Estudios in vivo de la internalización de la hormona ...

VICENTE RUIZ VIROGA 1

Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas (PEDECIBA)- Biología

Sub-área Neurociencias

Tesis de Maestría en Ciencias Biológicas

Estudios in vivo de la internalización de la

hormona concentradora de melanina (MCH) y su

receptor MCHR1 en el Sistema Nervioso Central de

rata

Lic. Vicente Ruiz Viroga

Directora de Tesis: Dra. Patricia Lagos

Departamento de Fisiología, Facultad de Medicina, Universidad de la República

Tribunal evaluador:

Dra. Ana Silva

Dra. Silvia Olivera

Dra. Alejandra Kun

Junio 2017. Montevideo, Uruguay


ÍNDICE

Contenido 1- INTRODUCCIÓN .................................................................................................................... 7

1.1- Neuropéptidos .............................................................................................................. 7

1.1.1- Comparación entre neuropéptidos y neurotransmisores clásicos ......................... 7

1.1.2- Receptores ............................................................................................................. 9

1.1.3- Inactivación ......................................................................................................... 10

1.1.4- Efectos celulares .................................................................................................. 10

1.1.5- Métodos de estudio de la internalización de neuropéptidos .............................. 11

1.2- Hormona Concentradora de Melanina ...................................................................... 13

1.2.1- Estructura .................................................................................................................. 13

1.2.2- Síntesis y anatomía de núcleos MCHérgicos en el SNC ............................................. 14

1.2.3- Receptores ................................................................................................................. 16

1.2.4- Núcleos inervados por fibras MCHérgicas ................................................................ 20

2- ANTECEDENTES PARTICULARES ......................................................................................... 24

2.1- Efectos funcionales de la MCH en el NDR ...................................................................... 24

2.1.1. Modulación del ciclo sueño-vigilia ............................................................................ 24

2.1.2. Efectos pro-depresivos .............................................................................................. 25

2.2- Estudios in vitro ............................................................................................................... 26

3- HIPOTESIS ............................................................................................................................ 29

4- OBJETIVO GENERAL ............................................................................................................ 30

5- OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................................................................... 30

6- METODOLOGÍA ................................................................................................................... 31

6.1- Animales y grupos experimentales ................................................................................. 31

6.1.1- Animales .................................................................................................................... 31

6.1.2- Grupos experimentales ............................................................................................. 31

6.2- Drogas y vías de administración ..................................................................................... 32

6.3- Experimentos “in vivo” ................................................................................................... 32

6.3.1- Microinyección local intra-NDR ................................................................................. 33

6.3.2- Microinyecciones intracerebroventriculares ............................................................. 34

6.3.3- Pre-tratamiento i.c.v. de un antagonista de MCHR1 y de un inhibidor de la

endocitosis mediada por clatrina + MCH-ROD en T20 ........................................................ 35

6.4- Procesamiento de los tejidos .......................................................................................... 37


6.4.1- Procesamiento y obtención de cortes coronales ....................................................... 37

6.4.2- Cuantificación de marcas MCH-ROD (+) ................................................................... 38

6.5- Ensayos de inmunofluorescencia.................................................................................... 41

6.5.1- Protocolo general ...................................................................................................... 41

6.6- Análisis de datos .............................................................................................................. 42

7- RESULTADOS ....................................................................................................................... 43

7.1- Microinyección de MCH-ROD ......................................................................................... 43

7.1.1- Microinyección intra-NDR de MCH-ROD ................................................................... 43

7.1.2- Ensayos de inmunofluorescencia .............................................................................. 44

7.2- Microinyección de MCH-ROD i.c.v. ................................................................................. 45

7.2.1- Cuantificación de marcas MCH-ROD (+) a T20.......................................................... 51

7.3- Ensayos de inmunofluorescencia.................................................................................... 52

7.3.1- Detección de GFAP .................................................................................................... 52

7.3.2- Detección de NeuN .................................................................................................... 53

7.3.3- Detección de MCH ..................................................................................................... 55

7.3.4- Detección de 5-HT ..................................................................................................... 56

7.3.5- Detección de GAD67 .................................................................................................. 58

7.3.6- Detección de la enzima tirosina hidroxilasa (TH) ...................................................... 60

7.4- Microinyección de ATC o PAO y MCH-ROD a T20 .......................................................... 62

7.4.1- Microinyección de un antagonista de los MCHR1, el ATC-175 ................................. 62

7.4.2- Microinyección de un inhibidor de la endocitosis mediada por clatrina, el óxido de

fenilarsina (PAO) ................................................................................................................. 66

8- DISCUSIÓN .......................................................................................................................... 71

8.1- Microinyección local intra-NDR ...................................................................................... 71

8.2- Microinyección i.c.v. de MCH-ROD ................................................................................. 73

8.3- Transporte de MCH-ROD a través del LCR ...................................................................... 78

8.4- Comparación entre la microinyección de MCH-ROD intra-NDR y la i.c.v...................... 80

8.5- Identificación de fenotipos neuroquímicos MCH-ROD (+) ............................................. 81

8.5.1- Las neuronas GABAergicas en todos los núcleos estudiados son capaces de

internalizar la MCH-ROD ..................................................................................................... 83

8.5.2- Las neuronas serotoninérgicas en el Núcleo Dorsal del Rafe son capaces de

internalizar la MCH-ROD ..................................................................................................... 85

8.5.3- Las señales MCH-ROD colocalizaron con neuronas TH (+) del Núcleo Dorsal del Rafe

............................................................................................................................................. 87

8.6- Evidencias de la dependencia de MCHR1 y de clatrina para la internalización de MCH-

ROD ......................................................................................................................................... 88

8.6.1- La internalización de MCH-ROD es dependiente del receptor MCHR1 ..................... 88


8.6.2- La internalización de MCHR1 exhibe un proceso típico de receptor GPCR ............... 90

9- CONCLUSIONES GENERALES ............................................................................................... 92

10- PERSPECTIVAS ................................................................................................................. 93

11- CONTRIBUCIONES ........................................................................................................... 94

12- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................................... 95

13- ABREVIATURAS ............................................................................................................. 104


RESUMEN

La hormona concentradora de melanina (MCH) es un neuropéptido hipotalámico que cumple

diversas funciones, entre las que se encuentran el aumento de la ingesta y la modulación del

ciclo sueño-vigilia. Las neuronas MCHérgicas inervan diversas regiones del sistema nervioso

central (SNC). Los mecanismos celulares desencadenados al activar el único receptor funcional

en roedores, el MCHR1, y el proceso de la internalización del receptor junto al ligando, se han

estudiado en modelos in vitro no neuronales en los cuales se sobre-expresó dicho receptor.

Escasos estudios han analizado dicho proceso en modelos in vivo que endógenamente expresan

dicho receptor.

En la presente Tesis de Maestría se realizó el estudio del curso temporal de la internalización in

vivo del conjugado MCH-rodamina (MCH-ROD) en células MCH-receptivas presentes en el SNC

de rata luego de su administración intracerebroventricular (i.c.v.) y se comparó con la

administración local en el núcleo dorsal del rafe (NDR) ; se determinó qué tipo celular es capaz

de internalizarlo y se identificó su fenotipo neuroquímico; y por último, se determinó que dicho

proceso es antagonizado por un antagonista de los MCHR1 y es dependiente de un mecanismo

de endocitosis mediado por clatrina.

Las señales MCH-ROD (+) se cuantificaron en cortes coronales de cerebro de rata a 10, 20 y 60

minutos post-microinyección (T10, T20 y T60). Se identificaron los fenotipos neuroquímicos

capaces de internalizar el conjugado por inmunofluorescencia. Un grupo de ratas a T20 fue pre-

tratado con ATC-0175 (antagonista del MCHR1) y otro grupo con óxido de fenilarsina (PAO), un

inhibidor de la endocitosis mediada por clatrina, previo a la administración de MCH-ROD.

Se obtuvieron mejores resultados con la administración i.c.v. Se detectó una mayor densidad de

marcas MCH-ROD (+) en el núcleo septolateral, núcleo accumbens, hipocampo y núcleo dorsal

del rafe (NDR) en los tres tiempos empleados. El pre-tratamiento con ATC-0175 y PAO redujo la

internalización del conjugado en células presentes en todas estas estructuras. Los elementos

celulares capaces de internalizar dicho conjugado eran neuronas y se pudo determinar que en

su gran mayoría eran GABAérgicas y en el NDR también algunas serotoninérgicas y

catecolaminérgicas (tirosina hidroxilasa (+).

Con este abordaje experimental se demostró que la internalización de MCH-ROD in vivo se

produjo en neuronas presentes en núcleos del SNC de rata descritos como densamente

inervados por fibras MCHérgicas. Nuestros resultados sugieren que endógenamente este

proceso depende de la interacción de la MCH con su receptor, y que es dependiente de clatrina.


En el presente trabajo de Tesis se obtuvieron resultados originales, siendo uno de los primeros

estudios que demuestran la interacción entre la MCH y su receptor MCHR1 en un sistema

endógeno de expresión del MCHR1 in vivo en el SNC de la rata, utilizando una herramienta

novedosa que permite evidenciar la presencia de células MCH-receptivas.

Presentación de la Tesis

El presente trabajo de Tesis se realizó en el Laboratorio de Neurotransmisión Peptídica

del Departamento de Fisiología de la Facultad de Medicina, UdelaR, en el marco del

proyecto “Estudios in vivo e in vitro de internalización de la hormona concentradora de

melanina (MCH) a través de sus receptores en el núcleo dorsal del rafe: modulación sobre el

sistema serotoninérgico y su relación con la depresión” financiado por la Comisión Sectorial de

Investigación Científica (CSIC; n° de proyecto ID 218) y por una beca de posgrado financiada por

la Agencia Nacional de Investigación e Innovación (ANII, POS_NAC_2013_1_11751).


1- INTRODUCCIÓN

1.1- Neuropéptidos

David De Wied (1987) definió a los neuropéptidos o péptidos neurogénicos como

pequeñas sustancias endógenas presentes en las neuronas, las cuales se encuentran

vinculadas a funciones del sistema nervioso (de Wied 1987; Burbach 2010). Dicho

concepto surgió de los estudios de De Wied sobre la hormona adrenocorticotrópica

(ACTH), vasopresina y la hormona estimulante de melanocitos (MSH), en los cuales

descubrió que dichos péptidos se encontraban presentes en el tejido nervioso y

producían efectos fisiológicos en éste (de Wied 1987). En su trabajo, De Wied afirma

que, además de sus funciones como hormonas, estos péptidos actúan como

neuromoduladores de las funciones nerviosas. Estas funciones incluyen la motivación,

atención, comportamiento social, agresión, comportamiento sexual, el dolor, la

alimentación, el estado de ánimo, el aprendizaje y memoria, desarrollo de adicciones y

comportamiento maternal y control de la temperatura (de Wied 1987).

1.1.1- Comparación entre neuropéptidos y neurotransmisores clásicos

A continuación se muestra una tabla comparativa describiendo generalidades de

neuropéptidos y diferencias de éstos con los neurontransmisores clásicos.


NEUROPEPTIDOS NEUROTRANSMISORES CLÁSICOS

Síntesis

Se sintetizan en el soma neuronal como precursores peptídicos (Zhang et al. 2010;

Fricker 2012)

Se sintetizan en las terminales sinápticas dentro de las vesículas de secreción (Merighi et

al. 2011)

Almacenamiento

Una vez sintetizados se almacenan en vesículas en el aparato de Golgi (Salio et al.

2006; Zhang et al. 2010; Merighi et al. 2011)

Un transportador específico introduce al neurotransmisor en su vesícula sináptica (Salio et al. 2006)

Liberación

Las vesículas no se fusionan con la membrana de la presinápsis. Liberación dependiente de clatrina

Liberación rápida (Merighi et al. 2011)

La liberación requiere estímulos de alta frecuencia (gran aumento de [Ca2+] intracelular)(Xu and Xu 2008;

Trueta and De-Miguel 2012)

Estímulos de baja frecuencia son suficientes para su liberación (solo se requiere un aumento local de [Ca2+] intracelular) (Xu and

Xu 2008; Trueta and De-Miguel 2012)

La liberación se da en sitios específicos de la neurona, no solo en la presinápsis. Transmisión por volumen (Merighi et al. 2011)

Se liberan en la zona activa del terminal presináptica (Salio et al. 2006; Merighi et al. 2011)

Farmacología

Presentan mayor afinidad por su receptor, debido al gran tamaño y presencia de múltiples sitios de interacción con éste (Merighi et

al. 2011)

Pequeño tamaño, afinidad moderada dependiendo del neurotransmisor (Merighi et

al. 2011)

Debido al gran tamaño, difunden lentamente; vida media mayor a neurotransmisores de menor peso molecular(Merighi

et al. 2011)

Unión a receptor y reciclaje o degradación rápida (Merighi et al. 2011)

Transmisión por volumen: acción parácrina y/o autócrina(Merighi et al. 2011)

Los neurotransmisores actúan sobre la postsinapsis(Merighi et al. 2011)


1.1.2- Receptores

Debido a la existencia de una baja concentración de neuropéptidos en el tejido nervioso,

es necesario que sus receptores presenten una alta afinidad por ellos (Strand, 1999).

Dicha afinidad puede ser alterada por mecanismos regulatorios (por ejemplo,

fosforilación o cambios conformacionales). Esta capacidad de reducir o incrementar la

afinidad del receptor, le confiere reversibilidad a la unión del neuropéptido con su

receptor correspondiente (Ferguson 2001; Evron et al. 2012). Una alta especificidad de

parte del receptor impide también la unión de otros péptidos de estructura similar al

péptido específico para dicho receptor.

De acuerdo a la concentración extracelular de su ligando, la expresión del receptor

puede verse modificada, moderando así la respuesta de la célula ante la exposición a su

ligando (Gao and Jacobson 2013). Un mecanismo de retroalimentación negativa es la

desensibilización, donde altas concentraciones del ligando desencadenan una

disminución de la afinidad de su receptor por cambios conformacionales, o una

reducción de su expresión a nivel de la membrana plasmática, mediante su secuestro

debido a la activación de cascadas de señalización intracelular específicas (Mantyh et al.

1995b; Wolfe and Trejo 2007; Evron et al. 2012). Por lo general, este fenómeno

desencadena la internalización del receptor junto con su ligando. Dicho mecanismo

requiere la interacción de sus dominios intracelulares con elementos intracelulares que

asisten a la internalización del receptor dentro de un endosoma (Tsao et al. 2001).

El 80% de los receptores para neuropéptidos son de tipo metabotrópicos acoplados a

proteína G (GPCRs, del inglés G Protein-Coupled Receptors)(Dong et al. 2007; Zhang et

al. 2010). Estos receptores presentan un dominio extracelular ubicado en su extremo N-

terminal, sitio que también es blanco de reacciones de glicosilación y de unión de

hormonas glicoproteicas (Rosenbaum et al. 2009), y cuentan con 7 segmentos

transmembrana compuestos mayoritariamente por aminoácidos hidrofóbicos

conectados por bucles citoplasmáticos y extracelulares. Expuesto a la superficie

extracelular, se presenta un poro central contenedor de varios residuos aminoacídicos

que participan en la unión del ligando al receptor. El extremo C-terminal intracelular

contiene residuos aminoacídicos que participan en la inserción del receptor a la


membrana celular o en la desensibilización, así como también participa en la interacción

del receptor con elementos de cascadas de señalización intracelular, quinasas o clatrina

para favorecer su endocitosis (Ferguson 2001; Evron et al. 2012).

Los GPCRs al activarse, activan proteínas G acopladas a la membrana plasmática, las

cuales desencadenan cascadas de señalización intracelular (Wolfe and Trejo 2007). La

activación de estos receptores es capaz de influir sobre la concentración de segundos

mensajeros como el Ca2+ , AMPc, o PIP2 actuando sobre las enzimas que los sintetizan y

produciendo la inhibición o activación de sus células blanco (Rosenbaum et al. 2009; Lin

2013).

1.1.3- Inactivación

Los neuropéptidos pueden ser inactivados antes de ser liberados o una vez que

interactúan con su receptor específico. La inactivación intracelular de los neuropéptidos,

ocurre a nivel del retículo endoplásmico rugoso o el aparato de Golgi minutos después

de la síntesis de su precursor. También es posible que éstos sean inactivados dentro de

las vesículas de almacenamiento días después de haber sido sintetizados. Al ser

internalizado junto con su receptor, el neuropéptido puede ser degradado dentro del

endosoma y dejando libre al receptor para ser reciclado si éste no fue degradado junto

con su ligando. A nivel extracelular, la inactivación o degradación peptídica ocurre

rápidamente tanto en el plasma como por acción de células gliales debido a la presencia

de una alta variedad de peptidasas (Fricker 2012). Debido a la presencia de peptidasas

capaces de clivar a los neuropéptidos, éstos son capaces de ejercer sus efectos en bajas

concentraciones (Merighi et al. 2011).

1.1.4- Efectos celulares

Los neuropéptidos presentan numerosas funciones en la totalidad de las funciones

nerviosas yendo desde niveles celulares hasta comportamentales. Por este motivo, es

válido hablar del carácter pleiotrópico de muchos neuropéptidos, dado el amplio

espectro de blancos celulares y moleculares de éstos y de los posibles efectos que son

capaces de inducir (Burbach 2010). Debido a lo mencionado anteriormente, también


suele referirse a los neuropéptidos como neuromoduladores (Strand, 1999; Merighi et

al., 2011). La principal diferencia que presentan dichas funciones en comparación con

aquellas descritas para los neurotransmisores clásicos es la lenta velocidad de acción de

los neuropéptidos, un rasgo que es atribuido a las condiciones de almacenamiento en

las células, las altas concentraciones intracelulares de Ca2+ necesarias para su secreción,

y la lenta activación de los receptores metabotrópicos tras su unión a sus

correspondientes ligandos (Burbach 2010; Merighi et al. 2011).

Dentro de las funciones descritas para los neuropéptidos, está incluida la influencia

sobre patrones de disparo de la neurona, la modulación de la producción de segundos

mensajeros intracelulares, modificación de la permeabilidad iónica y por tanto, la

excitabilidad neuronal. También se han descrito efectos de los neuropéptidos sobre

patrones de expresión génica, sinaptogénesis, entre otras (Strand, 1999; Burbach, 2010;

Merighi et al., 2011)

1.1.5- Métodos de estudio de la internalización de neuropéptidos

Distintas metodologías han sido utilizadas para estudiar el mecanismo de internalización

de los GPCR. Numerosos autores han destacado la utilidad de los neuropéptidos

conjugados con fluorocromos para estudiar tanto in vitro como in vivo su interacción

con sus respectivos receptores (Bunnett 1995; Grady et al. 1995; Hubbard et al. 2009;

Ionescu et al. 2012). Hubbard et al. (2009) desarrollaron un conjugado del factor de

liberación de corticotropina (Corticotropin Releasing factor, CRF) con un análogo de

rodamina (TAMRA-X) para localizar las neuronas blanco capaces de internalizar dicho

péptido en el tronco encefálico de salamandras. Esta herramienta no solo demostró ser

útil para detectar neuronas blanco del CRF sino que también reprodujo los efectos

comportamentales descritos para el péptido nativo (Hubbard et al. 2009). Ionescu et al.

(2012) emplearon una estrategia similar mediante la administración intranasal e

intracerebroventricular (i.c.v.) de un conjugado del neuropéptido S (NPS) con Cy3,

pudiendo determinar cuáles regiones del sistema nervioso de ratón se encuentran

inervadas por fibras de NPS (Ionescu et al. 2012). El seguimiento de la localización de los


receptores en la membrana o en el citoplasma en la célula luego de su internalización,

también fue estudiado por Mantyh et al. (1995) realizando ensayos de

inmunohistoquímica utilizando anticuerpos contra el receptor para sustancia P (SPR)

luego de la inyección intraestriatal de sustancia P en ratas (Mantyh et al. 1995a).

También se han realizado estudios de neuropéptidos in vitro empleando receptores

marcados con fluoróforos (Gicquiaux et al. 2002; Moden et al. 2013). Gicquiaux et al.

(2002) estudiaron el proceso de internalización y tráfico intracelular de los receptores

para el neuropéptido Y (NPY Y1 y Y2) expresándolos en células HEK293 conjugados a la

proteína verde fluorescente (EGFP, del inglés, Enhanced Green Fluorescent Protein).

Midiendo la disminución de la fluorescencia de EGFP al exponer las células a agonistas

de los receptores, los autores demostraron que la internalización de éstos es

dependiente de clatrina, y que dichas señales del receptor colocalizaron con marcadores

de vías de reciclaje de los receptores. De esta manera, demuestran que luego del

proceso de desensibilización de las células a un ligando específico, los receptores son

reciclados (Gicquiaux et al. 2002). Debido a que el uso de receptores marcados implica

en algunos casos la fijación de las células, una alternativa experimental para poder

observar en tiempo real el tráfico del complejo ligando-receptor, es la utilización de

ligandos marcados con fluorocromos, como fue expuesto anteriormente (Beaudet et al.

1998; Arttamangkul et al. 2000; Fabry et al. 2000). Arttamangkul et al. (2000) utilizaron

ligandos opioides fluorescentes para los receptores opioides µ y δ, con el objetivo de

superar los obstáculos que implicaba el uso de receptores marcados con FLAG.

Expresando dichos receptores en células CHO (del inglés, Chinese Hamster Ovary), los

autores no solo pudieron rastrear en tiempo real la ubicación de los péptidos marcados

una vez internalizados en células vivas, sino que también demostraron que el marcado

de los péptidos opioides no interfirió con su actividad biológica (Arttamangkul et al.

2000).


1.2- Hormona Concentradora de Melanina

La hormona concentradora de melanina (MCH, del inglés Melanin Concentrating

Hormone) es un neuropéptido cíclico inicialmente descrito como uno de los factores

responsables del cambio de color en peces teleósteos debido a su acción de inducir la

agregación de gránulos de melanina, lo cual aclara el color de los peces, sirviendo como

mecanismo básico de camuflaje con su entorno. De esta observación proviene su

nombre (Kawauchi and Baker 2004). Vaughan et al. (1989) describieron la presencia de

dicho neuropéptido en neuronas del hipotálamo (Hp) de la rata, lo cual permitió estudiar

las funciones de la MCH actuando como un neuromodulador en el SNC de mamíferos,

incluyendo a los humanos (Vaughan et al. 1989).

1.2.1- Estructura

La MCH en mamíferos presenta una estructura cíclica constituida por una secuencia de

19 aminoácidos altamente conservada entre mamíferos y peces teleósteos (siendo en

los últimos una secuencia de 17 aminoácidos). La estructura cíclica del péptido está

determinada por la formación de un puente disulfuro entre dos residuos de cisteína

presentes en las posiciones 7 y 16 (Vaughan et al. 1989)

Fig. 1. A. Secuencia aminoacídica de MCH de rata y salmón. Los aminoácidos en recuadros

corresponden a aminoácidos conservados entre ambas moléculas. Las líneas gruesas representan

puentes disulfuro B. Estructura cíclica de MCH de mamífero. (A, extraído y modificado de Presse

&Nahon, 2013; B: extraído de Presse et al. 2014)


1.2.2- Síntesis y anatomía de núcleos MCHérgicos en el SNC

La MCH se origina a partir del clivaje por endoproteasas de su precursor de 165

aminoácidos denominado prepro-MCH (ppMCH), que contiene además de la MCH a los

neuropéptidos EI (NEI) y GE (NGE) ambos activos en el SNC (Bittencourt et al. 1992;

Bittencourt and Elias 1998; Bittencourt 2011; Presse et al. 2014).

La síntesis de la MCH en el SNC está limitada a neuronas presentes en el Hp,

específicamente en el hipotálamo lateral (HL) y la zona incertohipotalámica

(ZI)(Bittencourt et al. 1992; Nambu et al. 1999; Kawauchi and Baker 2004). Por técnicas

de hibridación in situ e inmunohistoquímica se demostró que las neuronas MCHérgicas

se distribuyen de forma continua a lo largo del eje rostro-caudal desde ZI hasta la región

postero-lateral del Hp (fig. 2) (Bittencourt et al. 1992; Risold et al. 2009; Bittencourt

2011). Aparte de los ya mencionados núcleos MCHérgicos, se ha detectado la

localización de neuronas MCHérgicas en estructuras extra-hipotalámicas como el bulbo

olfatorio, la formación reticulopontina y también en el área preóptica media en hembras

lactantes (Bittencourt et al. 1992; Bittencourt 2011).


A partir de los núcleos mencionados, las neuronas MCHérgicas envían proyecciones a

todo el SNC, con la excepción del cerebelo (fig. 3)(Bittencourt 2011; Presse and Nahon

2013; Presse et al. 2014). Dentro de la diversidad de núcleos inervados por fibras

MCHérgicas se encuentran la ccx, NAc, Hc, Am, tálamo, y el NDR, entre otros

(Bittencourt 2011; Torterolo et al. 2011; Lima et al. 2013; Monti et al. 2013; Yoon and

Lee 2013; Haemmerle et al. 2015). Aparte de estos núcleos, el propio Hp también

presenta una considerable densidad de fibras MCHérgicas (Bittencourt et al. 1992;

Bittencourt 2011).

Fig. 2. Distribución de las neuronas MCHérgicas en el hipotálamo de la rata en el eje rostro-caudal

marcadas por técnicas de inmunohistoquímica. A. Corte coronal de la zona incerto-hipotalámica; las

neuronas se ubican en el eje horizontal desde el extremo dorsal del 3V hasta el fornix. B. Región

anterior del Hp lateral; se destaca un grupo de neuronas MCH (+) en el área dorsomedial del Hp. C.

Neuronas MCH (+) a nivel del hipotálamo lateral tuberal ubicadas entre la cápsula interna y el fornix.

D. Hipotálamo lateral posterior; se observan tres grupos de neuronas MCH (+): un grupo medial, otro

dorsal en la cápsula interna y un tercer grupo en la zona perifornical. Abreviaciones: 3V: tercer

ventrículo; f: fornix; ic: cápsula interna; mt: tracto mamilotalámico; opt: tracto óptico. Barra de

calibración A: 150 µm, B-D: 200 µm (Tomado y modificado de Bittencourt, 2011)


1.2.3- Receptores

Se han descrito dos tipos de receptores metabotrópicos del tipo GPCR, a través de los

cuales la MCH ejerce sus efectos: el MCHR1 y MCHR2 (Hill et al. 2001; Saito et al. 1999).

En roedores, debido a procesos de splicing alternativo, es frecuente la expresión de

receptores MCH2R truncos, por lo que éste se describe como un seudogen, mientras

que en humanos se presenta como un receptor funcional (Hill et al. 2001; Wang 2001).

Por este motivo, la gran mayoría de los estudios sobre la MCH y los mecanismos de

internalización de ésta junto con su receptor, se han realizado con el MCHR1.

Por técnicas de farmacología reversa, el previamente denominado receptor huérfano

SLC-1, fue descrito por Bächner et al. (1999) como el receptor capaz de responder a la

MCH, denominándolo desde entonces MCHR1 (Bächner et al. 1999; Lembo et al. 1999).

Dicho receptor cuenta con 7 dominios transmembrana, un domino extracelular N-

terminal con 3 sitios blancos de glicosilación y múltiples sitios de fosforilación presentes

Fig. 3. Esquema sagital de cerebro de rata indicando la localización de neuronas MCHérgicas (puntos

negros) y sus proyecciones. Abreviaciones: Amyg: amígdala; AON: núcleo olfatorio anterior; BST:

núcleo basolateral de la amígdala; CG: sustancia gris central; CP: caudado-putamen; CTX: corteza

cerebral; Hab: habenula; HF: formación hipocampal; HYP: hipotálamo; IC: colículo inferior; IP: núcleo

interpeduncular; LDT: núcleo laterodorsal tegmental; ME: eminencia media; MidThal: núcleo talámico

medial; Mam: complejo mamilar; NTS: núcleo del tracto solitario; OB: bulbo olfatorio; OT: tubérculo

olfatorio; PB: núcleo parabranquial; POA: área preóptica; PP: pituitaria posterior; PPN: núcleo

pedunculopontino; PreCBL: núcleo pre-cerebelar; SEP: complejo nuclear septal; SN: Substancia nigra;

Sp. V: núcleo vestibuloespinal; Sp. Cd: médula espinal; SubThal: región subtalámica; Vest: núcleo

vestibular; VTA: área tegmental ventral. (Tomado de Bittencourt et al. 1992)


en los bucles intracelulares y en el extremo C-terminal, siendo este último clave para el

proceso de internalización del receptor (fig. 4; (Hawes et al., 2000a; Saito et al., 2003;

Chung et al., 2009b; Presse et al., 2014).

Utilizando técnicas de hibridación in situ fue posible mapear los sitios de expresión del

ARNm codificante para MCHR1 (Lembo et al. 1999; Saito et al. 1999). Estos estudios

revelaron la amplia distribución del receptor a lo largo del SNC de la rata (Lembo et al.

1999; Saito et al. 1999; Hervieu et al. 2000). Aquellos núcleos que presentaron la mayor

expresión del receptor coinciden con aquellos núcleos descritos como densamente

inervados por fibras MCHérgicas, entre los que se destacan el Hc, NAc y NDR (fig. 5;

Hervieu et al., 2000; Chung et al., 2009b; Presse et al., 2014).

Fig. 4. Estructura de MCHR1 y vías de señalización asociadas. Sitios de relevancia funcional para

MCHR1 están indicados con círculos. Círculos verdes (N13, N16 y N23) representan sitios de

glicosilación. Círculo rojo (D123) es el sitio de unión de la MCH y activación del receptor. R155 (círculo

púrpura) es un sitio de regulador de la transducción de señales. T255 (círculo azul) regula la expresión

de MCHR1 en la superficie celular. El extremo C-terminal está vinculado a la función de señalización a

través del dominio helicoidal (Helix 8). El dominio DRY cumple un papel fundamental en el

mantenimiento de la conformación y la interacción del receptor con proteínas G. (Tomado y

modificado de Chung et al. 2009)


Estudios in vitro han demostrado que al unirse la MCH a su receptor MCHR1, éste es

activado tras la fosforilación de su dominio intracelular ubicado en el extremo C-

terminal y el complejo MCH-MCHR1 es internalizado en la célula por reclutamiento de

la β-arrestina (Saito et al. 2004; Chung et al. 2009b). Está reportado para la gran mayoría

de los GPCRs, que para que ocurra la internalización se requiere un complejo de

proteínas encargadas de dicho proceso. Entre estas proteínas se encuentran la clatrina,

la β-arrestina y la dinamina. Éstas y otras proteínas adaptadoras son reclutadas a

regiones de la membrana plasmática enriquecidas con fosfatidilinositol-(4,5)-bifosfato

(PIP2) y colaboran con la invaginación de la membrana (Ferguson 2001). Estas proteínas

interactúan con un complejo adaptador que permite la unión entre la clatrina y los

fosfolípidos de la membrana tras reconocer sitios fosforilados en la clatrina, lo cual

revela un mecanismo de regulación de su actividad (Wolfe and Trejo 2007).

Fig. 5. Detección por hibridación in situ de expresión de ARNm para MCHR1 en el cerebro de rata.

A – C, cortes coronales representativos de la expresión del ARNm para MCHR1 a distintos niveles

en el eje rostrocaudal. D, corte sagital exhibiendo la distribución del ARNm para MCHR1 en el

cerebro de rata. AcbSh: Núcleo accumbens Shell; Am: Amígdala; AO: núcleo olfatorio anterior; CA1-

3: regiones de Asta de Ammon; CB: cerebelo; CPu: Caudado-Putamen; Ent: corteza entorrinal;

Hippo: hipocampo; Hypo: hipotálamo; IG: indusium griseum; iTH: Núcleo talámico interlaminar;

MM: Núcleo mamilar; Pir: corteza piriforme; SuG: capa gris superficial del colículo superior; Tu:

tubérculo olfatorio. (Tomado y modificado de Lembo et al. 1999)


Como consecuencia de la activación de MCHR1, se estimulan distintas vías de

señalización intracelular a través de proteínas G del tipo Gi, Go y Gq (Hawes et al. 2000a;

Saito et al. 2004; Hamamoto et al. 2011, 2015). Utilizando cultivos de células CHO se

describieron otros efectos intracelulares producidos por la internalización del complejo

MCH-MCHR1, entre los que se encuentran la inhibición de la adenilato ciclasa tras la

activación de la proteína Gi, el cual reduce los niveles intracelulares de AMPc, la

activación de las vías MAPK/ERK (MAPK, mitogen-activated protein kinase; ERK,

extracelular signal-regulated kinase), y un aumento de la concentración intracelular de

Ca2+ por activación del tipo Gq (fig.4; Hawes et al., 2000a; Hamamoto et al., 2015). A

pesar de que el receptor MCHR1 es un GPCR y en general para éstos se ha descrito que

su internalización es mediada por clatrina, no se sabe con certeza si esa proteína estaría

implicada en la internalización de dicho receptor.

Se ha reportado que la MCH ejerce un efecto inhibitorio sobre la actividad sináptica de

las neuronas (Gao and Pol 2001). Estudios in vitro realizados por Gao y Pol (2002)

evidenciaron un efecto inhibitorio de la MCH sobre las corrientes de calcio registradas

en neuronas presentes en rebanadas de Hp de embriones de rata (Gao and Pol 2002).

Debido a la rápida acción inhibitoria de dicho neuropéptido, los autores asumen que el

efecto modulador de la MCH fue a nivel de la membrana de las neuronas, por lo cual la

activación del MCHR1 presente en neuronas del Hp produciría un efecto directo sobre

los canales de calcio L, N y P/Q, afectando principalmente la corriente de tipo N,

importantes en la liberación del neurotransmisor a nivel presináptico (Gao and Pol

2002). Estas observaciones podrían explicar el efecto inhibitorio de la MCH sobre la

función sináptica neuronal.

Estos estudios son los únicos que ponen en evidencia los efectos de la MCH a nivel

celular en un sistema endógeno donde están presentes neuronas MCH-receptivas. Sin

embargo, dichos autores no utilizan un modelo in vivo que permita describir el mismo

proceso.


1.2.4- Núcleos inervados por fibras MCHérgicas

Como se mencionó previamente, desde el HL y el ZI, se envían proyecciones a todo el

SNC, exceptuando al cerebelo (Bittencourt et al. 1992; Bittencourt and Elias 1998;

Bittencourt 2011). Es importante resaltar que estos núcleos también fueron reportados

como sitios del SNC donde hay una importante expresión del MCHR1 (Lembo et al. 1999;

Saito et al. 2001; Chung et al. 2009b; Presse et al. 2014). Como se mencionó

anteriormente, entre los núcleos inervados con mayor densidad se encuentran el NSL,

NAc, Hc, y NDR, entre otros (Risold and Swanson 1997a; Kilduff and de Lecea 2001;

Monti 2010a; Bittencourt 2011; Lima et al. 2013; Haemmerle et al. 2015). La MCH puede

ser transportada a núcleos distantes al HL y ZI por la vía clásica que implica la liberación

de la MCH desde fibras que inervan dichas estructuras nerviosas o a través de una vía

neurohumoral, siendo dicho neuropéptido vertido hacia el sistema ventricular y

transportado por el LCR hacia sus núcleos blanco localizados el lugares distantes

(Torterolo et al. 2008; Conductier et al. 2013b).

Resulta importante destacar características anatómicas y funcionales de algunos de

estos núcleos mencionados y su relación con la MCH, como el NSL, NAc, Hc y NDR.

a) Uno de los núcleos con una densa inervación MCHérgica es la región septal, la

cual es una región interventricular también conocida como septum pellucidum

conectado estrechamente con el hipocampo a través de la región

septohipocampal. Dicha región puede dividirse en 2 grupos de núcleos basados

en su ubicación anatómica: el complejo septomedial (que incluye el núcleo

septomedial y el Núcleo de la Banda Diagonal) y el grupo lateral que contiene al

Núcleo Septolateral (NSL), el septofimbrial y núcleo septohipocampal (Risold,

2004). De los núcleos mencionados, el NSL es el de mayor tamaño (Risold and

Swanson 1997b). Dicho núcleo presenta una división dorsoventral en tres

regiones: porción dorsal, intermedia y ventral. Histológicamente, dichas

regiones no son fácilmente distinguibles, aunque se ha podido identificar los

tipos neuronales presentes en cada porción y las aferencias que reciben de otros

núcleos (Swanson and Cowan 1979; Risold and Swanson 1997a, 1997b). Las

neuronas que abundan en todas las regiones del NSL son principalmente


GABAérgicas y glutamatérgicas (Jakab and Leranth 1990; Gallagher et al. 1995;

Bredewold et al. 2015). Es importante destacar que dentro del NSL se han

localizado alrededor de 15 neuropéptidos entre los que se encuentran la

encefalina, neurotensina y somatostatina (tanto aferencias como neuronas que

los sintetizan; Risold and Swanson, 1997a, 1997b). El NSL ha sido descrito por

Luo et al. (2011) como un centro de relevo entre el hipocampo (CA3

específicamente) y ATV (Luo et al. 2011). Además, se han logrado revelar otras

funciones del NSL en el comportamiento social en roedores, motivación y

recompensa (Luo et al. 2011; Bredewold et al. 2015).

b) El NAc forma parte del estriado ventral y se encuentra vinculado estrechamente

a mecanismos de procesamiento de la motivación, control motor, y aprendizaje

(Gutiérrez-García et al. 2003; Shirayama and Chaki 2006). Dicho núcleo se ha

visto implicado también en trastornos en la etiología y fisiopatología de

enfermedades como la depresión mayor, estrés crónico y adicción a las drogas

(Gutiérrez-García et al. 2003; Shirayama and Chaki 2006; Haemmerle et al. 2015).

Este núcleo comparte una notoria conectividad con la CPF, Hc, Am, ATV, NDR, y

LC, muchos de los cuales integran el sistema límbico. El NAc está

anatómicamente dividido en dos sectores: el core, y el shell. Ambas

subestructuras del NAc, presentan tanto tipos neuronales como funciones

nerviosas bien diferenciadas, al igual que aferencias provenientes de otros

núcleos presentes en el SNC. Los principales tipos neuronales descritos

presentes en NAc son interneuronas GABAérgicas y colinérgicas, además del tipo

de neuronas GABAérgicas denominadas Medium Spiny Neurons

(MSN)(Shirayama and Chaki 2006). La actividad de las MSN es regulada por

aferencias glutamatérgicas provenientes de CPF, Hc y Am, dopaminérgicas del

ATV, serotoninérgicas del NDR, noradrenérgicas del LC (Shirayama and Chaki

2006; Haemmerle et al. 2015). Estas aferencias convergen a las MSN, las cuales

también son reguladas por interneuronas GABAérgicas y colinérgicas presentes

dentro del mismo núcleo. Aparte de receptores para neurotransmisores clásicos,

las neuronas del NAc expresan receptores para neuropéptidos como la

encefalina, dinorfina y también MCH (DiLeone et al. 2003). El NAc es uno de los

núcleos con mayor expresión de ARNm del MCHR1 (Hervieu et al. 2000; Chung


et al. 2009b). Una de las funciones descritas para la MCH en dicho núcleo es la

regulación de la transmisión dopaminérgica puesta en evidencia por Pissios et al.

(2008)(Pissios et al. 2008; Chung et al. 2009a; Liu and Borgland 2015).

c) La formación hipocampal puede dividirse en cuatro regiones corticales: el giro

dentado, el hipocampo propiamente dicho (subdividido en CA1, CA2 y CA3),

corteza entorrinal, y el complejo subicular (Amaral and Witter 1989). Cada una

de estas regiones puede ser identificada por el tipo celular que la constituye. Las

células que forman el hipocampo son de tipo piramidal (Chronister and White Jr.

1975; Kobayashi and Amaral 1999). La capa CA3 recibe aferencias del giro

dentado y la corteza entorrinal a través de la vía perforante, y envía proyecciones

hacia dentro de CA3 y hacia CA1, dando origen a las conocidas colaterales de

Schaffer (Amaral and Witter 1989). El hipocampo recibe aferencias de otros

sectores del SNC como por ejemplo la Am, hipotálamo, región septal, NDR, ATV,

entre otras. Entre los tipos neuronales más abundantes presentes en el

hipocampo, se destacan las neuronas glutamatérgicas y GABAérgicas (Kobayashi

and Amaral 1999; Pachoud et al. 2010). Ambos fenotipos neuroquímicos

corresponden a las neuronas piramidales que constituyen a CA1, CA2 y CA3

(Kobayashi and Amaral 1999). Está reportado que estas regiones hipocampales

reciben densa inervación de fibras glutamatérgicas y GABAérgicas (provenientes

tanto desde adentro como desde afuera del hipocampo), colinérgicas,

monoaminérgicas, serotoninérgicas, así como también recibe aferencias de

neuropéptidos como la somatostatina, neuropéptido Y, sustancia P, entre otros

(Chronister and White Jr. 1975; Jakab and Leranth 1990; Kobayashi and Amaral

1999). Aparte de tener una importante expresión de receptores para cada uno

de los neurotransmisores y neuropéptidos mencionados, se destaca la expresión

del receptor MCHR1 así como también la presencia de fibras MCHérgicas

(Bittencourt et al. 1992; Saito et al. 2001; Chung et al. 2009a). En el hipocampo,

se le ha adjudicado a la MCH un rol regulador de la transmisión glutamatérgica y

en los procesos de formación de memorias, influyendo en la expresión de

receptores glutamatérgicos (Varas et al. 2002, 2003; Pachoud et al. 2010).

d) El NDR es una porción de los Núcleos del Rafe, ubicado a nivel del tronco

encefálico. Ubicado ventral respecto a la sustancia gris periacueductal central del


mesencéfalo, este núcleo puede subdividirse en una parte ventral y otra

interfascicular (Hornung 2012). El principal fenotipo neuroquímico presente en

el NDR corresponde a neuronas serotoninérgicas, seguidas por una importante

población de neuronas GABAérgicas (Charara and Parent 1998; Harsing Jr. 2006;

Fu et al. 2010). Aparte de estos fenotipos, se ha descrito la presencia de otros

tipos neuronales como neuronas dopaminérgicas y colinérgicas, al igual que una

gran cantidad de neuropéptidos (Charara and Parent 1998; Fu et al. 2010). Se ha

reportado la presencia de aferencias glutamatérgicas y GABAérgicas las cuales

actuarían como agentes intrínsecos y extrínsecos reguladores de la actividad de

las neuronas serotoninérgicas que constituyen el NDR (McDevitt and Neumaier

2011; Soiza-Reilly and Commons 2014; Weissbourd et al. 2014). Dichas

aferencias provienen de diversas regiones del SNC entre las que se encuentran

la corteza cerebral (cx), los ganglios basales y el hipotálamo (Peyron et al. 1998;

Hornung 2012; Yoon and Lee 2013; Pollak Dorocic et al. 2014). Las eferencias

serotoninérgicas y GABAérgicas que se proyectan desde el NDR alcanzan

regiones como la amígdala, Hc, NSL, cx, médula espinal, ATV, sustancia nigra,

etc. (Halberstadt and Balaban 2008; Hornung 2012). Este núcleo ha demostrado

tener importante influencia en funciones como la regulación del estado de

ánimo y el ciclo sueño-vigilia (Monti 2010b; Matthews and Harrison 2012; Spiacci

et al. 2012). Se ha demostrado que la MCH presenta un importante papel

modulador de dichas funciones en el NDR, induciendo comportamientos pro-

depresivos y alteraciones en el ciclo sueño-vigilia cuando la MCH es

microinyectada en este núcleo (Lagos et al. 2009; Torterolo et al. 2011; Devera

et al. 2015; Urbanavicius et al. 2016).


2- ANTECEDENTES PARTICULARES

2.1- Efectos funcionales de la MCH en el NDR

2.1.1. Modulación del ciclo sueño-vigilia

Se sabe que este núcleo contiene una importante población de neuronas con un perfil

neuroquímico y electrofisiológico típico de neuronas serotoninérgicas (Fu et al. 2010;

Monti 2010a; Hornung 2012). La activación de las neuronas serotoninérgicas presentes

en el NDR ha sido descrita como un factor importante en la generación del sueño REM

(del inglés, Rapid Eye Movement) (Monti et al. 2013). Lagos et al. pusieron en evidencia

los efectos promotores de la MCH sobre el sueño, aplicando localmente dicho

neuropéptido en el NDR, lo cual indujo un aumento en la duración del sueño REM,

acompañado de una disminución en la duración del estado de vigilia (Lagos et al. 2009).

Dichos efectos pudieron ser revertidos a través de la inmunoneutralización aplicando

anticuerpos anti-MCH, los que indujeron una disminución en la duración y el número de

episodios de sueño REM y un aumento en la duración del estado de vigilia (Lagos et al.

2011a). Considerando que las neuronas serotoninérgicas del NDR son de tipo “REM-off”,

se propuso que la MCH estaba ejerciendo un efecto inhibitorio sobre las neuronas

serotoninérgicas del NDR, pudiendo así explicar los efectos de la MCH sobre el sueño

REM. Para evidenciar el efecto de la MCH sobre la generación del sueño REM, Devera et

al. (2015) realizaron registros electrofisiológicos de unidades en el NDR al inyectar MCH

i.c.v. o al aplicarla de forma yuxtacelular (Devera et al. 2015). Estos experimentos

pusieron en evidencia una reducción en la descarga de las neuronas del NDR al inyectar

la MCH i.c.v. (59%), y al inyectar la MCH yuxtacelular (80%) (Devera et al. 2015). Así

también, se realizó la microinyección i.c.v. de un conjugado de MCH con rodamina

(MCH-ROD) con el objetivo de localizar dicha marca fluorescente intracelularmente e

identificar los fenotipos neuronales presentes en el NDR sobre las que la MCH actuaba

(MCH-receptivos). Tanto por sus características electrofisiológicas como por ensayos de

inmunofluorescencia se demostró que las neuronas blanco de la MCH dentro del NDR

eran neuronas tanto serotoninérgicas como no-serotoninérgicas. Es importante


destacar el empleo de esta herramienta experimental, pues fue utilizada en el desarrollo

de este trabajo de tesis.

2.1.2. Efectos pro-depresivos

Otro de los efectos de la MCH sobre el NDR que han sido puestos en evidencia es la

generación de comportamientos tipo-depresivos (Lagos et al. 2011b). Lagos et al.

(2011b) evidenciaron que mediante el test de nado forzado (TNF), la microinyección de

la MCH en el NDR de la rata indujo un comportamiento tipo-depresivo, debido a un

aumento significativo del tiempo de inmovilidad y una importante disminución en el

tiempo de escalamiento al utilizar el TNF (Lagos et al., 2011b). El aumento en el tiempo

de inmovilidad se considera como una respuesta pro-depresiva, la cual se vio disminuida

en animales pre-tratados con fluoxetina, un conocido inhibidor selectivo de la

recaptación de serotonina (ISRS) y muy utilizado en la clínica para el tratamiento de la

depresión (Lagos et al. 2011b). Este resultado puso en evidencia la relación existente

entre la MCH y el sistema de neurotransmisión serotoninérgico (Lagos et al. 2011b). Roy

et al. (2007) por otro lado, mediante un modelo de ratones knock-out para MCHR1

habían demostrado previamente que dicho comportamiento tipo-depresivo se veía

revertido ante la ausencia del receptor MCHR1, y que la expresión de dicho receptor

aumentaba bajo condiciones de estrés crónico (Roy et al. 2007). Este conjunto de

evidencias comportamentales pueden relacionarse con la inhibición de la descarga de

neuronas serotoninérgicas del NDR cuando se aplicó MCH de forma yuxtacelular

(Devera et al. 2015). Así también, Urbanavicius et al. (2016) lograron demostrar por

perfusión intra-NDR de MCH un efecto dosis-dependiente sobre la liberación de

serotonina, detectando una disminución en la liberación de serotonina al perfundir una

dosis baja de dicho neuropéptido por la cánula de microdiálisis, mientras que una dosis

mayor indujo el efecto opuesto. Es así que se sugiere un efecto de la MCH indirecto

sobre la neurotransmisión serotoninérgica a través de la regulación de la

neurotransmisión GABAérgica presente en el NDR (Urbanavicius et al. 2016).

Los efectos de la MCH sobre el ciclo sueño-vigilia y la aparición de comportamientos pro-

depresivos puede ser asociados considerando que el trastorno del sueño es uno de los


síntomas que se presentan los pacientes con depresión mayor. En pacientes afectados

por dicha patología, se observa una disminución de la latencia del primer período de

sueño REM y un aumento en la duración de éste. Esto puede afirmar la conexión entre

el síntoma y la enfermedad a través de estudios que describen la disminución del sueño

REM en pacientes tratados con antidepresivos (Palagini et al. 2013). Estas evidencias

sugieren una correlación entre la aparición de trastornos en el sueño REM y la

modulación de la transmisión serotoninérgica.

En ese sentido, los resultados de Devera et al. (2015) mostraron que 60 minutos luego

de la microinyección i.c.v. de MCH-ROD, ésta es observada en neuronas

serotoninérgicas así como no-serotoninérgicas, lo cual pone en evidencia que el

conjugado fue internalizado como está descrito para el receptor in vitro en sistemas de

sobre-expresión, y que dichas neuronas estarían expresando el MCHR1 (o serían MCH-

receptivas) y que la acción inhibitoria de la MCH se generaría a través de la

internalización del receptor con su ligando (Hawes et al., 2000a; Devera et al. 2015).

Como se mencionó anteriormente, la MCH indujo una disminución en la descarga de

neuronas con un perfil electrofisiológico propio de neuronas serotoninérgicas. Dicho

efecto inhibitorio se puede relacionar con los efectos pro-depresivos de la MCH y su

efecto promotor del sueño REM al ser microinyectada en el NDR (Lagos et al. 2009;

García-Fuster et al. 2012; Urbanavicius et al. 2014).

2.2- Estudios in vitro

Diversos abordajes in vitro han sido empleados para el estudio de la interacción entre la

MCH y MCHR1, y los efectos que tiene la activación de dicho receptor a nivel celular.

Una estrategia aplicada con frecuencia es la utilización de radioligandos de la MCH o

conjugados de la MCH con un isótopo de yodo (125I-MCH) pero dicha técnica requiere

una correcta purificación del radioligando antes de su utilización, debido a su alta

hidrofobicidad (Eberle et al. 2010). Otros ensayos biológicos permitieron detectar la

formación de complejos entre proteínas G y GPCRs, la activación de fosfolipasas,

movilización intracelular de Ca2+ en células cargadas con Fura2AM o modulación de

producción de segundos mensajeros (Hawes et al. 2000a; Gao and Pol 2002; Eberle et


al. 2010). Hawes et al. (2000) evidenciaron la interacción de MCHR1 (sobre-expresado

en células CHO) tras su activación y proteínas Go/Gi y Gq. Al activarse la proteína Gi se

induce la inhibición de la adenilato ciclasa, provocando una disminución de la

concentración intracelular de AMPc (Hawes et al. 2000a). Esta proteína G presenta una

subunidad βγ que al activarse, estimula la actividad de la vía MAP-quinasa y la

producción de inositol trifosfato (IP3). Por otro lado, la activación de la proteína Go fue

responsable de incrementar la concentración intracelular de Ca2+, efecto también

observado al activarse Gq (Hawes et al. 2000a). Sin embargo, Hamamoto et al. (2015)

lograron identificar no solo los aminoácidos del extremo C-terminal claves para la

interacción con estas proteínas, sino también la afinidad de cada proteína G al MCHR1,

siendo Gq la que presentó menor afinidad por el receptor (Hamamoto et al. 2015).

Algunas líneas celulares capaces de expresar MCHR1 como por ejemplo las células de

neuroblastoma humano, no fueron capaces de responder al estímulo con MCH o

presentaron una activación parcial de las quinasas MAPK/ERK, mientras que otras líneas

celulares como células de melanoma o melanocitos a pesar de expresar el receptor, al

ser estimuladas por la MCH fallaron en evocar los cambios en la concentración

intracelular de Ca2+ (Eberle et al. 2010). Esto puede ser debido a la baja concentración

de los MCHR1 presentes en dichas células. Por dicho motivo, se han seleccionado líneas

celulares capaces de sobre-expresar el MCHR1 que en su gran mayoría no son líneas

provenientes de sistemas neuronales, por lo cual su habilidad de expresar el receptor

no refleja las mismas condiciones que se encontrarían en un sistema endógeno de

expresión de MCHR1.

Dentro de las líneas capaces de sobre-expresar MCHR1, los cultivos de células HEK293 y

células CHO a las que se les indujo la sobre-expresión de éste de forma estable, han

demostrado que la activación e internalización del MCHR1 tiene como consecuencia la

reducción de los niveles intracelulares de AMPc a través de la inhibición de la adenilato

ciclasa, además de la activación de proteína quinasa C (PKC) y las quinasas MAP/ERK

gracias a la activación de las vías de señalización Gi/Go y Gq (Hawes et al. 2000a; Saito et

al. 2000, 2004; Moden et al. 2013). En estas líneas celulares fue posible revelar que el

estímulo de las células por parte de la MCH, provoca un aumento de [Ca2+]i y de IP3,

efectos que pudieron ser revertidos por aplicación de PTX (Pertussis Toxin), la cual


interfiere con una subunidad de Gi/Go (Hawes et al. 2000a). Por otro lado, en cultivos de

células HEK293 que sobreexpresan el receptor MCHR1 marcado con FLAG que se

encuentran presentes en la membrana plasmática en situación basal, Saito et al.

observaron que luego de 40 minutos de exponerse a la MCH, se modificaba su

localización, internalizándose en dichas células en vesículas, reflejando un mecanismo

de desensibilización a la MCH por parte de las células (Saito et al. 2004).

Si bien se han empleado numerosos modelos in vitro con líneas celulares capaces de

sobre-expresar MCHR1, escasos modelos experimentales utilizados ofrecen un sistema

neuronal que exprese de forma endógena el receptor y que éste sea capaz también de

activar las vías de señalización descritas hasta la fecha. Por otra parte, también es

importante destacar la ausencia de modelos in vivo que ofrezcan un sistema que permita

poner en evidencia el proceso de internalización del complejo MCH/MCHR1 a nivel

celular y los mecanismos intracelulares que se desencadenan al activarse el receptor

ante la MCH endógena de dichos tejidos.

En resumen y de acuerdo a los antecedentes especificados anteriormente, se sabe que:

1) el sistema MCHérgico inerva de forma amplia una variedad de estructuras del

SNC, destacándose por su notoria densidad, núcleos como el NAc, NSL, Hc y NDR.

2) existe una concordancia entre dicha inervación y la alta expresión del ARNm

codificante para el MCHR1.

3) se conocen los efectos funcionales de la MCH en los núcleos densamente

inervados por sus fibras, y particularmente se ha descrito el papel de dicho

neuropéptido en la regulación de la neurotransmisión de sistemas particulares

como el de serotonina a nivel del NDR, o glutamatérgico en el Hc.

4) con respecto al MCHR1, se han puesto en evidencia los efectos celulares de la

interacción MCH-MCHR1 in vitro en sistemas celulares no-neuronales y con

sobre-expresión de los MCHR1, así como las cascadas de señalización que se

activan consecuentemente.

5) si bien MCHR1 es un GPCR y para este tipo de receptores la endocitosis mediada

por clatrina es el proceso de internalización descrito, no se ha demostrado que


sea dicho proceso el que esté modulando la internalización de MCHR1 in vitro o

in vivo.

Es así que a pesar de los numerosos trabajos que describen estos procesos, ninguno de

éstos demuestra la activación de las vías de señalización celular que están presentes en

un sistema endógeno in vivo que exprese dicho receptor. Por otra parte, si bien los

efectos de la MCH están descritos para varias de las estructuras inervadas, y se han

identificado los núcleos donde está presente el ARNm de los MCHR1, no se han logrado

identificar los fenotipos neuronales capaces de expresar los MCHR1.

De esta forma, el presente trabajo de tesis propone responder las interrogantes acerca

de la internalización del receptor MCHR1 junto a su ligando en un sistema in vivo,

utilizando a la MCH-ROD, evidenciando la especificidad de dicho proceso e identificando

uno de los factores que influye en el proceso intracelular de su endocitosis. Así también,

propone, a través del empleo de esta herramienta, identificar células MCH-receptivas

presentes en algunos de los circuitos sobre los que la MCH tiene efectos y así asociarlos

a los efectos funcionales ampliamente descritos para dicho neuropéptido.

3- HIPOTESIS

En base a las evidencias in vivo sobre el curso temporal de los efectos funcionales de la

MCH y evidencias in vitro de la internalización de la MCH junto a su receptor MCHR1,

nuestra hipótesis es que, mediante el empleo de la MCH-ROD, se constatará un curso

temporal en la internalización in vivo de la MCH en células presentes en estructuras del

SNC inervadas por fibras de dicho neuropéptido, que dicho proceso será dependiente

del MCHR1 y de la endocitosis mediada por clatrina.


4- OBJETIVO GENERAL

Estudiar la dinámica temporal de la internalización in vivo del complejo MCH/MCHR1 en

células presentes en distintas estructuras del SNC de rata, su dependencia de la

presencia del MCHR1 y uno de los mecanismos celulares subyacentes a tal proceso.

5- OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Seleccionar la vía de administración intracerebral de MCH-ROD más adecuada

para responder las interrogantes planteadas por este trabajo

2. Estudiar in vivo la dinámica temporal de internalización del conjugado MCH-

ROD en NAc, NSL, Hc y NDR a distintos tiempos luego de su administración

i.c.v.

3. Dilucidar si el proceso de internalización in vivo depende de la presencia del

receptor y describir si está mediado por endocitosis mediada por clatrina.

4. Identificar en los núcleos mencionados aquellos fenotipos neuroquímicos

capaces de internalizar el conjugado MCH-ROD a través de MCHR1 y asociar

su presencia con la inervación por fibras MCHérgicas.


6- METODOLOGÍA

6.1- Animales y grupos experimentales

6.1.1- Animales

Se utilizaron ratas macho adultas de la cepa Sprague-Dawley de 280 – 300 gr criados en

la Unidad de Reactivos y Biomodelos de Experimentación (URBE) de la Facultad de

Medicina. Los animales fueron criados y alojados con comida y agua ad libitum, y

mantenidos en condiciones de temperatura y luz controladas (22 ± 2°C; 12 horas de ciclo

luz-oscuridad). Todos los procedimientos fueron aprobados por la Comisión Ética en el

Uso de Animales (CEUA; Nº de expediente: 070153-00515-13).

6.1.2- Grupos experimentales

Con el objetivo de estudiar la dinámica de internalización in vivo del conjugado MCH-

ROD en el SNC de la rata, se realizaron dos tipos de aproximaciones experimentales:

1. Microinyección local de MCH-ROD en el NDR y estudio a tres tiempos post-

microinyección: 10 minutos (T10), 20 minutos (T20) y 60 minutos (T60).

2. Microinyección intracerebroventricular (i.c.v.) de MCH-ROD y estudio de la

dinámica de internalización a T10, T20 y T60, y en segunda instancia, pre-

tratamiento farmacológico con un antagonista de los MCHR1 o un inhibidor

de la endocitosis mediada por clatrina previamente a la microinyección i.c.v.

de MCH-ROD únicamente en el grupo de T20.


6.2- Drogas y vías de administración

MCH-ROD fue obtenida de Phoenix Pharmaceuticals (CA, USA) y fue diluida en 12 µL de

DMSO puro y 48 µL de H2Od para llevar a una concentración de 1,2 µg/µL. El antagonista

de MCHR1 [N-[cis-4-[[4-(Dimetilamino)-2-quinazolinil]amino]ciclohexil]-3-4-

difuorobenzamida clorhidrato (ATC-0175) fue obtenido en Tocris Bioscience (Bristol, UK)

y fue diluido en Tween 80 y H2Od y llevada a una concentración de 1 mM. El óxido de

fenilarsina (PAO, del inglés phenylarsine oxide) fue obtenida de Sigma-Aldrich (MI, USA)

y diluida en DMSO 3% y H2Od hasta alcanzar las concentraciones finales de 10 y 30 mM.

La rodamina B también fue obtenida de Sigma-Aldrich y diluida en agua y llevada a una

concentración de 0,1 mg/mL.

Los distintos tipos de anestesia, uretano (1,2 g/kg) o ketamina (90 mg/kg) y xilacina (5

mg/kg) fueron administradas por vía intraperitoneal (i.p.).

6.3- Experimentos “in vivo”

Como fue mencionado anteriormente, realizamos dos aproximaciones

experimentales in vivo, cada una con varios grupos experimentales:

1. Microinyecciones locales de MCH-ROD en NDR:

a) grupo control absoluto

b) grupos tratados: evaluados a tres tiempos posteriores a la microinyección

de MCH-ROD: T10, T20 y T60.

2. Microinyecciones i.c.v. de MCH-ROD

a) grupo control (rodamina)

b) grupos tratados con MCH-ROD: T10, T20 y T60

c) grupo T20: ATC +MCHROD

d) grupo T20: PAO + MCHROD


Los animales fueron anestesiados con uretano (1,2 g/Kg) por vía i.p. y posteriormente

colocados en un aparato estereotáxico para la implantación de la cánula guía en los sitios

de inyección. Las cánulas fueron fijadas al cráneo utilizando un tornillo y acrílico dental,

2,0 mm por encima del sitio de inyección en el eje dorsoventral. Las coordenadas de

implantación y los calibres de las cánulas guía y de administración se especificarán en el

siguiente ítem 3.1 y 3.2. Las coordenadas utilizadas para la microinyección fueron

determinadas a partir de Bregma de acuerdo al Atlas de Paxinos y Watson (2005).

Una vez implantada la cánula guía, se procedió a la microinyección del conjugado MCH-

ROD a través de una cánula de administración conectada a una bomba de

microinyección (Harvard Apparatus, Elite P11, Holliston, MA, USA).

6.3.1- Microinyección local intra-NDR

Este procedimiento se realizó mediante implante de cánula guía con posterior

microinyección de MCH-ROD 5 días después. Se realizaron tres grupos experimentales

T10 (n = 8), T20 (n = 15), T60 (n = 17).

El día 1, los animales fueron anestesiados con una mezcla de ketamina (90 mg/kg) y

xilacina (5 mg/kg) administrada por vía i.p. y colocados en un aparato estereotáxico

(David Kopf Instruments; CA, USA). Las coordenadas empleadas para la implantación de

la cánula guía en el Núcleo Dorsal del Rafe fueron: AP: -7,8; L: -3,2; -5,0 mm desde la

duramadre en ángulo de 30° según el atlas de Paxinos y Watson (2005). La cánula guía

(24G, 20 mm de longitud) se colocó y se fijó utilizando un implante de acrílico dental

anclado a la superficie del cráneo con tres tornillos. Luego de su implante, los animales

fueron devueltos a sus respectivas cajas, donde se recuperaron de la anestesia y

permanecieron hasta el día de la microinyección en el día 5.

Cinco días después de la implantación de la cánula, se realizó la microinyección de MCH-

ROD mediante una cánula de administración. Se anestesió al animal con uretano (1,2

g/mL) por vía i.p. y se microinyectaron 0,1 µL de MCH-ROD (1,2 µg/µL) a un flujo de 0,1

µL/min a través de una cánula de administración (27G y 22 mm de longitud) colocada

dentro de la cánula guía. Luego de la microinyección y transcurrido el tiempo post-


inyección (10, 20 o 60 minutos, T10, T20 y T60, respectivamente), las ratas fueron

perfundidas intracardíacamente por gravedad como se detalla en el ítem 4 y

posteriormente procesado el tejido.

Los tiempos post-inyección empleados para los experimentos in vivo, están basados en

los estudios realizados por Saito et al. (2004), Lagos et al. (2009), Urbanavicius et al.

(2014) y Devera et al. (2015), donde describen tiempos específicos en los que la MCH

ejerce sus efectos tanto a nivel del receptor, neurontransmisión y comportamentales

(Saito et al. 2004; Lagos et al. 2009; Urbanavicius et al. 2014; Devera et al. 2015)

6.3.2- Microinyecciones intracerebroventriculares

Procedimiento general

A diferencia de los grupos microinyectados intra-NDR, en los grupos i.c.v. la implantación

de la cánula, la microinyección y la posterior perfusión y disección de los cerebros, se

realizaron en el mismo día.

Los animales fueron anestesiados con uretano (1,2 g/Kg) por vía i.p. y colocados en un

aparato estereotáxico para la implantación de cánulas guía en el ventrículo izquierdo

(VLi). Las cánulas se fijaron al cráneo utilizando un tornillo y acrílico dental, 2,0 mm por

encima del sitio de inyección en el eje dorso-ventral. Las coordenadas de implantación

Implante de cánulas guía

1 5 10

Microinyección MCH-ROD +

Perfusión NaCl + PFA 4%

Observación de cortes MCH-ROD (+) y procesamiento de

tejidos para ensayos de inmunofluorescencia

Tiempo (días)

Fig. 6. Protocolo experimental empleado para microinyecciones locales intra-NDR.


de cánulas guía en el Vli fueron: AP: -0,92; L: +1,6; DV: -3,4 mm según el atlas Paxinos y

Watson (2005). Las cánulas utilizadas eran de calibre 21G y 20 mm de largo. Las cánulas

fueron implantadas en el cráneo utilizando acrílico dental y un tornillo para su anclaje.

Una vez implantada la cánula guía, se procedió a la inyección del conjugado MCH-ROD a

través de una cánula de administración conectada a una bomba de microinyección

(Harvard Apparatus, Elite P11, Holliston, MA, USA). Para la microinyección i.c.v. se

inyectaron 10 µL de MCH-ROD a través de una cánula de administración 24G de 22 mm

de largo. El flujo de administración fue de 1,0 µL/min. Este mismo protocolo fue

empleado para realizar la microinyección de rodamina (10 µL, [0,1 mg/mL]).

Las ratas sometidas a este procedimiento fueron separadas en los siguientes grupos

experimentales:

a) grupo control rodamina (0,1 mg/mL, 10 µL) T10 (n = 4), T20 (n = 4) y T60 (n = 4).

b) grupos MCH-ROD (1,2 µg/µL, 10 µL): T10 (n = 4), T20 (n = 8) y T60 (n = 9).

Una vez que se identificaron marcas MCH-ROD positivas en las estructuras de interés

luego de procesados estos grupos experimentales, se eligió el tiempo T20 para los

experimentos con el antagonista ATC-0175 y PAO dado que las ratas del grupo T20

presentaron numerosas marcas MCH-ROD (+) bien definidas en dichos núcleos.

c) Grupo T20 controles MCH-ROD (5 µL)

d) Grupo ATC + MCH-ROD

e) Grupo PAO + MCH-ROD

6.3.3- Pre-tratamiento i.c.v. de un antagonista de MCHR1 y de un inhibidor de la

endocitosis mediada por clatrina + MCH-ROD en T20

Con el objetivo de dilucidar las características de la activación e internalización del

receptor MCHR1, se realizó un pre-tratamiento i.c.v. con el antagonista de dicho


receptor, el ATC-0175, con posterior microinyección de MCH-ROD, para evidenciar la

competencia por los sitios receptoriales.

Para demostrar la dependencia de la clatrina en el proceso de endocitosis del receptor,

se pre-trató por vía i.c.v. con el inhibidor de la endocitosis mediada por clatrina, el óxido

de fenilarsina (PAO) antes de la MCH-ROD.

Para llevar a cabo estos experimentos, se realizaron tres grupos experimentales a T20,

como fue especificado en el ítem 1.2: ATC 1 mM, PAO 10 mM y PAO 30 mM. Estos grupos

se procesaron a los 20 minutos de culminado el procedimiento quirúrgico. Los tres

grupos presentaron controles a los que solamente se les microinyectaron 5,0 µL de MCH-

ROD.

Para el pre-tratamiento con ATC o PAO, se realizó el mismo procedimiento quirúrgico

detallado en el ítem 6.3.2. Previo a la inyección de MCH-ROD, se procedió a inyectar por

vía i.c.v. 5,0 µL de ATC-0175 1 mM, o PAO 10 mM o 30 mM. Al finalizar la microinyección,

la cánula de administración fue retirada suavemente, se colocó otra cánula de

administración y se procedió a microinyectar 5,0 µL de MCH-ROD (1,2 µg/µL). De esta

forma, se realizó la microinyección de un total de 10 µL como se había realizado en los

grupos anteriormente descritos. Al iniciar la microinyección del conjugado, se empezó la

contabilización de los 20 minutos. Al finalizar este tiempo, los animales fueron

perfundidos como se describirá en el ítem 4.

Para los controles correspondientes, se microinyectaron 5 µL de los respectivos vehículos

de ATC y PAO, seguido de la microinyección del mismo volumen de MCH-ROD descrito

anteriormente.


6.4- Procesamiento de los tejidos

6.4.1- Procesamiento y obtención de cortes coronales

Una vez transcurrido el tiempo post-inyección estipulado para cada grupo experimental,

los animales ya anestesiados con uretano fueron perfundidos por vía transcardíaca con

250 mL de NaCl 0,9% y 400 mL de solución fijadora (paraformaldehído, PFA 4%) bajo

campana utilizando una bomba de perfusión a un flujo de 25 mL/min. Los cerebros

fueron disecados y fijados por inmersión en una solución de PFA 4% en buffer fosfato 0,2

M durante 24 horas. Posteriormente, fueron inmersos en una solución de crioprotección

(sacarosa 30% en PBS 0,2M) durante 48 horas. Pasado ese tiempo, los cerebros fueron

incluidos en bloques en el montante CryO-Z-T (Ted Pella, Inc) y congelados en hielo seco

y mantenidos a -80°C hasta ser cortados. Se obtuvieron cortes coronales (30 µm de

espesor) en un crióstato (Leica, Alemania) a -22°C. Para cada animal, se colectaron

aproximadamente 30 cortes que contenían el NAc y NSL entre las coordenadas desde

Bregma 0,20 y 1,00 mm. Para el hipocampo se obtuvieron 20 cortes colectados entre

Bregma -3,30 hasta -2,30. Los cortes de NDR se obtuvieron entre las coordenadas -8,30

y -7,04 de Bregma, obteniéndose aproximadamente 40 cortes por cerebro. También se

colectaron cortes coronales de la región donde fue insertada la cánula guía para verificar

su correcta localización (Bregma -0,92 mm). Los cortes obtenidos conteniendo NDR, Hc,

-5 0 5 10 15 20 min

ATC o PAO MCH-ROD

PERFUSIÓN Y PROCESAMIENTO DE CEREBROS

Fig. 7. Protocolo experimental de pre-tratamiento con ATC o PAO + MCH-ROD a T20.


NAc y NSL fueron guardados en oscuridad en solución de conservación de tejidos

(solución de Olmos) y mantenidos a -20°C hasta su observación en microscopio de

epifluorescencia y/o procesamiento para inmunofluorescencia.

6.4.2- Cuantificación de marcas MCH-ROD (+)

Se cuantificaron las marcas MCHROD (+) en los grupos experimentales i.c.v. T20 y T60, y

en los T20 pre-tratados con ATC, y PAO 10 y 30 mM.

En cada animal, la cuantificación de marcas MCH-ROD (+) se realizó en seis cortes

coronales conteniendo los núcleos de interés, seleccionados al azar, entre coordenadas

específicas tomadas del atlas de Paxinos y Watson (2005). Para su observación y

detección de la presencia de marcas positivas, los cortes fueron montados de forma

transitoria en PBS-T 0,3% en un portaobjetos y cubiertos con cubreobjetos y observados

en un microscopio de epifluorescencia (Nikon Eclipse 50i).

En primera instancia, se observaron todos los cortes obtenidos en sentido antero-

posterior de los cerebros ensayados, para localizar las marcas MCH-ROD (+) con el filtro

adecuado, y así determinar en qué núcleos se enfocaría posteriormente el estudio de

internalización y cuantificación de las marcas. Luego de realizada esta selección, se

obtuvieron imágenes a 10x utilizando un microscopio de epifluorescencia (Nikon Eclipse

50i).

Para el NSL, Hc y NDR, las señales se cuantificaron en tres campos en fotos obtenidas a

10x, mientras que para NAc y NDR, solo se cuantificaron las señales positivas en un

campo de una imagen a 10x.

Las señales (+) cuantificadas correspondieron solo a las visualizadas en elementos

presentes en el parénquima. Las señales (+) detectadas en el epéndimo no fueron

cuantificadas debido a dificultades para reconocer elementos celulares individuales.

Luego de su obtención, las imágenes fueron procesadas utilizando el software Adobe

Photoshop CS6 para un análisis más preciso. La cuantificación de señales se realizó

utilizando el software Image J. Para esto, se trazaron ROIs (region of interest) de distinta

área dependiendo del núcleo y de las marcas positivas encontradas. En la fig. 8 A-D, se


especifican las áreas utilizadas para cuantificar las marcas en las distintas estructuras

analizadas. Solamente se cuantificaron aquellas marcas que se encontraron en las áreas

de interés y se calculó el número de marcas presentes en el área del/los ROI utilizado

para cada núcleo. Se promedió el número de marcas presentes en cada campo para cada

núcleo cuantificado por animal.

Área de ROIs (mm2) Área total analizada (mm2)

0,13 0,26


0,10 0,30

A2)

A1)



0,10 0,30


0,22 0,22

B1)

B2)

Fig. 8. Esquemas de cortes coronales de especificando los campos analizados para la cuantificación.

Los cuadrados rojos enmarcan los campos fotografiados y cuantificados en los cortes correspondientes

a cada núcleo en esquemas del atlas de Paxinos…. Las fotografías de tinción de Nissl son

representativas de los campos analizados para la cuantificación. Los cuadrados negros representan las

ROI utilizadas y sus áreas se especifican en las tablas adjuntas. A1, Núcleo Accumbens; A2, Núcleo

Septolateral; B1, Hipocampo; B2, Núcleo Dorsal del Rafe. Abreviaciones: AqS: acueducto de Silvio; CA2-

3, capas de Astas de Ammon; cc, corpus callosum; NAc, Núcleo Accumbens; NDR, Núcleo Dorsal del

Rafe; NSL, Núcleo Septolateral; VL, ventrículo lateral. Barra de calibración: 100 µm. (Esquemas

coronales tomados y modificados de Paxinos y Watson, 2005)


6.5- Ensayos de inmunofluorescencia

6.5.1- Protocolo general

Los cortes para los ensayos fueron seleccionados en base a su observación en un

microscopio de epifluorescencia para verificar previamente que éstos presentaran

marcas MCH-ROD (+) en los núcleos de interés. Los cortes se montaron en PBS-T 0,3%

en un portaobjetos y fueron cubiertos por un cubreobjetos para ser observados en el

microscopio. Luego de confirmarse la presencia de señales MCH-ROD en los cortes, el

cubreobjetos era retirado con cuidado y los cortes colocados en PBS en una placa de

cultivo de 12 pocillos, donde fueron conservados a 4°C hasta iniciado el ensayo. Para

proteger de la luz a las marcas de rodamina en los tejidos, la placa fue cubierta con papel

de aluminio. Para todos los ensayos de inmunofluorescencia, los cortes fueron

procesados en libre flotación, en agitación constante y mantenidos en oscuridad durante

el ensayo. Previamente los cortes fueron lavados 3 veces con buffer fosfato salino (PBS,

0,1 M) para remover la solución anticongelante. Luego, los cortes fueron sometidos a un

bloqueo con una solución de borhidruro de sodio (0,5%) durante 25 min. Una vez

culminada esta etapa, los cortes fueron lavados nuevamente 3 veces con PBS e

incubados con una solución de glicina (50 mM) y albúmina de suero bovino (0,1%)

durante 60 min. Tras ser lavados con PBS, los cortes se sometieron a un bloqueo con

suero normal de burro (NDS; 3%) en PBS durante 60 min. Estas etapas previas a la

incubación del anticuerpo primario se realizaron para disminuir las uniones inespecíficas

en el tejido y reducir la autofluorescencia que presentan las soluciones fijadoras que

contienen grupos aldehídos. Los anticuerpos primarios fueron diluidos en una solución

conteniendo Triton X-100 (0,3%) y NDS (3%) en PBS.

Una vez cumplido el tiempo de incubación del anticuerpo primario durante toda la

noche (overnight, ON) en agitación constante a temperatura ambiente o 48 hrs. a 4°C,

los cortes fueron lavados con PBS e incubados con sus respectivos anticuerpos

secundarios durante 90 min. a temperatura ambiente en agitación constante. Los

anticuerpos secundarios fueron diluidos en Triton X-100 (0,3%) en PBS. Luego de

finalizada la incubación con este anticuerpo, los cortes fueron lavados en PBS y

montados en láminas (Superfrost plus, Ted Pella, Inc) y cubiertos con cubreobjetos en


medio de montaje Vectashield (Vectorlabs, CA, US). Todos los lavados, bloqueos e

incubaciones a temperatura ambiente fueron realizados en agitación constante.

Tabla 2. Lista de anticuerpos primarios y secundarios utilizados

6.6- Análisis de datos

Para el NAc, se seleccionaron 6 cortes. Se cuantificaron las marcas MCH-ROD (+) en cada

ROI y se sumaron las cantidades cuantificadas por corte. Luego se promediaron las

sumas de ambos ROI para cada corte y se obtuvo la media de las regiones analizadas de

NAc para cada rata. Luego se calculó la media para todas las ratas para NAc.

Para NSL y Hc, se cuantificaron 3 campos utilizando 3 ROI en cada uno. Para cada campo

se realizó la suma del número de marcas MCH-ROD (+) presentes en cada ROI. Luego se

promedió el total de marcas MCH-ROD (+) en cada campo cuantificado. Posteriormente,

el promedio para cada campo se utilizó para calcular la media de cada campo para cada

rata.

ANTICUERPO PRIMARIO ANTICUERPO SECUNDARIO

ANTÍGENO TIPO HUÉSPED Y

CONCENTRACIÓN FABRICANTE

ANTICUERPO Y CONCENTRACIÓN

FLUORÓFORO FABRICANTE

GFAP Monoclonal Ratón 1:1000 Thermo

Scientific (CA, USA)

Burro anti-ratón (1:1500)

Alexa Fluor 488

Jackson ImmunoResearch

(PA, USA)

GAD-67 Monoclonal Ratón 1:2000 Millipore (CA,

USA) Burro anti-ratón

(1:1000)

NeuN Monoclonal Ratón 1:500 Millipore (CA,


(1:1500)


(PA, USA)

MCH Policlonal Conejo 1:5000 Phoenix

Pharmaceuticals (CA, USA)

Burro anti-conejo (1:1500)


(PA, USA)

5-HT Policlonal Cabra 1:1000 Immunostar

(WI, USA) Burro anti-cabra

(1:1500)

TH Monoclonal Ratón 1:1000 Millipore (CA,


(1:1000)


(PA, USA)


Para el NDR, se cuantificó un solo campo en 6 cortes, y se promedió el número de marcas

MCH-ROD (+) cuantificadas en el ROI que abarcó el NDR en cada corte cuantificado.

Los valores finales se expresaron como la Media ± Error Estándar de la media. Los datos

fueron procesados y graficados utilizando el software GraphPad Prism.

7- RESULTADOS

7.1- Microinyección de MCH-ROD

7.1.1- Microinyección intra-NDR de MCH-ROD

Para los grupos que recibieron una microinyección intra-NDR, los resultados positivos se

obtuvieron principalmente con el grupo T60. Tanto los controles como los grupos en los

que se evaluó a T10 y T20, no presentaron señales visibles de MCH-ROD en el sitio de

inyección. Es importante destacar que en esos grupos, el número de animales fue bajo.

En los tejidos de los animales pertenecientes al grupo T60, fue posible observar una

intensa marca MCH-ROD (+) en el sitio de la microinyección. Como lo muestra la foto

representativa de la figura 9, rodeando esta marca intensa es posible observar señales

MCH-ROD (+) de menor tamaño e intensidad, las cuales correspondían a elementos

celulares del parénquima y que se confirmó al utilizar el marcador nuclear DAPI (fig. 9).

Debido a la fuerte intensidad de la señal en el sitio de inyección, la cuantificación de las

señales de menor tamaño se vio dificultada ya que la señal más intensa y de mayor

tamaño opacó las señales más pequeñas y menos intensas de alrededor. Los controles

intra-NDR para este grupo experimental de T60 no presentaron señales intensas como

las observadas en los grupos T60 con MCH-ROD.


Fig. 9. Co-localización de señales de MCH-ROD con DAPI a T60. A. Las flechas indican componentes

celulares del NDR que internalizaron la MCH-ROD. B. Marcado de núcleos con DAPI. C. Detección

combinada de MCH-ROD y DAPI. Las flechas blancas indican señales de DAPI que colocalizaron con señales

de MCH-ROD. A y C: La flecha vacía señala una marca intensa de MCH-ROD en el sitio de inyección. Barra

de calibración: 50 µm.

7.1.2- Ensayos de inmunofluorescencia

Las imágenes de inmunofluorescencia revelan que la marca MCH-ROD (+) no colocalizó

con el marcador de astrocitos, GFAP (fig. 10).

Fig. 10. Presencias de marcas positivas de MCH-ROD a 60 minutos post-inyección en NDR e

inmunofluorescencia para detección de GFAP. A: Las flechas indican componentes celulares del NDR que

internalizaron la MCH-ROD; las flechas punteadas indican el sitio de la microinyección. B: Las flechas

indican marcas positivas para GFAP en el NDR. C: detección combinada de MCH-ROD y GFAP. Barra de

calibración: 50 µm.

A B C


Los resultados demostraron que las marcas MCH-ROD (+) no fueron detectadas en las

neuronas serotoninérgicas dado que no hubo colocalización entre dicha marca y la

detección de serotonina (fig. 11). La presencia de la señal intensa de MCH-ROD en el

sitio de microinyección dificultó el análisis de las imágenes para detectar colocalización

entre las marcas (+) observadas en elementos celulares y la de serotonina. Aparte de

dicho fenotipo, otros tipos neuroquímicos presentes en el NDR pueden considerarse

para estudiar si la marca MCH-ROD (+) está presente en ellos. Dentro de ellos están los

GABAérgicos y catecolaminérgicos. Debido a lo expresado anteriormente, por la

presencia de esa intensa marca MCH-ROD (+) en el sitio de microinyección, no fueron

realizados ensayos de inmunofluorescencia para detectar dichos fenotipos en estos

tejidos del grupo T60.

Fig. 11. Presencia de marcas positivas de MCH-ROD a 60 minutos post-inyección en NDR e

inmunofluorescencia para detección de serotonina (5-HT). A: Las flechas indican componentes celulares

del NDR que internalizaron la MCH-ROD; las flechas punteadas indican el sitio de la microinyección. B: Las

flechas indican marcas positivas para 5-HT en el NDR. C: detección combinada de MCH-ROD y 5-HT. Barra


7.2- Microinyección de MCH-ROD i.c.v.

Mediante la microinyección de MCH-ROD i.c.v. y la evaluación de la internalización de

dicho marcador a los tres tiempos elegidos, T10, T20 y T60, fue posible observar que las

marcas positivas se encontraron localizadas en células presentes en el parénquima, en

su mayoría contiguas a los VLs y AqS. En T10 se observaron señales positivas para MCH-

ROD en NAc y NSL, siendo escasas en el NDR e inexistentes a nivel del Hc. En los grupos

T20 y T60 se observaron marcas MCH-ROD (+) en el parénquima de todas las regiones

mencionadas.


La mayor densidad de señales MCH-ROD (+) tanto en T20 como en T60 se observaron

en células presentes en el NSL, NAc, Hc y NDR. Es importante destacar que estas

estructuras del SNC están descritas en la bibliografía como densamente inervadas por

fibras MCHérgicas provenientes del hipotálamo. También se observaron marcas MCH-

ROD (+) en otras estructuras o regiones que no fueron tomadas en cuenta en el análisis

de cuantificación ni de identificación de fenotipos neuroquímicos en este trabajo de

Tesis. Estas regiones incluyeron a los colículos superiores (SuC), núcleos circundantes al

3V y Sustancia gris periacueductal (región lateroventral, dorsomedial y dorsolateral).

En el NSL, NAc y en el Hc a T20 y T60, las marcas se ubicaron en el parénquima cercano

a los VLs. Es importante resaltar que las células del epéndimo presentaron una

intensidad mayor de la marca a la observada en elementos celulares presentes en

regiones parenquimatosas más alejadas de las cavidades ventriculares (fig. 12 y 13). Esto

podría deberse a la difusión del conjugado desde el LCR desde los VLs hacia el

parénquima.

Fig. 12. Señales MCH-ROD (+) en NSL. Señales positivas a nivel del NSL a T20 y T60 (A y B,

respectivamente). Las flechas señalan elementos celulares del NSL que internalizaron la MCH-ROD. Barra


A nivel de NAc en T20 y T60, las marcas MCH-ROD (+) se ubicaron concentradas en el

extremo ventral del VL en que se realizó la inyección (fig. 13). En general, no se

observaron marcas MCH-ROD (+) en estructuras circundantes como el estriado o núcleo


septomedial. Debido a la dificultad para delimitar core y shell del NAc, no se realizó

distinción entre estas dos regiones al analizar los resultados.

Fig. 13. Señales MCH-ROD (+) en NAc. Señales positivas a nivel de NAc a T20 y T60 (A y B,

respectivamente). Las flechas señalan elementos celulares de NAc que internalizaron la MCH-ROD. Barra


Al igual que en el NSL, a nivel del Hc también se observaron marcas de MCH-ROD

definidas e intensas rodeando el VL izquierdo a T20 y T60, siendo imposible observar

marcas a T10 (fig. 14).

Fig. 14. Señales MCH-ROD (+) en hipocampo (CA2/CA3). Señales positivas a nivel del hipocampo, en el

límite entre CA2 y CA3 a T20 y T60 (A y B, respectivamente). Las flechas señalan elementos celulares del

hipocampo que internalizaron la MCH-ROD. Barra de calibración: 100 µm.


A nivel del NDR a T20 y T60, se detectaron marcas (+) rodeando el AqS tanto a nivel de

dicho núcleo como también en la PAG (fig. 15). Las marcas en el NDR se distribuyeron

desde el epéndimo hacia el parénquima y resultaron menos intensas que las observadas

en núcleos más anteriores y cercanos al sitio de microinyección como el NSL, NAc y Hc.

Fig. 15. Señales MCH-ROD (+) en NDR. Señales positivas a nivel de NDR a T20 y T60 (A y B,

respectivamente). Las flechas señalan elementos celulares de NDR que internalizaron la MCH-ROD. Barra


Fue posible observar una disminución en el número de marcas (+) presentes en dichas

estructuras a T20 en comparación con T60. Esto puede deberse a que la MCH-ROD

difundió por el LCR hacia estos sectores más posteriores al sitio de microinyección y que,

debido al tiempo transcurrido, la marca (+) no permaneció en las células en que fue

internalizada o fue degradada dentro de la célula.

Debido a que con la administración i.c.v. de MCH-ROD a T20 y T60 se observaron marcas

positivas a la altura del NDR, un núcleo de nuestro particular interés, se exploraron

dichos cortes con mayor atención y se muestran los resultados obtenidos a dos de los

tres tiempos ensayados (T20 y T60; fig. 15).

A T10, se observaron marcas positivas de MCH-ROD a nivel del epéndimo del AqS. Dichas

células presentaron una mayor intensidad en comparación con marcas en el parénquima


circundante, lo cual sugeriría que el conjugado es capaz de ser transportado desde el

LCR y luego captado por elementos ependimales para luego ser transportado al

parénquima (fig. 16).

Tanto a T20 como a T60, el borde del acueducto presentó marcas positivas con

moderada intensidad, la cual decae gradualmente a medida que estas se ubican más

lejos del acueducto hacia el parénquima circundante donde se observaron marcas

positivas tenues y difusas en elementos celulares (fig. 16).

A T60, se observaron varios elementos celulares positivos en el parénquima en el NDR y

sectores más laterales a AqS y colículos superiores. En este caso las marcas fueron

difusas pero de una intensidad suficiente para diferenciarlas del background.


Fig. 16. Señales MCH-ROD (+) en NDR a T10, T20 y T60. Señales positivas a nivel de NDR a T10, T20 y T60

(A, B y C, respectivamente). Las flechas blancas señalan elementos celulares de NDR que internalizaron la

MCH-ROD. Las flechas vacías señalan elementos del epéndimo MCH-ROD (+) Barra de calibración: 100

µm.

T10

T20

T60


7.2.1- Cuantificación de marcas MCH-ROD (+) a T20

Se realizó la cuantificación de las marcas MCH-ROD (+) en los grupos T20 y T60 en los

núcleos antedichos.

A nivel del NSL, se cuantificaron un total de 24 células MCH-ROD (+) en el área escogida

en base a la presencia de marcas (+) (0,3 mm2 por corte coronal, ver esquemas de Figura

8B de materiales y métodos).

A nivel del NAc se detectaron un total de 41 células en un área de 0,26 mm2 analizada.

En el Hc se cuantificaron 52 células en un área analizada de 0,3 mm2. En el NDR se

cuantificaron 6 células en un área de 0,22 mm2 analizada. Los valores de cuantificación

de dichas marcas MCH-ROD (+) por núcleo y por área analizada se presentan en la tabla

2.

Tabla 2. Cuantificación del número de marcas MCHROD (+) en todos los núcleos analizados a T20. Los

valores están expresados como la Media ± S.E.M (del inglés, Standard Error of the Mean).

Núcleos analizados Área por secciones/campo

cuantificado (mm2)

Nº de señales MCHROD (+)

Área total y Nº de señales MCHROD

(+)

Núcleo septolateral

Campo 1: 0,1 mm2 11± 4 0,3 mm2 24 cels.

Campo 2: 0,1 mm2 11 ± 6

Campo 3: 0,1 mm2 3 ± 1

Núcleo Accumbens

Campo 1: 0,26 mm2

41 ± 10

0,26 mm2

41 cels.

Hipocampo

Campo 1: 0,1 mm2 19 ± 3 0,3 mm2

52 cels. Campo 2: 0,1 mm2 20 ± 4

Campo 3: 0,1 mm2 3 ± 2

Núcleo Dorsal del Rafe

Campo 1: 0,22 mm2 6 ± 2 0,22 mm2

6 cels.


A T60 se cuantificaron 135 células en la misma área del NSL que para T20. Un total de

88 células se cuantificaron en el NAc, mientras que en Hc se cuantificaron 41 células. A

nivel del NDR se observaron 9 células MCH-ROD (+). Los valores de la cuantificación de

elementos MCH-ROD (+) en T60 por campo elegido y por área de todos los núcleos

mencionados, se muestran en la tabla 3.

Tabla 3. Cuantificación del número de marcas MCHROD (+) en todos los núcleos analizados a T60. Los

valores están expresados como la Media ± S.E.M (del inglés, Standard Error of the Mean).

7.3- Ensayos de inmunofluorescencia

7.3.1- Detección de GFAP

A pesar de que la morfología de los elementos celulares MCH-ROD (+) observados, tanto

a T20 como a T60, daba la pauta de que eran neuronas y no elementos gliales, así como

ya se había demostrado con las microinyecciones intra-NDR de MCH-ROD (fig. 10)

igualmente se realizaron ensayos de inmunofluorescencia para detectar GFAP y

descartar una posible co-localización de dichas marcas. Los resultados de dicho ensayo

permitieron observar que no existió colocalización entre las marcas MCH-ROD (+) y las

GFAP (+) presentes en ninguna de las estructuras estudiadas (fig. 17). En la figura 16 se

observan microfotografías representativas de tales ensayos en tejido de Hc a T20 (fig.

Núcleos analizados Área por secciones/campo

cuantificado (mm2)

Nº de señales MCHROD (+)

Área total y Nº de señales MCHROD

(+)

Núcleo septolateral

Campo 1: 0,1 mm2 35 ± 22 0,3 mm2 135 cels.

Campo 2: 0,1 mm2 40± 23

Campo 3: 0,1 mm2 60 ± 32

Núcleo Accumbens

Campo 1: 0,26 mm2

88 ± 33

0,26 mm2

88 cels.

Hipocampo

Campo 1: 0,1 mm2 13 ± 3 0,3 mm2

41 cels. Campo 2: 0,1 mm2 16 ± 2

Campo 3: 0,1 mm2 11± 1

Núcleo Dorsal del Rafe

Campo 1: 0,22 mm2 9 ± 3 0,22 mm2

9 cels.


17). Estos resultados permiten concluir que los astrocitos no son capaces de internalizar

el conjugado de MCH-ROD en las condiciones establecidas en nuestros ensayos.

Fig. 17. Micrografías representativas de señales MCH-ROD (+) detectadas a T20 en Hc (A – C; CA2

específicamente) y NSL (D – F) con inmunolocalización de GFAP en astrocitos. Las flechas marcan

elementos celulares del Hc y NSL que internalizaron la MCH-ROD. A – C: barra de calibración, 100 µm. D

– F: barra de calibración, 50 µm.

7.3.2- Detección de NeuN

Con el objetivo de determinar y confirmar si los elementos celulares que fueron capaces

de internalizar la MCH-ROD eran neuronas, se realizó un ensayo de inmunofluorescencia

para la detección de NeuN en tejidos MCH-ROD (+) obtenidos de ratas del grupo T20.

Los resultados demostraron co-localización entre las señales de MCH-ROD y NeuN,

permitiendo concluir que las neuronas son los elementos celulares capaces de

internalizar el conjugado. La figura 18 muestra micrografías representativas del NSL y

NDR a T20 (fig. 18). Este resultado fue observable en todas las estructuras estudiadas.

A B C

D E F

100 µm


Fig. 18. Micrografías representativas de señales MCH-ROD (+) detectadas a T20 en NSL (A - C) y NDR (D

– F) con inmunolocalización de NeuN en neuronas. Las flechas marcan elementos celulares del NSL y NDR

que internalizaron la MCH-ROD. A – C: barra de calibración, 100 µm. D – F: barra de calibración, 50 µm.

100 µm

50 µm


7.3.3- Detección de MCH

Con el objetivo de evidenciar si era posible detectar a la MCH que estaba presente en

el conjugado internalizado y además, demostrar la presencia de fibras MCHérgicas en

las estructuras analizadas, se realizaron ensayos de inmunofluorescencia para MCH. Los

resultados obtenidos lograron evidenciar la presencia de fibras MCHérgicas cercanas a

señales MCH-ROD (+) observadas en las regiones de interés (fig. 18). La

inmunodetección para MCH no puso en evidencia a la MCH presente en el conjugado

MCH-ROD. En la figura 19 se muestran microfotografías representativas de tales ensayos

en Hc y NAc a T20 (fig. 19). Estos resultados mostraron que existiría una correlación

anatómica entre la presencia de fibras MCHérgicas y la distribución de MCH-ROD (+) en

las estructuras analizadas, lo cual reforzaría la idea de que la MCH, al ser liberada desde

las fibras MCHérgicas, actúa en neuronas MCH-receptivas cercanas.

Fig. 19. Micrografías representativas de señales MCH-ROD (+) detectadas a T20 en Hc (A – C) y NAc (D –

F) con inmunodetección de fibras MCHérgicas. Las flechas marcan elementos celulares del Hc y NAc que

internalizaron la MCH-ROD. Las flechas vacías señalan fibras MCHérgicas. A – C: barra de calibración, 50

µm. D – F: barra de calibración, 100 µm.

A B C

50 µm


7.3.4- Detección de 5-HT

Considerando que el NDR se destaca por tener la mayor densidad de neuronas

serotoninérgicas del SNC, como ya fue mencionado anteriormente, se realizaron

ensayos de inmunofluorescencia para evaluar si la MCH-ROD era internalizada por

neuronas serotoninérgicas. Los resultados muestran la internalización del conjugado por

parte de alguna de las neuronas serotoninérgicas presentes en el NDR, en las cuales se

observa co-localización de ambas marcas (fig. 20). Este resultado es consistente con los

reportados por Devera et al. (2015), quienes observaron que neuronas positivas para la

serotonina en el NDR fueron capaces de internalizar MCH-ROD administrada por vía

i.c.v. (Devera et al. 2015). También se observó la presencia del conjugado en neuronas

no-serotoninérgicas.


Fig. 20. Micrografías representativas de señales MCH-ROD (+) detectadas a T20 en NDR con

inmunolocalización de neuronas positivas para serotonina (+). A. Las flechas marcan elementos celulares

del NDR que internalizaron la MCH-ROD. B. Las flechas señalan neuronas 5-HT (+) en el NDR. C. A y B

superpuestas. Barra de calibración, 100 µm.

A

B

C


7.3.5- Detección de GAD67

Debido a que en el SNC, las neuronas GABAérgicas están presentes en la gran mayoría

de los núcleos y estructuras, inclusive en los núcleos en que detectamos y cuantificamos

las marcas MCH-ROD (+), se realizaron ensayos de inmunofluorescencia contra la GAD-

67, una de las enzimas de síntesis del GABA a nivel del SNC. Es así que se detectó una

co-localización entre las señales de MCH-ROD (+) y las señales GAD67 (+) en todas las

estructuras analizadas. En la figura 21 se observan microfotografías representativas de

Hc y NSL del grupo T20 (fig. 21).


Fig. 21. Micrografías representativas de señales MCH-ROD (+) detectadas a T20 en Hc (A – C) y NSL (D –

F) con inmunolocalización de células GAD-67 (+). Las flechas marcan elementos celulares del Hc y NSL

que internalizaron la MCH-ROD.A – C: barra de calibración, 100 µm. D – F: barra de calibración, 50 µm.


7.3.6- Detección de la enzima tirosina hidroxilasa (TH)

Otro fenotipo neuroquímico dentro del NDR que podría ser un candidato capaz de

internalizar la MCH-ROD son las neuronas dopaminérgicas. Para identificarlas se realizó

un ensayo de inmunofluorescencia contra la TH, la enzima responsable de la síntesis de

la dopamina, noradrenalina y adrenalina. Los resultados demuestran colocalización

entre la señal de MCH-ROD (+) y la señal TH (+), permitiendo considerar a las neuronas

dopaminérgicas o TH (+) como un fenotipo capaz de internalizar la MCH-ROD en el NDR

y ser MCH-receptivas(fig. 22).


Fig. 22. Micrografías representativas de señales MCH-ROD (+) detectadas a T20 en NDR con

inmunolocalización de neuronas TH (+). A. Las flechas marcan elementos celulares del NDR que

internalizaron la MCH-ROD. B. Las flechas señalan neuronas TH-positivas en el NDR. C. A y B superpuestas

Barra de calibración, 100 µm

A

B

C

100 µm


7.4- Microinyección de ATC o PAO y MCH-ROD a T20

7.4.1- Microinyección de un antagonista de los MCHR1, el ATC-175

El pre-tratamiento i.c.v. con ATC-0175 previo a la administración i.c.v. de MCH-ROD a

T20, produjo un bloqueo de la internalización de la MCH-ROD en una mayor cantidad de

elementos celulares que el efecto producido por el pre-tratamiento con PAO.

Mientras que para el NSL, NAc y Hc, se pudo observar una gran disminución en el

número de marcas MCH-ROD (+) presentes en el parénquima, a nivel del NDR no se

lograron visualizaron marcas MCH-ROD (+) con dicho pre-tratamiento. La figura 23

muestra fotos representativas de dichos resultados obtenidos en NSL y NAc. Además de

una disminución en el número de marcas (+), también fue posible detectar que las

marcas (+) observadas, presentaron una intensidad menor a las observadas solo con la

administración de MCH-ROD. Al igual que lo observado en los experimentos previos sin

pre-tratamientos en los grupos T20, las marcas MCH-ROD (+) en el parénquima se

ubicaron rodeando las cavidades ventriculares y AqS.


Fig. 23. Señales MCH-ROD (+) en NSL y NAc luego de tratamiento con ATC-0175. Señales

positivas a nivel de NSL (A y B) y NAc (C y D) a 20 minutos post inyección. Las flechas señalan

elementos celulares de NSL y NAc que internalizaron la MCH-ROD. A y C, controles de MCH-ROD

(5 µL), B y D, tratados: ATC-0175 + MCH-ROD (5 µL ambos). Barra de calibración: 100 µm.

Se cuantificaron las señales MCH-ROD (+) observadas en todos los núcleos

previamente analizados, en controles (solo MCH-ROD) y grupo pre-tratados con

ATC-175, considerando las mismas áreas de tejido utilizadas para la

cuantificación en T20 anteriormente descrita.

En el NSL se cuantificaron 10 ± 2 células MCH-ROD (+) en los controles y 2 ± 0

células MCH-ROD (+) en los grupos pre-tratados; mientras que en el NAc se

cuantificaron 50 ± 19 células MCH-ROD (+) en los controles y 8 ± 5 células en los

grupos pre-tratados. Para ambos núcleos, hubieron diferencias estadísticamente

significativas al comparar controles y pre-tratados de p<0,05. La figura 24

muestra estos resultados en forma gráfica. Estos resultados pusieron en

evidencia el efecto específico del antagonista de los MCHR1, compitiendo con la

MCH-ROD a nivel del receptor e impidiendo que la MCH-ROD sea internalizada

en las neuronas (fig. 24).

C D

A B

CONTROL

CONTROL

ATC-0175

ATC-0175


Fig. 24. Efectos del pre-tratamiento con ATC-0175 1 mM y MCH-ROD a T20 a nivel de NSL (A) y

NAc (B). Las barras representan la media ± Error Estándar. Control: n=3; ATC: n=5. * P<0,05, test

t de Student.

A nivel de Hc también se observaron menos marcas en los grupos pre-tratados

con ATC-0175 que en los controles (fig. 25).

Fig. 25. Señales MCH-ROD (+) en Hc luego de tratamiento con ATC-0175. Señales positivas a

nivel de Hc a 20 minutos post inyección. Las flechas señalan elementos celulares de Hc que

internalizaron la MCH-ROD. A, controles de MCH-ROD (5 µL), B, tratados: ATC-0175 + MCH-ROD

(5 µL ambos). Control: n=3; ATC: n=5. Barra de calibración: 100 µm.

A B

CONTROL ATC-0175


Como lo muestra la figura 26, si bien se observó una tendencia a la disminución

de la presencia de señales MCH-ROD (+) en el Hc luego del pre-tratamiento con

ATC-0175, ésta no fue estadísticamente significativa en comparación con los

controles (4 ± 2 (pre-tratados) versus 12 ± 2,8 (controles).

Fig. 26. Efectos del pre-tratamiento con ATC-0175 1 mM y MCH-ROD a T20 a nivel del Hc. Las

barras representan la media ± Error Estándar. Control: n=3; ATC: n=5. test t de Student.

Fig. 27. Señales MCH-ROD (+) en NDR luego de tratamiento con ATC-0175. Señales positivas a

nivel de NDR a 20 minutos post inyección. Las flechas señalan elementos celulares de NDR que

internalizaron la MCH-ROD. A, controles de MCH-ROD (5 µL), B, tratados: ATC-0175 + MCH-ROD

(5 µL ambos). Barra de calibración: 100 µm.

A B


Al igual que en Hc, con el pre-tratamiento con ATC-0175 se observó una

tendencia a un bloqueo total de la internalización de MCH-ROD en el NDR,

aunque no se detectaron diferencias significativas entre controles (7 ± 3) y

grupos pre-tratados (1 ± 1, fig. 28) debido al reducido número de células MCH-

ROD (+) (Fig. 27 y 28)

Fig. 28. Efectos del pre-tratamiento con ATC-0175 1 mM y MCH-ROD a T20 a nivel del NDR. Las

barras representan la media ± Error Estándar. Control: n=3; ATC: n=5. test t de Student.

7.4.2- Microinyección de un inhibidor de la endocitosis mediada por clatrina, el óxido de

fenilarsina (PAO)

En el grupo pre-tratado con PAO 10 mM y luego MCH-ROD a T20 se observa una

disminución tanto en número como en la intensidad de las marcas MCH-ROD (+)

presentes en las estructuras analizadas. Aparte de observar una disminución de marcas

en el parénquima del NSL y NAc pre-tratados con PAO, pudo observarse una disminución

en la intensidad de dichas marcas, dándoles una apariencia más difusa (fig. 29).


Fig. 29. Señales MCH-ROD (+) en NSL y NAc luego de tratamiento con PAO 10 mM. Señales

positivas a nivel de NAc (A y B) y NSL (C y D) a 20 minutos post inyección. Las flechas señalan

elementos celulares de NSL y NAc que internalizaron la MCH-ROD. A y C, controles de MCH-ROD

(5 µL), B y D, tratados: PAO 10 mM + MCH-ROD (5 µL ambos). Barra de calibración: 100 µm.

Tanto en el NSL como en NAc, se observó una reducción de las señales MCH-ROD

(+) en los grupos pre-tratados con PAO 10 mM. Para el NSL se detectaron 5 ± 2

marcas MCH-ROD (+) y 5 ± 2 para NAc. La cuantificación de los grupos pre-

tratados presentó diferencias significativas con el grupo control (10 ± 1 y 15 ± 3,

respectivamente; fig. 30).


Fig. 30. Efectos del pre-tratamiento con PAO 10 mM y MCH-ROD a T20 a nivel de NSL (A) y NAc

(B). Las barras representan la media ± Error Estándar. * P<0,05, test t de Student.

El pre-tratamiento con PAO 10 mM a nivel del Hc produjo un bloqueo

significativo de la internalización de MCH-ROD observándose una menor

intensidad en las señales MCH-ROD (+) que permanecieron (fig. 31) asi como

también, generando diferencias significativas entre los controles (15 ± 3) y los

grupos tratados (5 ± 1) (Tabla 5 y fig. 32).

Fig. 31. Señales MCH-ROD (+) en Hc luego de tratamiento con PAO 10 mM. Señales positivas a

nivel de Hc a 20 minutos post inyección. Las flechas señalan elementos celulares de Hc que

internalizaron la MCH-ROD. A, controles de MCH-ROD (5 µL), B, tratados: PAO 10 mM + MCH-

ROD (5 µL ambos). Barra de calibración: 100 µm.


Fig. 32. Efectos del pre-tratamiento con PAO 10 mM y MCH-ROD a T20 a nivel de Hc. Las barras

representan la media ± Error Estándar. * P<0,05, test t de Student.

Al igual que lo observado a nivel del NDR en el grupo pre-tratado con ATC-0175,

el pre-tratamiento con PAO 10 mM logró inhibir casi totalmente la

internalización de MCH-ROD por parte de células del NDR, impidiendo detectar

células MCH-ROD (+), como lo muestra la fig. 33.

Fig. 33. Señales MCH-ROD (+) en NDR luego de tratamiento con PAO 10 mM. Señales positivas

a nivel de NDR a 20 minutos post inyección. Las flechas señalan elementos celulares de NDR que

internalizaron la MCH-ROD. A, controles de MCH-ROD (5 µL), B, tratados: PAO 10 mM + MCH-

ROD (5 µL ambos). Barra de calibración: 100 µm.


A pesar de lo observado, los resultados de la cuantificación de señales MCH-ROD

(+) no presentaron diferencias significativas entre los controles (6 ± 4,27) y los

grupos tratados (1 ± 0,56; fig.34).

Fig. 34. Efectos del pre-tratamiento con PAO 10 mM y MCH-ROD a T20 a nivel de NDR. Las

barras representan la media ± Error Estándar. test t de Student.


8- DISCUSIÓN

8.1- Microinyección local intra-NDR

El protocolo empleado para esta serie de experimentos ofrece la ventaja de estudiar el

proceso de internalización de la MCH-ROD restringido al NDR sin tomar en cuenta otras

estructuras presentes en el cerebro de la rata. El proceso de microinyección intra-NDR

implica la administración de un fluido directamente en el parénquima, lo cual requiere

tiempos de espera prolongados para que éste difunda a través del parénquima. De los

tres tiempos post-microinyección analizados, solamente T60 mostró señales ROD (+) en

el parénquima. Por el contrario, tanto T10 y T20, al igual que sus respectivos controles,

no exhibieron señales MCH-ROD (+). Estos resultados podrían indicar que el tiempo que

se dejó transcurrir en estos últimos grupos experimentales no fue suficiente para que la

MCH-ROD pudiera difundir por el parénquima del NDR, a diferencia de T60, y por lo

tanto, no se detectó ningún tipo de señal positiva (específica o inespecífica). Este patrón

observado puede ser producto de la estructura reticular que presenta la matriz

extracelular en el tejido nervioso, la cual puede afectar la difusión de la MCH-ROD a

través de dicha matriz, considerando también el tamaño de la molécula del conjugado

(Nicholson and Sykova 1998; Syková and Nicholson 2008).

Los resultados obtenidos de los experimentos de microinyección local de MCH-ROD

intra-NDR no fueron suficientes para poder responder las preguntas que planteó

inicialmente el presente trabajo. La microinyección intra-NDR de MCH-ROD produjo una

marca ROD (+) de gran tamaño que dificultó diferenciar y detectar células MCH-ROD (+).

Este abordaje experimental fue planteado inicialmente en base a numerosos estudios

en los que se realizó la inyección intraparenquimatosa de neuropéptidos (entre ellos la

MCH), con las cuales se lograron ejercer los efectos fisiológicos esperados al inyectar en

núcleos específicos (Höistad et al. 2005; Dine et al. 2013; Urbanavicius et al. 2014).

Höistad et al. (2005) concentraron su atención en los detalles técnicos de la

microinyección de β-endorfina directamente en el estriado (Höistad et al. 2005). Los

autores destacan la elección del estriado como sitio de inyección debido a la ausencia

de fibras de β-endorfina en esta estructura y su proximidad a los ventrículos laterales.


Este trabajo toma en consideración el pasaje de la β-endorfina del parénquima al LCR

circulando por los ventrículos laterales, y la internalización por células presentes en el

estriado. Luego de la microinyección intraestriatal, se detectó un aumento en los niveles

de β-endorfina en el LCR en la cisterna magna 30-45 minutos después. Los autores

describen que el tiempo en que se detectó el aumento se debió al tiempo del transporte

de la β-endorfina desde el estriado por el LCR hasta la cisterna magna (Höistad et al.

2005). También resaltan la mayor degradación que sufrió la β-endorfina al

microinyectarse en el parénquima comparada con la microinyección i.c.v. Lo observado

en el presente trabajo en cuanto a la microinyección intra-NDR no nos permite llegar a

las mismas conclusiones dado que la marca de rodamina en el parénquima persistió

luego de 60 minutos, presentando una intensidad suficiente para dificultar la

identificación de elementos celulares marcados y la cuantificación de células MCH-ROD

(+). Siguiendo esta observación realizada por Höistad et al. podemos suponer que la

marca ROD (+) observadas en el NDR correspondería a la rodamina solamente, ya que

la MCH debería haber sido degradada por peptidasas contenidas en la matriz

extracelular del tejido (Merighi et al. 2011). La naturaleza hidrofóbica de la rodamina

pudo haber afectado la difusión de ésta a través de la matriz extracelular, causando la

acumulación de la rodamina y la internalización de la MCH-ROD solamente en

elementos celulares próximos al sitio de inyección.

Si bien la microinyección de MCH-ROD intra-NDR permite estudiar el proceso de

internalización en el NDR específicamente, y numerosos estudios han descrito efectos

funcionales de la MCH en dicho núcleo, el abordaje experimental empleado en el

presente trabajo no fue apropiado o requiere ser refinado para su aplicación. Teniendo

en cuenta las características de la matriz extracelular, emplear tiempos post-inyección

más prolongados que los utilizados en este trabajo para permitir la difusión del volumen

de MCH-ROD inyectado en el parénquima podría ser una estrategia plausible para

obtener resultados adecuados para la cuantificación.


8.2- Microinyección i.c.v. de MCH-ROD

El empleo de neuropéptidos marcados con fluoróforos ha demostrado ser una

herramienta útil para el estudio de la especificidad de la interacción ligando receptor

tanto in vivo como in vitro (Beaudet et al. 1998; Hubbard et al. 2009; Ionescu et al. 2012).

La microinyección de MCH-ROD i.c.v. permitió observar, a distintos tiempos post-

administración, una distribución localizada y específica de marcas MCH-ROD (+) en

estructuras del SNC descritas como densamente inervadas por fibras MCHérgicas

provenientes de las neuronas MCHérgicas del HL y ZI (Bittencourt et al. 1992). En

concordancia con lo descrito por Saito et al. (2001), y Lembo et al. (1999), las regiones

densamente inervadas por fibras MCHérgicas, coincidían con aquellas donde la

expresión del ARNm del receptor MCHR1 era mayor (Lembo et al. 1999; Hervieu et al.

2000; Saito et al. 2001). Los resultados obtenidos con este abordaje experimental in vivo,

nos demostraron que la MCH-ROD fue capaz de ser transportada a través del LCR y

captada desde éste por elementos del epéndimo para ser transportada posteriormente

al parénquima y ser internalizada por elementos celulares claramente identificados

(Scott and Sladek 1981).

A pesar de que los estudios de expresión del MCHR1 han permitido localizar los núcleos

con mayores niveles de expresión del ARNm codificante para el receptor a nivel del SNC

de la rata, escasos trabajos han confirmado la presencia de la proteína expresada por

dicho ARNm en dichas regiones y a nivel celular (Conductier et al. 2013a). A su vez, las

marcas (+) para MCH-ROD observadas en los elementos celulares presentes en todas las

estructuras analizadas, coinciden con estructuras y núcleos donde ya habían sido

descritas las fibras MCHérgicas así como la presencia del ARNm del MCHR1. Tomando

esto en consideración, además de que en los animales controles microinyectados solo

con rodamina no se observaron marcas ROD (+) en elementos celulares definidos, los

resultados obtenidos sugieren que la internalización de MCH-ROD se produjo a través

de la interacción específica con el receptor MCHR1 presente en dichas células, ya que el

receptor MCHR2 no se expresa en roedores (Hill et al. 2001; Presse et al. 2014). Por lo

tanto, el empleo de esta herramienta no ha permitido detectar neuronas MCH-

receptivas.


Estudios centrados en los efectos de la MCH a nivel de distintas estructuras del sistema

nervioso apuestan a la interacción específica de la MCH y su receptor MCHR1 a pesar de

no haberse evidenciado la presencia de la proteína del receptor en los núcleos de

interés. Muchos estudios han descrito los efectos funcionales de la MCH al ser

administrada en determinadas estructuras y en algunos casos, el antagonismo de dichos

efectos mediante el empleo de antagonistas específicos de los MCHR1.

La administración i.c.v. de MCH-ROD tuvo como consecuencia la aparición de señales

MCH-ROD (+) en el NAc. Si bien no hubieron diferencias significativas en el número de

marcas MCH-ROD (+) observadas en el NAc entre T20 y T60, existen diversos estudios

capaces de justificar la presencia de la MCH-ROD en neuronas de dicho núcleo. A nivel

del NAc, muchos estudios han evidenciado el rol de la MCH en comportamientos

inducidos por drogas como la cocaína, la regulación de la alimentación, así como

también en la asignación del valor hedónico del alimento (Saper et al. 2002; DiLeone et

al. 2003; Chung et al. 2009a). Chung et al. (2009a) demostraron que en el shell del NAc,

MCHR1 se encuentra co-expresado en neuronas junto con receptores dopaminérgicos

(Chung et al. 2009a). En este mismo trabajo, se puso en evidencia que la MCH al ser

administrada i.c.v., es capaz de aumentar la actividad locomotora inducida por una dosis

de cocaína administrada i.p. Estos efectos se vieron revertidos en ratones knock-out

para MCHR1, para los cuales también se describió una disminución en la sensibilización

a la cocaína (Chung et al. 2009a). De estos resultados se desprende la idea de que el

bloqueo del circuito MCHérgico operando a nivel del NAc puede servir como un abordaje

terapéutico para el tratamiento de la adicción a la cocaína. Otros estudios describieron

la importancia de la MCH en el NAc y los efectos que tiene ésta en el (Saper et al. 2002;

Liu and Borgland 2015). Ratones knock-out para MCHR1 exhibieron un comportamiento

hipofágico en contrapartida con la obesidad y sobrealimentación observada cuando la

MCH es administrada i.c.v. (Saper et al. 2002). Los resultados descritos sugieren un papel

determinante de la MCH en la asignación del valor hedónico del alimento, función que

se le ha descrito a varios neuropéptidos hipotalámicos (DiLeone et al. 2003).

El NSL fue uno de los núcleos que presentó gran cantidad de marcas MCH-ROD (+). La

inyección del conjugado permitió que éste sea captado por elementos del epéndimo

ubicado en los ventrículos laterales, haciendo posible que la MCH-ROD sea captada del


LCR y sea transportada al parénquima donde entraría en contacto con neuronas

receptivas para la MCH. Como se mencionó previamente, poco se sabe de las funciones

que la MCH podría modular a nivel del NSL. Entre las funciones descritas para este

núcleo se encuentra el control del comportamiento social y la asociación de un estímulo

a un contexto o ambiente específico actuando también como un centro de relevo entre

el hipocampo y la ATV (Luo et al. 2011; Bredewold et al. 2015). Bredewold et al. (2015)

describieron diferencias en la modulación del juego social en hembras y machos. El

GABA y el glutamato (los neurotransmisores más abundantes en el NSL) probaron ser

cruciales para dicho comportamiento; al bloquear los receptores GABA-A, el juego social

se vio reducido en ambos sexos, mientras que al bloquear receptores NMDA y AMPA,

se exhibió una disminución dosis-dependiente en el juego social exclusivamente en

hembras, revelando así diferencias en el control de dicho comportamiento entre ambos

sexos (Bredewold et al. 2015). Chee et al. (2015) describieron por primera vez procesos

de comunicación entre el sistema MCHérgico y neuronas del NSL (Chee et al. 2015).

Trabajos anteriores habían descrito la densa inervación de dicho núcleo por parte de

fibras MCHérgicas, pero ninguno de ellos describió los efectos de la MCH en él

(Bittencourt et al. 1992; Risold and Swanson 1997a). Chee et al. no solo describieron los

efectos de la MCH a nivel neuronal en el NSL sino también demostraron que las

neuronas MCHérgicas también co-expresan glutamato (Chee et al. 2015). En dicho

trabajo, se demostró que la estimulación de las fibras MCHérgicas en el NSL induce la

liberación de glutamato, lo cual favoreció la liberación de GABA, llevando a una

disminución en el disparo de potenciales de acción de las neuronas presentes en rodajas

del NSL. Estas observaciones demostraron el papel de la MCH en la regulación de la

neurotransmisión del NSL. El trabajo realizado por Chee et al. (2015) junto con el de

Bredewold et al. (2015), dan un indicio del papel de la MCH en la regulación del

comportamiento social en ratas. La MCH al modular la liberación de glutamato y/o GABA

en el NSL podría estar indirectamente influyendo en el juego social de los animales,

operando en distintos modos dependiendo del sexo de estos (Bredewold et al. 2015;

Chee et al. 2015).

El Hc es otra de las estructuras para la cual se describió no solo una densa inervación

MCHérgica sino también una alta expresión del ARNm del receptor MCHR1 (Bittencourt


et al. 1992; Saito et al. 2001; Chung et al. 2009b). La administración intra-hipocampal de

MCH ha demostrado tener efectos notorios en la neurotransmisión glutamatérgica y, a

nivel funcional, sobre la memoria espacial y el comportamiento de búsqueda del

alimento (Varas et al. 2003; Sita et al. 2016). Varas et al. (2003) evidenciaron que la

administración de MCH directamente en CA1 indujo una disminución en el umbral para

generar LTP, efecto que se vio reflejado en un aumento de la latencia observada en el

test de tarea de esquiva inhibitoria (Varas et al. 2003). Este proceso de facilitación del

LTP está asociado a la activación de los receptores NMDA. Se cree que la corriente de

calcio que fluye a través de los receptores NMDA es suficiente para inducir el LTP. Varas

et al. sugieren que el aumento de [Ca2+]i luego de la administración de la MCH es el

responsable de facilitar la inducción del LTP (Varas et al. 2003). Este mismo trabajo

mostró que se producía un aumento de la expresión de las subunidades NR2A y NR2B

de los receptores NMDA con la administración de MCH en el Hc. Está descrito que dichas

subunidades son capaces de modular las corrientes iónicas a través de los receptores

NMDA incidiendo en los umbrales para generar LTP y modular los procesos de

aprendizaje (Varas et al. 2003). Lu et al. (2013) demostraron cómo la administración de

MCH en el núcleo septomedial induce la liberación de acetilcolina proponiendo un

efecto de dicho neuropéptido sobre la memoria (Lu et al. 2013). En contrapartida con lo

observado al administrar MCH en el Hc, Pachoud et al. (2010) observaron en ratones

knock-out para el receptor MCHR1, la generación de LTP se vio fuertemente afectada al

aumentar el umbral de generación. Los autores proponen que este fenómeno es

producto de una reducción de la transmisión sináptica mediada por los receptores

glutamatérgicos NMDA (Pachoud et al. 2010). Los efectos descritos para la MCH sobre

circuitos neuronales en el hipocampo pueden ser puestos en evidencia por los

resultados obtenidos en esta Tesis de Maestría. Considerando que el Hc fue una de las

regiones con gran cantidad de señales MCH-ROD (+), la presencia de éstas a los 20 y 60

minutos luego de la microinyección i.c.v. demuestra la receptividad de las neuronas del

Hc ante la MCH y por ende un probable efecto directo de la MCH, lo cual estaría

subyaciendo a los efectos funcionales ya evidenciados en trabajos anteriores.

La MCH sobre el NDR ha demostrado ejercer sus efectos en funciones como el ciclo

sueño-vigilia y el estado de ánimo (Monti 2010a; Matthews and Harrison 2012; Spiacci


et al. 2012). Numerosos estudios basados en la microinyección intra-NDR de MCH han

evidenciado los efectos moduladores del neuropéptido en dichas funciones. Lagos et al.

(2009) evidenciaron que la microinyección intra-NDR de MCH provocó un aumento en

la duración del sueño REM al actuar sobre las neuronas presentes en el NDR (Lagos et

al. 2009). Las neuronas serotoninérgicas presentes en el NDR son activas durante la

vigilia y se vuelven inactivas durante el sueño REM (neuronas REM-off). Durante el sueño

REM, la liberación de serotonina disminuye en diversas áreas del cerebro, posiblemente

por acción de la MCH, la cual como neuropéptido inhibitorio podría facilitar la

generación del sueño REM a través de la inhibición de las neuronas serotoninérgicas

(Lagos et al. 2009). Las teorías propuestas a raíz de este estudio fueron puestas a prueba

en el trabajo realizado por Lagos et al. (2011), donde a través de la inmunoneutralización

utilizando anticuerpos anti-MCH, se pudo observar una reducción del tiempo que los

animales permanecía en sueño REM (Lagos et al. 2011a). Este estudio sirvió para

complementar los resultados de Lagos (2009) evidenciando nuevamente el rol de la

MCH en el control del ciclo sueño-vigilia y la inducción del sueño REM (Lagos et al.

2011a). Si bien estos estudios ponen en evidencia los efectos de la MCH sobre el ciclo

sueño-vigilia, ninguno de ellos confirma que la MCH actúa directamente sobre las

neuronas serotoninérgicas, o sobre otros tipos celulares presentes en el NDR o

aferencias de otros núcleos.

Devera et al. (2015) demostraron, utilizando el mismo conjugado de MCH-ROD utilizado

en este trabajo, que al administrarlo i.c.v., este era internalizado por neuronas

serotoninérgicas y no-serotoninérgicas (posiblemente GABAérgicas) del NDR (Devera et

al. 2015). Estos resultados sugieren que dichas neuronas estarían expresando los

MCHR1 y que debido a la interacción entre éste y la MCH-ROD, el conjugado es

internalizado. Este mismo trabajo demostró que la administración de la MCH i.c.v. y

yuxtacelular indujo una disminución en la frecuencia de disparo de neuronas del NDR.

El conjunto de resultados expuesto en este estudio sustentan las bases para explicar

cómo la MCH actúa sobre el ciclo sueño-vigilia induciendo el sueño REM y que los

efectos del neuropéptido sobre las neuronas del NDR se dan posiblemente a través de

la interacción de la MCH con su correspondiente receptor (Devera et al. 2015).


Los efectos pro-depresivos de la MCH al actuar sobre neuronas (posiblemente

serotoninérgicas) del NDR se han descrito en numerosos estudios. Lagos et al. (2011)

evidenciaron un efecto pro-depresivo a través del TNF inducido por la microinyección

de MCH directamente en el NDR, reflejado en el aumento del tiempo de inmovilidad de

la rata (Lagos et al. 2011b). Este efecto se vio revertido con el pre-tratamiento con

fluoxetina o con anticuerpos anti-MCH. Los resultados expuestos en este trabajo están

en concordancia con los reportes realizados por Roy et al. (2007), los cuales vinculan a

la MCH con la neurotransmisión serotoninérgica (Roy et al. 2007). En este mismo

estudio, los autores analizan los efectos del pre-tratamiento con fluoxetina sobre la

expresión del receptor MCHR1, y describen una disminución en la expresión de dicho

receptor (Roy et al. 2007). Por otro lado, Urbanavicius et al. (2014) demostraron un

efecto pro-depresivo dosis-dependiente de la MCH al ser microinyectada en el NDR

(Urbanavicius et al. 2014). Un estudio clínico realizado por Schmidt et al. (2015)

describieron en pacientes afectados por trastorno depresivo mayor, una disminución en

la concentración de MCH a nivel del LCR luego de 4 semanas de tratamiento con

antidepresivos (Schmidt et al. 2015).

El hecho de que la expresión del receptor de la MCH influya sobre el desarrollo de un

comportamiento pro-depresivo ha llevado a varios investigadores a abordar el

tratamiento de dicha patología con herramientas farmacológicas dirigidas al sistema

MCHérgico (Chung et al. 2011). Borowsky et al. (2002), a través de un tratamiento con

un antagonista del MCHR1, el SNAP-7941, lograron reducir los efectos ansiogénicos y

pro-depresivos inducidos por la MCH administrada i.c.v., al igual que los efectos sobre

la ingesta de alimento (Borowsky et al. 2002).

8.3- Transporte de MCH-ROD a través del LCR

En los últimos años se han realizado varios reportes que afirman que fibras MCHérgicas

provenientes del HL entran en contacto con el epéndimo de 3V, a partir de donde la

MCH podría ser liberada en el LCR y transportada por el sistema ventricular a distintas

partes del SNC. Este proceso de transporte permitiría que los neuropéptidos

(particularmente la MCH), pueda actuar en núcleos distantes a los núcleos MCHérgicos


a través de una transmisión en volumen y neurohumoral (Torterolo et al. 2008). Para

que pueda ejercer sus efectos en aquellas estructuras inervadas por fibras MCHérgicas,

la MCH debe ser captada desde el LCR y transportada al parénquima. Se cree que los

tanicitos son las células del epéndimo encargadas de realizar dicha tarea (Flament-

Durand and Brion 1985; Torterolo et al. 2008). Torterolo et al. (2008) a través de ensayos

de inmunofluorescencia evidenciaron la presencia de MCH en tanicitos ubicados en las

cavidades ventriculares (Torterolo et al. 2008). Dado que no hay ARNm de la prepro-

MCH en elementos del epéndimo y que la MCH no es sintetizada en éstos, los autores

concluyen que la presencia de la MCH en este tipo celular no-neuronal se debe a que los

tanicitos son capaces de captar dicho neuropéptido del LCR circulante y transportarlo al

parénquima (Rodríguez et al. 2005; Torterolo et al. 2008). Particularmente en el AqS, los

tanicitos MCH (+) extienden sus prolongaciones para entrar en contacto con las

neuronas serotoninérgicas presentes en el NDR (Torterolo et al. 2008). Esta observación

realizada por Torterolo y cols. brinda firmeza a los resultados obtenidos en esta Tesis

para el NDR, uno de los núcleos donde observamos señales MCH-ROD (+). Por otro lado,

Devera y cols. (2015) utilizando una ventana temporal de una a cuatro horas luego de la

microinyección i.c.v. observaron señales MCH-ROD (+) en el parénquima del NDR,

sugiriendo que el conjugado fue transportado hasta el acueducto, en donde los tanicitos

presentes en éste captaron la MCH-ROD para transportarlo al parénquima donde fue

internalizado por neuronas serotoninérgicas y no-serotoninérgicas (Torterolo et al.

2008; Devera et al. 2015).

Estas evidencias apoyan lo mencionado por Proescholdt et al. (1999) quienes afirman

que existen distintas regiones anatómicas en el sistema ventricular encargados de

transferir elementos transportados en el LCR desde las cavidades al parénquima

(Proescholdt et al. 1999). Höistad et al. (2005) afirman que el transporte ventricular de

neuropéptidos a través del LCR representa una vía de transporte relativamente estable

para estas moléculas, debido a la relativamente escasa presencia de peptidasas en el

LCR (Höistad et al. 2005). Esto podría garantizar que los neuropéptidos que son vertidos

en los ventrículos son capaces de recorrer distancias determinadas hasta llegar intactos

al núcleo blanco sin ser degradados.

Algunos autores han descrito que la propia MCH es capaz de influir sobre el flujo de LCR

a través de los ventrículos (Conductier et al. 2013a, 2013b). Conductier y cols. (2013)


describieron la capacidad de la MCH de acelerar el flujo de LCR al aumentar la frecuencia

de batido de las cilias presentes en las células epiteliales del epéndimo presentes en el

3V in vitro. Este efecto de la MCH es explicado por Conductier y cols. por las evidencias

que afirman la expresión de MCHR1 en dichas células del epéndimo, haciendo posible

que éstas respondan a la MCH aumentando la frecuencia de batido de las cilias e

induciendo la aceleración del flujo de LCR a través de los ventrículos y acueducto

(Conductier et al. 2013a).

Existe escasa evidencia de que la MCH sea liberada en los ventrículos y transportada por

el LCR a sus respectivos núcleos blanco por una vía neurohumoral. Sin embargo, han

podido cuantificarse los niveles de MCH presente en el LCR de varias especies de

mamíferos como la oveja y las ratas albinas (Ungerfeld et al. 2011; Dias Abdo Agamme

et al. 2015). Algunos estudios han medido los niveles de MCH en el LCR de pacientes

afectados por diversas patologías como la Enfermedad de Alzheimer, lo cual indica que

este neuropéptido es capaz de ser transportado o liberado en los ventrículos para su

transporte por el LCR (Schmidt et al. 2013). Esta serie de trabajos brindan una

explicación de cómo la MCH-ROD puede ser transportada en el LCR, ser captada por

elementos del epéndimo (por ejemplo, los tanicitos) y entrar al parénquima para

interactuar con las células blanco. En nuestro caso, las evidencias expuestas

previamente justifican cómo al inyectar MCH-ROD i.c.v. el conjugado pudo recorrer las

cavidades ventriculares y ser internalizado por elementos celulares en las estructuras de

interés para este trabajo.

8.4- Comparación entre la microinyección de MCH-ROD intra-NDR y la i.c.v.

Desde un punto de vista técnico, en comparación con el protocolo de microinyección

local intra-NDR, el protocolo de microinyección i.c.v. presentó mayores facilidades en

cuanto al tiempo transcurrido entre la implantación de la cánula guía, microinyección,

procesamiento del tejido, y la obtención de los cortes y su posterior análisis en el

microscopio.


A diferencia del protocolo de microinyección intra-NDR de MCH-ROD, el cual como se

explicó anteriormente nos permitió estudiar el patrón de distribución de marcas MCH-

ROD (+) localizado exclusivamente en el NDR, la microinyección i.c.v. nos permitió

explorar otras estructuras en el SNC de la rata donde se internalizó la MCH-ROD. La

aplicación i.c.v. del conjugado de MCH-ROD, si bien nos permitió obtener más

información acerca de elementos MCH-receptivos en estructuras del SNC, también

agregó a la circulación del LCR como un factor determinante de los resultados obtenidos.

De todas las estructuras analizadas, tanto NSL como NAc presentó gran cantidad de

marcas MCH-ROD (+), siendo ambas estructuras cercanas al sitio de inyección y de

localización periventricular (Bregma -0,92 mm). Es evidente que de no ser por la

circulación del LCR a través del sistema ventricular, no sería posible observar marcas en

estructuras alejadas del sitio de inyección como fueron Hc o el NDR.

8.5- Identificación de fenotipos neuroquímicos MCH-ROD (+)

Los ensayos de inmunofluorescencia pudieron demostrar que las señales MCH-ROD (+)

estaban presentes en neuronas presentes en el parénquima que fueron capaces de

internalizar dicho conjugado. La colocalización de la señal MCH-ROD (+) y NeuN (+) se

observó en todos los núcleos o estructuras analizadas en este trabajo. Los resultados de

estos ensayos de inmunofluorescencia se complementan con los obtenidos con los

ensayos para detectar GFAP en los tejidos tratados con MCH-ROD. En estos

experimentos observamos que las señales MCH-ROD (+) no colocalizaron con señales

positivas para GFAP (Gao et al. 2003). Estos resultados sugieren que los astrocitos no

son capaces de expresar MCHR1, lo cual justificaría la falta de bibliografía que describa

la presencia de dicho receptor en éste tipo celular. Dado lo mencionado, no sería posible

que los astrocitos internalicen el conjugado, lo cual explicaría que ambas señales no

colocalicen.

En conjunto, los resultados descritos nos permiten afirmar que las neuronas son el tipo

celular presentes en el parénquima capaz de internalizar la MCH-ROD, por un

mecanismo dependiente del MCHR1, descartando a los astrocitos como un tipo celular

capaz de realizar dicho proceso. Es importante aclarar que el presente trabajo no


contempló la posibilidad de que otros elementos de la neuroglia como los

oligodendrocitos o la microglia expresen el receptor y, por lo tanto, puedan internalizar

el conjugado debido a que no fueron realizados los ensayos para detectar dichos tipos

gliales. Por tal motivo, no es posible descartar a la neuroglia en su totalidad como

posibles blancos celulares para la MCH. Para esto, futuros ensayos de

inmunofluorescencia contra marcadores celulares para otros tipos de neuroglia (por

ejemplo, lectina o Iba1, del inglés ionized calcium-binding adapter molecule 1) prometen

ser un buen abordaje.

Estos resultados en primera instancia demuestran que en todos los núcleos y estructuras

analizadas en el presente trabajo, las neuronas serían los elementos celulares capaces

de internalizar el conjugado, posiblemente a través de su receptor MCHR1. Numerosos

estudios han evaluado los efectos de la MCH al ser internalizada a través de su receptor

y los mecanismos intracelulares que se activan al darse dicho evento (Hawes et al.

2000a; Tetsuka et al. 2004; Chung et al. 2009b). Muchos de estos estudios se realizaron

en líneas celulares no-neuronales en las cuales se realizó la sobreexpresión del receptor,

y aportaron valiosa información para describir los efectos intracelulares de la activación

de MCHR1 in vitro (Hawes et al. 2000a). Por otro lado, estudios empleando cultivos de

neuronas del hipotálamo u otras estructuras inervadas por fibras MCHérgicas, también

han permitido indagar sobre los efectos neuronales de la MCH sobre las corrientes

iónicas y/o la liberación de ciertos neurotransmisores (Gao and Pol 2001, 2002). Otros

estudios in vivo estudiaron, desde un punto de vista principalmente funcional, los

efectos de la MCH sobre ciertos fenotipos neuronales y la modulación de ciertos

neurotransmisores (Hassani et al. 2009; Devera et al. 2015; Urbanavicius et al. 2016).

Todos estos estudios se centran en los efectos directos o indirectos producidos por la

MCH al interactuar con sus correspondientes blancos neuronales, evidenciando a las

neuronas como el tipo celular sobre el cual actúa dicho neuropéptido.

En este trabajo, también se logró observar una correspondencia entre los núcleos y

estructuras que presentaron marcas MCH-ROD (+) y la presencia de fibras MCHérgicas.

Mediante ensayos de inmunofluorescencia contra la MCH, logramos confirmar la

presencia de fibras MCHérgicas en núcleos para los cuales se describe una densa

inervación por estas fibras (Bittencourt et al. 1992; Steininger et al. 2004; Chung et al.


2009b). Como describieron Presse et al. (2014), aquellas estructuras del SNC inervadas

por fibras MCHérgicas coinciden con sitios donde el ARNm del MCHR1 es expresado

(Chung et al. 2009b; Presse et al. 2014). Si bien las fibras observadas no se encontraron

en contacto aparente con las células MCH-ROD (+), estás se ubicaron cercanas a dichas

marcas. Considerando la capacidad de los neuropéptidos de ser liberados por

transmisión de volumen, dicho proceso podría justificar la separación física entre las

células que internalizaron a la MCH-ROD (marcadas con el conjugado) y las fibras

MCHérgicas (Trueta and De-Miguel 2012). En conjunto, la presencia de fibras

MCHérgicas y las neuronas MCH-ROD (+) cercanas son resultados complementarios que

confirman que en dichos núcleos de interés la MCH es liberada y captada por las

neuronas presentes en éstos que son MCH-receptivas.

8.5.1- Las neuronas GABAergicas en todos los núcleos estudiados son capaces de

internalizar la MCH-ROD

Uno de los fenotipos neuroquímicos sugeridos como receptivos para MCH-ROD fueron

las neuronas GABAérgicas o GAD-67 (+). Para todas las estructuras estudiadas, algunas

neuronas MCH-ROD (+) colocalizaron con señales GAD-67 (+) en NAc, NSL, Hc y NDR. A

nivel del NAc, Haemmerle et al. (2015) describe una densa inervación de aferencias

MCHérgicas dirigidas a neuronas GABAérgicas y colinérgicas en dicho núcleo

(Haemmerle et al. 2015). Las conexiones entre el HL y NAc constituirían un eje

hipotálamo-accumbens a través del cual la MCH ejerce su función como neuropéptido

orexigénico. La participación de la MCH en este eje y la modulación que ejerce sobre la

neurotransmisión GABAérgica en el NAc, ayudan a reforzar el papel descrito para dicho

neuropéptido en la modulación del valor hedónico de la cocaína y otros

comportamientos adictivos (Saper et al. 2002; DiLeone et al. 2003; Chung et al. 2009a).

Chen et al. (2013) describen la influencia del glutamato en HL, donde la inyección de

AMPA Y NMDA en dicha región del hipotálamo moduló de forma positiva la ingesta de

alcohol, aumentando la liberación de hipocretinas y reduciendo la liberación de MCH.

Este estudio no solo revela el rol de la neurotransmisión glutamatérgica sobre el sistema


MCHérgico, sino que también sugiere la participación de otras áreas del SNC en dicho

proceso (Chen et al. 2013).

Como se mencionó anteriormente, son escasos los estudios que describan efectos

funcionales de la MCH sobre el NSL, a pesar de que dicho núcleo sea uno de los más

inervados por fibras MCHérgicas (Chee et al. 2015). Chee y cols. (2015) describieron que

la activación de neuronas MCHérgicas aferentes al NSL desde el HL induce la liberación

de GABA en el NSL en rodajas de ratón. Este trabajo no solo describió a la MCH como un

modulador de la liberación de GABA, sino que también puso en evidencia que las

neuronas MCHérgicas no solo son GABAérgicas, sino también glutamatérgicas, siendo

este último neurotransmisor el que induce la liberación de GABA (Chee et al. 2015).

Desde el punto de vista funcional, ambos neurotransmisores en el NSL han sido

vinculados al comportamiento social entre machos y hembras, siendo éste facilitado

gracias a la liberación de GABA y glutamato (Bredewold et al. 2015).

Los ensayos de inmunofluorescencia para la detección de GAD67 en el presente trabajo,

demostraron que también existió colocalización de esta enzima con las señales MCH-

ROD (+) presentes en Hc (particularmente en CA3 y CA2). A nivel de Hc, Lima et al. (2013)

determinaron que neuronas GABAérgicas presentes en la formación hipocampal

(particularmente la población neuronal en CA3), reciben fibras aferentes MCHérgicas

provenientes del HL (Lima et al. 2013). Los autores discuten que las neuronas

GABAérgicas del Hc, en conjunto con las glutamatérgicas y colinérgicas, colaboran con

el procesamiento de información espacial a nivel hipocampal (Kobayashi and Amaral

1999; Lima et al. 2013; Lu et al. 2013). Tales observaciones aportarían sustento desde

un punto de vista circuital y neuroquímico a los efectos descritos para la MCH en el Hc

(Adamantidis and de Lecea 2009; Sita et al. 2016). En este trabajo no se estudió la

inervación MCHérgica del área septomedial ni la influencia de la MCH sobre la

neurotransmisión colinérgica, lo cual no quita la relevancia de la relación entre ambos

sistemas de neurotransmisión y las implicancias en el procesamiento de memorias.

Devera et al. (2015) describieron la internalización de MCH-ROD por neuronas tanto

serotoninérgicas como no-serotoninérgicas presentes en el NDR, al inyectar i.c.v. dicho

conjugado (Devera et al. 2015). Dichas neuronas no-serotoninérgicas fueron inmuno-


reactivas para GAD-67, identificándolas como un fenotipo neuronal receptivo para

MCH-ROD dentro del NDR (Devera et al. 2015). Además, Urbanavicius et al. (2016),

sugieren que tanto las neuronas serotoninérgicas como las GABAérgicas del NDR

podrían presentar contactos sinápticos con fibras MCHérgicas aferentes del HL y ZI

(Urbanavicius et al. 2016). Weissbourd et al. (2014) utilizando técnicas de

electrofisiología y rastreo viral, describieron fibras aferentes peptidérgicas de diversas

partes del SNC, entre ellas del HL, presentes en el NDR (Weissbourd et al. 2014).

Esta serie de trabajos ponen en evidencia la relación existente entre la MCH y la

neurotransmisión GABAérgica en los núcleos estudiados, y detallan cuales son las

posibles consecuencias funcionales de la interacción entre los dos sistemas de

neurotransmisores. En conjunto, los resultados obtenidos para los ensayos de

inmunofluorescencia para GAD-67 son sustentados por los trabajos mencionados y

representan una evidencia preliminar de que las neuronas GABAérgicas presentes en los

núcleos de interés podrían expresar MCHR1 y, por lo tanto, internalizar a la MCH-ROD a

través de su interacción con el receptor.

8.5.2- Las neuronas serotoninérgicas en el Núcleo Dorsal del Rafe son capaces de

internalizar la MCH-ROD

Los ensayos de inmunofluorescencia para serotonina demostraron una colocalización

de la MCH-ROD con marcas correspondientes a neuronas serotoninérgicas en el NDR.

Este resultado no solo sugiere que las neuronas serotoninérgicas podrían ser capaces de

internalizar la MCH a través de su interacción con su receptor MCHR1, sino que serviría

también de sustento para estudios anteriores que proponen un vínculo entre la MCH y

la serotonina. Yoon et al. (2013) describen que las neuronas MCHérgicas e

hipocretinérgicas del HL envían proyecciones a núcleos colinérgicos del tronco

encefálico y también a núcleos aminérgicos (Yoon and Lee 2013). Weissbourd et al.

(2014) discuten que la presencia de neuronas GABAérgicas en conjunto con las

serotoninérgicas en el NDR podría actuar como un circuito de regulación del disparo de

éstas últimas, y que existen núcleos dentro del Núcleo del Rafe que inervan

selectivamente neuronas serotoninérgicas para su regulación (Sparta and Stuber 2014;


Weissbourd et al. 2014). Estas observaciones sugieren que la MCH, al interactuar con

neuronas GABAérgicas puede modular indirectamente el disparo de neuronas

serotoninérgicas. Devera et al. (2015) pusieron en evidencia que la MCH-ROD no solo es

internalizada por neuronas no-serotoninérgicas, sino también por neuronas

serotoninérgicas. Este fenómeno tiene como consecuencia una disminución en la

frecuencia de disparo de estas neuronas, efecto que también se observó al administrar

la MCH-ROD de forma yuxtacelular (Devera et al. 2015). Por otro lado, Urbanavicius et

al. (2016), mediante ensayos de inmunofluorescencia sugieren que existen contactos

sinápticos entre fibras MCHérgicas que inervan al NDR y neuronas serotoninérgicas

presentes en el. Se propone que la MCH podría regular la neurotransmisión de

serotonina también directamente y no solo a través de GABA (Urbanavicius et al. 2016).

En un trabajo previo, Torterolo et al. (2008) demostró una relación anatómica entre

tanicitos ubicados en el epéndimo del AqS y neuronas serotoninérgicas del NDR. En este

trabajo, se describe un contacto o proximidad entre los procesos basales de los tanicitos

y los de las neuronas serotoninérgicas presentes en el NDR (Torterolo et al. 2008).

También se reportó la presencia de la MCH tanto en tanicitos como en dichas neuronas.

Al descartarse la síntesis de MCH en los tanicitos, se llegó a la conclusión de que dicho

neuropéptido era captado del LCR y transportado al parénquima (Torterolo et al. 2008).

Los autores proponen que la MCH puede ser liberada al sistema ventricular del SNC y

ser transportada por el LCR para luego ser captada por tanicitos que favorecerían su

pasaje al parénquima para interactuar con las neuronas presentes.

Este conjunto de reseñas anatómicas respecto a la inervación MCHérgica del NDR y las

neuronas serotoninérgicas en éste, explicaría los efectos pro-depresivos de la MCH y la

modulación del ciclo sueño-vigilia (Lagos et al. 2011a; Urbanavicius et al. 2014). Los

resultados presentados en esta tesis aportan evidencias complementarias a todo lo

mencionado en los trabajos anteriores y aportan observaciones adicionales que

sugieren la expresión de MCHR1 en neuronas serotoninérgicas. Estudios realizados por

Urbanavicius et al. (2014) y Lagos et al. (2011), observaron una reversión del efecto pro-

depresivo inducido tras la inyección intra-NDR de MCH, al pre-tratar a los animales con

el antagonista de MCHR1, el ATC-0175 previamente a la administración de MCH. Esta

reversión fue observada en el TNF, evidenciándose por una disminución del tiempo de


inmovilidad de la rata en dicho test (Lagos et al. 2011b; Urbanavicius et al. 2014). Los

resultados obtenidos en esta tesis al microinyectar ATC-0175 previamente a la MCH-

ROD i.c.v. son coherentes con la idea de que dicho pre-tratamiento es capaz de

interrumpir la interacción entre la MCH-ROD y MCHR1, por competencia entre la MCH-

ROD y el antagonista por el mismo sitio en el receptor.

8.5.3- Las señales MCH-ROD colocalizaron con neuronas TH (+) del Núcleo Dorsal del

Rafe

Además de las evidencias que demuestran interacción entre la MCH en neuronas

GABAérgicas y serotoninérgicas, los ensayos de inmunofluorescencia revelaron que la

MCH-ROD es capaz de ser internalizada por neuronas TH (+). Dichas observaciones

fueron realizadas a nivel del NDR, núcleo en el que existe una población considerable de

neuronas dopaminérgicas (Hornung 2012).

La MCH ha sido vinculada a la neurotransmisión dopaminérgica principalmente gracias

al vínculo que existe entre este neuropéptido y el circuito dopaminérgico mesolímbico

(Pissios et al. 2008; Liu and Borgland 2015). Existen pocos trabajos que detallen los

efectos de la MCH sobre las neuronas TH (+) presentes en el NDR, específicamente. Sin

embargo, numerosos grupos de trabajo han evidenciado la modulación de la liberación

de dopamina en diversos núcleos del SNC por parte de la MCH. Estos efectos

modulatorios se ponen en evidencia a nivel de NAc por Pissios et al. (2008) quienes

observaron en ratones knock-out para MCH, un aumento tanto en la liberación de

dopamina a nivel de NAc, sino también un aumento en la expresión del DAT (del inglés,

Dopamine Active Transporter). Los autores discuten que dicho fenómeno podría actuar

como una medida modulatoria para contrarrestar la ausencia de MCH en el circuito

mesolímbico (Pissios et al. 2008). Por otro lado, Domingos et al. (2013) vincularon a la

MCH con la liberación de dopamina a nivel estriatal con la preferencia a un alimento

respecto a su valor nutritivo (Domingos et al. 2013). En este trabajo, los autores

describen que la ingesta de sucrosa induce la activación de neuronas MCHérgicas,

desencadenando un aumento en la liberación de dopamina en el estriado. Por tal

motivo, los autores concluyen que las neuronas MCHérgicas en el HL son capaces de


sensar y comunicar el valor nutritivo de un alimento en base a los niveles de glucosa

extracelular, enviando señales a centros de recompensa en función del valor nutritivo,

modulando así, la preferencia por alimentos específicos (Domingos et al. 2013).

Si bien estos estudios no se concentran en los efectos de la MCH y la liberación de

dopamina específicamente en el NDR, sí destacan a la MCH y su papel modulador en los

circuitos de recompensa y estado de ánimo. La influencia de la MCH sobre las neuronas

TH (+) del NDR podría tener su participación, regulando el valor hedónico del alimento,

la interacción social o de drogas de abuso. Futuros estudios se requieren para dilucidar

qué efectos presenta la MCH sobre la activación de neuronas dopaminérgicas del NDR.

En conjunto, los resultados obtenidos de los ensayos de inmunofluorescencia realizados

para la presente Tesis de Maestría, permitieron:

identificar a las células MCH-receptivas como neuronas

descartar a los astrocitos como posibles células capaces de internalizar la MCH-

ROD

identificar a neuronas GABAérgicas, serotoninérgicas y TH (+) que internalizan a

la MCH-ROD (+) y que posiblemente expresen MCHR1.

8.6- Evidencias de la dependencia de MCHR1 y de clatrina para la internalización de

MCH-ROD

8.6.1- La internalización de MCH-ROD es dependiente del receptor MCHR1

El pre-tratamiento con ATC-0175 y MCH-ROD a T20 indujo una tendencia a disminuir la

internalización de la MCH-ROD, viéndose dicho proceso disminuido significativamente

en NSL y NAc (ambas estructuras próximas al sitio de microinyección). Es posible que,

debido al flujo de circulación del LCR, el pequeño volumen de ATC-0175 haya sido

transportado y captado rápidamente en dirección hacia las estructuras mencionadas,

alejándolas del Hc y NDR, las cuales no tuvieron diferencias significativas entre las

marcas MCH-ROD (+) entre los controles y los grupos pre-tratados, aunque se observa


una tendencia. Como se describió antes, la naturaleza molecular tanto del antagonista

como de la MCH-ROD pudo estar a merced del transporte del LCR a través de los

ventrículos y hacia la circulación sanguínea y el parénquima, distribuyendo al ATC-0175

y a la MCH-ROD a regiones del sistema nervioso que no fueron contempladas en el

presente trabajo (Bulat and Klarica 2011).

La disminución de la internalización de MCH-ROD con el ATC-0175 por parte de células

contenidas en núcleos inervados por fibras MCHérgicas sugiere que dicho proceso

depende de la interacción específica MCH-ROD – MCHR1. Estos resultados pueden

relacionarse con estudios anteriores que reportan a los antagonistas del MCHR1 como

agentes farmacológicos capaces de revertir los efectos generados por la MCH (Chung et

al. 2011). Los resultados presentes en este trabajo evidencian a nivel celular la

importancia de la interacción MCH-ROD – MCHR1 para la internalización de la MCH y la

activación de los procesos intracelulares que trae como consecuencia la unión de la MCH

a su receptor.

Muchos estudios han sugerido la administración o utilización de antagonistas del

MCHR1 como potenciales agentes terapéuticos para el tratamiento de trastornos

específicos en los que puede estar vinculada la MCH (Chung et al. 2011). Chaki et al.

(2005) sintetizaron el ATC-0175, antagonista de alta afinidad por el MCHR1. Al

administrar por vía oral dicho antagonista, se observaron efectos ansiolíticos y

antidepresivos en modelos animales para estudiar estrés y depresión (Chaki et al. 2005).

Otro antagonista que demostró revertir los efectos inducidos por la MCH, es el SNAP-

94847, el cual fue utilizado por Smith et al. (2009) para evaluar los efectos de la MCH

sobre el eje hipotálamo-hipofisario-adrenal (HPA; del inglés, hypothalamic-pituitary-

adrenal). En este estudio, la administración i.c.v. del antagonista fue capaz de bloquear

la liberación de ACTH (del inglés, Adrenocorticotropic Hormone) inducida por la MCH

(Smith et al. 2009). Este estudio permitió demostrar la relación existente entre dicho

neuropéptido y el estrés.

Los resultados obtenidos en el presente trabajo, se suma al grupo de evidencias que

sugieren que los efectos funcionales de la MCH en ratas son dependientes de la

interacción de ésta con su receptor MCHR1. Estas observaciones permiten apuntar al


sistema MCHérgico como un posible blanco terapéutico para el tratamiento de diversas

patologías o afecciones en las que la MCH participa.

8.6.2- La internalización de MCHR1 exhibe un proceso típico de receptor GPCR

Los resultados obtenidos del pre-tratamiento de los animales con PAO demostraron que

éste logró inhibir significativamente la internalización de la MCH-ROD, efecto que se

evidenció en una reducción de la cantidad de señales MCH-ROD (+) en los núcleos

estudiados con la excepción de NDR. Esto último puede ser producto de la distancia

entre el sitio de inyección y el núcleo mencionado. Debido a que la PAO además de estar

descrita como una droga que inhibe la internalización mediada por clatrina, también se

le adjudican otros efectos celulares, existe la posibilidad de que ésta haya sido captada

a lo largo del sistema ventricular, dejando menor cantidad de PAO para ser captada por

los tanicitos del acueducto y luego transportarla al parénquima del NDR. También es

posible que la concentración de PAO utilizada esté induciendo alguno de los otros

efectos descritos y no solamente la inhibición de la endocitosis mediada por clatrina

(Dutta and Donaldson 2012). Otro de los efectos de la PAO que se ha demostrado

también es la capacidad de bloquear el proceso de macropinocitosis. Es posible que la

PAO sea captada por tanicitos y ella misma impida su traspaso al parénquima, haciendo

imposible que llegue a los tipos celulares de interés y dificultando la observación de

diferencias significativas (Dutta and Donaldson 2012).

PAO ha sido reportado en la bibliografía como un inhibidor de la macropinocitosis y

fagocitosis (Moss and Ward 1991; Dutta and Donaldson 2012). Si bien no se conoce el

mecanismo, se ha descrito también que dicho fármaco es capaz de inhibir la endocitosis

mediada por clatrina, efecto que se ha puesto en evidencia en numerosos estudios

(Grady et al. 1995; Boudin et al. 2000). Dado que MCHR1 es un GPCR, algunos autores

afirmaron que el proceso de internalización de éste involucraba la endocitosis mediada

por clatrina (Lin 2013). Sin embargo, dicho proceso nunca fue evidenciado en sistemas

in vitro utilizando líneas neuronales ni en modelos in vivo. Por tal motivo, los resultados

referidos a tal experimento aportan evidencias preliminares del mecanismo celular que

media la internalización de MCHR1 in vivo.


Como se mencionó anteriormente, la ausencia de diferencias significativas entre los

controles y el grupo pre-tratado con PAO a nivel del NDR pueden deberse a diversos

factores. Uno de ellos puede ser producto de la inespecificidad de PAO. Esta

característica impide canalizar al fármaco específicamente a células que expresen

MCHR1, lo cual representa una limitante para PAO como herramienta farmacológica

para estudiar los mecanismos celulares de internalización de los GPCRs (Dutta and

Donaldson 2012). Además de esto, se le han atribuido a PAO otros efectos celulares

aparte de interferir con la endocitosis mediada por clatrina. García-Morales et al. (1990)

demostraron que PAO es capaz de inhibir la actividad de la tirosina fosfatasa en linfocitos

T e interferir con mecanismos intracelulares que favorecen la activación de estas células

(Garcia-Morales et al. 1990). Por otro lado, Takahashi et al. (1997) describen que PAO

es capaz de bloquear los cambios conformacionales que sufre el ADN al iniciarse

mecanismos de apoptosis (Takahashi et al. 1997). Otro efecto descrito para PAO, fue

reportado por Hmadcha et al. (1999), quienes demostraron el efecto inhibitorio de PAO

sobre la actividad de las ATPasas dependientes de calcio (Hmadcha et al. 1999). Los

autores discuten que este efecto puede afectar la concentración intracelular de calcio,

el cual a su vez actúa como cofactor y segundo mensajero en numerosas vías de

señalización intracelular (Hmadcha et al. 1999). Esta observación dificulta aún más la

comprensión de los mecanismos por los que PAO es capaz de inhibir la endocitosis

mediada por clatrina. Aun así, esto permite establecer un posible vínculo en las vías de

señalización activadas al activarse MCHR1 y PAO, dado que tras la activación de la

proteína Gq uno de los efectos ejercidos es un aumento de la concentración intracelular

de calcio (Lembo et al. 1999; Hawes et al. 2000a).

Al no conocerse bajo qué mecanismo PAO inhibe la endocitosis mediada por clatrina, no

es posible descartar que alguno de los efectos descritos para PAO tenga como efecto

colateral la inhibición de la internalización de los GPCRs. Se sabe que debido a los átomos

de arsénico presentes en la molécula de PAO, ésta es capaz de formar enlaces estables

con residuos de cisteína presentes en proteínas de las células, posiblemente

interfiriendo con el contacto entre dos moléculas específicas o induciendo un cambio

conformacional que afecte la función de éstas (Gerhard et al. 2003). Hamamoto et al.

(2015) estudiaron en un modelo in vitro con células HEK293, los aminoácidos clave para


la interacción entre el extremo C-terminal del receptor MCHR1 y proteínas G capaces de

activarse tras la activación de este receptor (Hawes et al. 2000a; Hamamoto et al. 2015).

Mediante la expresión del MCHR1 con mutaciones a nivel de su extremo C-terminal, los

autores lograron identificar cuales mutaciones lograron una pronunciada disminución

de la señalización mediada por la proteínas Gi/o, ambas activadas tras la activación de

MCHR1 (Hawes et al. 2000a; Hamamoto et al. 2015). Este abordaje podría ser adecuado

para identificar si los efectos de PAO se deben a su interacción con estos blancos

celulares.

Los resultados obtenidos en esta parte de la presente Tesis de Maestría, no solo brindan

evidencias preliminares que apuntan a que la internalización del complejo

receptor/ligando para el MCHR1 depende parcialmente de un proceso de endocitosis

mediada por clatrina, sino que también es de los primeros estudios realizados en

modelos in vivo para estudiar dicho mecanismo para este receptor metabotrópico. A

pesar de esto, numerosos estudios serían necesarios para detallar el efecto inhibidor de

PAO sobre la endocitosis mediada por clatrina de MCHR1.

9- CONCLUSIONES GENERALES

Dados los resultados y las observaciones obtenidas del presente trabajo de Tesis,

podemos concluir que:

El protocolo de microinyección de MCH-ROD intra-NDR debe continuar la puesta

a punto para adecuarse a los objetivos del estudio.

El protocolo de microinyección de MCH-ROD i.c.v. fue efectivo para el marcado

y la cuantificación de neuronas receptivas para la MCH-ROD, dado que el

conjugado fue internalizado por elementos celulares del NAc, NSL, Hc y NDR. La

ventana temporal entre los tiempos post-inyección empleados no fue

suficientemente amplia para realizar una curva temporal de internalización de

MCH-ROD y detectar una graduación en dicho proceso.

Se comprobó que en todos los núcleos estudiados, las neuronas son capaces de

internalizar la MCH-ROD, no así los astrocitos.


En todos los núcleos de interés, la MCH-ROD fue internalizado por neuronas

GABAérgicas, mientras que en el NDR el conjugado también fue captado por

neuronas serotoninérgicas y dopaminérgicas.

El pre-tratamiento i.c.v. con el antagonista del MCHR1, el ATC-175, fue capaz de

bloquear la internalización de MCH-ROD a T20 en elementos celulares de NSL,

NAc, Hc y NDR, lo cual pone en evidencia la dependencia del receptor MCHR1

para dicho fenómeno de internalización

El pre-tratamiento i.c.v con PAO, exhibió una tendencia a la disminución de la

cantidad de células MCH-ROD (+), lo cual indicaría que la internalización del

receptor MCHR1 es parcialmente dependiente de clatrina, característica descrita

para los GPCRs en general.

10- PERSPECTIVAS

Dados los resultados obtenidos de los experimentos de microinyección intra-

NDR, además del empleo de 60 minutos post-inyección, tiempos más extensos

(por ejemplo 4 horas) pueden ser necesarios para la obtención de resultados que

permitan realizar la cuantificación al inyectar el conjugado directamente en el

parénquima de los núcleos de interés.

La inmunodetección de los MCHR1 en los núcleos donde éste se expresa, puede

actuar como complemento para los resultados obtenidos de los experimentos

de microinyección de MCH-ROD i.c.v., permitiendo no solo localizar al receptor

en los núcleos en los que se concentran los estudios, sino también en aquellas

neuronas que fueron capaces de internalizar el conjugado.

En relación al ítem anterior, el marcado de neuronas MCH-ROD (+), MCHR1 y un

marcador para identificar el fenotipo neuroquímico de las neuronas MCH-ROD

(+), ofrecerían una evidencia sólida sobre qué fenotipos neuroquímicos expresan

el receptor MCHR1 y son MCH-receptivos.

Realizar experimentos in vitro, con la incubación de rodajas conteniendo los

núcleos de interés con MCH-ROD y PAO o ATC-0175, nos permitiría realizar una


curva dosis-respuesta para cada droga, pudiendo así dilucidar las

concentraciones específicas a las que el efecto inhibitorio de la internalización

de MCH-ROD es más notorio.

Para confirmar la colocalización de las señales de MCH-ROD con las señales

correspondientes a los fenotipos neuroquímicos de interés, z-stacks de las

inmunofluorescencias para detectar su ubicación en las tres dimensiones de los

cortes empleados.

11- CONTRIBUCIONES

Los resultados presentados en esta Tesis de Maestría fueron expuestos en formato

póster en los siguientes congresos:

Jornadas XV de la Sociedad Uruguaya de Biociencias (SUB) – 2014,

Maldonado, Uruguay

Título del poster: Estudio de internalización de la Hormona Concentradora

de Melanina (MCH) y su receptor mchr-1 en ratas: puesta a punto de un

protocolo de microinyección

9th World Congress International Brain Research Organization (IBRO) – 2015,

Rio de Janeiro, Brasil y Jornadas de SNU

Título del poster: In vivo approach to study the internalization of Melanin

Concentrating Hormone (MCH) and its receptor in the CNS of the rat

2nd FALAN Congress – 2016, Buenos Aires, Argentina

Título del poster: A novel in vivo approach to study the internalization of

Melanin-Concentrating Hormone in the CNS of the rat.


Parte de los resultados formarán parte de dos manuscritos a publicar que se

encuentran en elaboración:

1- “In vivo and in vitro evidences of the internalization of MCHR1 at

hippocampal neurons by rhodamine-labeled MCH” – Ruiz, Vicente;

Mouhape, Camila; Prunell, Giselle; Lagos, Patricia.

2- “Internalization dynamics of MCHR1 at several structures of the Central

Nervous System of the rat by a novel in vivo approach” – Ruiz, Vicente;

Urbanavicius, Jessika; Torterolo, Pablo; Lagos, Patricia

12- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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13- ABREVIATURAS

3V: tercer ventrículo

ACh: acetilcolina

Am: amígdala

AqS: Acueducto de Silvio


ATV: área tegmental ventral

CA: Cornu Ammonis

cc: cuerpo calloso

ccx: corteza cerebral

CPF: corteza prefrontal

GABA: ácido γ-aminobutílico

GAD: glutamato descarboxilasa

GPCR: receptor acoplado a proteína G, del inglés: G Protein-coupled Receptor

Hc: hipocampo

i.c.v.: intracerebroventricular

intra-NDR: intra-rafe

i.p.: intraperitoneal

IP3: inositol 3-fosfato

HL: Hipotálamo lateral

Hp: hipotálamo

LC: locus coeruleus

LCR: Líquido Cefalorraquídeo

MCH: hormona concentradora de melanina

MCHR1: del inglés, Melanin Concentrating Hormone Receptor-1

MCH-ROD: MCH-rodamina

MSN: del inglés Medium Spiny Neurons

NAc: núcleo Accumbens

NDR: Núcleo Dorsal del Rafe

NPe: Núcleo hipotalámico Periventricular

NSL: Núcleo Septolateral

PAG: del inglés, Periaqueductal Gray

PAO: del inglés, phenylarsine oxide

PFA: paraformaldehído

PTX: del inglés, pertussis toxin

ROD: rodamina

SNC: Sistema Nervioso Central


SuC: del inglés, Superior Colliculi

TH: tirosina hidroxilasa

VL: ventrículo lateral

ZI: Zona Incertohipotalámica

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