactobacillus. En el

Manual de Bergey se clasifica éste género en tres grupos como se muestra en la

Tabla 2.

Homofermentación Heterofermentación

fosfocetolasa

Triosa-3P + Acetil-P

PiruvatoAcetato (Etanol)

Lactato

Piruvato

Lactato

Fru-1,6P

Xululosa-5P+CO2

Triosa-3P

Glucosa 6P

Glc-6P

Aldolasa 6P-Gluconato

Glucosa

Lactosa

Galactosa

β-(1-4)Galactosidasa

Glucosa

Glucosa Isomerasa

Tabla 2. Clasificación del género Lactobacillus Grupo Tipo de

fermentación % Ácido láctico

de glucosa I Homofermentativo 85% o más II Heterofermentativo 50% II Heterofermentativo Muy bajo

Fuente: HENDRICKS, David. Bergey’s Manual of systematic bacteriology.

Propiedades comunes del género: las propiedades de Lactobacillus se

caracterizan por células en formas de bastoncillos, solas o agrupadas en pares o

cadenas, además de ser una especie con gran exigencia de factores de

crecimiento por ejemplo vitaminas del complejo B y aminoácidos. Lactobacillus

delbrueckii requiere de 11 a 15 aminoácidos según las cepas, una acidificación de

la leche más lenta en el caso de los Estreptococos pero generalmente más

intensa gracias a una mejor resistencia a pH ácidos (hasta pH 3,5) y a una

concentración más elevada de ácido láctico (como máximo 27g/litro).

1.4 MICROORGANISMO Lactobacillus plantarum

Con respecto al Lactobacillus plantarum se han realizado varios estudios

relacionados a la fermentación láctica, entre los que se tiene: “Kinetics and

Modeling of Lactic Acid Production by Lactobacillus plantarum” realizado por

Passos V., Fleming H., Ollis D., Ferlder R y McFeeters R12; publicado en la revista

Applied and environmental Microbiology; “Lactic acid baterial fermetation of burong

dalag” realizado por: Orillo C y Pederson C13, publicado por la revista Applied

Microbiology y “Lactic acid production from agricultural resouses as cheap raw

materials” realizado por Oh H., Wee J., Yun J., Han S., Jung S., y Ryu H14,

12 PASSOS, V; et al. Kinetics and Modeling of Lactic Acid Production by Lactobacillus plantarum. En: Aplied and environmental microbiology. Estados Unidos. Vol 60, no 7 (Julio 1994); p2627 – 2636. 13 ORILLO, C y PEDERSON, C. Lactic acid baterial fermetation of burong dalag. En: Applied microbiology. Estados Unidos. Vol 16, no 11 (Nov 1968); p 1669 – 1671. 14 OH H., WEE J., YUN J., HAN S., JUNG S., y RYU H. Lactic acid production from agricultural resouses as cheap raw materials. En: Bioresourse technology. Estados Unidos. Vol 96, no __ (2005); p 1492 - 1498

publicado por la revista Bioresourse Technology. En la Tabla 3, que a continuación

se presenta, se describen algunas de las características del microorganismo, por

las cuales fue seleccionado para realizar la fermentación.

Tabla 3. Características generales del Lactobacillus plantarum Característica Descripción Forma Bacilos rectos, puntas redondeadas, pueden encontrarse

solos, en parejas o en cadenas cortas. Tamaño Generalmente entre 0,9 -1,2 µm ancho y 3-8 µm de largo. Motilidad No son motiles, aunque en algunas subespecies se han

reportado flagelos Colonias La superficie de las colonias son de aproximadamente 3 mm

de ancho, elevadas, redondas, lisas, compactas, blancas y ocasionalmente brillantes o amarillo oscuro. Crecimiento en medio líquido resulta en una pronunciada turbidez.

Ácido láctico Produce DL-Ácido Láctico. 0,3-1,2% de acidez Ácido a partir de Fructosa, galactosa, glucosa, lactosa, maltosa, manitol

manosa, sacarosa, solbitol, entre otros Factores de crecimiento

Temperatura óptima: 30-35 ºC Vitaminas del complejo B (Acido fólico, B12, tiamina, niacina) Calcio pH óptimo 6.00

Fuente: HENDRICKS, David. Manual de Bergey of systematic bacteriology.

1.5 SUERO DE LECHE El suero de leche es el residuo que se obtiene a partir de la separación de la

caseína en la leche usualmente realizada por acidificación, calentamiento o

coagulación enzimática, su color es amarillo opaco y sin brillo, sus sólidos están

representados en su mayoría por lactosa; su composición en macro y

micronutrientes aparece en la Tabla 4.

El uso más común del suero de leche es la alimentación animal, aunque a partir

de este subproducto se puede obtener una gran variedad sustancias que pueden

ser usadas como aditivos en varios procesos alimentarios; entre los diferentes

subproductos que se pueden mencionar están el suero dulce y ácido en polvo,

proteína de suero concentrada, polvo deslactosado, queso, polvo

desmineralizado, alcohol, vinagre, proteína, lactosa, ácido láctico, alcoholes, etc.

Tabla 4. Algunas características del suero de queso Características Concentración

g/100g Sólidos totales Proteína Lactosa Ácido láctico

6,25 0,13 4,82 0,22

mg/100g Potasio Calcio Fósforo Sodio Azufre Magnesio Hierro pH = 4.9

167 88 48

43,5 15 9

0,1

Fuente: GHALY A.E., TANGO M.S.A., y ADAMS M.A. Enhanced lactic acid production from cheese whey with nutrient supplement addition.

El suero lácteo puede ser clasificado de acuerdo con la acidez titulable que este

posea, como se muestra en la Tabla 5.

Tabla 5. Clasificación de sueros lácteos Clase de suero Acidez titulable pH

Dulce 0,1 – 0,2 % 5.8 – 6.6 Medio ácido 0,2 – 0,4 % 5.0 – 5.8

Ácido 0,4 – 0,6% 4.0 – 5.0 Fuente: KOSIKOWSKI y MISTRY. Cheese and fermented milk products.

De acuerdo a la Tabla anterior se puede decir que para cada variedad de queso

existen determinadas características de pH y acidez titulable dependiendo de la

técnica empleada para obtener el suero; así, por ejemplo: “quesos elaborados por

coagulación enzimática como el Emmental y Cheddar desarrollan pequeñas

cantidades de ácido en sus sueros a menos que estos sean manejados o

almacenados de manera inapropiada. Otros quesos cuajados de otra manera,

como el Camembert, sin embargo, producen un suero relativamente ácido”15. La

composición general de suero lácteo es bien conocida, como lo es también el

suero líquido y en polvo y los polvos de concentrado de proteína de suero.

En la Figura 6 se puede observar el diagrama de flujo para el procesamiento de

algunos subproductos obtenidos a partir del suero de leche que constituyen un

amplio mercado en Estados Unidos. Para este proceso “el lactosuero se retira de

la cuajada en etapas tempranas de la elaboración del queso, antes de que se

añada la sal o se desarrolle acidez en forma significativa”16.

Lactosuero Fluido

Clarificación y Separación

Lactosuero Fluido “Finos de Queso” Crema de Lactosuero

Pasteurización

Concentración y/o Evaporación

Secado por aspersión

Lactosuero en Polvo

Figura 6. Procesamiento del lactosuero. Fuente: HUGININ, Alan. El lactosuero. En: Industria Alimenticia.

15 KOSIKOWSKI, Frank y MISTRY, Vikram. Cheese and fermented milk products Vol I. Virginia: Great falls, 1997. 423 p 16 HUGININ, Alan. El lactosuero: Aplicaciones del lactosuero en estados Unidos y posibles aplicaciones en Mexico y otros países latinoamericanos. En: Industria Alimenticia. México. Vol. 10, no. 5 (may. 1999); p. 44 – 50.

La Tabla 6 muestra la composición de algunas clases de suero obtenidos a partir

del suero lácteo obtenido de diferentes tipos de queso.

Tabla 6. Composición de algunos sueros fluidos y secos (% m/v) Componente Suero

dulce fluidoSuero

ácido fluidoSuero ácido condensado

Suero dulce seco

Suero ácido seco

Sólidos totales 6,35 6,5 64,0 96,5 96

Humedad 93,70 93,50 33,5 3,5 4,0 Grasa 0,5 0,04 0,6 0,8 0,6 Proteína 0,8 0,75 7,6 13,1 12,5 Lactosa 4,85 4,90 34,9 75,0 67,4 Cenizas 0,5 0,80 8,2 7,3 11,8 Ácido láctico 0,05 0,40 12,0 0,2 4,2 Fuente: KOSIKOWSKI y MISTRY. Cheese and fermented milk products.

El suero pulverizado es el que está destinado a ser el producto más importante de

los productos del lactosuero, debido a que a partir de este es posible obtener una

gran variedad de derivados líquidos y secos que varían en su composición,

características y aplicaciones.

1.5.1 Suero seco. Debido al alto contenido de lactosa de éste producto, el suero

seco representa un gran desafío, pues la lactosa es un disacárido que tiende a

ganar humedad rápidamente; de no ser manejado apropiadamente, el polvo

obtenido forma terrones, es muy pegajoso y deja residuos sobre las paredes. Este

suero se obtiene concentrando a 77ºC hasta alcanzar un 45% de sólidos,

posteriormente es secado en deshidratadores de tambor o de rocío.

1.5.2 Suero ácido seco. Antes de proceder a secar el suero, es necesario

cristalizar la lactosa concentrando los sólidos hasta un 45 – 55 % en un

evaporador y luego pasarla por un intercambiador de calor tubular a 30ºC y

posteriormente un enfriado a 10ºC. después de este proceso, el secado por rocío

puede llevarse a cabo por varias vías:

Secado a baja temperatura, produciendo un polvo con alta humedad (10 a

14%), secado después a 3% en un lecho fluido vibratorio.

Secado en un lecho fluido estático suplido con aire caliente, concentrado

después a un polvo de aproximadamente 5% de humedad.

Secado en un secador que incluye pequeños conos con recirculación y

lecho fluido vibratorio

Inyección de aire caliente a 13,8 MPa de presión dejando un polvo de baja

densidad.

1.5.3 Suero condesado. A partir del suero de algunos quesos se elabora

también suero condensado, usado para productos muy comerciales como

caramelos y principalmente en alimentos para animales como aves y teneros. Se

prepara bombeando el suero de las bateas del proceso de fabricación de quesos

como el Cheddar a un evaporador de doble efecto hasta tener sólidos totales del

62 – 64%. Posteriormente se enfría hasta 10ºC con agitación lenta, luego es

almacenado en bolsas de polietileno y almacenado como un sólido consistente. 1.5.4 Usos del suero en alimentos. Son muchas las aplicaciones que se le

pueden dar al suero lácteo en la industria, entre estos usos se pueden mencionar

la panadería, mezcla para helados, dulces, alimentos para el desayuno y queso. El

suero es usado en industrias de queso Gjetost y Mysost en Noruega y en el queso

recocido o Ricotta de Italia y Estados Unidos. Kosikowski y Mistry17 dicen: “El suero dulce ha logrado considerables éxitos, pero no el suero ácido. En consecuencia,

más investigaciones tienen que enfocarse al desarrollo de suero ácido condensado, ácido

hidrolizado, fraccionado, pulverizado y condesado en alimentos para humanos y

animales, no obstante, que algunos sueros ácidos pulverizados están siendo utilizados

como acidulantes para alimentos, bebidas alcohólicas y mezclas alimenticias

nutricionales”.

17 KOSIKOWSKI, Frank y MISTRY, Vikram. Cheese and fermented milk products Vol I. Virginia: Great falls, 1997. 445 p

2. METODOLOGÍA DE LA EXPERIMENTACIÓN

Durante la experimentación para determinar la producción de ácido láctico a partir

del suero lácteo por medio de la fermentación anaerobia realizada con

Lactobacillus plantarum ssp. se siguió el procedimiento que aparece en la Figura 7

y que posteriormente se describe con mayor detalle. Las fermentaciones

evaluadas se trabajaron con volúmenes de 1 L y 5 L.

Selección del

microorganismo

Activación del microorganismo

Caracterización del

microorganismo

Elaboración curva de crecimiento

Fermentación medio 2 en 1L

Fermentación medio 3 en 1L

Fermentación medio 1 en 1L

Análisis y selección del mejor medio

Fermentación mejor medio 5L

Propuesta escalado de la fermentación

Conclusiones

Figura 7. Procedimiento para realizar el trabajo.

2.1 SELECCIÓN Y ACTIVACIÓN DEL MICROORGANISMO El microorganismo utilizado para realizar las fermentaciones de 1 L y 5 L fue el

Lactobacillus plantarum ssp., se escogió éste microorganismo debido a las

características que éste presenta para su manejo entre las que se cuentan su

rápido crecimiento y rango de temperatura óptima de crecimiento y desarrollo (30-

35ºC)18, además de la facilidad que presentaba para su consecución, pues este

microorganismo se encontraba en el cepario del Laboratorio de Microbiología de la

Universidad De La Salle sede La Floresta.

La activación del microorganismo se llevó a cabo de la siguiente manera: se

sembró en dos cajas de Petri que contenían el medio de crecimiento Agar Man,

Rogosa And Sharpe (MRS) a partir de la cepa madre de Lactobacillus platarum

ssp. usando la técnica de siembra por aislamiento; posteriormente, se incubaron

las cajas de petri con el microorganismo a una temperatura de 35ºC durante 48

horas. Terminada la incubación se procedió a realizar algunas pruebas de

reconocimiento del microorganismo tanto macroscópicas como microscópicas

entre las que se cuentan características morfológicas y tinción con el reactivo de

Gram, realizada de la siguiente manera: se hizo un frotis con las bacterias

sembradas en las cajas de Petri, posteriormente se agregó el Violeta de gram, se

esperó 1 min y se enjuagó suavemente con abundante agua, después de esto, se

agregó al frotis el lugol, se enjuagó suavemente con abundante agua y luego se

agregó alcohol-acetona sobre la lámina permitiendo que escurriera hasta que la

solución salía clara, esta operación se hizo en un tiempo no mayor a 30 s, por

último se agregó la fuccina, se enjuagó suavemente con abundante agua y se

observó bajo el microscopio.

Una vez identificado el microorganismo la medida a tomar fue realizar una

resiembra e incubación del microorganismo a 35ºC durante 48 horas para la 18 HENDRICKS, David. Bergey's manual of systematic bacteriology. Philadelphia: Williams & Wilkins. 1984. 585 p

posterior determinación de la curva de crecimiento (ver numeral 2.2). Las dos cajas

de Petri utilizadas para la activación del microorganismo Lactobacillus plantarum

ssp. fueron almacenadas en refrigeración a 4ºC con repiques realizados cada mes.

2.2 PRE-EXPERIMENTACIÓN: CURVA DE CRECIMIENTO Para conocer el comportamiento de la bacteria Lactobacillus plantarum ssp. se hizo

una fase de pre-experimentación que consistió en obtener la curva de crecimiento

del microorganismo; se partió de la resiembra realizada y una cantidad de

microorganismo equivalente a 9 x 108 células/mL, valor encontrado de acuerdo con

el patrón de turbidez número 3 de McFarland19, las mediciones se efectuaron de la

siguiente manera: se tomaron 3 mL de medio para tomar como blanco exento de

microorganismos (esta muestra se mantuvo refrigerada a 4°C), luego se adicionó el

microorganismo y se tomo una lectura inicial de la absorbancia en un

espectrofotómetro comparada contra el blanco a una longitud de onda de 460 nm.

El caldo se mantuvo en 35°C durante 2 días tomando muestras de 3 mL a

intervalos de 2 horas. Terminado esto, se llevaron los resultados a una hoja de

cálculo y se determinó el tiempo que tarda el microorganismo en llegar a la fase

logarítmica, las muestras obtenidas en la fase logarítmica fueron sembradas en

medio MRS, y se realizo conteo de células en cámara de New Bawer.

2.3 FERMENTACIÓN DE 1 L Para llevar a cabo la fermentación de 1 L, se utilizaron tres medios de cultivo

diferentes, cada uno de estos por duplicado; después de realizados los análisis de

cada medio, los resultados fueron analizados estadísticamente con el fin de

seleccionar el medio de cultivo en el cual la cantidad de ácido láctico producido fue

mayor.

19 ESCOBAR, Myriam. Fundamentos de Microbiología. Bogotá: CEJA. 1998, p.183-186

2.3.1. Evaluación de tres medios de cultivo. Para realizar la fermentación con

Lactobacillus plantarum ssp. se tuvo en cuenta la composición del suero a partir

del cual se elaboraron los 3 medios de cultivo experimentales con adición de otros

nutrientes adicionales que se utilizaron basados en pruebas realizadas por otros

autores y que proporcionarían al microorganismo los nutrientes necesarios para su

crecimiento y desarrollo. Las fermentaciones se llevaron a cabo en fermentadores

con capacidad de 1 L, después se seleccionó el que presentó las mejores

características de crecimiento y producción de ácido láctico.

2.3.1.1. Análisis y manejo del suero lácteo empleado. El suero lácteo

utilizado en las fermentaciones es el residuo de la elaboración del queso

campesino fresco fabricado por la Empresa LÁCTEOS SAN ANDRÉS ubicada en

el Municipio de Ubaté (Cundinamarca). Este suero fue colectado y transportado al

Laboratorio de Biotecnología de la Universidad De La Salle sede Floresta una vez

finalizado el proceso de desuerado y obtención de la cuajada.

Para preparar los medios experimentales se hizo un mezclado del suero con los

diferentes componentes y luego se pasteurizó a 70 ºC durante 45 minutos, el cual

se consideró como el método térmico para la eliminación de microorganismos y se

eligió debido a que la proteína del suero lácteo se desnaturaliza a 72 ºC.

La composición de macronutrientes del suero lácteo empleado en las

fermentaciones fue analizada por el laboratorio químico INTERLABCO LTDA.

2.3.1.2. Composición de los medios de cultivo experimentales. Los 3

medios de cultivo se prepararon a partir del suero lácteo y después de revisar

investigaciones similares realizadas por otros autores; para elaborar el Medio 1

(M1) se siguió la formulación empleado por Ghaly A.E et al20, que era la más

20 GHALY A.E., TANGO M.S.A., and ADAMS M.A. Enhanced lactic acid production from cheese whey with nutrient supplement addition. Agricultural Engineering International: the CIGR Journal of Scientific Research and Development. Manuscript FP 02 009. May, 2003.

simple en cuanto a contenido de micronutrientes, por contener suero lácteo y

extracto de levadura como únicos constituyentes; la elaboración de los medios M2

y M3 se basó en las formulaciones de las investigaciones realizadas por Telles L.

et al21 y Chakraborty et al22 respectivamente; a partir de éstas formulaciones se

pretendía seleccionar el medio en el cual el microorganismo presentara las

mejores condiciones de crecimiento y desarrollo para la producción de ácido

láctico. La Tabla 7 muestra los componentes de los diferentes medios de cultivo

usados para hacer las fermentaciones lácticas.

Tabla 7. Formulación de los 3 diferentes medios de cultivo Componente (g) Medio 1 Medio 2 Medio 3 Extracto de levadura 20 10 5 Peptona - 10 10 Citrato de amonio - 2 - Acetato de sodio - 5 - Sulfato de magnesio - 0,2 0,1 Fosfato ácido de potasio - 2 - Tween 80 (ml) - - 2 Carbonato de sodio Para ajustar pH 5.6 Suero de leche Se completó volumen a un litro

Una vez preparados los medios para realizar la fermentación se inoculó en 100 mL

de cada uno (equivalente al 10%) una cantidad de microorganismos igual a 9 x 108

células/mL, tomando como referencia el patrón 3 de la escala de turbidez de

McFarland23, para realizar la adaptación del microorganismo a cada uno de los

medios. Éste periodo de adaptación se estimó en 6 horas. Cumplido éste tiempo,

se procedió a inocular en los fermentadores de 1 L e incubarlos a 35ºC por 48

horas en anaerobiosis, tomando muestras de 55 mL cada 2,5 horas para realizar

cuantificación de lactosa, proteína y ácido láctico. Las muestras se tomaron en este

intervalo de tiempo debido a las características de crecimiento de este

21 TÉLLEZ, Luis, MOLDES , A.B., VÁZQUEZ, Alonso. Optimization of lactic acid production by Lactobacillus delbrueckii through response surface methodology. Journal of food science. Vol. 68, Nr. 4, 2003. 1454 – 1458 p. 22 CHAKRABORTY P.J. and DUTTA, S.K,. Kinetics of lactic acid production by Lactobacillus delbrueckii and L. bulgaricus in glucose and whey media. Food Sci. Technol., 1999, Vol. 36, No. 3, 210 – 216 p. 23 ESCOBAR, Myriam. Op.cit., p. 183-186

microorganismo observadas durante la elaboración de la curva de crecimiento. Las

fermentaciones en cada medio fueron hechas por duplicado con el fin de obtener

resultados confiables,

2.3.1.3. Elaboración de los fermentadores de 1 L. Debido a que la

capacidad mínima de trabajo del biorreactor del Laboratorio de Biotecnología de la

Universidad De La Salle sede Floresta es 3.5 L, fue necesario diseñar y elaborar

los fermentadores para trabajar en volumen de 1 L; los materiales que se utilizaron

para construirlos fueron:

• 1 frasco de vidrio con tapa metálica

• 3 equipos de venoclisis

El procedimiento empleado para la elaboración de los fermentadores fue el

siguiente: cada equipo de venoclisis debe ser separado a la altura de el acople

plástico, con el fin de obtener 2 mangueras, una de éstas con válvula de control

que se ubicó en la parte exterior del reactor, y la otra irá situada en la parte interior

del reactor en contacto con el medio separada del fondo, el acople servirá

posteriormente de unión entre las dos mangueras separadas por la tapa; este

acople se debe fijar en el orificio de la tapa con lo cual se aísla el medio de cultivo

del ambiente, esto se logra haciendo un orificio en la tapa del frasco por el cual el

acople entra a presión.

La parte ancha del equipo de venoclisis se separa de la manguera y se sella por el

extremo inferior, por el otro se adiciona azul de metileno diluido que actuará como

indicador de anaerobiosis cambiando de azul claro a incoloro en ausencia de

oxígeno; este sistema se coloca en uno de los orificios de la tapa del fermentador.

La tapa debe llevar 4 orificios para montar 3 acoples y el sistema indicador de

anaerobiosis. De acuerdo al procedimiento el reactor tendría tres mangueras cada

una con válvula de control, una de estas para tomar muestras del medio, otra para

alimentar dióxido de carbono (CO2) desde un sistema compuesto por un embudo

de decantación que contenía ácido sulfúrico concentrado (H2SO4) y que era

soportado por un erlemeyer con desprendimiento lateral que contenía solución de

carbonato de sodio (Na2(CO3)) y así generar anaerobiosis (Figura 8), y la última

para ingresar al medio carbonato de sodio Na2(CO3) para controlar el pH y

mantenerlo en un rango constante.

Figura 8. Sistema generador de CO2 para crear atmósfera de anaerobiosis

Una vez listas las partes del fermentador, se procedió a unirlas a la tapa y luego

se sumergieron en etanol al 96% antes de esterilizar en autoclave envueltos en

papel Kraf® para evitar la contaminación de los frascos. La pasteurización del

medio se hacía con tapas metálicas sin perforar y al momento de inocular se

cambiaban asépticamente por las tapas perforadas, se sellaba el sistema y se

creaba la atmósfera de anaerobiosis haciendo circular CO2 por el medio hasta

lograr el cambio de color del indicador de azul de metileno. La Figura 9 muestra el

esquema del fermentador de 1 L diseñado.

Figura 9. Esquema del fermentador de 1 L

2.3.1.4. Control de pH. La medición del pH de las muestras se realizó

inmediatamente después de tomada la muestra de cada frasco de fermentación,

por lo tanto, muestran una gran variación. Inmediatamente después de tomado el

valor de pH se procedió a regularlo en 5,6 con carbonato de sodio (Na2(CO3)),

debido a que este reactivo además de regular el pH ayuda a controlar la

anaerobiosis de los frascos de fermentación por medio de la liberación de CO2 a la

atmósfera presente en cada medio. El pH en las fermentaciones de 1 L se controló

de manera manual tomando muestra, midiendo pH y adicionando carbonato de

sodio hasta dejar el pH en 5,6, en la fermentación de 5 L el pH se realizó por

medio del potenciómetro que el biorreactor trae incorporado. La medición del pH

se realizó en los mismos intervalos que la toma de muestras para cuantificar

variables.

2.3.1.5. Control de ausencia de oxígeno. La ausencia de oxígeno en los

medios de fermentación en volumen de 1 L se utilizó como indicador el azul de

metileno diluido (una gota a 10 mL de agua destilada), cuando éste cambiaba a

transparente se obtenía una anaerobiosis en el sistema, esta se lograba unos

minutos después de adicionado el CO2

2.3.2. Cuantificación de las variables de fermentación. Para evaluar el mejor

medio de producción de ácido láctico, se determinó la cantidad de lactosa,

proteína y ácido láctico que contienen las muestras de cada una de las

fermentaciones. La metodología empleada para las fermentaciones en 1 L y 5 L se

presenta a continuación.

2.3.2.1. Cuantificación de proteínas. El contenido de proteína de cada una

de las muestras se evalúo con el método fotométrico de Lowry24, seleccionado por

ser un método altamente sensible (1 – 300 µg/ml).

Para la medición de proteína se siguió la siguiente metodología: se preparó una

solución conocida de ovoalbúmina (concentración de 0.3 mg/mL) y a partir de éste

se elaboraron 10 diluciones que variaban desde 0 µg/mL correspondiente al

blanco hasta 300 µg/mL para elaborar la curva patrón sobre la cual se leían las

muestras a una longitud de onda de 540 nm (ver anexo 1). 24 COPELAND, Robert A. Methods for protein analysis: a practical guide to laboratory protocols. Cap. 3: Methods for protein quantification. Editorial Chapman & Hall. E.E.U.U. 1994.

Una vez elaborada la curva se prepararon las muestras tomando 100 µL de

muestra y llevándola a 1 mL con agua destilada, posteriormente se agregó el

reactivo de Lowry, agitando con un vortex y dejando en reposo durante 15

minutos, seguido a esto, se agregaron 3 mL de solución Folin a las muestras y

luego se agitó en el vortex, dejando nuevamente en reposo por un periodo de 45

minutos. Cumplido el tiempo de incubación, las muestras fueron leídas en el

espectrofotómetro a 540 mn (igual que la curva patrón) comparadas contra un

blanco preparado previamente con los mismos reactivos. Los datos fueron

registrados en tablas para posterior análisis.

2.3.2.2. Cuantificación de lactosa. La lactosa presente en cada una de las

muestras se calculó con el método de Antrona25, que es un método sensible para

medir concentraciones de azúcar del orden de 1 a 50 µg/mL, por lo tanto es un

método confiable.

La metodología para cuantificar el contenido de lactosa, que en su mayoría

corresponden a lactosa, a continuación de describe: la curva de calibración se

elaboró preparando una solución de 50 µg/mL de glucosa y preparando 10

diluciones desde 0 µg/ml correspondiente al blanco hasta 50 µg/mL, se tomó con

micropipeta una cantidad igual a 167 µL de cada muestra y se lleva a volumen de

2.5 mL en sendos tubos de ensayo, luego se adicionó 5 mL de reactivo Antrona y

se agitaron los tubos en un vortex para homogenizar la solución; posteriormente

se llevaron los tubos a ebullición en baño maría durante 10 minutos, cumplido el

tiempo se llevaron los tubos a un baño de hielo. Aquí se esperó 15 minutos para

eliminar las burbujas de aire, luego se leyeron las muestras en el espetrofotómetro

a 625 nm comparados frente a un blanco preparado y se realizaron los cálculos

pertinentes (ver anexo 2). El mismo procedimiento fue empleado para el análisis

de las muestras.

25 FA. Improvement in anthrone method for determination of carbohydrates. Analysis Chemical Cap: 241952; 219 p

2.3.2.3. Cuantificación de ácido láctico. La cuantificación del ácido láctico

de las diferentes muestras se reportó por Matissek, Schnepel y Steiner26. La cuantificación se realizó como a continuación se indica: Se tomaron alícuotas

que oscilaban ente 5 y 10 mL de cada una de las muestras a examinar y se les

agregó 100 mL de agua destilada y 10 mL de solución de hidróxido de sodio 2 N a

cada muestra y se calentó a reflujo durante 15 minutos; posteriormente se

neutralizó con ácido sulfúrico 0.25 N, se filtró y se llevó a volumen de 250 mL con

agua destilada. Del frasco anterior se tomó una alícuota de 2 mL y se le agregó 20

mL de agua destilada para luego concentrar hasta la mitad del volumen

aproximadamente, esta cantidad se llevó a 50 mL en un balón aforado con agua

destilada. De aquí nuevamente se tomó una alícuota de 2 mL y se le agregó 2 mL

de solución de sulfato de cerio (IV) en un tubo de ensayo con tapa, se agitó en el

vortex y se llevó a un baño maría a 60 ºC durante 15 minutos, cumplido el tiempo

se llevó a baño de hielo hasta que se enfrió (aproximadamente 4 ºC), seguido a

esto se le agregó 2 mL de solución de piperidina al 10%, se agitó en el vortex,

luego se filtró y se le agregó 2 mL de solución de nitroprusiato al 0.4% y se leyó en

el espectrofotómetro a 570 nm; la máxima absorbancia se logra aproximadamente

50 segundos después de adicionar la solución de nitroprusiato.

Luego se compararon los resultados frente a una curva preparada previamente

con un patrón de ácido láctico que se prepara bajo las mismas condiciones, éste

método actúa de manera efectiva en un rango comprendido entre 0 µg/mL y 800

µg/mL, posteriormente se hacen los cálculos pertinentes teniendo en cuenta las

diluciones (Ver anexo 3).

2.3.3. Análisis estadístico para la selección del mejor medio de fermentación. Una vez realizados los análisis mencionados anteriormente, se

determinó el medio que presentaba la mayor producción de ácido láctico y se

26 MATISSEK, SCHNEPEL Y STEINER, Análisis de los alimentos. Zaragoza: Acribia. p 181 – 184.

analizó estadísticamente los resultados mediante un análisis de varianza de una

sola vía para corroborar los resultados obtenidos experimentalmente. Con el

medio seleccionado se realizó una fermentación en el biorreactor marca NEW

BRUNSWICK referencia Bioflo 110 ubicado en el laboratorio de biotecnología de

la Universidad De La Salle, con un volumen de 5 L, en el cual se controlaron y

cuantificaron las mismas variables de las fermentaciones de 1 L.

Después se analizó la variación que presentaba el consumo de lactosa, presencia

de proteína y producción de ácido láctico entre los tres diferentes tratamientos que

corresponden a las fermentaciones efectuadas en los medios experimentales

(variable independiente), para el análisis de las variables en las fermentaciones

realizadas en cada medio se hicieron dos repeticiones por prueba y se plantearon

las hipótesis estadísticas, el diseño experimental fue trabajado con un grado de

significancia de 95%. Se escogió el análisis de varianza completamente

aleatorizado de una sola vía porque es el tipo de análisis más sencillo y los datos

obtenidos se ajustaban a este modelo.

Las hipótesis planteadas para las tres variables en ésta etapa del trabajo de grado

se describen así:

Hipótesis nula (Ho). No existe diferencia significativa en las cantidades de

proteína, lactosa y ácido láctico para ninguna de las fermentaciones

realizadas.

Hipótesis alterna (Hi). Existe diferencia significativa en las cantidades de

proteína, lactosa y ácido láctico en al menos una de las fermentaciones

realizadas.

Los resultados de cada variable se organizaron según la matriz de datos empleada

para el análisis de datos que aparece en la Tabla 8.

Tabla 8. Matriz de datos para las variables del diseño experimental ANOVA de una sola vía

M1 M2 M3 Tiempo (h) M1.1 M1.2 M2.1 M2.2 M3.1 M3.2 0 Variable Variable Variable Variable Variable Variable

2,5 5 21

23,5 26

28,5 48

Replicas 16 16 16

Después de realizar el análisis de varianza se evaluó la igualdad de varianzas

mediante la prueba de Barlett.

2.4 FERMENTACIÓN DE 5L Con base en los resultados obtenidos en los análisis estadísticos realizados para

las fermentaciones de 1 L se determinó el mejor medio de producción de ácido

láctico para seguir el proceso de la experimentación con las fermentación de 5 L,

una vez cuantificadas las variables de la fermentación, se procedió a realizar un

análisis estadístico para determinar la variación de los resultados con relación a la

fermentación de 1 L.

2.4.1. Protocolos de operación del fermentador. Todo el proceso de

fermentación se realizó según las recomendaciones indicadas en el manual del

equipo de fermentación marca NEW BRUNSWICK referencia Bioflo 110 Modular

Fermentor & Birreactor (ver anexo 4); el procedimiento se describe a continuación. 2.4.1.1. Esterilización del Vaso. Este procedimiento se efectuó de la

siguiente manera:

• Verificar que el equipo se encuentre completo y todas sus piezas estén

en perfecto estado.

• Realizar una limpieza de todas las partes del equipo con agua y

detergente no abrasivo y posterior secado.

• Cubrir con etanol de 96% todas las superficies del equipo que entran en

contacto con el medio de fermentación (vaso, tapa, tubos colectores,

potenciómetro, medidor de D.O., aspersor de gases, medidor de

temperatura) y sellarlo herméticamente para eliminar microorganismos

que puedan afectar las fermentaciones.

• Cubrir con papel aluminio la parte exterior del agitador y del

potenciómetro y el medidor de D.O.

• Llevar el vaso a esterilización a 121 ºC durante 15 minutos; pasado este

tiempo dejar enfriar sin destapar la autoclave por un periodo de 2 horas.

2.4.1.2. Preparación del medio. Como se mencionó anteriormente, el suero

lácteo no puede someterse a temperaturas superiores a 72 ºC debido a que la

proteína presente se desnaturaliza, por lo tanto el procedimiento empleado para

preparar los diferentes medios fue así.

• Pesar cada uno de los ingredientes para los diferentes medios en

balanza analítica de precisión en sendos pedazos de papel aluminio.

• Mezclar los ingredientes de cada medio y completar al volumen

correspondiente con suero y colocar a un baño maría graduado a 70 ºC y

mantenerlos allí durante 45 minutos.

• Enfriar el medio hasta una temperatura de 35 ºC para posterior

inoculación.

2.4.1.3. Protocolo de inoculación. Se realizo con el siguiente

procedimiento:

• Junto a un mechero tomar con un asa previamente flameada colonias

presentes en la caja que contiene la cepa madre del Lactobacillus

platarum.

• Sembrar por la técnica de agotamiento en cajas de Petri marcadas con el

nombre de cada uno de los medios de fermentación e incubar a 35 ºC

por 48 horas.

• Sacar de cada una de las cajas en forma estéril azadas y colocarlas en

la solución salina hasta lograr la turbidez indicada de acuerdo la escala

de Mcfarland.

• De manera aséptica retirar un volumen equivalente al 10% de cada uno

de los medios y a éstos adicionar el contenido de los tubos de solución

salina con previamente inoculados.

• Incubar por espacio de 10 horas a una temperatura de 35 ºC.

• Inocular de manera aséptica en cada medio e iniciar la fermentación. 2.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO PARA LA FERMENTACIÓN DE 5 L

Para realizar el análisis estadístico de las diferentes fermentaciones se usó el

programa estadístico Statistix versión 7.0 en el cual se corrieron las muestras de

la siguiente manera: Para el manejo de los datos en las fermentación de 5 L

comparada contra el mejor medio en 1 L se empleó un análisis de varianza

(ANOVA) de una sola vía con diferente número de repeticiones, ésta prueba se

realizó para evaluar el comportamiento de las variables frente a un cambio en la

escala de la fermentación. Para éste análisis se utilizó un grado de confiabilidad

del 95%; las hipótesis planteadas para las variables en ésta etapa de la

investigación se describen así:

Hipótesis nula (Ho). No existe diferencia significativa en las cantidades de proteína,

lactosa y ácido láctico en las dos fermentaciones de 1 L y 5 L.

Hipótesis alterna (Hi). Existe diferencia significativa en las cantidades de

proteína, lactosa y ácido láctico en las fermentaciones de 1 L de 5 L.

Los resultados de cada variable se organizaron según la Tabla 9 para aplicarle

el análisis de varianza de una sola vía.

Como prueba de confirmación para el análisis de varianza de utilizó la prueba de

Barlett que sirve para verificar que existe una distribución normal de los datos

obtenidos.

Tabla 9. Matriz de datos para las variables del diseño experimental ANOVA de una sola vía en las fermentaciones de

1 L y 5 L. Tiempo

(h) Fermentación

1 L Fermentación

5 L 2.1 Variable Variable 0 2.2 2.1 2,5 2.2 2.1 5 2.2 2.1 7,5 2.2 2.1 10, 2.2 2.1 21 2.2 2.1 23,5 2.2 2.1 24 2.2 2.1 26,5 2.2 2.1 29 2.2 2.1 31,5 2.2 2.1 48 2.2 2.1 50,5 2.2

Replicas 16 16 ó 11* * Para ácido láctico el tamaño de la muestra fue 11; para las demás variables fue 16

2.6 PROCEDIMIENTO DE LA PROPUESTA DE ESCALADO Para realizar la propuesta del escalado de la fermentación acidoláctica hasta un

volumen de 10 L, se buscó conservar la relación existente entre la altura y el

diámetro del vaso (h:∅). Mientras que para los componentes internos las

características de trabajo, como velocidad de agitación se tuvo en cuenta el

criterio potencia por unidad de volumen (P/V) manteniéndolo constante a cualquier

volumen.

Se asumió que las propiedades del medio de cultivo como su composición y las

condiciones de fermentación como temperatura, pH y cantidad de oxigeno disuelto

(D.O.) son similares tanto en el biorreactor de 5 L como en el de 10 L propuesto,

del mismo modo se supuso que los biorreactores están equipados con un agitador

y cuatro placas deflectoras para evitar la formación de vórtice.

3. 4.

3 ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS En el presente capítulo se analizan y se discuten los resultados obtenidos durante

todo el proceso de experimentación descrito en el capitulo 2.

3.1 CARACTERÍSTICAS DEL SUERO LÁCTEO EMPLEADO Los resultados de los análisis del suero lácteo entregados por el laboratorio

INTERLABCO LTDA. Aparecen en la Tabla 10.

Tabla 10. Análisis muestra de suero lácteo (m/v) Determinación Resultado Humedad 93,52 % Extracto seco 6,43 % Lactosa* 5,03 % Proteína 0,8 % Ácido Láctico** 0,4 % Sales minerales 0,6 % Grasa 0,05 % Densidad a 20ºC 1,023 g / cm3 * % Azúcares expresado como lactosa. ** % Acidez expresada como ácido láctico.

El suero lácteo empleado tiene como característica un alto contenido de lactosa

(5,03%) respecto al valor descrito en la teoría (4,82%) representados en su

mayoría por lactosa, lo cual favorece el crecimiento del Lactobacillus plantarum

ssp., además, las sales minerales presentes (0,6%) son mayores que las

reportadas en la teoría (0,37), estas pueden ser usadas por el microorganismo en

los diferentes procesos metabólicos, el nivel de proteína en el suero utilizado

(0,8%) también es alto con relación al nivel de proteína reportado en la teoría

(0,13%); la presencia de estos sustratos hacen del suero un componente

adecuado para la elaboración de medios de cultivo, en especial para el desarrollo

y crecimiento del microorganismo y producción del metabolito a estudiar.

3.2 CARACTERÍSTICAS DE LA CEPA SELECCIONADA Al realizar la caracterización del microorganismo Lactobacillus plantarum ssp. se

observó a nivel macroscópico que este se presenta en colonias color blanco

hueso, poco brillantes, redondeadas, de 2,0 mm de diámetro aproximádamente,

separadas; sembradas en medio sólido MRS, como se muestra en la Figura 10,

además reacciona a la tinción de Gram como bacteria Gram +; en cuanto a sus

características microscópicas se observó con lente de aumento 100X bacterias en

forma de bacilos cortos, redondos, agrupados en forma de racimos.

Figura 10. Características del Lactobacillus plantarum ssp

3.3 PRE-EXPERIMENTACIÓN: CURVA DE CRECIMIENTO Los datos obtenidos durante la realización de la cinética de crecimiento del

microorganismo Lactobacillus plantarum ssp. aparecen reportados en la Tabla 11.

Estos resultados indican el tiempo en el cual el microorganismo se adapta al

medio y logra iniciar su fase logarítmica.

Tabla 11. Curva de Crecimiento L. plantarum ssp Muestra Tiempo (h) Absorvancia

1 0 0,012 2 2 0,024 3 4 0,025 4 6 0,095 5 8 0,554 6 24 1,540 7 26 1,447 8 28 1,535 9 30 1,537

10 32 1,534

Los datos obtenidos fueron tratados de la siguiente forma: como primera medida

se realizó la grafica Nº de microorganismos vs Tiempo (Figura 11) para observar el

comportamiento del microorganismo durante la fermentación, además se

determinó cual fue el tiempo durante el cual el microorganismo se mantuvo en la

fase de adaptación, esto para que previamente a la inoculación del medio de

fermentación el microorganismo permanece aproximadamente por el mismo

periodo de tiempo en una pequeña cantidad (10%) del medio, para que logre

adaptarse a éste y al momento de inocular el microorganismo ya se encuentre en

la fase logarítmica de su crecimiento, ahorrando una cantidad considerable de

tiempo en el desarrollo de las fermentaciones. Para el caso del Lactobacillus

plantarum ssp., éste valor es de 6 horas aproximadamente, sin embargo el

microorganismo permaneció en esta fase por un periodo de 10 horas para tener

certeza de que éste ya estaba en la fase logarítmica. Después de esto, se

procedió a determinar la velocidad de crecimiento por intervalos de acuerdo con la

siguiente relación:

0XX

Donde X representa los diferentes valores de las absorvancias que equivalen a la

cantidad de biomasa y Xo la absorvancia inicial.

9.

00E

+08

1.80

E+0

9

1.88

E+0

9

7.13

E+0

9 4.16

E+1

0

1.16

E+1

1

1.09

E+1

1

1.15

E+1

1

1.15

E+1

1

1.15

E+1

1

0.00E+00

2.00E+10

4.00E+10

6.00E+10

8.00E+10

1.00E+11

1.20E+11

1.40E+11

0 5 10 15 20 25 30 35

Tiempo (h)

Mic

roor

agni

smo

(Cél

ulas

/mL)

Figura 11. Curva de crecimiento del Lactobacillus plantarum ssp

Luego, se calculó el logaritmo natural de los resultados obtenidos y con éste valor

se consigue la velocidad media de cada intervalo por medio de la siguiente

ecuación:

( )( )12

12

ttXX

−−

=µ

Donde µ es la velocidad de crecimiento, X es la absorvancia y t el tiempo. En la

Tabla 12 se reportan los resultados obtenidos.

Tabla 12. Velocidad de crecimiento del microorganismo

Células/mL X/Xo Ln X/Xo µ

intervalos 9,00*108 1 0 - 1,80*109 2 0,69 0,69 1,88*109 2,08 0,73 0,49 7,13*109 7,92 2,07 0,23 4,16*1010 46,17 3,83 0,04 1,16*1011 128,33 4,85 0,012 1,09*1011 120,58 4,79 0,008 1,15*1011 127,92 4,85 0,008 1,15*1011 128,08 4,85 0,008 1,15*1011 127,83 4,85 0,008

La representación gráfica de los datos registrados en la Tabla 11 es la que

aparece en la Figura 12.

Linealización fase logarítmica

y = 1,1421x - 2,1319R2 = 0,9406

0,0000

1,0000

2,0000

3,0000

4,0000

5,0000

6,0000

0 2 4 6 8

Tiempo (h)

Ln (X

/Xo)

Figura 12. Linealización de la fase logarítmica

Cuando el valor de la pendiente (m) obtenida en la linealización de la fase

logarítmica es menor de 0,1 se dice que la velocidad de crecimiento del

microorganismo es baja o lenta, cuando m está comprendida entre 0,1 y 0,5 la

velocidad de crecimiento es media, pero cuando m es mayor de 0,5 la velocidad

de crecimiento del microorganismo es alta, y por lo tanto el microorganismo

presenta buenas condiciones de trabajo, como el valor de la pendiente obtenida

en la fase logarítmica del Lactobacillus plantarum ssp. fue 1,1421

(Células/mL/hora), es posible afirmar que el microorganismo presenta condiciones

favorables de adaptación y crecimiento al medio.

3.4 CONDICIONES DE LA FERMENTACIÓN DE 1 L La Figura 13 muestra el comportamiento del pH a lo largo de la fermentación

(Tabla 13). Estas gráficas muestran una gran variación del pH debido a que el éste

era regulado inmediatamente después de tomar la muestra, además, las

variaciones más grandes se presentan justo después de tomar la muestra 21,

pues durante la noche no era posible tomar muestras. Las condiciones de

fermentación se mantuvieron constantes para las fermentaciones realizadas en

volúmenes de 1 L y 5 L; en el caso de la cantidad de oxígeno disuelto (D.O.), éste

se controló a través del cambio de coloración de la solución de azul de metileno

(método cualitativo) en las fermentaciones de 1 L y con el instrumento medidor de

D.O. del biorreactor (método cuantitativo).

Tabla 13. Variación del pH a través del tiempo (h) para fermentación de 1L

Medio 1 Medio 2 Medio 3 Muestra Hora

M 1.1

M 1.2

M 2.1

M 2.2

M 3.1

M 3.2

0 5,50 5,60 5,80 5,80 5,40 5,40 2 ½ 5,30 5,16 5,74 5,75 5,33 5,24 5 5,12 5,70 5,71 5,65 5,10 5,70 21 4,07 4,20 3,96 4,01 3,95 3,84

23 ½ 5,11 5,42 5,93 5,67 6,36 6,86 26 4,79 4,51 4,56 4,43 4,48 4,67

28 ½ 4,65 4,57 4,80 4,62 4,57 4,75 48 3,96 3,84 4,13 4,12 3,97 3,98

3,00

3,50

4,00

4,50

5,00

5,50

6,00

6,50

7,00

7,50

0 10 20 30 40 50 60

M1.1M1.2M2.1M2.2M3.1M3.2

Figura 13. Variación del pH a través del tiempo

Además de controlar el pH, también se controlaron factores como temperatura y

porcentaje de oxígeno disuelto; la temperatura del bioreactor se mantuvo a 35 ºC

por medio de la chaqueta de calentamiento; la temperatura del vaso presentó

variaciones hasta de +/- 0,2 ºC; en el caso del control del oxígeno disuelto, este

inició con un valor de 5,8% y se disminuyó hasta obtener un valor de 0%, para

mantener este valor se utilizó hielo seco que circulaba constantemente.

3.5 CUANTIFICACIÓN DE LAS VARIABLES DEPENDIENTES

Las variables dependientes que fueron analizadas en el presente trabajo

corresponden al contenido de lactosa, proteína y ácido láctico, evaluados con

respecto al tiempo en el cual fueron consumidas por el microorganismo

Lactobacillus platarum ssp. durante el proceso de fermentación.

3.5.1 Comportamiento de las variables dependientes en el medio de cultivo M1. Los contenidos de proteína (medida a una longitud de onda de 540 nm),

lactosa (medido a una longitud de onda de 625 nm) y ácido láctico (medido a una

longitud de onda de 570 nm) son los que aparecen en las tablas 14, 15 y 16;

seguido a éstas, la Figura 14 muestra los promedios de las repeticiones de cada

variable.

Tabla 14. Variación del contenido de proteína vs tiempo para el medio M1 Tiempo

(h) Abs M1.1 mg P /mL Abs M1.2 mg P /mL

0 0,152 11,99 0,137 10,53 2,5 0,195 16,18 0,209 17,54 5 0,159 12,67 0,178 14,52 21 0,158 12,58 0,153 12,09

23,5 0,150 11,80 0,148 11,60 26 0,146 11,41 0,148 11,60

28,5 0,144 11,21 0,148 11,60 48 0,118 8,68 0,131 9,95

Tabla 15. Variación del contenido de lactosa vs tiempo el medio M1 Tiempo

(h) Abs M1.1 % A Abs M1.2 % A

0 0,948 6,525 1,181 8,580 2,5 1,331 9,903 1,580 12,100 5 1,186 8,625 1,205 8,792 21 1,135 8,175 1,006 7,037

23,5 0,671 4,082 0,841 5,582 26 0,579 3,271 0,725 4,559

28,5 0,518 2,733 0,514 2,697 48 0,418 1,851 0,510 2,662

Tabla 16. Variación del contenido de ácido láctico vs tiempo

el medio M1

Tiempo (h)

Abs M1.1 mg Ác/mL Abs M1.2 mg Ác/mL

0 0,111 0,315 0,102 0,290 2,5 0,174 0,490 0,170 0,479 5 0,203 0,571 0,210 0,590 21 0,418 1,168 0,350 0,979

23,5 0,581 1,620 0,539 1,504 26 0,623 1,737 0,649 1,809

28,5 0,816 2,273 0,791 2,203 48 0,921 2,564 0,930 2,589

0,0002,0004,0006,0008,000

10,00012,00014,00016,00018,000

0 10 20 30 40 50 60

Tiempo (h)

Cant

idad

(mg/

mL)

(%)

Proteína mg/mL

Azúcares (%)

Ácido láctico (mg/mL)

Figura 14. Comportamiento de las variables en el medio M1 En la figura anterior se pueden observar picos para el contenido de lactosa y el

nivel de proteína en la segunda hora de fermentación, esto se puede presentar

debido a que el microorganismo inicia una producción de enzimas para el posterior

uso en del medio como sustrato, de igual manera se puede observar que la

cantidad de ácido láctico producido es mayor entre la hora 21 y la hora 28 de la

fermentación, al tiempo que se presenta un acelerado consumo de lactosa por

parte del microorganismo.

3.5.2 Comportamiento de las variables dependientes en el medio M2. Los

análisis realizados para evaluar los contenidos de proteína (medida a una longitud

de onda de 540 nm), lactosa (medido a una longitud de onda de 625 nm) y ácido

láctico (medido a una longitud de onda de 570 nm) se reportan en las tablas 17, 18

y 19; después de las tablas, se muestra la Figura 15 en la cual se relacionan las

tres variables con el tiempo transcurrido durante la fermentación.

Tabla 17. Variación del contenido de proteína vs tiempo para el medio M2 Tiempo

(h) Abs M2.1 mg P /mL Abs M2.2 mg P /mL

0 0,150 11,80 0,149 11,70 2,5 0,202 16,86 0,205 17,15 5 0,176 14,33 0,184 15,11 21 0,167 13,42 0,153 12,09

23,5 0,166 13,35 0,149 11,70 26 0,164 13,10 0,148 11,60

28,5 0,148 11,63 0,148 11,60 48 0,131 9,95 0,130 9,85

Tabla 18. Variación del contenido de lactosa vs tiempo para el medio M2 Tiempo

(h) Abs M2.1 % A Abs M2.2 % A

0 1,042 7,354 0,988 6,878 2,5 1,015 7,116 1,131 8,139 5 0,945 6,499 1,068 7,584

21 0,579 3,271 0,704 4,373 23,5 0,570 3,191 0,640 3,809 26 0,539 2,918 0,556 3,068

28,5 0,380 1,516 0,480 2,398 48 0,367 1,401 0,410 1,780

Tabla 19. Variación del contenido de ácido láctico vs tiempo para el medio M2 Tiempo

(h) Abs M2.1 mg Ác/mL Abs M2.2 mg Ác/mL

0 0,105 0,299 0,104 0,296 2,5 0,161 0,454 0,165 0,465 5 0,252 0,707 0,317 0,887

21 0,610 1,701 0,650 1,812 23,5 0,708 1,973 0,713 1,987 26 0,712 1,984 0,826 2,301

28,5 1,254 3,489 1,221 3,397 48 1,335 3,714 1,319 3,669

0,0002,0004,0006,0008,000

10,00012,00014,00016,00018,000

0 10 20 30 40 50 60

Tiempo (h)

Cant

idad

(mg/

mL)

(%)

Proteína mg/mL

Azúcares (%)

Ácido láctico (mg/mL)

Figura 15. Comportamiento de las variables en el medio M2

La principal característica de la fermentación en este medio es una velocidad de

producción de acido láctico de tendencia constante, llegando a su valor máximo

después de la hora 30 y manteniéndose estable hasta el fin de la fermentación, a

diferencia del medio M1 el pico presentado en la curva de consumo de lactosa en

las segunda hora de fermentación es más bajo, lo cual da a entender que el

microorganismo se adapta con más facilidad al medio para la producción de ácido

láctico.

3.5.3 Comportamiento de las variables dependientes en el medio M3. Al

realizar los análisis para evaluar los contenidos de proteína (medida a una longitud

de onda de 540 nm), lactosa (medido a una longitud de onda de 625 nm) y ácido

láctico (medido a una longitud de onda de 570 nm) se obtuvieron los resultados

que aparecen en las tablas 20, 21 y 22; de igual manera, aparece la Figura 16 que

relaciona las tres variables con el tiempo empleado para la femrnetación.

Tabla 20. Variación del contenido de proteína vs tiempo para las muestras M3.1 y M3.2 Tiempo

(h) Abs M3.1 mg P /mL Abs M3.2 mg P /mL

0 0,155 12,28 0,131 9,95 2,5 0,148 11,60 0,178 14,52 5 0,179 14,62 0,173 14,04 21 0,160 12,77 0,170 13,74

23,5 0,147 11,51 0,143 11,12 26 0,141 10,92 0,128 9,66

28,5 0,125 9,36 0,122 9,07 48 0,112 8,10 0,114 8,29

Tabla 21. Variación del contenido de lactosa vs tiempo para las muestras M3.1 y M3.2 Tiempo

(h) Abs M3.1 % A Abs M3.2 % A

0 0,901 6,111 0,807 5,282 2,5 1,066 7,566 1,036 7,302 5 0,958 6,614 0,856 5,714

21 0,777 5,017 0,772 4,973 23,5 0,581 3,288 0,603 3,482 26 0,540 2,927 0,584 3,315

28,5 0,530 2,839 0,577 3,253 48 0,509 2,653 0,461 2,230

Tabla 22. Variación del contenido de Ácido láctico vs tiempo para las muestras M3.1 y M3.2 Tiempo

(h) Abs M3.1 mg Ác/mL Abs M3.2 mg Ác/mL

0 0,099 0,282 0,105 0,299 2,5 0,115 0,327 0,120 0,340 5 0,126 0,357 0,155 0,438

21 0,244 0,685 0,248 0,696 23,5 0,274 0,768 0,325 0,910 26 0,336 0,940 0,361 1,010

28,5 0,485 1,354 0,517 1,443 48 0,648 1,806 0,713 1,987

0,000

2,000

4,000

6,000

8,000

10,000

12,000

14,000

16,000

0 10 20 30 40 50 60

Tiempo (h)

Can

tidad

(mg/

mL)

(%)

Proteína mg/mL

Azúcares (%)

Ácido láctico (mg/mL)

Figura 16. Comportamiento de las variables en el medio M3

En este medio la producción de ácido láctico fue la más baja, mostrando un

consumo de lactosa similar al de los medios M1 y M2, por lo que es posible

afirmar que el microorganismo empleó una baja cantidad de lactosa en la

producción de ácido láctico. También se puede observar que es en este medio

donde se presenta el mayor consumo de proteína.

Al comparar los valores de consumo de lactosa obtenidos en la experimentación,

contra los reportados por Oh. H et27 al se encontró que la cantidad de azúcares y

la curva que expresa su consumo presentan la misma tendencia, obteniendo

valores finales de aproximadamente 2%.

En cuanto a la producción de ácido láctico se encontró que la cantidad obtenida en

la experimentación 3.69 mg ácido láctico / mL, contra 1.87 mg ácido láctico / mL

• 27 OH H., WEE J., YUN J., HAN S., JUNG S., y RYU H. Lactic acid production from agricultural

resouses as cheap raw materials. En: Bioresourse technology. Estados Unidos. Vol 96, no __ (2005); p 1492 – 1498

que es el valor reportado por Passos et al28 para fermentaciones realizadas con

Lactobacillus plantarum, y 34.8 mg de ácido láctico / mL para fermentaciones

realizadas con Lactobacillus helveticus, valor reportado por Ghaly et al29.

3.6 ANÁLISIS ESTADÍSTICO PARA LA SELECCIÓN DEL MEJOR MEDIO DE

FERMENTACIÓN Los resultados del análisis estadístico realizado a cada una de las variables

arrojaron los siguientes resultados. Cada uno de los análisis corresponde a los

tres medios evaluados a volumen de 1 L.

3.6.1 Proteínas. Para el análisis estadístico de la presencia de proteína en los

tres diferentes medio se plantearon las siguientes hipótesis.

Hipótesis nula (Ho). No existen diferencias significativas en la presencia de

proteína para ninguna de las fermentaciones realizadas.

Hipótesis alterna (Hi). Existe diferencia significativa en cuanto a la

presencia de proteína en al menos una de las fermentaciones realizadas.

El grado de significancia empleado para el análisis de varianza de la presencia de

proteína en los medios experimentales en volumen de 1 L fue de 95%. La Tabla

23 muestra la matriz de datos. 28 PASSOS, V; et al. Kinetics and Modeling of Lactic Acid Production by Lactobacillus plantarum. En: Aplied and environmental microbiology. Estados Unidos. Vol 60, no 7 (Julio 1994); p2627 – 2636 29 GHALY A.E., TANGO M.S.A., and ADAMS M.A. Enhanced lactic acid production from cheese whey with nutrient supplement addition. Agricultural Engineering International: the CIGR Journal of Scientific Research and Development. Manuscript FP 02 009. May, 2003

Tabla 23. Matriz de datos del diseño experimental ANOVA de una sola vía para presencia de proteína

Proteina 1L M1.1 M2.2 M2.1 M2.2 M3.1 M3.2 Tiempo

(h) mg P /mL Mg P /mL mg P /mL mg P /mL mg P /mL mg P /mL0 11,993 10,533 11,798 11,701 12,284 9,949

2,5 16,177 17,539 16,858 17,150 11,603 14,522 5 12,674 14,522 14,328 15,106 14,620 14,036

21 12,576 12,090 13,452 12,090 12,771 13,744 23,5 11,798 11,603 13,355 11,701 11,506 11,117 26 11,409 11,603 13,160 11,603 10,922 9,657

28,5 11,214 11,603 11,603 11,603 9,365 9,073 48 8,684 9,949 9,949 9,852 8,100 8,295

Réplicas 16 16 16 STATISTIX 7.0 ONE-WAY AOV FOR RESPUESTA BY TRATAMIEN SOURCE DF SS MS F ------- ---- --------- --------- ------ BETWEEN 2 17.8851 8.94256 1.89 WITHIN 45 212.823 4.72940 TOTAL 47 230.708 Al comparar el valor de F calculado (1.89) contra el valor F tabulado30 (3.23) con 2

grados de libertar entre tratamientos y 45 grados de libertad para el error, se

acepta la hipótesis nula ya que el F calculado es menor al F tabulado, por lo tanto

el consumo de proteína por Lactobacillus plantarum ssp. fue similar en los tres

medios durante el periodo de fermentación. Éste resultado indica que la

composición del medio no afecta la presencia de proteína en este. CHI-SQ DF BARTLETT'S TEST OF ------ ------ EQUAL VARIANCES 0.01 2 COMPONENT OF VARIANCE FOR BETWEEN GROUPS 0.26332 EFFECTIVE CELL SIZE 16.0

30 DANIEL, Wayne. Bioestadística: Base para el análisis de las ciencias de la salud. México: Uthea, 2000. p 826 - 835

SAMPLE GROUP TRATAMIEN MEAN SIZE STD DEV --------- ---------- ------ ---------- 1 12.248 16 2.2081 2 12.832 16 2.1435 3 11.348 16 2.1721 TOTAL 12.142 48 2.1747

CASES INCLUDED 48 MISSING CASES 0

Al comparar el resultado obtenido en la prueba de Barlett (0.01) con el valor

tabulado en la distribución ji-cuadrada31 (9,21) con 2 grados de libertad y una

significancia de 99% se aprueba nuevamente la hipótesis nula.

3.6.2 Lactosa. Las hipótesis estadísticas planteadas para el análisis de consumo

de lactosa fueron:

Hipótesis nula (Ho). No existen diferencias significativas en el consumo de

lactosa para ninguna de las fermentaciones realizadas.

Hipótesis alterna (Hi). Existe diferencia significativa en cuanto a el consumo

de lactosa en al menos una de las fermentaciones realizadas.

El grado de significancia empleado para el análisis de varianza de la del consumo

e lactosa en los medios experimentales en volumen de 1 L fue de 95%. La Tabla

24 muestra la matriz de datos.

Tabla 24. Matriz de datos del diseño experimental ANOVA de una sola vía para consumo de lactosa

Ázucares 1L M1.1 M2.2 M2.1 M2.2 M3.1 M3.2

Tiempo (h) %A %A %A %A %A %A 0 6,525 8,580 7,354 6,878 6,111 5,282

2,5 9,903 12,100 7,116 8,139 7,566 7,302 5 8,625 8,792 6,499 7,584 6,614 5,714 21 8,175 7,037 3,271 4,373 5,017 4,973

23,5 4,082 5,582 3,191 3,809 3,288 3,482 26 3,271 4,559 2,918 3,068 2,927 3,315

28,5 2,733 2,697 1,516 2,398 2,839 3,253 48 1,851 2,662 1,401 1,780 2,653 2,230

Replicas 16 16 16 31 MONTGOMERY, Douglas. Diseño y análisis de experimentos. México: Limusa. p. 641

STATISTIX 7.0 ONE-WAY AOV FOR RESPUESTA BY TRATAMIEN SOURCE DF SS MS F ------- ---- --------- --------- ------ BETWEEN 2 26.6586 13.3293 2.18 WITHIN 45 274.988 6.11085 TOTAL 47 301.647 De acuerdo a los resultados obtenidos con ANOVA se puede concluir que el

consumo de lactosa por el microorganismo en los tres medios evaluados fue

similar durante el tiempo de fermentación, ya que el valor del F calculado (2.18) es

menor al valor F tabulado32 (3.23). CHI-SQ DF BARTLETT'S TEST OF ------ ------ EQUAL VARIANCES 4.48 2 COMPONENT OF VARIANCE FOR BETWEEN GROUPS 0.45115 EFFECTIVE CELL SIZE 16.0 SAMPLE GROUP TRATAMIEN MEAN SIZE STD DEV --------- ---------- ------ ---------- 1 6.0734 16 3.0887 2 4.4528 16 2.3910 3 4.5354 16 1.7537 TOTAL 5.0205 48 2.4720 CASES INCLUDED 48 MISSING CASES 0

Al comparar el resultado obtenido en la prueba de Barlett (4,48) con el valor

tabulado en la distribución ji-cuadrada33 (9,21) con 2 grados de libertad y una

significancia de 99% se aprueba nuevamente la hipótesis nula.

3.6.3 Ácido láctico. hipótesis estadísticas planteadas para éste análisis fueron:

Hipótesis nula (Ho). No existen diferencias significativas en la producción de

ácido láctico para ninguna de las fermentaciones realizadas. 32 DANIEL, Wayne. Op. Cit. p 826 - 825 33 MONTGOMERY, Douglas. Op. Cit. p. 641

Hipótesis alterna (Hi). Existe diferencia significativa en la producción de

ácido láctico en al menos una de las fermentaciones realizadas.

El grado de significancia empleado para el análisis de varianza producción de

ácido láctico en los medios experimentales en volumen de 1 L fue de 95%.

Tabla 25. Matriz de datos del diseño experimental ANOVA de una sola vía para producción de ácido láctico

Ácido láctico 1 L M1.1 M2.2 M2.1 M2.2 M3.1 M3.2

Tiempo (h) g Ácido g Acido g Ácido g Ácido g Ácido g Ácido 0 0,315 0,290 0,299 0,296 0,282 0,299

2,5 0,490 0,479 0,454 0,465 0,327 0,340 5 0,571 0,590 0,707 0,887 0,357 0,438

21 1,168 0,979 1,701 1,812 0,685 0,696 23,5 1,620 1,504 1,973 1,987 0,768 0,910 26 1,737 1,809 1,984 2,301 0,940 1,010

28,5 2,273 2,203 3,489 3,397 1,354 1,443 48 2,564 2,589 3,714 3,669 1,806 1,987

Replicas 16 16 16 STATISTIX 7.0 ONE-WAY AOV FOR RESPUESTA BY TRATAMIEN SOURCE DF SS MS F ------- ---- --------- --------- ------ BETWEEN 2 7.50283 3.75141 4.49 WITHIN 45 37.6122 0.83583 TOTAL 47 45.1151 Con un nivel de significancia del 95% el F tabulado34 es de 3.23, el cual,

comparado con el F calculado (4.49) es menor, por tanto se rechaza la hipótesis

nula y se puede inferir que la producción de ácido láctico por Lactobacillus

plantarum ssp. fue diferente para alguno de los medios.

CHI-SQ DF BARTLETT'S TEST OF ------ ------ EQUAL VARIANCES 9.30 2 34 DANIEL, Wayne. Op. Cit. p 826 - 825

COMPONENT OF VARIANCE FOR BETWEEN GROUPS 0.18222 EFFECTIVE CELL SIZE 16.0 SAMPLE GROUP TRATAMIEN MEAN SIZE STD DEV --------- ---------- ------ ---------- 1 1.3238 16 0.8199 2 1.8209 16 1.2396 3 0.8526 16 0.5465 TOTAL 1.3325 48 0.9142 CASES INCLUDED 48 MISSING CASES 0

Al comparar el resultado obtenido en la prueba de Barlett (9,30) con el valor

tabulado en la distribución ji-cuadrada35 (9,21) con 2 grados de libertad y una

significancia de 99% se rechaza la hipótesis nula, coincidiendo con .

Como no se encontró diferencias significativas entre tratamientos en el análisis

estadístico para lactosa y proteína, se tomó como parámetro para la selección del

mejor medio la variación de ácido láctico para llevar la fermentación a 5 L. Al

aprobar la hipótesis alterna para este parámetro se observaron los valores medios

entre los tratamientos y se halló que el valor medio de producción de ácido láctico

fue mayor para el medio M2 (1.82 mg/mL) con respecto a los medios M1 (1.32

mg/mL) y M3 (0.85 mg/mL). A partir de estos resultados se decidió que el mejor

medio para la producción de ácido láctico era el medio M2.

3.7 RESULTADOS DE LA FERMENTACIÓN EN 5 L PARA EL MEJOR MEDIO.

Como se mencionó en el numeral 3.6. el medio seleccionado fue el medio M2;

para realizar la fermentación de 5 L se trabajó bajo las mismas condiciones que la

fermentación realizada para el volumen de 1 L. de acuerdo con esto, los

resultados obtenidos para proteína, lactosa y ácido láctico fueron los reportados

en las Tabla 26 y que aparecen en la Figura 15.

35 MONTGOMERY, Douglas. Op. Cit. p. 641

Tabla 26. Variación de las cantidades de Proteína, lactosa y ácido láctico para las fermentaciones de 5 L

M5.2.1 M5.2.2 M5.2.1 M5.2.2 M5.2.1 Tiempo (h) Abs mgP/mL Abs mgP/mL Abs %A Abs %A Abs g Ácido0 0,364 17,58 0,364 17,58 1,054 7,451 1,060 7,503 0,098 0,279

2,5 0,357 17,22 0,352 16,95 1,005 7,019 1,041 7,336 0,154 0,435 5 0,352 16,95 0,352 16,95 1,095 7,812 1,064 7,539 0,221 0,621

7,5 0,350 16,85 0,347 16,69 1,061 7,512 1,061 7,512 0,198 0,557 10 0,337 16,16 0,340 16,32 1,013 7,089 1,002 6,993 0,295 0,826 24 0,345 16,58 0,344 16,53 0,883 5,944 0,879 5,909 0,498 1,390

26,5 0,344 16,53 0,344 16,53 0,634 3,751 0,635 3,760 0,698 1,945 29 0,341 16,37 0,346 16,64 0,429 1,945 0,432 1,972 0,401 2,241

31,5 0,345 16,58 0,325 15,53 0,225 0,148 0,220 0,104 0,465 2,597 48 0,310 14,74 0,322 15,37 0,480 0,024 0,481 0,024 0,668 3,724

50,5 0,302 14,32 0,307 14,58 0,450 0,021 0,480 0,024 0,671 3,741

-2,00000,00002,00004,00006,00008,0000

10,000012,000014,000016,000018,000020,0000

0 10 20 30 40 50 60

Tiempo (h)

Can

tidad

Proteína mg/mL

Azúcares (%)

Ácido láctico (mg/mL)

Figura 17. Comportamiento de las variables en el medio M2 en 5 L

Debido a que no se disponía de la suficiente cantidad de uno de los de los

reactivos (piperidina) para la cuantificación de ácido láctico solo se pudo realizar

una replica de la prueba. Como se puede observar en la grafica la curva de

producción de ácido láctico fue similar que en el mismo medio a volumen de 1 L,

del mismo modo los niveles de ácido mostraron valores equivalentes (3.696

mg/mL para 1 L y 3.741 mg/mL para 5 L).

3.8 ANÁLISIS ESTADÍSTICO PARA EL ESCALADO DE LA FERMENTACIÓN LÁCTICA.

3.8.1 Proteínas. Para éste caso las hipótesis estadísticas son:

Hipótesis nula (Ho). No existen diferencias significativas en la presencia de

proteína para las fermentaciones en ninguno de los dos volúmenes trabajados.

Hipótesis alterna (Hi). Existe diferencia significativa en la presencia de proteína

para las fermentaciones entre los dos volúmenes trabajados.

El grado de significancia empleado para realizar éste análisis de varianza del para

esencia de proteína en el cambio de escala en la fermentación fue del 95%. STATISTIX 7.0 ONE-WAY AOV FOR RESPUESTA BY TRATAMIEN SOURCE DF SS MS F ------- ---- --------- --------- ------ BETWEEN 1 114.333 114.333 47.89 WITHIN 36 85.9388 2.38719 TOTAL 37 200.272 El consumo de proteína en el medio M2 por el microorganismo no fue igual para

los volúmenes de 1 L y 5 L, esto es corroborado al comparar el F calculado (47.89)

ya que su valor es mayor que el F tabulado36 (4.08), lo cual indica que la cantidad

de proteína presente en el medio es afectada por el cambio de volumen de 1 L a

5 L en medio de fermentación M2. CHI-SQ DF BARTLETT'S TEST OF ------ ------ EQUAL VARIANCES 12.51 1

36 DANIEL, Wayne. Op. Cit. p 826 - 825

COMPONENT OF VARIANCE FOR BETWEEN GROUPS 6.04254 EFFECTIVE CELL SIZE 18.5 SAMPLE GROUP TRATAMIEN MEAN SIZE STD DEV --------- ---------- ------ ---------- 1 16.345 22 0.9002 2 12.832 16 2.1435 TOTAL 14.866 38 1.5451

CASES INCLUDED 38 MISSING CASES 0 Al realizar la prueba de Barlett para determinar la homogeneidad de varianzas en

el contenido de proteína se obtuvo un valor calculado de 12,51 que al ser

comparado contra el valor tabulado en la distribución ji-cuadrada37 (6,63) con un

grado de libertad y 99% de significancia se rechaza la hipótesis nula y se dice que

existen diferencias significativas en la presencia de proteína entre las

fermentaciones de 1 L y 5 L.

3.8.2 Lactosa. Para éste caso las hipótesis estadísticas son:

Hipótesis nula (Ho). No existen diferencias significativas en el consumo de

lactosa para las fermentaciones en ninguno de los dos volúmenes trabajados.

Hipótesis alterna (Hi). Existe diferencia significativa en el consumo de lactosa

para las fermentaciones entre los dos volúmenes trabajados.

El grado de significancia empleado para realizar éste análisis de varianza del para

determinar el consumo de lactosa en el cambio de escala en la fermentación fue

del 95%.

STATISTIX 7.0 ONE-WAY AOV FOR RESPUESTA BY TRATAMIEN SOURCE DF SS MS F ------- ---- --------- --------- ------ BETWEEN 1 0.00781 0.00781 0.00 WITHIN 36 305.750 8.49305 37 MONTGOMERY, Douglas. Op. Cit. p. 641

TOTAL 37 305.757 El valor de F tabulado38 (4.08) es un valor mayor al F calculado (0.000) por lo

tanto, se puede decir que el consumo de lactosa se mantuvo constante tanto para

la fermentación en el medio de un litro como para el volumen de 5 L. CHI-SQ DF BARTLETT'S TEST OF ------ ------ EQUAL VARIANCES 1.47 1 COMPONENT OF VARIANCE FOR BETWEEN GROUPS -0.45801 EFFECTIVE CELL SIZE 18.5 SAMPLE GROUP TRATAMIEN MEAN SIZE STD DEV --------- ---------- ------ ---------- 1 4.4269 22 3.2352 2 4.4559 16 2.3938 TOTAL 4.4391 38 2.9143 CASES INCLUDED 38 MISSING CASES 0 Al realizar la prueba de Barlett para determinar la homogeneidad de varianzas en

el consumo de lactosa se obtuvo un valor calculado de 1,47 que al ser comparado

contra el valor tabulado en la distribución ji-cuadrada39 (6,63) con 1 grado de

significancia y 99% de confiabilidad, se aprueba la hipótesis nula y se dice que no

existen diferencias significativas en el consumo de lactosa entre las

fermentaciones de 1 L y 5 L.

3.8.3 Ácido láctico. Para éste caso las hipótesis estadísticas son:

Hipótesis nula (Ho). No existen diferencias significativas en la producción de

ácido láctico para las fermentaciones en ninguno de los dos volúmenes

trabajados.

Hipótesis alterna (Hi). Existe diferencia significativa en la producción de ácido

láctico para las fermentaciones entre los dos volúmenes trabajados. 38 DANIEL, Wayne. Op. Cit. p 826 - 825 39 MONTGOMERY, Douglas. Op. Cit. p. 641

El grado de significancia empleado para realizar éste análisis de varianza del para

la producción de ácido láctico en el cambio de escala en la fermentación fue del

95%.

STATISTIX 7.0 ONE-WAY AOV FOR RESPUESTA BY TRATAMIEN SOURCE DF SS MS F ------- ---- --------- --------- ------ BETWEEN 1 0.15102 0.15102 0.10 WITHIN 25 39.4085 1.57634 TOTAL 26 39.5595 Con una significancia del 95% el F tabulado40 es de 4.08, el cual, comparado con

el F calculado (0.10) es menor, por tanto se rechaza la hipótesis nula y se puede

inferir que la producción de ácido láctico por Lactobacillus plantarum ssp. fue se

mantuvo constante al realizar la fermentación a volumen de 5 L. CHI-SQ DF BARTLETT'S TEST OF ------ ------ EQUAL VARIANCES 0.01 1 COMPONENT OF VARIANCE FOR BETWEEN GROUPS -0.10933 EFFECTIVE CELL SIZE 13.0 SAMPLE GROUP TRATAMIEN MEAN SIZE STD DEV --------- ---------- ------ ---------- 1 1.6687 11 1.2790 2 1.8209 16 1.2396 TOTAL 1.7589 27 1.2555 CASES INCLUDED 27 MISSING CASES 0

Al realizar la prueba de Barlett para determinar la homogeneidad de varianzas en

la producción de ácido láctico se obtuvo un valor calculado de 0.01 que al ser

comparado contra el valor tabulado en la distribución ji-cuadrada41 (6,63) con 1

grado de libertad y una confiabilidad de 99%, se acepta la hipótesis nula y se dice

40 DANIEL, Wayne. Op. Cit. p 826 - 825 41 MONTGOMERY, Douglas. Op. Cit. p. 641

que no existen diferencias significativas en la producción de ácido láctico entre las

fermentaciones de 1 L y 5 L.

De acuerdo con los resultados obtenidos se puede afirmar que al realizar el

escalado de las fermentaciones de 1 L a 5 L manteniendo las condiciones del

medio como agitación, pH y oxígeno disuelto, el microorganismo utiliza el sustrato

de la misma forma y las variables a controlar no presentan cambios

estadísticamente significativos en el consumo de lactosa y producción de ácido

láctico, a partir de lo cual se podría sugerir que al realizar el escalado hasta un

volumen de 10 L bajo las mismas condiciones mencionadas y con los ajustes

necesarios a velocidad de agitación, tamaño y geometría del tanque y potencia

suministrada, el comportamiento del microorganismo en el medio, la cantidad de

sustrato utilizado así como la cantidad de ácido láctico producido no tendrá una

variación que pueda afectar considerablemente el desarrollo de la fermentación.

4. PROPUESTA DE ESCALADO PARA FUTURAS FERMENTACIÓNES LÁCTICAS

En el presente capítulo se describen las condiciones bajo las cuales funcionaría un

biorreactor escalado a un volumen de 10 L. De acuerdo a los resultados de las

fermentaciones reportados en el capítulo 3, se procedió a realizar un análisis de la

fermentación de acuerdo con las características que a continuación se describen.

4.1 CARACTERÍSTICAS DEL BIORREACTOR BIOFLO 110

El biorreactor Bioflo 110 Fermentor and Bioreactor es un avanzado sistema de

bioprocesamiento diseñado para maximizar el rendimiento de fermentaciones y de

cultivos celulares. Ideal para satisfacer las necesidades cambiantes del

laboratorio de investigación, éste versátil Fermentador/Biorreactor es capaz de

producir altos rendimientos de biomasa o secreciones de productos de

virtualmente cualquier línea celular de microorganismos, animales, insectos y

plantas. El sistema tanque-mezclado viene completo con todo lo necesario para

iniciar la fermentación, y es ofrecido con una variedad de opciones dedicadas a

aplicaciones de cultivo celular. En el se pueden trabajar fermentaciones, sistemas

de cultivo de células, obtención de biomasas, DNA recombinarte, utilización de

residuos, enzimas y biocatalizadores, entre otros.

4.2 PARTES DE UN BIORREACTOR A continuación se detallan las partes del biorreactor Bioflo 110 Modular Fermentor

and Bioreactor ubicado en el Laboratorio de Biotecnología de la Universidad De

La Salle sede La Floresta, las cuales se presentan algunos biorreactores en

general.

4.2.1. Cabina de control. Es el soporte del vaso a demás de ser el sistema

receptor y controlador de todos los sensores que miden diferentes variables del

medio estudiado.

4.2.2. Vaso. Es un recipiente de vidrio refractario incoloro en el que se llevan a

cabo los procesos biotecnológicos. Alrededor del vaso se coloca la chaqueta que

posee con una resistencia para el control de la temperatura del proceso. En la

parte superior se encuentra una tapa de acero inoxidable que se acopla

herméticamente al vaso por medio del uso de una empaquetadura, también sirve

de apoyo al motor de agitación; está provista de varios accesorios:

• Sensor de temperatura.

• Agitador.

• Sensor de pH.

• Sensor de oxigeno disuelto (D.O.).

• Tubo de succión para toma de muestras.

• Inoculador.

• Tubo de cosecha.

4.2.3. Sistema de control de temperatura. Es un sistema constituido por una

camisa de acero inoxidable y una termocupla que va conectada a una cabina de

control la que permite observar el valor de la temperatura interna del medio, el

valor de la temperatura tiene variaciones de 0,1 ºC, la termocupla maneja un

rango de temperatura entre 5ºC y 70ºC, si se necesitan temperatura de trabajo

inferior al rango mencionado se pueden obtener por medio de un sistema de

refrigeración opcional y una termocupla adecuada.

4.2.4. Sistema de agitación. Posee un motor DC de imán permanente de altas

fuerzas de rendimiento cuyo rango de velocidad fluctúa entre 50 y 1000 rpm con

incrementos de 1 rpm. Se controla con el PID del microprocesador de la cabina de

control, su finalidad es accionar el eje en el que se encuentran instalados los

rodetes para la agitación.

4.2.5. Sistema controlador de oxigeno disuelto (D.O.). Este sistema es

manejado directamente desde la panel de control, el valor es expresado en

porcentaje (%) de Oxígeno Disuelto.

4.2.6. Sensor controlador de pH. Está compuesto por un electrodo el cual está

formado por dos tubos de vidrio axial. El tubo interno contiene una pasta formada

por mercurio-cloruro de mercurio en solución de cloruro de potasio saturado y está

conectado a la solución exterior. El sensor va conectado a la cabina para leer el

valor de pH en la pantalla de control de pH. 4.2.7. Bombas peristálticas o gravitatorias. En total se cuenta con 4 bombas

que pueden ser utilizadas para introducir al medio sustancias como ácidos, bases,

espuma y/o para recoger del medio muestras de forma continua. Estas bombas

también pueden ser usadas para realizar fermentaciones continuas.

4.2.8. Válvula para toma de muestras con colector. Esta válvula está diseñada

para tomar muestras del vaso de manera aséptica. La válvula está calibrada para

retirar del vaso 20 mL. 4.2.9. Tubo de cosecha. Al igual que el recolector de muestras, este tubo

también puede ser utilizado para retirar muestras del medio, o para retirar medio

en procesos haciendo uso de las bombas peristálticas. 4.2.10. Aro aspersor de gases. A través de este tubo pueden ser

incorporados al vaso diferentes gases (CO2, N2, O2 y Aire) por medio de 4 orificios

que posee en la parte inferior del aro.

4.2.11. Placas deflectoras. Se utiliza durante los procesos con agitación

para evitar que el medio forme vórtice logrando una agitación poco brusca.

En la Tabla 27 aparecen las imágenes de cada uno de los componentes

mencionados anteriormente.

Tabla 27. Componentes del biorreactor

Panel de control

Vaso

Control de temperatura

Sistema de agitación

Control de pH

Control de oxígeno disuelto (D.O.)

Bombas peristálticas

Sistema recolector de muestras

Tubo de cosecha

Aspersor de gases (aire, O2, CO2 y N2)

Placas deflectoras

Fuente: NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC CO., INC. Bioflo 110 modular fermentor and birreactor.

4.3 DIMENSIONES Y CONDICIONES DE OPERACIÓN DEL BIORREACTOR En la Tabla 28 se muestran las dimensiones del biorreactor Bioflo 110 usado para

realizar las fermentaciones de éste trabajo, las cuales se requieren para la

propuesta de escalado.

Tabla 28. Características del biorreactor (cm)

Alto 63 Largo 30,4 Panel de controlAncho 35 Alto 32,4

Vaso Diámetro 18 Tapa Diámetro 29,2

Alto 30 Agitador Diámetro 6

Alto 1,5 Paletas Largo 1,5

Alto 37 Motor Diámetro 8

Medidor de pH Alto 36 Medidor de DO Alto 40

Agua 5 – 10 psig Aire 3 – 10 psig Requerimientos

de uso Electricidad

100/120 V, 50/60 Hz, 10

Amp Fuente: NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC CO., INC. Bioflo 110 modular fermentor and birreactor.

4.4 PROPUESTA PARA FERMENTACIONES DE 10 L Asumiendo que la composición del medio de cultivo permanezca igual, y las

condiciones de fermentación como temperatura, pH, ausencia de oxigeno es decir

0% (D.O), en la fermentación de 10 L, puesto que los biorreactores son

geométricamente similares, equipados con agitador y cuatro placas deflectoras.

Criterios para el cambio de escala en biorreactores:

Potencia por unidad de volumen constante en ambos biorreactores

Velocidad del impulsor igual en ambos biorreactores

Velocidad de la punta del impulsor igual en ambos biorreactores

Número de Reynolds igual en ambos biorreactores

Para este caso, se tomó como criterio base potencia por unidad de volumen

constante en ambos biorreactores.

La relación de los volúmenes de medio en ambos biorreactores es:

3A

3T

P

G DDV:ADEMAS;25

10VV

∝∝==

Donde los subíndices G y P se refieren a los bioreactores de 10 L y 5 L

respectivamente.

4.4.1. Diámetro del impulsor del bioreactor de 10L. El diámetro del impulsor del

biorreactor de 10 L es 1,26 veces mayor que el diámetro correspondiente al

biorreactor de 5 L.

26,1)2(D 31

AG ==

Ya que el diámetro del impulsor en el biorreactor de 5 L es de 6cm, el diámetro

teórico para el impulsor en el biorreactor de 10 L sería de 7,56cm.

4.4.2. Velocidad del impulsor del biorreactor de 10 L. La potencia disipada por

el impulsor a elevados Reynolds es proporcional a:

.)D(AdemásV.)D(n 3A

5A

.3 ∝

2AG

3G

2AP

3P D.nD.n

VP

=∝

884,0n)26,1(n1.1 G23

G =∴=

La velocidad de giro del impulsor del biorreactor de 10 L es 0,88 veces menor que

la velocidad en el biorreactor de 5 L.

4.4.3. Caudal de CO2 en el biorreactor de 10 L. El biorreactor de 10 L requiere

teóricamente un caudal de CO2 1,77 veces mayor que el biorreactor de 5 L.

77,1)26,1.(884,0D.nQ 3AGGAG ==∝

Ya que la inducción del CO2 se realizó en forma manual con el biorreactor de 5L

se recomienda medir la cantidad de CO2 incorporada al biorreactor.

4.4.4. Volumen de aire por volumen de medio por minuto (v.v.m) en el biorreactor de 10 L. El caudal del aire, por unidad de volumen de medio,

suministrado al biorreactor de 10 L es 0,884 veces menor que el correspondiente

en el biorreactor de 5 L.

884,0nV

QG

G

AG =∝

De igual manera, se recomienda tomar la medida del caudal de aire suministrado

al biorreactor.

4.4.5. Velocidad de la punta del impulsor del biorreactor de 10 L. La velocidad

de la punta del impulsor del biorreactor de 10 L 1,14 veces mayor que la

correspondiente al biorreactor de 5 L.

14,1)26,1.(884,0D.n AGG ==

4.4.6. Número de Reynolds en el biorreactor de 10 L. El número de Reynolds

es proporcional a: 2

A )D.(n

4,1)26,1(884,0D.nR 22AGGB ===∝

El número de Reynolds en el biorreactor de 10 L es 1,4 veces mayor que en el

biorreactor de 5 L.

4.4.7. Dimensionamiento del vaso para el biorreactor de 10 L. Para

dimensionar este vaso se mantuvo la relación altura: diámetro, la cual es 1:1.8

LLVLparaLV

hrV

L

T

T

8414812485248

10

2

..*..

==→=

= π

Aplicando la relación 1.8 mencionada anteriormente al biorreactor de 5 L, se

obtiene el volumen total para el biorreactor de 10 L que corresponde a 14.84 L;

una vez obtenido este valor se procede a calcular el diámetro del nuevo vaso:

cmD

DDL

89.21

8.1*2

*84.142

=

⎟⎠⎞

⎜⎝⎛= π

En diámetro obtenido fue de 21.89 cm, por lo tanto ela altura sera:

cmhcmh

29.398.1*89.21

==

Estas dimensiones del tanque son para realizar la fermentación a un volumen de

trabajo de 10 L.

De acuerdo con lo anterior las dimensiones propuestas para llevar la fermentación

para producción de ácido láctico a partir del suero de lácteo por medio de

Lactobacillus plantarum ssp. en un volumen de 10 L efectuada en un vaso se

muestran en la Tabla 29 que aparece a continuación.

Tabla 29. Dimensiones del biorreactor de 10 L Alto 39.29

Vaso Diámetro 21.89 Tapa Diámetro 35.51

Alto 36.37 Agitador Diámetro 7.56

Alto 1.38 Paletas Largo 1,38

Velocidad de agitación 44.2 rpm

4.5 ESTIMACIÓN DE COSTOS DE LA FERMENTACIÓN LÁCTICA ESTUDIADA

Para la estimación de costos se tuvo en cuenta que el tiempo empleado para las

fermentaciones de 1 L fue de 2 meses, mientras que para la fermentación llevada

a cabo en el biorreactor de 5 L el tiempo empleado fue de 1 mes; el mismo tiempo

fue supuesto para la propuesta de escalado a 10 L; para la estimación de el valor

por uso de equipos de laboratorio se tuvo en cuenta los siguientes aspectos: se

estimo que estos tuviesen una vida útil de 10 años, que su valor residual es decir

el valor del equipo al final de su vida útil fuese el 30% del valor inicial del equipo, y

de esta forma se calculo el valor por el uso de cada uno de estos a lo largo de

cada fermentación. Algunos de los materiales solo se incluyen en las

fermentaciones de 1 L, ya que estos fueron adquiridos al inicio de la

experimentación y no hubo necesidad de adquirirlos posteriormente.

4.5.1. Costos de la fermentación de 1 L. A continuación se presenta en las

tablas 30, 31, 32, 33, 34 y 35, los costos de materiales, reactivos, equipos,

servicios industriales y personal para las fermentaciones de 1 L.

Tabla 30. Materiales para fermentación de 1 L

Materiales Cant V. Unitario V. Total

Algodón 1 2.500 2.500Caja de papel filtro 1 80.000 80.000Cinta de enmascarar 1 1.500 1.500Gasa 1 4.000 4.000Jeringas 3 1.500 4.500Marcador 1 1.000 1.000Papel aluminio 1 5.000 5.000Toallas absorbentes 1 4.500 4.500Venoclisis 18 1.200 21.600Total materiales 124.600

Tabla 31. Reactivos para fermentación de 1 L

Reactivos Cant Precio/kg V. totalAcetato de sodio (g) 10 15.000 150Carbonato de sodio (g) 1000 17.000 17.000Citrato de amonio (g) 4 70.000 280Extracto de levadura (g) 70 3.350.000 234.500Fosfato ácido de potasio (g) 4 167.000 668Pectona (g) 40 120.000 4.800Suero de leche (L) 25 25 625Sulfato de magnesio (g) 0,6 35.000 21Tween 80 mL 4 2.500.000 10.000Hidróxido de sodio (g) 80 12.000 960Sulfato de cobre (g) 1 140.000 140Tartrato de potasio 2 120.000 240Ácido sulfurico (mL) 500 96.000 48.000Antrona (mL) 200 750.000 150.000Lactato de sodio (g) 10 8.500 85Sulfato de cerio (g) 16 9.000.000 144.000Piperidina (mL) 100 3.200.000 320.000Nitroprusiato de sodio (g) 10 2.600.000 26.000Total reactivos 957.469

Tabla 32 Servicios industriales para fermentación de 1 L

Servicios Industriales Valor totalAgua 35.000Energía eléctrica 75.000Gas 10.000

Total servicios industriales 120.000

Tabla 33. Costo de personal para fermentación de 1 L

Personal cantidad v.unitario v.totalOperarios (por 2 meses) 2 816.000 1.632.000

Tabla 34. Costo por el uso de materiales y equipos durante la fermentación de 1 L

Descripción Cant V. unitario V. total Valor

residual 30% Valor uso de materiales

agitador de vidrio 1 4500 4.500 1.350 45Agitador orbital 1 1.200.000 1.200.000 360.000 11.880Agitador magnético 1 200.000 200.000 60.000 1.980Autoclave 1 350.000 350.000 105.000 3.465Balanza Analítica 1 9.000.000 9.000.000 2.700.000 89.100Balón aforado 1L 1 35.000 35.000 10.500 347Balón aforado de 500 mL 2 40.000 80.000 24.000 792Balón aforado de 100 mL 10 60.000 600.000 180.000 5.940Baño de maría 1 500.000 500.000 150.000 4.950Bateria para reflujo 1 350.000 350.000 105.000 3.465Cajas de petri 28 6.000 168.000 50.400 1.663Celdas para espectrofotómetro 10 109.000 1.090.000 327.000 10.791

Computador 1 2.500.000 2.500.000 750.000 24.750Embudo 6 15.000 90.000 27.000 891Embudo de Decantación 1 45.000 45.000 13.500 446Erlemeyer 6 20.000 120.000 36.000 1.188Espectrofotómetro 1 3.500.000 3.500.000 1.050.000 34.650Frascos (1 L) 6 1.500 9.000 2.700 89Frascos de muestreo 48 800 38.400 11.520 380Frasco lavador 1 5.000 5.000 1.500 50Gradilla 1 15.000 15.000 4.500 149Incubadora 1 1.700.000 1.700.000 510.000 16.830Matras con tabuladora lateral 1 50.000 50.000 15.000 495

Mechero 1 40.000 40.000 12.000 396Micropipetas 2 700.000 1.400.000 420.000 13.860Pipeta de 10 mL 10 15.000 150.000 45.000 1.485Pipeta de 5 mL 10 20.000 200.000 60.000 1.980Pipeta de 25 mL 2 13.000 26.000 7.800 257Potenciómetro 1 280.000 280.000 84.000 2.772Probeta 1000 mL 1 20.000 20.000 6.000 198Refrigerador 1 800.000 800.000 240.000 7.920Termómetro 1 40.000 40.000 12.000 396Tripode 1 45.000 45.000 13.500 446Tubos de ensayo 30 1.200 36.000 10.800 356Vortex 1 250.000 250.000 75.000 2.475total materiales laboratorio 246.875

Tabla 35. Resumen de costos de la fermentación de 1 L Costos de materiales 124.600 Costos de reactivos 957.469 Costos de materiales de laboratorio 246.875 Costos de Servicios industriales 120.000 Costos de Personal 1.632.000 Total primera fermentación 3.080.944

4.5.2. Costos para la fermentación de 5 L. A continuación se presentan las

tablas 36, 37, 38, 39, 40 y 41 de costos de materiales, reactivos, equipos de

laboratorio, personal, para la fermentación de 5 L.

Tabla 36. Reactivos para fermentación de 5 L

Reactivos Cant Precio/kg V. totalAcetato de sodio (g) 5 15.000 75Carbonato de sodio (g) 2000 17.000 34.000Citrato de amonio (g) 4 70.000 280Extracto de levadura (g) 20 3.350.000 67.000Fosfato ácido de potasio (g) 4 167.000 668Pectona (g) 20 120.000 2.400Suero de leche (L) 5 25 125Sulfato de magnesio (g) 0,4 35.000 14Tween 80 mL 0 2.500.000 0Hidróxido de sodio (g) 60 12.000 720Sulfato de cobre (g) 1 140.000 140Tartrato de potasio 2 120.000 240Ácido sulfurico (mL) 500 96.000 48.000Antrona (mL) 100 750.000 75.000Lactato de sodio (g) 5 8.500 43Sulfato de cerio (g) 8 9.000.000 72.000Piperidina (mL) 50 3.200.000 160.000Nitroprusiato de sodio (g) 5 2.600.000 13.000 total reactivos 473.705

Tabla 37. Costo por uso de materiales y equipos de laboratorio para la fermentación de 5 L

Descripción Cant V. unitario V. total Valor residual 30%

Costo por uso de

materiales

Agitador de vidrio 1 4500 4.500 1.350 45Agitador orbital 1 1.200.000 1.200.000 360.000 12.000Agitador magnético 1 200.000 200.000 60.000 2.000Autoclave 1 350.000 350.000 105.000 3.500Balanza Analítica 1 9.000.000 9.000.000 2.700.000 90.000Balón aforado 1L 1 35.000 35.000 10.500 350Balón aforado de 500 mL 2 40.000 80.000 24.000 800Balón aforado de 100 mL 10 60.000 600.000 180.000 6.000Baño de maría 1 500.000 500.000 150.000 5.000Bateria para reflujo 1 350.000 350.000 105.000 3.500Biorreacotor bioflo 110 1 45.000.000 45.000.000 13.500.000 450.000Celdas para espectrofotómetro

10 109.000 1.090.000 327.000 10.900

Computador 1 2.500.000 2.500.000 750.000 25.000Embudo 6 15.000 90.000 27.000 900Embudo de Decantación 1 45.000 45.000 13.500 450Erlemeyer 6 20.000 120.000 36.000 1.200Espectrofotómetro 1 3.500.000 3.500.000 1.050.000 35.000Frascos de muestreo 24 800 19.200 5.760 192Frasco lavador 1 5.000 5.000 1.500 50Gradilla 1 15.000 15.000 4.500 150Incubadora 1 1.700.000 1.700.000 510.000 17.000Matras con tabuladora lateral

1 50.000 50.000 15.000 500

Mechero 1 40.000 40.000 12.000 400Micropipetas 2 700.000 1.400.000 420.000 14.000Pipeta de 10 mL 10 15.000 150.000 45.000 1.500Pipeta de 5 mL 10 20.000 200.000 60.000 2.000Pipeta de 25 mL 2 13.000 26.000 7.800 260Potenciómetro 1 280.000 280.000 84.000 2.800Probeta 1000 mL 1 20.000 20.000 6.000 200Refrigerador 1 800.000 800.000 240.000 8.000Tripode 1 45.000 45.000 13.500 450Tubos de ensayo 20 1.200 24.000 7.200 240Vortex 1 250.000 250.000 75.000 2.500Total uso de materiales y equipo de laboratorio 696.887

Tabla 38. Materiales para fermentación de 5 L

Materiales Cantidad V. Unitario V. Total Jeringas 3 1.500 4.500Marcador 1 1.000 1.000Papel aluminio 1 5.000 5.000Toallas absorbentes 1 4.500 4.500

total materiales 15.000

Tabla 39. Servicios industriales para fermentación de 5 L

Servicios Industriales v.totalAgua 15.000Energía eléctrica 35.000Gas 10.000

Total servicios industriales 60.000

Tabla 40. Mano de obra para fermentación de 5 L Personal cantidad v.unitario v.totalOperarios (por 1 mes) 2 816.000 1.632.000

Tabla 41. Resumen de costos para fermentación de 5 L Costos de materiales 15.000 Costos de reactivos 473.705 Costos de materiales de laboratorio 696.887 Costos de Servicios industriales 60.000 Costos de Personal 1.632.000 Total segunda fermentación 2.877.592

4.5.3. Costos para la propuesta de fermentación de 10 L. De acuerdo con los

costos obtenidos para las fermentaciones de 1 L y 5 L se propone una

aproximación de los costos que generaría la fermentación en un biorreactor con

una capacidad de 10 L de medio. Los costos de materiales reactivos equipos

servicios industriales y personal aparecen en las tablas 42, 43, 44, 45 46 y 47.

Tabla 42. Estimación de costos por uso de materiales y equipos de laboratorio para la fermentación de 10 L

MATERIALES DE LABORATORIO

Descripción Cant V. unitario V. total Valor

residual 30%

Costo por uso de

materiales

agitador de vidrio 1 4500 4.500 1.350 45 Agitador orbital 1 1.200.000 1.200.000 360.000 12.000 Agitador magnético 1 200.000 200.000 60.000 2.000 Autoclave 1 350.000 350.000 105.000 3.500 Balanza Analítica 1 9.000.000 9.000.000 2.700.000 90.000 Balón aforado 1L 1 35.000 35.000 10.500 350 Balón aforado de 500 mL 2 40.000 80.000 24.000 800 Balón aforado de 100 mL 10 60.000 600.000 180.000 6.000 Baño de maría 1 500.000 500.000 150.000 5.000 Bateria para reflujo 1 350.000 350.000 105.000 3.500 Biorreacotor 10 L 1 48.000.000 48.000.000 14.400.000 480.000 Celdas para espectrofotómetro

10 109.000 1.090.000 327.000 10.900

Computador 1 2.500.000 2.500.000 750.000 25.000 Embudo 6 15.000 90.000 27.000 900 Embudo de Decantación 1 45.000 45.000 13.500 450 Erlemeyer 6 20.000 120.000 36.000 1.200 Espectrofotómetro 1 3.500.000 3.500.000 1.050.000 35.000 Frascos de muestreo 24 800 19.200 5.760 192 Frasco lavador 1 5.000 5.000 1.500 50 Gradilla 1 15.000 15.000 4.500 150 Incubadora 1 1.700.000 1.700.000 510.000 17.000 Matras con tabuladora lateral

1 50.000 50.000 15.000 500

Mechero 1 40.000 40.000 12.000 400 Micropipetas 2 700.000 1.400.000 420.000 14.000 Pipeta de 10 mL 10 15.000 150.000 45.000 1.500 Pipeta de 5 mL 10 20.000 200.000 60.000 2.000 Pipeta de 25 mL 2 13.000 26.000 7.800 260 Potenciómetro 1 280.000 280.000 84.000 2.800 Probeta 1000 mL 1 20.000 20.000 6.000 200 Refrigerador 1 800.000 800.000 240.000 8.000 Tripode 1 45.000 45.000 13.500 450 Tubos de ensayo 20 1.200 24.000 7.200 240 Vortex 1 250.000 250.000 75.000 2.500 Total uso materiales y equipos de laboratorio 726.887

Tabla 43. Materiales para fermentación de 10 L

Materiales Cantidad V. Unitario V. Total

Jeringas 3 1.500 4.500

Total materiales 4.500

Tabla 44. Reactivos para fermentación de 10 L

Reactivos Cantidad Precio/Kg V. totalAcetato de sodio (g) 10 15.000 150Carbonato de sodio (g) 4000 17.000 68.000Citrato de amonio (g) 8 70.000 560Extracto de levadura (g) 40 3.350.000 134.000Fosfato ácido de potasio (g) 8 167.000 1.336Pectona (g) 40 120.000 4.800Suero de leche (L) 10 25 250Sulfato de magnesio (g) 0,8 35.000 28Tween 80 mL 0 2.500.000 0Hidróxido de sodio (g) 120 12.000 1.440Sulfato de cobre (g) 2 140.000 280Tartrato de potasio 4 120.000 480Ácido sulfurico (mL) 500 96.000 48.000Antrona (mL) 100 750.000 75.000Lactato de sodio (g) 5 8.500 43Sulfato de cerio (g) 8 9.000.000 72.000Piperidina (mL) 50 3.200.000 160.000Nitroprusiato de sodio (g) 5 2.600.000 13.000 total reactivos 579.367

Tabla 45. Servicios industriales para la fermentación de 10 L

Servicios Industriales v.totalAgua 15.000Energía eléctrica 35.000Gas 10.000

Total servicios industriales 60.000

Tabla 46. Costo de personal para la fermentación de 10 L

Personal cantidad v.unitario v.totalOperarios (por 1 meses) 2 816.000 1.632.000

Tabla 47. Resumen de costos para la fermentación de 10 L Costos de materiales 4.500 Costos de reactivos 579.367 Costos de materiales de laboratorio 726.887 Costos de Servicios industriales 60.000 Costos de Personal 1.632.000 Valor total estimado para la fermentación 10 L 3.002.754

De acuerdo con la estimación de costos para las fermentaciones las

fermentaciones efectuadas en los fermentadores de un 1 L presentan un valor

más alto ($ 3.080.944) que la fermentación efectuada en el biorreactor de 5 L ($

2.877.592), esta diferencia se debe principalmente a que las fermentaciones de 1

L se trabajó con tres medios de cultivo distintos y cada medio se analizó por

duplicado; por lo que el número de pruebas analíticas fue mayor afectando el

costo de la fermentación; otro factor que incide en los costos de manera

significativa es la mano de obre utilizada y el tiempo empleado en las

fermentaciones, pues para la fermentación en volumen de 1 L se gastaron dos

meses y para la fermentación de 5 L solo un mes.

CONCLUSIONES

Al realizar la evaluación de la producción de ácido láctico en tres diferentes

medios de cultivo a volumen de 1 L se logró establecer que al inducir al

microorganismo Lactobacillos plantarum ssp. a procesos de fermentación bajo

condiciones controladas de Temperatura, pH y agitación, se encontró que la

máxima velocidad de producción de ácido láctico se sitúa entre la hora 21 y la

hora 32 de la fermentación, logrando alcanzar niveles de producción de ácido

láctico de 1.987 mg/mL en el medio M3, 2.589 mg/mL en el caso del medio M1

y consiguiendo un máximo nivel del producción de 3.714 mg/mL en el medio

M2.

Se demostró estadísticamente que el medio M2 era el medio que presentaba

las condiciones mas favorables para el desarrollo del microorganismo, ya que

fue en este medio en el cual se encontraron los valores medios de producción

de ácido láctico más altos, por lo cual se decidió tomar este medio para realizar

el escalado del proceso hasta volumen de 5 L.

A través del proceso de experimentación se encontraron resultados que

indicaron que al realizar el cambio de escala de 1 L a 5 L no se apreciaban

cambios significativos a nivel estadístico en las variables cuantificadas, por lo

que se plantea la posibilidad de efectuar un escalado a volumen de 10 L con el

fin de observar posibles cambios en el proceso de fermentación, en la cual se

emplearía un vaso de similar geometría, que mantiene la relación potencia por

unidad de volumen constante en ambos biorreactores.

Se encontró que los costos estimados para las fermentaciones de 1 L y 5 L

fueron $3.080.994 y $2.877.592 respectivamente y el valor obtenido para la

propuesta de escaldo de la fermentación en un equipo con un volumen de 10 L

fue $3.002.754.

RECOMENDACIONES

Es necesario buscar microorganismos que sean capaces de entregar mayores

rendimientos en la producción de ácido láctico, así mismo es necesario buscar

técnicas más asequibles en cuanto a disponibilidad de reactivos y costos.

Para futuros trabajos relacionados con el área de las fermentaciones lácticas

en medios elaborados a partir del suero lácteo se recomienda buscar

materiales económicamente disponibles para reducir los costos y de esta forma

encaminarlo hacia la creación de empresa.

Es importante continuar con este tipo de proyectos porque existe una gran

variedad de subproductos de las industrias que no son adecuadamente

utilizados o se desechan completamente y pueden representar una nueva

fuente de ingresos para las industrias, además de generar nuevas alternativas

de mejoramiento ambiental.

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1-7

ANEXO 1. CURVA PATRÓN PARA CUANTIFICACIÓN DE

PROTEÍNA

tubo Abs mg ovoalb2 0,065 0,0306 3 0,146 0,0616 4 0,202 0,0919 5 0,276 0,1225 6 0,327 0,1532 7 0,386 0,1838 8 0,429 0,2145 9 0,482 0,2451 10 0,591 0,3064

Absorvancia vs mg ovoalbúmina

y = 1,8694x + 0,0299R2 = 0,9946

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 0,1 0,2 0,3 0,4

mg de ovoalbúmina

Abs

orva

ncia

ANEXO 2. CURVA PATRÓN PARA CUANTIFICACIÓN DE

LACTOSA

Tubo Absorbancia Concentración 2,000 0,332 0,005 3,000 0,612 0,010 4,000 0,860 0,015 5,000 1,032 0,020 6,000 1,285 0,025 7,000 1,500 0,030 8,000 1,831 0,040 9,000 2,170 0,050

Curva Calibración Antronay = 0,2516x + 0,0706

R20,9923 =

0,0000,5001,0001,5002,0002,500

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

0,030

0,040

0,050

mg/mL de Azúcares

Abs

orva

ncia

ANEXO 3. CURVA PATRÓN PARA CUANTIFICACIÓN DE

ÁCIDO LÁCTICO

Tubo Concentración Absorvancia 1 100 0,098 2 200 0,190 3 300 0,266 4 400 0,349 5 500 0,438 6 600 0,509 7 800 0,743

Acido láctico vs Absorvancia

y = 1110,6x + 2,8924R2 = 0,9933

0

100200

300

400500

600

700800

900

0,000 0,200 0,400 0,600 0,800

Absorbancia

Mic

rogr

amos

de

ácid

o lá

ctic

o

ANEXO 4. FERMENTACIÓN DE 5 L EN EL BIOFLO 110