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Isabel Saro * , Miguel Ángel GonzálezPérez y Pedro A. Sosa Departamento de Biología. Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. 35017 Gran Canaria. Islas Canarias. Spain. * [email protected] Estudio de la dinámica y extensión del flujo genéEco de la palmera canaria (Phoenix canariensis) INTRODUCCIÓN RESULTADOS CONCLUSIONES La palmera canaria Phoenix canariensis Hort. ex Chab. (Arecaceae) es una de las especies endémicas más importantes y representativas del archipiélago canario, que se encuentra ampliamente distribuida de manera individual o formando palmerales en todas las islas del archipiélago. El movimiento génico entre los distintos individuos, es lo que determinará el grado de adaptación local de sus poblaciones, siendo la dispersión del grano de polen el componente más importante en el transporte a larga distancia de los genes. Asignando la paternidad de semillas colectadas a partir de madres genotipadas y localizadas en campo, y mediante el uso de microsatélites nucleares, evaluamos dicho flujo genético y estimamos su influencia en la estructuración genética poblacional, obteniendo los patrones de polinización, distancias y trayectorias exactas del polen. METODOLOGÍA Se escogió la población natural de Acusa Verde, situada en el termino municipal de Artenara en el noroeste de la isla de Gran Canaria, con aproximadamente 10 ha de superficie. La población está constituida por 182 individuos naturales: 102 adultos reproductores (45 hembras y 57 machos), 59 individuos juveniles (de hasta 5 m de altura pero sin haberse desarrollado sexualmente) y 21 brinzales (plantas de menos de 3 años). Además, se colectaron frutos maduros de 23 hembras que se procedieron a germinar. De todas las palmeras se recogió una muestra foliar a la vez que se marcaron y georreferenciaron. Se analizaron genéticamente todos los ejemplares de la población y 22 plántulas por cada madre, con lo que se contó con un tamaño muestral de casi 700 genotipos. Para la caracterización genética se utilizaron 8 loci microsatélites descritos para P. dactylifera (Billote et al. 2004). La extracción de ADN se llevó a cabo siguiendo el protocolo de Dellaporta et al. (1983) y la purificación mediante el GenElute Plant Genomic DNA Kit de SIGMA. La lectura de los alelos fue llevada a cabo con el programa GeneMapper ® 4.0. Para el análisis de la variación genética poblacional se utilizó el GenALEx 6.4.1(Peakall & Smouse, 2006) y para la asignación de parentesco de las semillas el CERVUS 3.0 (Kalinowski et al. 2007). El tratamiento de los datos geográficos fue llevado a cabo con ArcMap™10. El número de alelos por locus varió entre 2 (mPh15 y mPh25) y 15 (mPh48). El contenido de información polimórfica por locus (PIC) varió entre 0,010 (mPh25) y 0,753 (mPh48), siendo el valor combinado para este índice de 0,481 (Tabla 1). El grado de variabilidad genética de la población natural fue elevado (P= 80,9%; Ho= 0,500; He= 0,422) siendo muy similar y homogéneo en los diferentes estadios de vida considerados: plántula, brinzal, juvenil y adulto. La población y su descendencia (progenie) se encuentra en equilibrio de Hardy- Weinberg. Se detectó un total de 47 alelos, de los cuales 5 (10%) fueron exclusivos de 4 plántulas, y que no aparecen en los adultos, sugiriendo la introgresión de flujo genético externo procedente de individuos alejados de la población, consecuencia de flujo genético a larga distancia. AGRADECIMIENTOS REFERENCIAS Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de Ciencia e Innovación, Plan Nacional de I+D+I (CGL2009-10215). El Cabildo de Gran Canaria ha facilitado el uso de las instalaciones del Vivero Forestal del Cabildo. Gracias a Agustín Naranjo por su asesoramiento en el tratamiento de los datos geográficos, a Marcos Díaz-Bertrana por su colaboración en los trabajos de campo, y a Elisabet Rivero, Cynthia Díaz, Josué Ramírez y Jorge Carnicer por su ayuda en la extracción y amplificación de ADN. Billote N, Marseillac N, Brottier P, Noyer JL, Jacquemoud-Collet JP, Moreau C, Couvreur T, Chevallier MH, Pintaud JC & Risterucci M (2004). Nuclear microsatellite markers for the date palm (Phoenix dactylifera L.): Characteriztion and utility across the genus Phoenix and other palm genera. Molecular Ecology Notes, 4:256-258. Dellaporta S, Wood I & Hicks JB (1983). A plant DNA minipreparation: version II. Plant Molecular Biology Reporter, 14:19-21. Kalinowski ST, Taper ML & Marshall TC (2007). Revising how the computer program CERVUS accomodates genotyping error increases success in paternity assignment. Molecular Ecology, 16: 1099-1106. Peakall R & Smouse PE (2006). GENALEX 6: Genetic Analysis in Excel. Population Genetic Software for Teaching and Research. Molecular Ecology Notes, 6: 288- 295. El flujo genético dentro de la población de Acusa Verde es considerablemente elevado, lo cual se traduce en una homogenización de la diversidad genética poblacional, y en un equilibrio de Hardy-Weinberg, sin estructuración genética aparente. A pesar de tener genotipado el 100% de la población adulta, solo se ha podido excluir estrictamente al 40% de los padres. El bajo grado de polimorfismo de algunos loci (mPh25 y mPh15) y la posible relación genética de los individuos en la población ha podido restringir dicho nivel de exclusión estricta. Las semillas de una misma madre proceden de un elevado números de padres, de forma que hasta 20 machos pueden contribuir a la progenie de una misma madre. El flujo genético en la población no parece seguir un patrón determinado ni se aprecia estructuración genética intrapoblacional. Desde el punto de vista de la conservación genética, una única madre dispone de semillas que albergan el 40% de la diversidad genética de la población. Solamente 2 loci (mPh15 y mPh25) mostraron una alta probabilidad (> 0,75) de que dos muestras escogidas al azar no se pudieran diferenciar por su genotipo. Sin embargo, la probabilidad combinada de todos los loci generó una probabilidad de no exclusión muy baja (NE-I = 0,9x10 -5 ) demostrando la fortaleza de los loci (Tabla 1). En este sentido, el nivel de confianza de la asignación de parentesco en un nivel estricto (95%) fue del 40%, mientras que considerando un nivel relajado (85%) fue del 68%. Los análisis de paternidad mostraron que en la descendencia de una sola madre podrían intervenir entre 9 y 20 padres candidatos diferentes distribuidos por toda la población. De hecho, sólo 2 individuos masculinos de los 57 no fueron candidatos en la asignación de paternidad de las plántulas. Así mismo, se observó que un mismo ejemplar podría ser el padre candidato más probable de hasta 37 plántulas de 13 madres diferentes, y podría polinizar entre 1 y 14 hembras de la población (Fig. 1). El flujo genético observado entre todos los ejemplares de la población es elevado y multidireccional, existiendo una alta paternidad efectiva. La distancia de separación entre machos y hembras relacionados varió considerablemente desde 4 a 290 m de distancia, siendo la distancia media de polinización de aproximadamente 75 m (Fig. 2). Esta alta relación entre los individuos de la población contribuye en que se pueda encontrar en la progenie de cada madre hasta el 43% de todos los alelos detectados en la población. Esto supone que tres madres albergan el 100% de la variación genética presente en toda la población. Locus A PIC NE1P NE2P NEPP NEI Frec. AN mPh078 9 0,69 0,672 0,495 0,306 0,113 0,6942 mPh010 5 0,575 0,782 0,628 0,462 0,194 0,0178 mPh015 2 0,09 0,996 0,955 0,916 0,825 0,0162 mPh057 11 0,555 0,787 0,639 0,469 0,210 0,018 mPh048 15 0,753 0,595 0,417 0,234 0,078 0,036 mPh025 2 0,010 1.000 0,995 0,990 0,980 0,0002 mPh085 7 0,522 0,827 0,660 0,478 0,231 0,0124 mPh063 6 0,655 0,717 0,545 0,367 0,137 0,0264 Media 7,13 0,481 0,145 0,028 0,0024 0,9 x 10 5 Figura 2 Esquema del patrón de polinización observado para tres palmeras hembras localizadas en el núcleo principal de la población. Cada color representa el flujo genético vía polen hacia cada madre desde los padres asignados. Las líneas más gruesas hacen referencia al aumento en las veces en que un determinado macho aparece como padre candidato de las semillas de esa madre. Los puntos negros son el resto de individuos de la población. 0 2 4 6 8 10 12 14 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Nº de casos a) Nº de hembras que poliniza un mismo individuo masculino 0 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 15 16 17 19 20 29 32 37 Nº de casos b) Nº de plántulas asignadas a un mismo padre Tabla 1. Loci analizados y probabilidades de no exclusión en el análisis de parentesco. A: número de alelos, PIC: contenido de información polimórfica, NE-1P: probabilidad media de no exclusión de un padre candidato no relacionado, NE-2P: probabilidad media de no exclusión de un padre candidato no relacionado cuando se conoce el genotipo de la madre, NE-PP: probabilidad media de no exclusión de una pareja de candidatos no relacionados, NE-I: probabilidad media de no exclusión de la identidad de dos individuos, Frec. AN: Frecuencia de alelos nulos. Figura 1. a) número de veces en que un macho apareció como candidato de la donación polen entre las diferentes hembras y b) número de veces en que un macho apareció como padre candidato entre las diferentes plántulas.
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Isabel Saro*, Miguel Ángel González-‐Pérez y Pedro A. Sosa Departamento de Biología. Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. 35017 Gran Canaria. Islas Canarias. Spain. * [email protected] !
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Estudio de la dinámica y extensión del flujo genéEco de la palmera canaria (Phoenix canariensis)
INTRODUCCIÓN!
RESULTADOS!
CONCLUSIONES!
La palmera canaria Phoenix canariensis Hort. ex Chab. (Arecaceae) es una de las especies endémicas más importantes y representativas del archipiélago canario, que se encuentra ampliamente distribuida de manera individual o formando palmerales en todas las islas del archipiélago. El movimiento génico entre los distintos individuos, es lo que determinará el grado de adaptación local de sus poblaciones, siendo la dispersión del grano de polen el componente más importante en el transporte a larga distancia de los genes. !!Asignando la paternidad de semillas colectadas a partir de madres
genotipadas y localizadas en campo, y mediante el uso de microsatélites nucleares, evaluamos dicho flujo genético y estimamos su influencia en la estructuración genética poblacional, obteniendo los patrones de polinización, distancias y trayectorias exactas del polen.!
METODOLOGÍA!Se escogió la población natural de Acusa Verde, situada en
el termino municipal de Artenara en el noroeste de la isla de Gran Canaria, con aproximadamente 10 ha de superficie.!
La población está constituida por 182 individuos naturales: 102 adultos reproductores (45 hembras y 57 machos), 59 individuos juveniles (de hasta 5 m de altura pero sin haberse desarrollado sexualmente) y 21 brinzales (plantas de menos de 3 años). Además, se colectaron frutos maduros de 23 hembras que se procedieron a germinar. De todas las palmeras se recogió una muestra foliar a la vez que se marcaron y georreferenciaron. !
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Se analizaron genéticamente todos los ejemplares de la población y 22 plántulas por cada madre, con lo que se contó con un tamaño muestral de casi 700 genotipos. Para la caracterización genética se utilizaron 8 loci microsatélites descritos para P. dactylifera (Billote et al. 2004). !! La extracción de ADN se llevó a cabo siguiendo el protocolo de Dellaporta et al. (1983) y la purificación
mediante el GenElute Plant Genomic DNA Kit de SIGMA. La lectura de los alelos fue llevada a cabo con el programa GeneMapper® 4.0. Para el análisis de la variación genética poblacional se utilizó el GenALEx 6.4.1(Peakall & Smouse, 2006) y para la asignación de parentesco de las semillas el CERVUS 3.0 (Kalinowski et al. 2007). El tratamiento de los datos geográficos fue llevado a cabo con ArcMap™10.!!
El número de alelos por locus varió entre 2 (mPh15 y mPh25) y 15 (mPh48). El contenido de información polimórfica por locus (PIC) varió entre 0,010 (mPh25) y 0,753 (mPh48), siendo el valor combinado para este índice de 0,481 (Tabla 1). !!
El grado de variabilidad genética de la población natural fue elevado (P= 80,9%; Ho= 0,500; He= 0,422) siendo muy similar y homogéneo en los diferentes estadios de vida considerados: plántula, brinzal, juvenil y adulto. La población y su descendencia (progenie) se encuentra en equilibrio de Hardy-Weinberg.!!
Se detectó un total de 47 alelos, de los cuales 5 (10%) fueron exclusivos de 4 plántulas, y que no aparecen en los adultos, sugiriendo la introgresión de flujo genético externo procedente de individuos alejados de la población, consecuencia de flujo genético a larga distancia.!
AGRADECIMIENTOS!
REFERENCIAS!
Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de Ciencia e Innovación, Plan Nacional de I+D+I (CGL2009-10215). El Cabildo de Gran Canaria ha facilitado el uso de las instalaciones del Vivero Forestal del Cabildo. Gracias a Agustín Naranjo por su asesoramiento en el tratamiento de los datos geográficos, a Marcos Díaz-Bertrana por su colaboración en los trabajos de campo, y a Elisabet Rivero, Cynthia Díaz, Josué Ramírez y Jorge Carnicer por su ayuda en la extracción y amplificación de ADN.!
Billote N, Marseillac N, Brottier P, Noyer JL, Jacquemoud-Collet JP, Moreau C, Couvreur T, Chevallier MH, Pintaud JC & Risterucci M (2004). Nuclear microsatellite markers for the date palm (Phoenix dactylifera L.): Characteriztion and utility across the genus Phoenix and other palm genera. Molecular Ecology Notes, 4:256-258.!
Dellaporta S, Wood I & Hicks JB (1983). A plant DNA minipreparation: version II. Plant Molecular Biology Reporter, 14:19-21.!
Kalinowski ST, Taper ML & Marshall TC (2007). Revising how the computer program CERVUS accomodates genotyping error increases success in paternity assignment. Molecular Ecology, 16: 1099-1106.!
Peakall R & Smouse PE (2006). GENALEX 6: Genetic Analysis in Excel. Population Genetic Software for Teaching and Research. Molecular Ecology Notes, 6: 288- 295.!
§ El flujo genético dentro de la población de Acusa Verde es considerablemente elevado, lo cual se traduce en una homogenización de la diversidad genética poblacional, y en un equilibrio de Hardy-Weinberg, sin estructuración genética aparente.!§ A pesar de tener genotipado el 100% de la población adulta, solo se ha podido excluir estrictamente al 40% de los padres. El bajo grado de polimorfismo de algunos loci (mPh25 y mPh15) y la posible relación genética de los individuos en la población ha podido restringir dicho nivel de exclusión estricta.!§ Las semillas de una misma madre proceden de un elevado números de padres, de forma que hasta 20 machos pueden contribuir a la progenie de una misma madre.!§ El flujo genético en la población no parece seguir un patrón determinado ni se aprecia estructuración genética intrapoblacional.!§ Desde el punto de vista de la conservación genética, una única madre dispone de semillas que albergan el 40% de la diversidad genética de la población.!
Solamente 2 loci (mPh15 y mPh25) mostraron una alta probabilidad (> 0,75) de que dos muestras escogidas al azar no se pudieran diferenciar por su genotipo. Sin embargo, la probabilidad combinada de todos los loci generó una probabilidad de no exclusión muy baja (NE-I = 0,9x10-5) demostrando la fortaleza de los loci (Tabla 1). En este sentido, el nivel de confianza de la asignación de parentesco en un nivel estricto (95%) fue del 40%, mientras que considerando un nivel relajado (85%) fue del 68%. !
Los análisis de paternidad mostraron que en la descendencia de una sola madre podrían intervenir entre 9 y 20 padres candidatos diferentes distribuidos por toda la población. De hecho, sólo 2 individuos masculinos de los 57 no fueron candidatos en la asignación de paternidad de las plántulas. Así mismo, se observó que un mismo ejemplar podría ser el padre candidato más probable de hasta 37 plántulas de 13 madres diferentes, y podría polinizar entre 1 y 14 hembras de la población (Fig. 1). !
El flujo genético observado entre todos los ejemplares de la población es elevado y multidireccional, existiendo una alta paternidad efectiva. La distancia de separación entre machos y hembras relacionados varió considerablemente desde 4 a 290 m de distancia, siendo la distancia media de polinización de aproximadamente 75 m (Fig. 2). Esta alta relación entre los individuos de la población contribuye en que se pueda encontrar en la progenie de cada madre hasta el 43% de todos los alelos detectados en la población. Esto supone que tres madres albergan el 100% de la variación genética presente en toda la población.!
Locus A PIC NE-‐1P NE-‐2P NE-‐PP NE-‐I Frec. AN mPh078 9 0,69 0,672 0,495 0,306 0,113 0,6942 mPh010 5 0,575 0,782 0,628 0,462 0,194 -‐0,0178 mPh015 2 0,09 0,996 0,955 0,916 0,825 -‐0,0162 mPh057 11 0,555 0,787 0,639 0,469 0,210 -‐0,018 mPh048 15 0,753 0,595 0,417 0,234 0,078 -‐0,036 mPh025 2 0,010 1.000 0,995 0,990 0,980 -‐0,0002 mPh085 7 0,522 0,827 0,660 0,478 0,231 -‐0,0124 mPh063 6 0,655 0,717 0,545 0,367 0,137 -‐0,0264 Media 7,13 0,481 0,145 0,028 0,0024 0,9 x 10-‐5
Figura 2 Esquema del patrón de polinización observado para tres palmeras hembras localizadas en el núcleo principal de la población. Cada color representa el flujo genético vía polen hacia cada madre desde los padres asignados. Las líneas más gruesas hacen referencia al aumento en las veces en que un determinado macho aparece como padre candidato de las semillas de esa madre. Los puntos negros son el resto de individuos de la población.!
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a) Nº de hembras que poliniza un mismo individuo masculino!
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Nº d
e ca
sos!
b) Nº de plántulas asignadas a un mismo padre!
Tabla 1. Loci analizados y probabilidades de no exclusión en el análisis de parentesco. A: número de alelos, PIC: contenido de información polimórfica, NE-1P: probabilidad media de no exclusión de un padre candidato no relacionado, NE-2P: probabilidad media de no exclusión de un padre candidato no relacionado cuando se conoce el genotipo de la madre, NE-PP: probabilidad media de no exclusión de una pareja de candidatos no relacionados, NE-I: probabilidad media de no exclusión de la identidad de dos individuos, Frec. AN: Frecuencia de alelos nulos.!
Figura 1. a) número de veces en que un macho apareció como candidato de la donación polen entre las diferentes hembras y b) número de veces en que un macho apareció como padre candidato entre las diferentes plántulas. !
