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MAESTRÍA EN CIENCIAS YBIOTECNOLOGiA DE PLANTAS

Estudio del secretoma de Coffea canepAoradurante su embriogénesis somática

BENJAMÍN ABRAHAM AYIL GUTIÉRREZ

CENTRO DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA DE YUCATÁN, A.C.

Maestría en Ciencias y Biotecnología de Plantas

Estudio del secretoma de Coffea canephora durante suembriogénesis somática

Tesis para obtener el grado de Maestro en

Ciencias y Biotecnología de Plantas

Benjamín Abraham Ayil Gutiérrez

Mérida, Yucatán, México 2009

Centro de lnvestigación Científica de Yucatai;:;SS{z:?

Índice

Reconocimientos

Agradecimientos

Dedícatorias

Lista de abreviaturas

Lista do cuadros

Lista de figuras

Resumen

Abstract

lntroducción

CAPÍTULO I

Antecedentes

1.1 Embriogénesis somática

1.2 Biotecnología en café

1.3 Proteómica

1.4 Comunicación celular

1.5 Proteínas, moléculas y compuestos que intervienen en la ES

1.6 Hipótesis

1.7 0bjetivo general

1.8 0bjetivos particulares

T[

V

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ix

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7

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17

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CAPITULO 11

2.1 Diseño experimental

2.2 Materiales y métodos

2.2.1 Condiciones de mantenimiento para las plántulas del café 20

2.2.2 Material biológico e inducción de la embriogénesis somática 20

2.2.3 Recolección de proteínas en el medio de cultivo 20

2.2.4 Electroenfoque

2.2.5 Etapa de equilibrio

2.2.6 Electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) 22

2.2.7 Tinción con nitrato de plata para geles 2D-(SDS-PAGE) 22

CAPÍTULo lll 25

Resultados y Discusión

3.1 Perfil electroforético de proteínas extracelulare§ en el medio decultivo

25

25

3.2 Cuantificación de proteína en el medio de cultivo y patroneselectroforéticos durante el proceso embriogénico (14, 21 y 28 d) 29

3.3 Análisis electroforético de doble dimensión del curso tomporal 32

3.4 Referencias bibliográficas

CAPITULO IV

4.1 Conclusión general

4.2 Perspectivas

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79

79

ReconocimientosEste trabajo se realizó en la Unidad de Bioquímica y BiologíaMolecular de Plantas del Centro de lnvestigacjón Científica deYucatán, bajo la dirección del Dr. Víctor Manuel Loyola Vargasa quien agradezco el apoyo y la confíanza que me brindódurante la realización de este trabaj.o.

Este trabajo fue financiado por el Consej.o Nacional de Cienciay Tecnología y una beca de Maestría (204929) para BenjamínAbraham Ayil Gutiérrez.

111

AgradecimientosAI Dr. Víctor Manuel Loyola Vargas por sus consejos y el graninterés por la formación de investígadores en la comunidadcientífica en nuestro país.

A los revisores Dr. Víctor M. Loyola Vargas, Dr. FranciscoQuiroz Figueroa, Dr. Enrique Sauri Duch, Dra. Nancy SantanaBuzzy, Dra. Virginia Herrera Valencia, por sus sugerencias yrevisión critica con que enriquecieron este documento.

A la M. C. Rosa María Galaz Avalos y al Dr. Eliel Ruiz May porsu amistad y el apoyo técnico en la parie experimental.

AI Diseñador de lnteriores Mario Adrian Monjiote Reyes por suapoyo incondicional en el diseño y representación de mis ideas.

Finalmente agradezco a las autoridades del Centro delnvestigación Científica de Yucatán A.C. por permitirme realizareste trabajo de investigación en sus instalaciones,especialmente a la Unidad de Bioquímica y Biología Molecularde Plantas.

DedicatoriasA toda mi maravillosa familia por concederme rasgoscaracterísticos de un ser entusiasta.

A mi madre Antonia Guadalupe Gutiérrez González pordirigirme para ver nuevas vísiones en la vida.

A mi hermana Georgina y a su linda familia.

A mi súper sobrina Jimena por recordarme la alegría y laresistencia de caer de último.

A mis amigos Chucho, lván, Rogelio, Chico, Chupes, HugoLupita, Pame, Adriana, y Cristina por su amistad y su tiempocompahido.

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GlcNAc4HBAAGPs-BA

Lista de abreviaturas

Acetil-D-glucosaminaAlcohol 4-hidroxibencíloArabínogalactoproteínasAusencia de benciladeninaCentímetrosDíaDoble dimensiónEmbriogénesis somáticaEspecieFactor de Rápjda AlcalinizaciónFitosulfucinasKilodaltonesLipo-quito-oligosacáridosMasa molecularMasas pro-embriogénicasMicrolitrosMiligramosMililitros

MilímetrosMilimolarMinutosMolarPresencía de benciladeninaPrimera dimensiónProteínas Relacionadas a la PatogénesisProteínas Extracelulares de tipo 1Proteínas Extracelulares de tipo 2Proteínas extracelulares de tipo 3Punto isoeléctrícoRango de marcador molecularRango de punto jsoeléctricoSegundoSensible a temperatura (11)Vanilil bencil éter

lx

Lista de cuadros

Cuadro 1. Comparación de ausencia ypresencia de proteínas.Cuadro 2. Comparación de proteínas en elproceso embriogénico y el no embriogénicocontabilizándose proteínas exclusívassecretadas por tejido foliar al medjo de cultívoen el día 14 de incubación.

Cuadro 3. Comparación de proteínas en elproceso embriogénico y el no embriogénicocontabilizándose la presencia y ausencia deproteínas secretadas por el tejido foliar almedio de cultivo en el día 21 de incubación.

Cuadro 4. Comparación de proteínas en elproceso embriogénico y el no embriogénjcocontabilizándose la presencia y ausencia deproteínas secretadas por el tejido foliar almedio de cultivo en el día 28 de incubación.

Cuadro 5. Proteínas exclusivas en el procesoembriogénico indicándose el número otorgadoa cada proteína la MM, pl y localización. Eluso de las letras A,B,C,D indjca el panel yadjunto el día (14,21 y 28) de cadasecretoma.

Cuadro 6. Proteínas extracelulares durante elproceso embriogénico en diversos genotipos,MM y pl.

Xl

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Lista de figuras

Figura 1. Diseño experimental

Figura 2. Perfíl electroforético de lD de proteínasextracelulares bajo condiciones de inducción de ia 25embriogénesjs somátíca.

:kgr:rcae ,:.,apr::r,Ó:r:teefií:í::é::omd:dzoD ddee cpur:í::ná: 2 7explantes incubados por 60 días en ausencia debenciladenina (-BA) se utílizo 150 ug de proteínas.

Figura 4. Patrón electroforético en 2D de proteínas

::nr:¡T:+u::¡r:: ¡:ÉX,e%¡:sdp:ág,t¿veo 6eon 3r%see::¡,¡Ívdoe 28Se utilizo 200 ug de proteínas extracelularesprovenjentes de explantes de C. canephora.Figura 5. Reproducjbilidad del patrón

:t:c:r::3:éái:oc u:tTv: :ndpere:reont:ií: adse :g::::|u::::: 2 9(+BA).

Figura 6. Cuantificación de las proteínasextracelulares durante un curso temporal de 14, 21 30y 28 días.

Figura 7. Patrón electroforético en 2D de proteínasextracelulares en el medio de cultivo, durante 30diferentes días del tratamiento testigo (-BA).

:kgr::ae,:.,apr:tsróenne'ee,Ct:°ef8::t¡::ecnu,Z¡Po:ed:::tnet:n::32inducción (+BA) a la embriogénesis somática.

Figura 9. Patrón electroforético en 2D visualizandoproteínas secretadas por el tejido foljar al medio de 34cultjvo en ausencia de bencjladenina (-BA) en eldía 14 de incubación.

xiii

Figura 10. Patrón electroforético en 2Dvisualizando proteínas secretadas por el tejido 35foliar al medio de cultivo en ausencia debenciladenina (-BA) en el día 21 de incubación.

Figura 11. Patrón electroforético en 2Dvisualizando proteínas secretadas por el tejido 36foliar al medio de cultivo en ausencia debenciladenina (-BA) en el día 28 de incubación.

Figura 12. Patrón electroforético en 2Dvisualizando proteínas secretadas por el tejido 37foliar al medio de cultivo en presencia debenciladenina (+BA) en el día 14 de incubación.



Figura 15. Análisis electroforético en 2Dvisualizando proteínas de mayor masa molecular(MM) secretadas por el tejido foliar al medio de 43cultivo en ausencia y en presencia debenciladenina (BA) en el día 14 de incubación.

Figura 16. Análisis electroforético en 2Dvisualizando proteínas de menor masa molecular(MM) secretadas por el tejido foliar al medio de 44cultivo en ausencia y en presencia debenciladenina (BA) en el día 14 de incubación.

Figura 17. Análisis electroforético en 2Dvisualizando proteínas de mayor masa molecular 47(MM) secretadas por el tejido foliar al medio de

XIV

cultivo en ausencia y en presencia debenciladenina (BA) en el día 21 de incubación.

Figura 18. Análisjs electroforético en 2Dvisualizando proteínas de menor masa molecular 48(MM) secretadas por el tejido foliar al medio decultjvo en ausencia y en presencia debenciladenina (BA) en el día 21 de Íncubación.

Figura 19. Análisis electroforétíco en 2Dvisualizando proteínas de mayor masa molecular(MM) secretadas por el tejido foliar al medio de 50cultivo en ausencia y en presencia debenciladenina (BA) en el día 28 de incubación.

Figura 20. Análisis electroforético en 2Dvisualizando proteínas de menor masa molecular(MM) secretadas por el tejido foliar al medio de 51cultivo en ausencia y en presencia debenciladenina (BA) en el día 28 de incubación.

Figura 21. Análisis electroforético de 2Dvisualizando proteínas de mayor masa molecular(MM) secretadas por el tejido foliar al medio decultivo en ausencia de benciladenina (-BA)comparando los días 14, 21 y 28 de incubación.

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Figura 22. Análisis electroforético de 2Dvisualizando proteínas de menor masa molecular(MM) secretadas por el tejido foliar al medio de 54cultivo en ausencia de benciladenina (-BA)comparando los días 14, 21 y 28 de incubación.

Figura 23. Análisis electroforético de 2Dvisualizando proteínas de alta masa molecular 55(MM) secretadas por el tejido foliar al medio decultivo en presencia de benciladenina (+BA)comparando los días 14, 21 y 28 de incubación.

Figura 24. Análisis electroforético de 2DvÍsualízando proteínas de menor masa molecular

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:T|r%se::etapdr:Se::.Ía el dteej,dboe;:!::áeaj,nTed(i:BdA: 56comparando los días 14, 21 y 28 de incubación.

Xvl

ResumenSe sabe que durante la embriogénesis somática

diferentes compuestos de alta y baja masa molecular sonsecretados al medio de cultivo. Estos compuestos puedeninhibir o estimular la formación de embriones. Actualmente seha demostrado la pahicipación de proteínas y de otrasmoléculas, que son liberadas en el entorno celular, en elproceso embriogénico. No obstante, aún con el amplioconocimiento acerca de algunas proteínas que intervienen demanera importante en la embríogénesis somática, poco sesabe sobre la función biológica de las proteinas extracelularesque podrían estar implicadas en la estímulación y el desarrollode la embriogénesis somática en tejído foliar en la especieCoffea canephora. Por lo tanto, este trabajo de investigación sedirigió al estudio de las proteinas presentes en el medio decultivo para determinar si algunas de estas proteínassecretadas al entorno celular juegan un papel crucial durante laÍnducción en el proceso embriogénico. Se han logradorecolectar, concentrar y cuantificar proteínas extracelulares delmedio de cultivo durante diferentes tiempos, así como elanálisis de sus patrones electroforéticos en doble dimensión.Se han podido determinar alrededor de 250 proteínas en elmedio de cultivo en donde se induce la embriogénesissomática. Durante un análisis comparativo entre el procesoembriogénico y el testigo se observa la presencia, ausencia,aumento y decremento de diversas proteínas, destacando elhecho de que se han determinado 40 proteínas específicasdurante el proceso embriogénico. En este trabai.o se hace unapropuesta del posible papel que tienen las proteínassecretadas al medio de cultivo durante la embriogénesissomática,

Abstractlt is known that during somatic embryogenesis different

compounds of high and low molecular mass are secreted to theculture medium. These compounds can inhibit or stimulate theformation of the somatic embryos. Nevertheless, even with theextensive work done wíth proteins during the somaticembryogenesis process, liftle is known about the biologicalfunction of the extracellular proteins secreted by the explants.Therefore, this research is a first step on focussing on theelectrophoretic analysis of proteins in the culture medium.During this research, the proteins were collected from theculture medium during different tjmes after the induction of thesomatic embryogenesis in C. Canephora explants. The proteinswere analyzed by two dimensional electrophoresis. lt waspossible to visualize more than 250 proteins from the culturemedium. A comparative analysis shows the presence, absence,increase and decrease of several proteins, highlighting the factthat there are 45 proteins that are secreted only during theinduction of the somatic embryogenesis.

lntroducciónDurante el proceso morfogenético en células

embriogénicas, que tiene lugar en callos o directamente enexplantes provenientes de plantas, se ha observado que seproduce una gran diversidad de moléculas y compuestos.(\/Varren y Fowler,1981). Entre la amplia variedad de moléculasque se han identificado se encuentran polisacáridos,aminoácidos, reguladores del crecímiento, vitaminas ypolipéptidos (Chung ef a/., 1992). Estos compuestos podríanestar interactuando entre sÍ para dar origen a diferentesprocesos entre los cuales se encuentra la embriogénesissomática (ES). Varios autores han definido a la ES como elproceso mediante el cual las células somáticas, bajocondiciones de inducción generan células embriogénicas, lascuales sufren una serie de cambios bioquímicos y morfológicosdando origen a la formación de un embrión somático.(Komamine ef a/., 2005; Schmidt eí a/., 1997; Zimmerman,1993).

Además de reguladores del crecimiento que estimulan ladiferenciación durante la ES (Matthys-Rochon eí a/., 1998;Zimmerman, 1993), diferentes compuestos, moléculas yproteínas han sido identificados como factores que podríanestar estimulando o inhibiendo la formación de embriones. Seha visto que estos factores podrían estar relacionados con lacoordinación de la división celular y la morfogénesis (Warren yFowler,1981), también podrían ser secretados desde la paredcelular mientras que otros se originan desde el interior de lacélula. Por otra parie, se ha observado, que estas moléculasjuegan un importante papel en el desarrollo de la ES ya seacomo inhibidores o como inductores (Matthys-Rochon, 2005;Quiroz-Figueroa eí a/., 2000; Van Engelen y De Vries,1992).Estos compuestos extracelulares pueden ser clasificados debaja o de alta masa molecular.

CAPÍTULO I

Antecedentes

1.1 Embriogénesis somática

Los primeros reportes de la embriogénesis somática seobtuvieron a fines de los años 50s en cultivos de Oaucus carofa(Reinert, 1959; Steward eí a/., 1958) y Oenaníhe aquaí/.ca(Krikorian y Simola, 1999; Waris, 1957). Desde entonces losembriones somáticos han sido obtenidos de diversas especiesde plantas (Ammirato, 1983; Quiroz-Figueroa eí a/„ 2006b;Williams y Maheswaran,1986) zanahoria (D. canoía) ha sido elmodelo más utmzado, debido principalmente a su viabilidad,una respuesta rápida y altos rendimientos. La embriogénesises uno de los procesos más importantes de desarrollo en elciclo de la vida de una planta. Sin embargo, diferentesacontecimientos durante este proceso aún no se conocen(Goldberg eí a/,,1994), Por otro lado la ES es utilizada comoun modelo de investigación en diferentes procesos fisiológicos,bioquímicos y moleculares (Zimmerman,1993).

Diferentes autores definen a la ES como el procesomediante el cual las células somáticas, bajo condiciones deinducción, generan células embriogénicas a través de una seriede cambios bioquímicos y morfológicos lo que da comoresultado la formación de un embrión somático (Komamine efa/., 2005; Schmidt eí a/.,1997; Zimmerman,1993). A díferenciade sus homólogos los embriones cigóticos, los embrionessomáticos son fácilmente manipulados modificando lascondiciones del medio de cultivo (Kawahara y Komamine,1995).

1.2 Biotecnología en café

La embriogénesis somática en el café fue mencionadapor primera vez por Sataritsky (1970) en donde se reportó laobtención de embriones somáticos en Coffea car)ephora. Apartir de entonces los embriones somáticos pueden serobtenidos utilizando diferentes protocolos, y usados comoherramienta en cultivo de tejidos en este género (Dublin,1981 ;Dublin, 1984; Neuenschwander y Baumann, 1992; Quiroz-Figueroa ef a/., 2002a; Sóndahl y Sharp,1977; Yasuda eí a/.,1985; Zamarripa ef a/.,1991).

En la actualidad ha habido un constante flujo deinformación sobre diversos aspectos de la investigaciónbiotecnológica del cafeto y se ha profundizado todavía más conlos avances de la genómica. Se han optimizado con éxitovarios métodos de regeneración /.n v/.fro y propagación en café,así como el de cultivos de yemas axilares y meristemosapicales, la inducción y el desarrollo de yemas adventicías,cultivos de embriones cigóticos, cultivos de anteras,suspensiones celulares y cultivos de protoplastos (Giridhar eía/., 2004b; Giridhar eí a/., 2004a; Hatanaka eí a/.,1991 ; Naidu ySreenath,1999; Sreenath ef a/.,1995).

La biotecnología en café ofrece alternativas para generarnuevas y mejores variedades incluyendo de resistencia, encondiciones ambientales extremas, resistentes aenfermedades, plagas, así como en la baja producción encafeína. El cultivo de tejidos juega un papel importante en labiotecnología en plantas, y ha conducido a la regeneración /.nv/.fro y la multiplicación de plantas bajo condiciones axénicas.La producción en biorreactores de la embriogénesis somática agran escala, la producción de semillas artificia[es,criopreservación, variación somaclonal, y la transformacióngenética son las áreas de mayor investigación (Santana-Buzzyet al., 2007).

1.3 ProteómicaLa proteómica es el análisis completo de los productos

de los genes en diversos tejidos y estadios fisiológicos de lascélulas (Pandey y Mann, 2000). La investigación de laparticipación de proteínas en diversos procesos celulares hallegado ser de gran importancia para el conocimiento delproteoma, el cual a su vez ha sido de gran relevancia para elestudio de células y organismos a nivel molecular. Lacaracterización de proteínas en las plantas ha tenido grandesavances y esto ha sido posible gracias a las técnicaselectroforéticas de doble dimensión (Kersten ef a/,, 2002; VanWijk, 2001). Varios de los principales estudios se han centradoen proteomas subcelulares y en complejos de proteínas (Bae eía/., 2003; Chivasa ef a/., 2002; Kruft eí a/., 2001; Millar ef a/„2001; Peltier eí a/., 2000; Prime ef a/., 2000; Rouquie ef a/.,1997). Sin embargo, es muy poco el estudio y casi no seconoce nada sobre la proteómica de proteínas secretadas en elmedio de cultivo en explantes de tejido foliar de la especieCoffea canephora.

1.4 Comunicación celularLa pared celular de las plantas es un complejo de

múltiples carbohidratos y proteínas. Además de su funcióncomo marco estructural que protege a la célula vegetal,también interactúa como fuente de información de señalizaciónpara moléculas extracelulares (Fry ef a/., 1993; Malinowski yFilipecki, 2002; Strauss, 1998). La pared celular es una zonadinámica y es fuente de diversos componentes que regulan lasinteracciones de célula a célula, así como las proteínas queson secretadas al exterior de la célula y que juegan un papelcrucial, en diferentes procesos fisiológicos, tales como elcrecimiento, el desarrollo y respuestas de defensa (Pennell,1998; Showalter,1993). Las proteínas más abundantes y mejorestudiadas en la pared celular son las proteínas estructurales,incluyendo extensinas, proteínas ricas en glicina, prolina yarabinogalactanoproteínas (Showalter, 1993). También

contiene un número grande de proteínas no estructurales,incluyendo peroxidasas, invertasas, proteasas, manosidasas,galactosidasas y glucanasas.

1.5 Proteínas, moléculas y compuestos queintervienen en la ES

1.5.1 ProteínasEn diferentes trabajos se ha observado que los cultivos

embriogénicos secretan algunas proteínas que modifican ladiferenciación de los embriones y que podrían ser utilizadaspara caracterizar su potencíal embriogénico (De Vries eí a/.,1988a De Vries ef a/„ 1988b). En suspensíones celulares de D,carota, Cucumis sativus, Vitis vinifera y Hordeum vulgare se haobservado la presencia de proteínas extracelulares especificasdel proceso de la ES (Coutos-Thevenot eí a/.,1992; Filipecki yPrzybecki, 1994; Níelsen y Hansen, 1992). En otro estudiorealizado en el género C/.chon'um sp se determinó la presenciade proteínas extracelulares de 9 kDa que son secretadas almedio de cultivo y las cuales podrían estar induciendo la ES(Blanckaert ef a/., 2002). Se desconoce cuál es la función delas proteínas en el medio de cultivo; sin embargo, se puedeespecular que una posible función es la modificación de lospolímeros de la pared celular. Se ha observado que algunas deestas proteínas juegan un importante papel en el desarrollo delproceso de la ES, ya sea promoviéndolo o inhíbiéndolo (Quiroz-Figueroa eí a/., 2000; Van Engelen y De Vries,1992).

Por ejemplo, la tunicamicina (un inhibidor de la

glucosilación) inhibe la ES en zanahoria y se ha determinadoque la ES se puede restaurar al añadir peroxidasas al medio decultivo (Cordewener eí a/„ 1991). En otro estudio de proteínasextracelulares que inhiben la ES en C/.frt/s auranf/.um Gavish eía/. (1991; 1992) determina que el desarrollo normal de la ESdepende obligatoriamente de la ausencia de proteínasglucosiladas entre 53 y 57 kDa. También se ha detectadoactividad de proteasa tanto en cultivos embriogénícos como no

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embriogénicos en zanahoria durante el crecimiento de callo y laformación de los embriones (Carlberg eí a/.,1984).

Se ha visto que durante el curso de desarrollo de uncultivo las proteínas secretadas aumentan y entre éstas la EP1(Proteínas extracelulares de tipol) es secretada por células noembriogénicas Van Engelen y De Vries,1992), mientras queEP2 (Proteínas extracelulares de tipo 2) únicamente essecretada por las células embriogénicas (Sterk eí a/., 1991).Otra proteína llamada EP3 (Proteínas Extracelulares de tipo 3)fue identificada como una quitinasa (De Jong ef a/., 1992). Seha visto que las quitinasas están involucradas en la generaciónde moléculas esenciales para la señalización en la ES (DeJong eí a/„ 1993). El mecanismo responsable es en granmedida desconocido. Curiosamente, EP3 también seencuentran presentes durante el desarrollo de semillas dezanahoria. Debe esperarse que las quitinasas jueguen un papelimportante durante el desarrollo de los embriones cigóticos. Lapresencia de EP3 puede dar lugar a la generación de GlcNAc(Acetil-D-glucosamina) que contienen moléculas que tienen unefecto estimulante sobre el desarrollo de los embrionessomáticos, efecto comparable con la acción de las quitinasascapaces de actuar en los factores Nod (Staehelin eí a/.,1994).

Se ha observado la participación en la ES de EP3, conuna masa molecular de 32 kDa, en los que se utilizó la líneacelular de D. carofa, mutante sensible a temperatura (Ís77) quepuede desarrollar el proceso de la ES en forma normal a 24°C,en tanto que a 32°C el proceso no va más allá del estadioglobular, a menos que el sistema sea complementado conmedio condicionado de cultivos silvestres o del mismo cultivo a24°C (Lo Schiavo eí a/., 1990). Los embriones fs77respondieron a la adición de esta glucoproteína ácida, laendoquitinasa -EP3- (De Jong eí a/., 1992; De Jong eí a/.,1995), aumentando el número de embriones globulares a 32°C(Kragh ef a/., 1996) y restaurando el sistema endomembranalde los embriones Ísí7 (Baldan ef a/.,1997). Esta mutante no es

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capaz de llevar a cabo apropiadamente la glucosilación dealgunas proteínas a temperatura no permisjble (32 °C).

En otros trabajos se ha observado la presenciaArabinogalactoproteínas (AGPs) y Proteínas RelacionadasPatogénesis (PRP), las cuales se ha sugerido que jueganpapel en el desarrollo de la ES. Las AGPs son una famjliaproteoglucanos con un alto contenido de carbohidratosresiduos de arabinosil y galactosil en estructurasramificadas, además de ser proteínas básicas ricashidroxiprolina, serina, alanina y glicina (Majewska-Sawka yNothnagel, 2000; Showalter, 2001; Van Engelen y De Vries,1992). Se han identificado AGPs en cultivos celulares dezanahoria (Kreuger y Van Holst, 1993; Mccabe ef a/., 1997),Ch/.chor/.um (Chapman eí a/., 2000), rosas (Svetek eí a/., 1999)y microsporas de maíz (Borderies ef a/., 2004). Se sabe que lasAGPs pueden ser el sustrato de las endoquitinasas (Showalter,2001; Van Hengel eí a/., 1998). Las endoquitinasas puedengenerar señales a partir de las AGPs en forma deoligosacáridos. Letarte ef a/., (2006) lograron incrementar elnúmero de embriones y regenerar plántulas de rn.f/.cumaesí/.vum utilizando arabjnogalactanos. Estos resultadosapoyan la hipótesis de que las AGPs desempeñan un papelimportante en el desarrollo estructural durante laembriogénesís. Sin embargo, también se ha vísto que otrogrupo de AGPs no afectan el proceso (Toonen ef a/., 1997).

Respecto a las PRP que han sido detectadas en elmedio de cultívo se pueden enumerar principalmente lasquitinasas, glucanasas y taumatinas. De suspensionescelulares embriogénicas en cereales se aíslaron tres quitinasasy una P-1,3-glucanasa en Ch/.chor/.um (Helleboid eí a/.,1998;Helleboid eí a/., 2000) así como también en maíz (Borderies eía/., 2004). Por otro lado las taumatinas han sido identificadasen cultivos embríogénicos de microsporas de maíz y tambiénen cebada (Osmond eí a/., 2001). Las taumatinas son PRPcapaces de unirse y actuar en conj.unto con pequeñoscomponentes como los oligosacáridos. Los genes

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correspondientes a estas enzimas han sido clonados y suexpresión apoya la hipótesis de que participan en la ES enCh/.chon.um (Helleboid eí a/., 2000). Recientemente se hadetectado la presencia de quitinasas en medio de cultivocondicionado de microsporas de maíz, pero por el momentotodavía no se conoce con precisión cuál es su función(Borderies eí a/., 2004).

Nielsen y Hansen (1992) encontraron 50 polipéptidos deentre 10 y 50 kDa, los cuales son secretados por suspensionescelulares embriogénicas durante la fase de crecimientoindiferenciado los cuales fueron agrupados en 5 categorías 1)proteínas expresadas constitutivamente; 11) proteínas queaumentan en concentración durante la embriogénesis; 111)proteinas que disminuyen en concentración durante laembriogénesis; lv) proteínas asociadas con el medio de cultivousado durante la embriogénesis y V) proteínas que aumentandurante el crecimiento indiferenciado sin subcultivo.

En un estudio diferente, usando suspensionesembriogénicas en D carofa, se caracterizó la función de lasproteínas extracelulares y se hicieron diferentes observaciones,A) la velocidad de adquisición de la capacidad embriogénicapor células de hipócotilo aumenta considerablemente por laadición de proteinas extracelulares de una suspensiónembriogénica ya establecida (De Vries eí a/.,1988b); 8) la faltade capacidad embriogénica en líneas celulares o líneascelulares no embriogénicas puede ser parcialmenterestablecida por la adición de componentes secretados porlíneas celulares embriogénicas (De Vries eí a/.,1988b).

1.5.2 MoléculasTambién existen diversos tipos de moléculas que

promueven el efecto del desarrollo embriogénico /.n v/.fro. Entreestos compuestos destacan los oligosacáridos derivados de lapared celular los cuales han sido identificados en diferentesmedios de cultivo condicionados como en suspensionescelulares de espinaca (Fry,1986), maíz (Goralski eí a/., 2002;

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Paire eí a/., 2003) y tabaco (Sims eí a/.,1996). Se piensa quela liberación de oligosacáridos al medio de cultivo es elresultado de su separación de carbohídratos o glucoproteínasde la pared celular. Los olígosacárjdos podrían contribuir a lanutrición y desarrollo de estructuras, pero también al control delproceso embriogénico. Se ha visto que moléculas deseñalizacíón endógena, como los factores Nod, promuevenclaramente el desarrollo de embriones somáticos en la especieP/.cea ab/.es (Dyachok eí a/., 2002). Los factores Nod son unafamilia de lipo-quito-oligosacáridos (LCOs) que se encuentranformados por enlaces 4 -1,4 -N ligados a residuos Glc-NAc(Acetil-D-glucosamina) con carácter de tipo lipofílico y se havisto que son secretados por cultivos embrjogénicos (\/\/Íwegereí a/., 2003). Además, los factores Nod pueden ser substitutosde reguladores del crecimiento, como auxinas y citocininas,para promover la división celular (Dyachok eí a/., 2000). Asímismo se ha visto que inducen el desarrollo de masas pro-embriogénicas (PEMs) en la especie P/.cea ab/.es (Dyachok efa/., 2000; Egertsdotter y Von Arnold,1998). En zanahoria losfactores Nod estimulan la ES interactuando en el estadioglobular tardío (De Jong ef a/.,1993). Diferentes péptidos señaljuegan un papel importante en diversos aspectos como elcrecimiento y el desarrollo. También se ha demostrado suparticipación en el mecanismo de defensa en las plantas(Huffaker eí a/., 2006; Huffaker y Ryan, 2007) así comotambién en la proliferación celular en varias especiesincluyendo espárrago (Matsubayashí eí a/.,1997; Matsubayashiy Sakagami, 1996), arroz, maíz (Matsubayashi eí a/.,1997),zanahoria (Hanai eí a/., 2000) y Arab/.dops/.s Wang ef a/„ 2001 ).Se han identificado otros péptidos de señalización, bienestudiados en animales y más recientemente en plantas (Ryanet al. , 2002).

Se sabe que en las plantas algunas moléculas actúansobre la división celular o en el desarrollo del embrión. Entreellas, se purificó y caracterizó una nueva clase de hormonaspeptídicas, las fítosulfocinasas (PSKs) o péptidos disulfatados

14

de 4-5 aminoácidos que regulan la división celular(Matsubayashi y Sakagami, 1996) en suspensiones celularesde Asparagus. Se ha demostrado que la PSKs, químicamentesintetizada, induce la desdiferenciación y proliferación celularen células del mesófilo en espárrago, incluso enconcentraciones nanomolares (Hanai ef a/.. 2000;Matsubayashi eí a/., 1997; Matsubayashi y Sakagami, 199.6).También se ha demostrado que las PSKs promueven variosestadios de desarrollo y crecimiento en plantas incluyendo laES (Hanai ef a/„ 2000; lgasaki ef a/., 2003; Kobayashi et a/.,1999), formación de yemas adventicias, formación de raíces(Yamakawa ef a/., 1998) y estimula la germinación del polen(Chen eí a/., 2000). En células embriogénicas de zanahoriaHanai ef a/., (2000) demostraron la presencia de PSK en elmedio de cultivo, la cual estimula la formación de embriones.Se ha demostrado que cuando se añaden estos polipéptidos almedio de cultivo no condicionado causan proliferación celular,como si los cultivos fueran condicionados.

EI Factor de Rápida Alcalinización (RALF), otra hormona

polipeptídica, al parecer tiene un papel importanteespecialmente durante el desarrollo y la germinación de lassemillas. Aunque la función de estos polipéptidos sigue siendoaún desconocida, diferentes experimentos sugieren quepodrian interactuar durante el desarrollo. Lo que sugiere queesta molécula podría estar interviniendo en el desarrollo delembrión (Haruta y Constabel, 2003; Pearce eí a/„ 2001).

1.5.3 CompuestosSe ha visto que también se acumulan otro tipo de

factores en el medio de cultivo y afectan fuertemente la ES(Kobayashi ef a/., 2001; Umehara ef a/„ 2005). En un estudiorealizado en D. caroía se analizó la acumulación del alcohol 4-hydroxybenzyl (4HBA) en suspensiones celulares. La ES seindujo en cultivos de células embriogénicas libre dereguladores de crecimiento en el medio de Murashige y Skoog

15

(1962), con diferentes densidades celulares, para determinar laacumulación de 4HBA en el medio de cultivo. La concentracjónde 4HBA fue alta en cultivos de alta densidad celularcomparada con los cultivos de baja densidad celular. Laacumulación de 4HBA en cultivos de alta densidad celular fuerápida durante un corto periodo de cultivo. Esta rápidaacumulacíón de 4HBA en el cultivo de alta densidad celular dacomo resultado una inhibjción de la ES. La producción de4HBA disminuyó conforme se fue dando el procesoembriogénico (Kobayashi ef a/., 2001).

En la especie Lan.x /epío/ep/.s se ha encontrado otrofactor identifícado como vanilil bencil éter (VBE), el cual inhibela ES en cultivos a altas densídades celulares, especialmentedurante el desarrollo del suspensor, cuyo crecímiento esfuertemente inhibido debido a factores que son liberados porlas células al medio de cultivo, sugiriendo que este compuestotiene un papel negativo como regulador durante el procesoembriogénico en esta especie (Umehara eí a/., 2005).

16

1.6 HipótesisSi las proteínas extracelulares son parie de la cadena de

señales que llevan al establecimiento del proceso embriogénico,entonces su ausencia o presencia podría ser una de las causasen el nivel de producción de embriones somáticos en lasespedie Coffea canephora.

1.7 0bjetivo generalConocer el patrón proteico en 2D de las proteínas

extracelulares secretadas al medío de cultivo durante elproceso de la embriogénesis somática en los explantes de laespecjie Coffea canephora.

1.8 0bjetivos particularesDetermínar el número de proteínas extracelulares

durante el proceso embriogénico (+BA) y el tratamiento testigo(-BA).

Caracterizar los pemles electroforéticos en los diferentesdías de cultívo de las proteínas secretadas en el entorno celulardel tejido embriogénico en Coffea canephora.

17

CAPITULO 11

2.1 Diseño experimentalPara determinar el patrón electroforético de las proteínas

extracelulares secretadas en el medio de cultivo durante la ESen la especie C. canephora se incubaron explantes enpresencia o ausencia de benciladenina (BA) en el mediodescríto por Yasuda eí a/. (1985) y Quiroz-Figueroa ef a/.(2006a). El medio de cultivo se recolectó a lo largo de un cursotemporal en tres diferentes tiempos 14, 21 y 28 días. Seextrajeron las proteínas presentes en el medio de cultivo, secuantificaron y se separaron mediante electroforesis de dosdimensiones con el fin de comparar los patroneselectroforéticos y localizar las diferentes proteínas que podríanestar intervíniendo en el proceso embríogénico (Figura 1).

lnducción del tejido foliar

(+BA, -BA)

tDías de recolección del medio de cultivo

(14,21 y 28d)

tExtracción y cuantificación de proteína

tSDS -PAGE (12.5%) en 1 D

'SDS -PAGE (12.5%) en 2D

'Análjsis en SDS -PAGE (12.5%) en 2D

de proteínas díferenciales

Figura 1. Diseño experimental para determinar la presencia de proteínasextracelulares en el medio de cultivo durante el proceso de laembriogénesis somática en la especie Coffea oanepAora.

19

2.2 Materiales y métodos

2.2.1 Condiciones de mantenimiento para lasplántulas del café

Se emplearon plántulas de C. canephora, cultivadas /.nv/.íro en medio MS (Murashige y Skoog,1962), suplementadocon tiamina 29.6 LiM, mio-inositol, 0.56 uM, biotina 0.41 uM, L-cisteína 0.15 uM, sacarosa 87.64 mM, ácido naftalén acético0.54 uM, kinetina 2.32 LJM, gelrite 0.25% (w/v), el pH fueajustado a 5.8 y esterilizado (20 min,110°C). Las plántulasfueron cultivadas en condiciones de fotoperíodo (16 h/8 hluz/oscuridad) a 25°C ± 2°C y transferidas a medio fresco cada90 días.

2.2.2 Material biológico e inducción de laembriogénesis somática (ES)

Para la inducción de la ES en medio liquido seemplearon los protocolos establecidos previamente en nuestrolaboratorio (Quiroz-Figueroa eí a/., 2006a). A partir de las hojasse cortaron pequeños discos utilizando un sacabocados

:oyitaar:gocl:nn:Taad:[apecri?cn,terala!r::,smabdoádeds:Loo25excpta2nt::depositaron en medio liquido para la inducción de laembriogénesis directa en medio MS modificado (Quiroz-Figueroa ef a/„ 2006a) en presencia de benciladenina (BA) 5uM, en matraces Erlenmeyer de 250 ml. Los explantes fueronincubados bajo condiciones de oscuridad a 25 ± 2°C ymantenidas en rotación a 55 rpm.

2.2.3 Recolección de proteinas en el medio decultivo

El medio de cultivo utilizado para la inducción de la ESen los explantes de C. canephora se recolectó durante uncurso temporal de 14, 21 y 28 días. Al medio de cultivo de cada

20

matraz se le agregó una mezcla de inhibidores de proteasas(Sigma P9599) y se centrifugó a 8,000 x g por 15 min, se filtró através de un filtro de 0.45 Lim, se pasó a través de un sistemaconcentrador de proteínas Amicon Ultra Centrifugal FilterDevices (Millipore) con un corte de 5,000 Da; la fracción mayora 5 kDa se liofilizó y se resuspendió en 5 ml de aguabidestilada. El contenido de proteínas se determinó por elmétodo de Peterson (1977), se utílizó albúmina sérica bovinapara elaborar la curva estándar.

2.2.4 ElectroenfoqueLa separación de las proteínas se llevó a cabo

empleando el punto isoeléctrico de las proteínas mediante latécnica de electroenfoque. Esta técnica se realizó en tuboscapilares de cristal de 15 cm de longitud y 1.5 mm de diámetro.La solución para el gel contenía 9.5 M urea, 2°/o (p/v) NonidetP-40 (NP-40), 4% (p/v) poliacrilamida y 2% (v/v) de la mezclade anfolitos (volumen total 3 ml). Esta solución se desgasificópor 10 min y luego se adicionaron 2 ul de persulfato de amonioal 10°/o (p/v). lnmediatamente después se adicionaron 2 ul deTEMED. La solución resultante fue vertida en los capilares,previamente sellados con parafilm en la parte Ínferior y se dejópolimerizar por 1 h. Después de que la acrilamida polimerizó,los geles se colocaron en el aparato de corrida y se agregó elamoriiguador de lisis, que consistió en 9.5 M urea, 2% (p/v)NP-40 y 2% (v/v) de la mezcla de anfolitos (volumen total 3 ml).Los geles fueron precorridos a 600 V por 5 horas y a 800 V por12 horas. Al término de la precorrida se retiró el amohiguadorde lisis y se lavó la parte superior del tubo capilar. Acontinuación se cargó la muestra de proteínas en la partesuperior del tubo. Encima de la muestra se colocaron 5 ml delamortiguador de sobrecarga que contíene urea 9 M, 1% (v/v)de la mezcla de anfolitos y 0.05% (p/v) de azul de bromofenol.El amortiguador de corrida se colocó encima del amortiguadorde sobrecarga y la corrida final se llevó a cabo a 1,200 V por

21

5.5 horas. La solución del ánodo fue de H3P04 10 mM y lasolución del cátodo fue de NaoH 300 mM (O'Farrell,1975).

2.2.5 Etapa de equilibrioFinalizada la corrida, los geles fueron extraídos de los

tubos capilares y sumergidos en el amortiguador de equilibrio[0.0625 M Tris HC1, pH 6.8, 2.3% (p/v) SDS,1% (p/v) DIT,30% glicerol (p/v) y O.05°/o (p/v) azul de bromofenol], atemperatura ambiente por 15 min.

2.2.6 Electroforesis en geles de poliacrilamida(SDS-PAGE)

La electroforesis se realizó con base en el sistemadiscontinuo propuesto por Laemmli (1970). Se ensambló elequipo de electroforesis (SE 600 series electrophoresis unitl,Hoefer) de 14 x 16 cm con un espesor para el gel de 1.5 mm,según las instrucciones del fabricante. Previamente loscristales que están en contacto directo con el gel se limpiaroncon etanol al 70% (v/v). Los geles para la segunda dimensiónse realizaron en un gel de separación uniforme depoliacrilamida al 12.5°/o (p/v). Los geles de los capilares sefijaron horizontalmente sobre el gel vertical de poliacrilamida yla corrida se llevó a cabo a 150 V por 5 h. Finalizado el tiempode corrida los geles fueron fijados en una solución que contiene57.55% (v/v) de metanol, 42.35% (v/v) de ácido acético y 0.1%(v/v) de formaldehído, durante un periodo de 2 horas.

2.2.7 Tinción con nitrato de plata para geles 2D-(SDS-PAGE)

Primero se hidrataron los geles durante una hora contres cambios de etanol al 30% (v/v) cada 20 min.Posteriormente los geles se pre-trataron con una solución al0.02% (p/v) de tiosulfato de sodio por un periodo de 1.5 min,inmediatamente los geles fueron enjuagados con agua por unmin con tres cambios cada 20 s. Luego los geles fueron

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incubados en una solución de nitrato de plata al O.2°/o (p/v) yformaldehído al 0.03% (v/v) por 20 min. Después del periodode incubación, la solución de plata fue descartada y los gelesfueron enjuagados con agua dos veces por 20 s. Acontinuación se llevó a cabo el revelado con una solución decarbonato de sodio al 6°/o (p/v), formaldehído al O.019°/o (p/v) y0.4 mM de tíosulfato de sodio. Una vez que la soluciónreveladora se oxidó fue necesarío cambiarla por otra porción desolución reveladora fresca. Fue de suma impor{ancia llevar acabo el revelado con la solucíón completamente transparente.Después de adquírir la intensídad de tinción deseada elrevelado fue detenido descahando la solución reveladora yadicionando ácido acético al 12% (v/v) y metanol al 50% (v/v).Los geles teñidos fueron almacenados en ácido acético al 1°/o(v/v) a 4°C hasta llevar a cabo los siguientes análisis. Todoeste proceso se realizó en un equipo de agitación Stovall a 30rpm y cada gel se realizó por triplicado de experimentosdiferentes.

23

CAPÍTULO 111

Resultados y Discusión

3.1 Perfi l electroforético de proteínasextracelulares en el medio de cultivo

Como experimento inicial para determinar si losexplantes foliares de C. canephora secretan proteínas en elmedio de cultivo, se realizó un análisis electroforético bajocondiciones desnaturalizantes y se tiñó con nitrato de plata engel de poliacrilamida al 12.5°/o. En la figura 2 se muestra unejemplo representativo de los geles obtenidos de las proteínasextracelulares de 14 días de incubación. Se puede observarque existen diferentes bandas a lo largo del gel, Io que indica lapresencia de proteínas extracelulares en el medio de cultivo demasas moleculares entre 21.5 y 116.13 kDa, si bien la mayorparie de las proteínas son de masa molecular elevada.

MM

200 kDa -

116.1®kDa +

97.14kDa +

21.5kDa +

14.4 kDa +

Figura 2. Periil electroforético de lD de proteínas extracelulares bajocondic.iones de inducción de la ES. La separación se realizó en un gel depoliacrilamida al 12.5% y teñido con nitrato de plata. El carril izquierdomarcado con el número 1 corresponde al marcador molecularrepresentando su MM en kDa y el carril 2 corresponde a las proteínasextracelulares secretadas en el medio de cultivo en presencia debenciladenina (+BA). Se cargaron 10 Lig de proteína por caml.

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Posteriormente para obtener una mejor resolución de lasproteínas extracelulares y con el fin de determinar la cantidadde proteína adecuada para llevar a cabo la separación de lasproteínas en segunda dimensión se llevo a cabo laconcentración y la cuantifícación de las proteinas extracelularesdel medio de cultivo de explantes incubados por dos meses encondiciones de no inducción de la ES (-BA), así como bajocondiciones de inducción (+BA). En el primer caso seobtuvieron un total de 1.77 ug de proteína por LiL de medio decultivo concentrado. En el segundo caso se obtuvieron 2.61 ugde proteína por uL de medio de cultivo concentrado.

Para separar las proteínas, primero se empleó lapropiedad del punto isoeléctrico (pl); se cargaron 150 ug deproteína por gel. Una vez separadas las proteínas en la primeracorrida, se llevó a cabo la separación de las proteínasextracelulares utilizando la segunda dimensión de laelectroforesis desnaturalizante empleando la propiedad demasa de las proteínas. Las bandas proteicas fueronvisualizadas mediante tinción con nitrato de plata (Figuras 3 y4).

26

Figura 3. Patrón electroforético en 2D de proteínas extracelulares,proveniente de medio de cultivo de explantes incubados por 60 días enausencia de benciladenina (-BA) se cargo 150 ug de proteínas. Laseparación fue realizada en un gel de poliacrilamida al 12.5% y teñido connitrato de plata. Los números en el lado izquierdo corresponden a la masamolecular (MM) representado en kDa.

Como puede apreciarse de los patrones electroforéticosde las proteínas extracelulares secretadas por los explantes almedio de cultivo 200 ug de proteína dan una mejor resolución yse pueden visualizar mejor las proteínas separadas (compararfiguras 3 y 4). Se puede observar en ambos patroneselectroforéticos una mayor pafte de las proteinas secretadas seencuentran en un rango de punto isoeléctrico entre 5 y 6. Lasmasas moleculares de las proteínas determinadas abarcandesde un poco más de 150 kDa hasta 6 kDa.

27

PMM

200 kDa

1 1 Ó25 kDa

97J kDa

Óó2 kDo

45 kDa

21 5 kDa

14J kDa

ó5 kDa

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Figura 4. Patrón electroforético en 2D de proteínas extracelulares delmedio de cultivo en presencja de benciladenina (+BA) después de 60días de cultivo. Se utilizo 200 ug de proteínas extracelularesprovenientes de explantes de C. canephora. La separación fue realizadaen un gel de poliacrilamida al 12.5% y teñido con nitrato de plata.

El siguiente paso fue determinar si la metodologíaempleada es suficientemente confíable en términos derepetibilidad. Para ello se llevó a cabo la realízación de dosexperimentos independientes con tres tiempos de muestreo.Los resultados se muestran en la figura 5. Como puedeapreciarse, la repetibílidad de las corrídas electroforéticas en2D de las tres muestras del medio de cultívo es confiable.

28

28d

'i,-#Eñi'iffl'fflfl,,•,Lim',,L±__,,,_nFigura 5. Reproducibilidad del patrón electroforético en 2D de proteínasextracelulares del medio de cultivo en presencia de benciladenina (+BA).Cada pareja de geles, letra mayúscula y letra minúscula, fue realizadacomo un experimento independiente con tres tiempos de muestreo. Secargo en cada gel 150 ug de proteína concentrada del medio de cultivo.

3.2 Cuantificación de proteína en el medio decultivo y patrones electroforéticos durante elproceso embriogénico (14, 21 y 28 d)

Una vez que se verificó que la metodología es confiableen términos de reproducibnidad (Figura 5) se realizó elexperimento de curso temporal. Para ello se incubaronexplantes de tejido foliar en medio líquido en condiciones deinducción y no inducción de la ES por 14, 21 y 28 dias.

29

14 16 18 20 22 24 26 28 30

Tiempo de inducción (días)

Figura 6. Cuantificación de las proteínas extracelulares durante un cursotemporal de 14, 21 y 28 días en ausencia (-BA) en rojo y presencia debenciladenina (+BA) en negro.

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Figura 7. Patrón electroforético en 2D de proteínas extracelulares en elmedio de cultivo, del tratamiento testigo (-BA) secretadas por explantes detejido foliar de la especie Coffea canephora. Día 14 panel (A), día 21 panel(8) y día 28 panel (C). Se cargaron 150 ug de proteína para cada gel. Laseparación fue realizada al 12 5% teñidos con nitrato de plata.

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El medio liquido en donde fueron incubados losexplantes de tejido foliar fue recolectado en los diferentes díasde incubación (14, 21 y 28), se concentró y posteriomente secuantificó. Al iniciarse el experimento en donde se cuantificóproteína concentrada se obtuvo en ausencia de benciladenina(- BA) 0.053 mg de proteína por litro de medio de cultivo en eldía 14; en el dia 21, se obtuvieron 0.145 mg de proteína porlitro de medio de cultivo y en el día 28, 0.395 mg de proteínapor litro de medio de cultivo (Figura 6).

En presencia de +BA se obtuvieron 0.323 mg deproteína por litro de medio de cultivo en el día 14 para el día21, 0.362 mg de proteína por litro de medio de cultivo y para eldia 28, 0.4 mg de proteína por litro de medio de cultivo (Figura6).

Si bien a los 14 días la diferencia en la concentración deproteínas fue muy grande, más de tres veces, a los 28 díasexiste una menor diferencia cuantitativa entre ambostratamientos (Figura 6).

El medio de cultivo en ausencia de benciladenina (-BA)utilizado como muestra testigo en donde no se dio el procesoembriogénico (Figura 7), así como en el medio de cultivo endonde se dio el proceso embriogénico en presencia debenciladenina (+BA) (Figura 8) se observan diferenciascualitativas muy marcadas en relación al curso temporal de lospatrones electroforéticos de las proteínas extracelulares.

31

medio de cultivo, durante la inducción (+BA) a la embriogénesis somática enexplantes de tejido foliar de la especie Coffea canephora. Dia 14 panel (A),día 21 panel (8) y día 28 panel (C). Se cargaron 150 ug de proteina paracada gel. La separación fue realizada al 12 5°/o teñidos con nitrato de plata.

La concentración (Figura 6), así como el número deproteínas extracelulares en el medio de cultivo incrementódurante el proceso embriogénico conforme avanzo el tiempo deincubación como se puede observar en el seguimientoelectroforético realizado durante el proceso embriogénico asícomo el proceso no embriogénico (Figuras s y 7).

3.3 Análisis electroforético de doble dimensión delcurso temporal

Este proyecto de investigación se ha apoyado en un tipode expresión simbólica una forma de escritura que nos hacepensar en intentos rudimentarios de escritura (Flechas,rectángulos, círculos) fijando de una manera permanente ycolocando en cierta simetría para poder marcar la presencia ola ausencia de proteínas secretadas al medio de cultjvo duranteel proceso embriogénico. Para un análisis más detallado secontabilizaron las proteínas, enumerándose de la siguientemanera, aquellas que se expresan constitutivamente señaladaspor círculos, las que se presentan con mayor o menorintensidad así como proteínas específicas con flechas azules ylas proteínas que se ausentaron fueron marcadas con flechasrojas.

32

Durante este trabajo hemos observado, que se tiene unamejor resolución del patrón electroforético trabajando con unaconcentración de 200 Lig de proteína en presencia debencilaminopurina (+BA) (Figura 4). Sin embargo debido a labaja concentración de proteina que hemos logrado obtener enel medio de cultivo (Figura 6) se ha decidido cargar en losgeles de poliacrilamida al 12.5% una concentración de 150 ugde proteína extracelular.

Los patrones electroforéticos de doble dimensión de lasproteínas del medio de cultivo de los días 14, 21 y 28 enpresencia de BA muestran diferencias notables, encomparación con las proteínas extracelulares del testigo comose puede observar en las figuras (9,10,11,12,13,14).

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9. Patrón electroforétjco enpor el tejido foliar al medio de cultivo en ausencia de benciladenina (-BA) ehel día 14 de incubación. Se cargaron 150 Lig de proteína para cada gel. Laseparación fue realizada al 12.5% teñidos con nitrato de plata. En el perfilizquierdo se encuentran los números que representan la masa molecular(MM) en kDa. Los números en la parte superi.or del gel indican el puntoisoeléctrico (pl). Las flechas azules indican mayor o menor intensidad en laresolución de proteínas, Ias flechas rojas ausencia de proteínas, los círculosseñalan aquellas proteínas que se presentan constitutivamente y losrectángulos cambios notorios.

2D visualizando proteínas secretadas

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FigLira 10. Patrón electroforético en 2D visualizando proteínas secretadaspor el tejido foliar al medio de cultivo en ausencia de benciladenina (-BA) enel día 21 de incubación. La separación fue realizada al 12.5% teñidos connitrato de plata. Se cargaron 150 Lig de proteína para cada gel. En el perfilizquierdo se encuentran los números que representan la masa molecular(MM) en kDa. Los números en la pane superior del gel indican el puntoisoeléctrico (pl). Las flechas azules indican mayor o menor intensidad en laresolución de proteínas, las flechas rojas ausencia de proteínas, los círculosseñalan aquellas proteinas que se presentan constitutivamente y losrectángulos cambios notorios.

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Figura 11. Patrón electroforético en 2D visualizando proteínas secretadaspor el tejido foliar al medio de cultivo en ausencia de benciladenina (-BA)en el día 28 de incubación Se cargaron 150 ug de proteína para cada gel.La separación fue realizada al 12.5% teñidos con nitrato de plata. En elperfil izquierdo se encuentran los números que representan la masamolecular (MM) en kDa. Los números en la parte superior del gel indican elpunto isoeléctrico (pl). Las flechas azules indican mayor o menorintensidad en la resolución de proteínas, las flechas rojas ausencia deproteínas, los círculos señalan aquellas proteínas que se presentanconstitutivamente y los rectángulos cambios notorios.

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Figura 13. Patrón electroforético en 2D visualizando proteínas secretadaspor el tejido foliar al medio de cultivo en presencia de benciladenina (+BA)en el día 21 de incubación. Se cargaron 150 ug de proteína para cada gel.La separación fue realizada al 12.5% teñidos con nitrato de plata. En el perfilizquierdo se encuentran los números que representan la masa molecular(MM) en kDa. Los números en la pane superior del gel indican el puntoisoeléctrico (pl). Las flechas azules indican mayor o menor intensidad en laresolución de proteínas, las flechas rojas ausencia de proteínas, los clrculosseñalan aquellas proteínas que se presentan constitutivamente y losrectángulos cambios notorios.

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11

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Figura 14. Patrón electroforético en 2D visualizando proteínas secretadaspor el tejido foliar al medio de cultivo en presencia de benciladenina (+BA)en el día 28 de incubación. Se cargaron 150 ijg de proteína para cada gel.La separación fue realizada al 12.5% teñidos con nitrato de plata. En elperfil izquierdo se encuentran los números que representan la masamolecular (MM) en kDa. Los números en la pahe superior del gel indican elpunto isoeléctrico (pl). Las flechas azules indican mayor o menor intensidaden la resolución de proteínas, las flechas rojas ausencia de proteínas, loscirculos señalan aquellas proteinas que se presentan constitutivamente ylos rectángulos cambios notorios.

Durante los primeros 14 días de cultivo se detectaron unmenor número de polipéptidos, en comparación con los días 21

39

y 28, en donde se ve un mayor número de proteínas. En el día14 se observo la presencia de 73 proteínas durante el procesoembriogénico y se ausentaron 32 proteínas (Figura 12). En elproceso no embriogénico (Figura 9) en el día 14 se observó lapresencia de 86 proteínas y la ausencia de 19 proteínas(Cuadro 1). En el análisis diferencial de doble dimensión de lasproteínas secretadas al medio de cultivo entre el procesoembriogénico y el no embriogénico, en el día 21 (Figura 13) seobservó la presencia de 146 proteínas durante el procesoembriogénico y se ausentaron 9 proteínas. Comparándose conel proceso no embriogénico (Figura 10) se observó la presenciade 134 proteínas y la ausencia de 21 proteínas. En el día 28 seobservó la presencia de 186 proteínas durante el procesoembriogénico (Figura 14) y se ausentaron 47 proteínas.Comparándose con el proceso no embriogénico (Figura 11) seobservó la presencia de 228 proteínas y la ausencia de 5proteínas (Cuadro 1 ).

Tiempo deProceso no embriogénico Proceso embriogénico

Ausencia de Presencia de Ausencia de Presencia deincubación proteinas prote ínas protei nas proteínas

Día 14 19 86 32 73

Día 21 21 134 9 146

Día 28 5 228 47 186

Cuadro 1. Comparación de ausencia y presencia de proteínas, enproceso embr.iogénico (+BA) y el testigo (-BA) en los días 14, 21 y 28 deincubación contabilizándose proteínas secretadas por el tejido foliar al mediode cultivo.

En este trabajo se detectó la ausencia de proteínas deuna manera notable durante los primeros días de la inducciónde la ES así como en el día 28; sin embargo, ya se hareporiado en otras investigaciones de proteínas extracelularesque podrían estar inhibiendo la embriogénesis somática(Gavish eí a/.1991,1992) en cultivos de C. auraníí.um se ha

40

determinado que el desarrollo normal de la ES depende,obligatoriamente, de la ausencia de proteínas glucosiladasentre 53 y 57 kDa (Coutos-Thevenot eí a/.1992). En un trabajocon suspensiones celulares con un híbrido de uva (V/.f/.s v/.n/.ÍeracN. Chasselas V. beriandie), se observaron algunos efectosinhibitorios en la ES concluyendo que moléculas extracelularescon una masa molecular de 10 kDa son responsables de dichoefecto. En el grupo de trabajo de Maés eí a/., (1997)demostraron que las proteínas extracelulares pueden estar através del mecanismo proteolítico extracelular. En un trabajorelacionado Carlberg ef a/., (1987) reportaron la presencia deun inhibidor de tripsina que es sintetizado tanto en célulasembriogénicas como no embriogénicas, pero solamentesecretado por cultivos embriogénicos al medio de cultivo, enque puede inhibir la actividad de la tripsina, eludiendoproteólisis de proteínas esenciales y promoviendoconsecución de la ES.

En este trabajo de investigación se han encontradoproteínas específicas extracelulares con diferentes masasmoleculares en el secretoma de C. canephora durante lainducción de la embriogénesis somática. Por otro ladoObenland ef a/., (1993) ha reportado la participación de tresinveriasas en hojas de Hondeum w/gane L, una proteínamonomérica de 64 kDa y dos proteinas multiméricas de 116 y155 kDa así como también se ha reponado la actividad de unainvertasa alcalina y una ácida (lraqi y Tremblay, 2001). A la vezse ha visualizado tres proteínas especificas de 60, 30 y 15 kDa;en una revisión científica se han reportado proteínas de choquetérmico de la misma masa molecular (Vierling, 1991). Ennuestros resultados hemos observado proteínas con una masamolecular de 32 kDa; es el caso de la proteína 167 con unpunto isoeléctrico de 6.2. En D. carofa se identificó unaproteína extracelular de tipo 3 (EP3) capaz de restaurar la ESen la mutante Ís77 sensible a temperatura, en donde se haobservado que a 24°C se obtiene un desarrollo normal deembriones y a 32°C el proceso embriogénico se detiene. Dicha

41

proteína tiene actividad de quitinasa con una masa molecularde 32 kDa y un punto isoeléctrico de 3.6 (De Jong eí a/„ 1992).También se determinó la presencia de las proteínas 176 conuna masa molecular de 30 kDa, Ia 243 de 33 kDa y la 198 de25 kDa. Previamente, se había reportado la presencia deproteínas de 25, 30, 32 y 33 kDa con actividad quitinasa quepodrían estar jugando un papel importante en la defensa de lasplantas (Jayasankar y Litz, 1998).

42

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Figura 15. Análisis electroforético en 2D visualizando proteinas de mayormasa molecular (MM) secretadas por el tejido foliar al medio de cultivo enausencia y en presencia de benciladenina (BA) en el día 14 de incubación.Los números que se encuentran entre los cuadrantes representan la MM enkDa. Los números en la parte superior de cada cuadrante indican el puntoisoeléctrico (pl). Las flechas azules indican mayor o menor intensidad en laresolución de proteínas, las flechas rojas ausencia de proteínas, los círculosseñalan aquellas proteínas que se presentan constitutivamente y losrectángulos cambios notorios. Los cuadrantes de la parte superior indicadoscomo panel A, se observan aquellas proteínas de mayor MM y con un rangomenor de pl. Los cuadrantes de la pafte inferior panel 8, se observanaquellas proteínas de mayor MM con un rango mayor de pl.

43

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Figura 16. Análisis electroforético en 2D visualizando proteínas de menormasa molecular (MM) secretadas por el tejido foliar al medio de ciiltivo enausencia y en presencia de benciladenina (BA) en el día 14 de incubación.Los números que se encuentran entre los cuadrantes representan la MMen kDa. Los números en la pane superior de cada cuadrante indican elpunto isoeléctrico (pl). Las flechas azules indican mayor o menorintensidad en la resolución de proteínas, las flechas rojas representanausencia de proteínas, los círculos señalan aquellas proteínas que sepresentan constitutivamente y los rectángulos cambios notorios. Loscuadrantes de la parte superior indicados como panel C, se observanaquellas proteínas de menor MM y con un rango menor de pl. Loscuadrantes de la parte inferior indicados como panel D, se observanaquellas proteínas de menor MM con un rango mayor de pl.

44

También se ha observado en el día 14 en la Figura 15panel 8 la presencia de polipéptidos con una masa molecularde 38 kDa, los cuales se enumeraron como las proteínas 157 y158. Proteínas similares de este tipo con una masa molecularparecida han sido identificadas como peroxidasasextracelulares de carácter catiónico durante la ES deAsparagus off/.c/-na//.s (Takeda eí a/., 2003) y pueden restaurarel proceso embriogénico en D. carofa en presencia detunicamicina (Cordewener ef a/.,1991).

alba

RMM; No. proteínas Proteínas ProteínasRpl comunes exclusivas por panel

-BA +BA -BA +BA

A 30 221 5029

8 18 35 2527

C 3 33 66

D 3 410 713

Proteinastotales 54 3219 8875

dío 2. Comparación de protriogénicocontabmzándosepralmediodecultivoeneldíaeínas en el proceso embriogénico y eroteínasexclusivassecretadasport€14deincubación.ElusodelaletraA,

indica proteínas que se contabilizaron en un área de mayor MM y con unrango menor de pl. 8, proteínas que se contabilizaron en un área de mayorMM con un rango mayor de pl. C, proteínas de menor MM en un rangomenor de pl. D, proteínas localizadas en un área de menor MM con unrango mayor de pl. El rango de marcador molecular así como el rango depunto isoeléctrico son abreviados de la siguiente manera (RMM, Rpl).

En el día 21 después de la inducción de la ES, laproteína numero 30 fue uno de los polipéptidos exclusivos demayor masa molecular con 116.25 kDa durante el procesoembriogénico. También aparecieron dos proteínas, Ia 115 y la

45

129 con una masa molecular de 45 kDa. Durante la ES ensuspensiones embriogénicas de mango resistentes aC.olletotrichum gloeosporioides, Jayasankar y Uia (1998)observaron la presencia de una isoenzima con la misma masamolecular de 45 kDa.

También observamos la presencia de cuatro proteínasde alrededor de 35 kDa (150,154,151,155). En SÍ.m/+a g/az/.ov/-/.se ha purificado y caracterizado dos P-1,3-glucanasas, una de35 kDa (Víeira ef a/., 2006) y otra de 38 kDa que sonsecretadas en la desarrollo temprano en la ES en C. /.níybm(Helleboid ef a/.,1998).

En este estudio en la ES de C. canephora se hanencontrado 19 proteínas en su secretoma de pequeña masamolecular, en un rango de entre 7 y 30 kDa que sólo seexpresan durante el proceso embriogénico. Por otro lado endiversos estudíos electroforéticos en plantas se ha comprobadola participación de proteínas transferidoras de lípidos conmasas moleculares de entre 9 y 10 kDa (Blanckaert eí a/.,2002; Coutos-Thevenot eí a/.,1993), en tanto que en cebada yen trigo se han detectado proteínas con una masa molecular de7 kDa (Désomeaux eí a/.,1992; Kalla ef a/.,1994). Por lo quees posible que algunas de estas proteínas correspondan a lastransferidoras de lípidos.

46

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Figura 17. Análisis electroforético en 2D visualizando proteínas de mayormasa molecular (MM) secretadas por el tejido foliar al medio de cultivo enausencia y en presencia de benciladenina (BA) en el día 21 de incubación.Los números que se encuentran entre los cuadrantes representan la masamolecular MM en kDa. Los números en la parte superior de cada cuadranteindican el punto isoeléctrico (pl). Las flechas azules indican mayor o menorintensidad en la resolución de proteínas, las flechas rojas ausencia deproteínas, los círculos señalan aquellas proteínas que se presentanconstitiitivamente y los rectángulos cambios notorios. Los cuadrantes de lapane superior indicados como panel A, se observan aquellas proteínas demayor MM y con un rango menor de pl. Los cuadrantes de la pahe inferiorindicados como panel 8, se observan aquellas proteínas de mayor MM conun rango mayor de pl.

47

-BA (d21)

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+ BA (d21)

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Figura 18. Análisis electroforético en 2D visualizando proteínas de menormasa molecular (MM) secretadas por el tejido foliar al medio de cultivo enausencia y en presencia de benciladenina (BA) en el día 21 de incubación.Los números que se encuentran entre los cuadrantes representan la MM enkDa. Los números en la parte superior de cada cuadrante indican el puntoisoeléctrico (pl). Las flechas azules indican mayor o menor intensidad en laresolución de proteínas, las flechas rojas ausencia de proteínas, los círculosseñalan aquellas proteínas que se presentan constitutivamente y losrectángulos cambios notorios. Los cuadrantes de la pane superior indicadoscomo panel C, se observan aquellas proteínas de menor MM y con un rangomenor de pl. Los cuadrantes de la parte inferior indicados como panel D, seobservan aquellas proteínas de menor MM con un rango mayor de pl.

48

RMM: No. de proteínas Proteinas Protelnas

Rpl comunes exciusivas por panel

-BA +BA -BA +BA

A 56 49 6065

8 42 14 4346

C 13 11 1414

D 14 37 1721

Proteinastotales 125 921 134 146

Cuadro 3. Comparación de proteínas en el proceso embriogénico y el noembriogénico contabilizándose la presencia y ausencia de proteínassecretadas por el tejido foliar al medio de cultivo en el día 21 de incubaciónEl uso de la letra A, nos indica el número de proteínas localizadas en unárea de mayor MM y un rango menor de pl. 8, Número de proteínaslocalizadas en un área de mayor MM con un rango mayor de pl. C, Númerode proteínas con menor MM en un rango menor de pl. D, Numero deproteínas localizadas en un área de menor MM con un rango mayor de pl. Elrango de marcador molecular así como el rango de punto isoeléctrico sonabreviados de la siguiente manera (RMM, Rpl).

Al comparar las proteínas de los geles de dobledimensión de los días 14, 21 y 28 entre el procesoembriogénico y el proceso no embriogénico (Figuras 15,16,17,18,19 y 20) se contabilizo una acumulación más alta deproteínas en aquellas que fueron de mayor masa molecular ycon un menor rango de punto isoeléctrico. La menoracumulación de proteínas fueron aquellos polipéptidos demenor masa molecular con un menor rango de puntoisoeléctrico como se puede observar en los cuadros 2, 3 y 4.Sin embargo en este trabajo se puede observar una ampliadistribución de las proteínas exclusivas de la embriogénesissomática, tanto en masa molecular como en su puntoisoeléctrico indicándonos complejidad en su composición(Cuadro 6).

49

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Figura 19. Análisis electroforético en 2D visualizando proteínas de mayormasa molecular (MM) secretadas por el tejido foliar al medio de cultivo enausencia y en presencia de benciladenina (BA) en el día 28 de incubación.Los números que se encuentran entre los cuadrantes representan la MM enkDa. Los números en la parte superior de cada cLiadrante indican el puntoisoeléctrico (pl). Las flechas azules indican mayor o menor intensidad en laresolución de proteínas, las flechas rojas ausencia de proteínas, los círculosseñalan aquellas proteínas que se presentan constitutivamente y losrectángulos cambios notorios. Los cuadrantes de la pahe superior indicadoscomo panel A, se observan aquellas proteínas de mayor MM y con un rangomenor de pl. Los cuadrantes de la parte inferior indicados como panel 8, seobservan aquellas proteínas de mayor MM con un rango mayor de pl.

50

- BA (d28)

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Figura 20. Análisis electroforético en 2D visualizando proteínas de menormasa molecular (MM) secretadas por el tejido foliar al medio de cultivo enausencia y en presencia de benciladenina (BA) en el día 28 de incubación.Los números que se encuentran entre los cuadrantes representan la MM enkDa. Los números en la parte superior de cada cuadrante indican el puntoisoeléctrico (pl). Las flechas azules indican mayor o menor intensidad en laresolución de proteínas, las flechas rojas ausencia de proteínas, los círculosseñalan aquellas proteínas que se presentan constitutivamente y losrectángulos cambios notorios. Los cuadrantes de la parte superior indicadoscomo panel C, se observan aquellas proteínas de menor MM y con un rangomenor de pl. Los cuadrantes de la parte inferior indicados como panel D, seobservan aquellas proteínas de menor MM con un rango mayor de pl.

51

RMM; No. de proteínas Proteínas ProteínasRpl comunes exclusivas por panel

-BA + BA -BA + BA

A 108 110 119 108

8 35 171 5236

C 19 70 2619

D 19 124 3123

PÍ.oteínastotales 181 475 228 186

Cuadro 4. Comparación de proteínas en el proceso embriogénico y el noembriogénico contabilizándose la presencia y ausencia de proteínassecretadas por el tejido foliar al medio de cultivo en el día 28 de incubación.El uso de la letra A, nos indica el número de proteinas que se localizaron enun área mayor de MM y con un rango menor de pl. 8, número de proteínaslocalizadas en un área de mayor MM con un rango mayor de pl. C, númerode proteínas localizadas en un área de menor MM en un rango menor de pl.D, número de proteínas localizadas en un área de menor MM con un rangomayor de pl. El rango de marcador molecular así como el rango de pl sonabreviados de la siguiente manera (RMM, Rpl).

En la comparación de proceso embriogénico y el noembriogénico a los 14 días de incubación de la ES se observala aparición de 19 proteínas exclusivas de la ES; a los 21 díasde incubación se contabiliza la aparición de 21 proteínas y a los28 días se observa una disminución, ya que sólo se observó lapresencia de 5 proteínas exclusivas en esta etapa deincubación (Cuadros 3, 4 y 5).

52

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Figura 21. Análisis electroforético de segunda dimensión visualizandoproteínas de mayor masa molecular (MM) secretadas por el tejido foliar almedio de cultivo en ausencia de benciladenina (-BA) comparando los días14, 21 y 28 de incubación Los números que se encuentran en el pemlizquierdo de los cuadrantes representan la MM en kDa. Los números en laparte superior de cada cuadrante indican el punto isoeléctrico (pl). Lasflechas azules indican mayor o menor intensidad en la resolución deproteínas, las flechas rojas ausencia de proteínas, los círculos señalanaquellas proteínas que se presentan constitutivamente y los rectánguloscambios notorios. Los cuadrantes de la pane superior indicados como panelA, se observan aquellas proteínas de mayor MM y con un rango menor de pl.Los cuadrantes de la parte inferior indicados como panel 8, se observanaquellas proteínas de mayor MM con un rango mayor de pl.

53

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TIF,[ _],Figura 22. Análisis electroforético de 2D visualizando proteínas de menormasa molecular (MM) secretadas por el tejido foliar al medio de cultivo enausencia de benciladenina (-BA) comparando los días 14, 21 y 28 deincubación. Los números que se encuentran en el perfil izquierdo de loscuadrantes representan la MM en kDa. Los números en la pahe superior decada cuadrante indican el punto isoeléctrico (pl). Las flechas azules indicanmayor o menor intensidad en la resolución de proteínas, las flechas rojasausencia de proteínas, los círculos señalan aquellas proteínas que sepresentan constitutivamente y los rectángulos cambios notorios. Loscuadrantes de la parte superior indicados como panel C, se observanaquellas proteínas de menor MM y con un rango menor de pl. Loscuadrantes de la parte inferior indicados como panel D, se observanaquellas proteínas de menor MM con un rango mayor de pl.

54

+ BA (dl4) + BA (d21) + BA (d28)

m L', ,7,

í; Ü.d" `"

hp~ -\+E¥` = +-

Figura 23. Análisis electroforético de 2D visualizando proteínas de altamasa molecular (MM) secretadas por el tejido foliar al medio de cultivo enpresencia de benciladenina (+BA) comparando los días 14, 21 y 28 deincubación. Los números que se encuentran en el perfil izquierdo de loscuadrantes representan la MM en kDa. Los números en la parte superior decada cuadrante indican el punto isoeléctrico (pl). Las flechas azules indicanmayor o menor intensidad en la resolución de proteínas, las flechas rojasausencia de proteínas, los círculos señalan aquellas proteínas que sepresentan constitutivamente y los rectángulos cambios notorios. Loscuadrantes de la pane superior indicados como panel A, se observanaquellas proteínas de mayor MM y con un rango menor de pl. Loscuadrantes de la parte inferior indicados como panel 8, se observanaquellas proteínas de mayor MM con un rango mayor de pl.

55

+ BA (dl4) + BA (d21) + BA (d28)

H.a a.| ü |f| aí ®D

Figura 24. Análisis electroforético de 2D visualizando proteínas de menormasa molecular (MM) secretadas por el tejido foliar al medio de cultivo enpresencia de benciladenina (+BA) comparando los días 14, 21 y 28 deincubación. Los números que se encuentran en el perfil izquierdo de loscuadrantes representan la MM en kDa. Los números en la parte superior decada cuadrante indican el punto isoeléctrico (pl). Las flechas azules indicanmayor o menor intensidad en la resolución de proteinas, las flechas rojasausencia de proteínas, los círculos señalan aquellas proteínas que sepresentan constitutivamente y los rectángulos cambios notorios. Loscuadrantes de la pane superior indicados como panel C, se observanaciuellas proteínas de menor MM y con un rango menor de pl Loscuadrantes de la parte inferior indicados como panel D, se observanaquellas proteínas de menor MM con un rango mayor de pl.

En las figuras 21, 22, 23 y 24 durante el seguimiento delexperimento observamos un aumento del total de proteínasextracelulares conforme avanza la edad de cultivo, similar alaumento reportado por Quiroz-Figueroa eí a/., (2002b), quienes

56

proceso embriogénico enarabi.ca la concentración det,\*`,r,_ ..-. _.._- -___

proteína extracelular aumentaba conforme avanzaba la edad

g:mceui{:ViúeB:rqaun::o'(°oS.48ri:e+f.ieTn2e,dd¡íaascedr:y¡no#C|%nm:i'en el día 12) pero éste alcanzó una concentración de 9.98 ugml-. en el día 24 representando un incremento de 20 veces conrespecto al día cero. Los mismos autores reportaron que bajocondiciones de mantenimiento de los cultivos podían contarhasta 22 proteínas. sin embargo, cuando se analizaron bajocondiciones de inducción de la ES lograron determinar algunasproteínas adicionales Quiroz-Figueroa ef a/., (2000).

En este trabajo de investigación se ha obtenidoevidencia de proteínas que son secretadas al medio de cultivo,desde explantes de tejido foliar en C. oanephora durante elproceso embriogénico. Se ha logrado contabilizar una grancantidad de proteínas en el medio de cultivo, más de 250.Algunas de ellas son comunes a las dos condicionesempleadas, con benciladenina (+BA) y sin benciladenina (-BA).Sin embargo, sólo alrededor de 40 proteínas son exclusivas dela emriogénesis somática,

Algunos investigadores han sugerido que las proteínasextracelulares que son secretadas al medio de cultivo podríanestar condicionando la ES (Baldan ef a/„ 1997; Blanckaert ef a/.,2002; Borderies ef a/„ 2004; Carlberg ef a/.,1987; Cordeweneref a/.,1991; Coutos-Thevenot eí a/.,1992; CoutoslThevenot efa/„ 1993; De Jong ef a/.,1993; De Jong ef a/.,1995; De Vriesef a/.,1988a; Gavish ef a/.,1992: Helleboid ef a/.,1998; Kraghef a/.,1996; Kreuger y Van Holst,1993; Lo Schiavo ef a/.,1990;Maés ef a/., 1997; Quiroz-Figueroa ef a/„ 2002b; Quiroz-

observaron que durante esuspensiones celulares de C

igueroa y Loyola-Vargas, 20-01; Van Engelen y De Vries,992; Von Arnold ef a/., 1995; Wiweger ef a/., 2003).

57

Cuadro 5. Pronúmero otorgaletras A,B,C ysecretoma.

MM pl Node Localización de

d12

kDa proteína proteínadíaanel

116.25 5.90 30 21A1218999570 1 6.60 1235

6.60 236 2185.85 86 21A

7066.2 5.90 89 21A5.91 99 21A

60 6.17 128 14845 5.81 115 21A4545 6.2i-129 218

6.27 129 Í 28841.5 6.10 136 21838 5.85 157 14838 6.17 158 14838 5.4 150 21A38 5.6 151 21A38 55 154 21A38 5.81 155 21A33 6_02 243 14832 5.90 167 14A32 6.10 170 14831 5.2 179 14C311311 6_37 175 14D

6.78 178 21D30 6.47 176 14D29 5.5 252 14C29 5_96 186 21C26 6.27 187 14D

126 6.67 197 21D25 5.35 198 14C25 6_15 253 14D25 6.67 201 28D18 6.07 211 14D18 6.67 209 21D17 6.27 217 14D17 6.27 217 21D16 6.67 213 21D

14.4 6.03 254 14D14.4 6.37 225 14D14.4 6.15 218 21D14.4 6.67 226 28D12 6.05 222 14D71 6.02 1 2311 21D

teínas exclusivas en el proceso embriogénico ido a cada proteína a MM, pl y localizacíón.D indica el panel y adjunto el día (14, 21 y

58

jcándose eluso de las

8) de cada

Nombre MM pl EC Organismo Referencia

Quitinasa 32 3_6 3.2_1 14 D. carota (De Jong et a/ 1992)

Peroxidasa 38 8_72 tll.17 A.ofíiicinalis (Takeda eí a/ 2003)

Peroxidasa 38 7.6 1.11.t7 D. carota (Cordewenor eí a/.1991)

Protedelíp na transferidorados 10 8.8 2_31.40 D. caro(8 (Sterk eí a/.1991)

P-1,3 Gliicanasa 38 37 3.2.1.39 C. iriDbus (Helleboid eí a/.1998)

P-1.3 Glucanasa 38 41 3.2_1.39 C intybus (Helleboid of a/. 1998)

P-i .3 Glucanasa 38 445 3,2.130 C m,ybus (Helleboid eí a/. i998)

Estearasa 36 98 31.12 D carota (Chibbar eí a/. 1989)

Fostatasa 40 5.42 3.1 3 2 1 batatas (Ciarrocchi eí a/ 1981)

Fumarasa 45 6.85 4 21.2 D. csrota (Kim eí a/. 2002)

Cisteprote nanasa 61_12 4.4 3.4,22,1 C aursntium (Gavish eí a/. 1992)

cL-mannosidasa 52 3_8 3.21 24 N` tabacum (Kunze eí a/. 1998)

Tripsina 26.04 5.5 3.4 21.4 D. carola (Maés el a/.1997)

Cuadro 6. Proteínas extracelulares durante el proceso embriogénico end.iversos genotipos, MM y pl (Cordewener eí a/.,1991; Sterk e{ a/.,1991;Takeda eí a/., 2003: Tchorbadjieva y Odjakova, 2001., Tchorbadjieva, 2006;Vieira eí a/., 2006).

Se hizo una revisión sobre las publicaciones en las querepohan que los cultivos secretan proteínas al medio de cultivobajo condiciones de ES (Cuadro 6). En donde se propone unaamplia variedad de funciones de proteínas extracelulares, entrelas cuales se pueden encontrar funciones como señalización,catálisis, defensa, regulación, degradación y protección de laestructura celular. Son muy pocas las proteínas biencaracterizadas y que puedan relacionarse directamente con losprocesos morfogénicos y que puedan ser de gran potencial enel entendimiento de la ES (Cuadro 6).

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CAPITULO IV

4.1 Conclusión generalEste trabajo aporta evidencia de que los explantes

foliares de C. canephora secretan proteínas al medio de cultivo,así como de la complejidad en su composición en masamolecular así como en su punto isoeléctrico.

Es posible que varias de estas proteínas extracelularesque se han visualizado en este trabajo pudieran Hegar a serÚtiles como herramienta para modular la embriogénesissomática.

AsÍ como también se sugiere que tanto la ausencia,presencia, cambio de intensidad y proteínas especificaspodrían estar implicadas directamente en la inducción así comoen el desarrollo del proceso embriogénico.

Estos resultados permiten tener una base sobre lasproteínas secretadas al medio de cultivo que podrían estarparticipando en la respuesta embriogénica.

4.2 PerspectivasSe sugiere que este informe llegue a formar parte, como

base de estudio para futuros trabajos en el género Coffea. Yposteriormente llegar a la identificación de las proteínas queson secretadas al medio de cultivo de forma específica durantela inducción de la ES. Una vez identificadas, en el caso deaquellas que tengan actividad enzimática, deberá confirmarsesu identidad midiendo dicha actividad, ya que es posible que setrate de isoenzimas, como son los casos de peroxidasas,glucanasas, quitinasas y estearasas, ya que se ha determinadoen algunos de estos casos, que cada una de las isoenzimastiene un papel biológico diferente.

Una vez identificadas, las proteínas extracelularespodrían ser purificadas y utilizadas para inducir los cultivos debaja eficiencia en la producción de embriones somáticos como

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en las especies C. arab/.ca o C. ch/.nens/.s, así como deherramienta para estudios básicos que lleven al entendimientodel mecanismo que dispara el proceso de la ES.

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