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ESTUDIO DEL CONTENIDO FITOQUÍMICO Y LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE
LAS HOJAS DE CEDRÓN (Aloysia citrodora)
Teresita de Jesús Ariza Ortega314*, Nallely Rosalba Román Cortés314 y Rocío Cruz Muñoz314,315
Resumen
El cedrón (Aloysia citrodora) es una planta espóntanea de América del Sur y
originaria de Perú; popularmente es conocida como cedrón, cidron, limón verbena,
verbena, yerba luisa o yerba de la princesa que crece en forma de arbusto de hasta
1.5 m de altura, sus hojas tienen un olor intenso y se consumen en forma de infusión
en la medicina tradicional para aliviar desordenes gastrointestinales o respiratorios;
además de emplearse como tónico, sedante, antipirético, expectorante,
antihipertensivo y antiespasmódico. La composición química de sus hojas se debe
principalmente a la presencia de aceites esenciales, compuestos fenólicos,
derivados de ácidos hidroxicinámicos, taninos y flavonoides; lo cual convierte a este
organismo en una importante fuente de antioxidantes. Es por ello, que el objetivo
del presente trabajo fue analizar el contenido fitoquímico y el potencial antioxidante
de las hojas de cedrón. Para lo cual se obtuvieron extractos metanólicos por el
método de maceración solido-líquido, y a dichos extractos se les cuantificó el
contenido de antocianinas, flavonoides, fenoles totales, actividad antioxidante y el
porcentaje de inhibición de radicales libres por el método ABTS. En los resultados
se observó que los extractos de cedrón presentaron moderado contenido de fenoles
y flavonoides; con un porcentaje de inhibición de radicales libres máximo de 81.38 ±
7.26, obtenido por el método ABTS.
Palabras clave: antocianinas, flavonoides, ABTS, extracto vegetal
314 División de Ingeniería en Nanotecnología. Universidad Politécnica del Valle de México. 315 Maestría en Ciencias en Tecnología en Productos Biológicos. Universidad Mexiquense del Bicentenario-UES Tultitlán. *[email protected]
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Introducción
Los hábitos alimenticios actuales, caracterizados por alimentos de fácil preparación
con contenido de harinas y azúcares refinados, dietas carentes de nutrientes de
origen vegetal funcionalmente saludables; están llevando a la aparición de
epidemias relacionadas con la obesidad como la diabetes tipo II, enfermedades
cardiovasculares, cáncer y otras enfermedades crónicas (Johns y Eyzaguirre, 2006).
Esto ha llevado a que, en años recientes, el interés por el estudio de alimentos
funcionales y nutracéuticos vaya en aumento (Chirinos et al., 2013). En la dieta diaria
se consumen lípidos cuya función principal es proveer al organismo de energía y de
ácidos grasos esenciales, su contraparte es la oxidación celular. Por otra parte, el
efecto de los antioxidantes consiste en interrumpir o reducir la velocidad del
proceso de oxidación celular al estabilizar los radicales libres dentro de un
organismo o un producto alimenticio (Vieitez et al., 2018).
En la industria es común la utilización de antioxidantes sintéticos entre los que
figuran el butilhidroxianisol (BHA), butilhidroxitolueno (BHT) y el galato de propilo
(PG); para prevenir la rancidez oxidativa, sin embargo, aún existe incertidumbre
sobre la inocuidad de este tipo de compuestos (Olmedo et al., 2012). Los
antioxidantes naturales tienen muchas ventajas como la aceptación por la mayoría
de los consumidores, que son considerados seguros y que normativamente no
requieren cumplir con mayores lineamientos (Sacchetti et al., 2005). El uso de
extractos herbales como aditivos naturales en la industria de los alimentos es una
opción aplicable, sin embargo, esta práctica depende de una buena selección
debido a que algunos compuestos vegetales son en extremos aromáticos o
pungentes por lo que no es correcto la aplicación de forma directa (Suhaj, 2006).
Para la obtención de extractos naturales de plantas existen diversos métodos. El
método más común es la extracción sólido-líquido que consiste en una maceración
simple. Las variables a considerar en este método son: el tipo de disolvente utilizado,
el tiempo y temperatura de extracción, los gramos de muestra vegetal por volumen
de disolvente, el tipo de agitación y el método final de separación de componentes
(Naczk y Shahidi, 2004).
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Un alimento nutracéutico está definido como cualquier producto que pueda
considerarse alimento, capaz de proporcionar beneficios saludables, incluidos la
prevención y el tratamiento de enfermedades; además de satisfacer las necesidades
nutricionales básicas. La actividad antioxidante es considerada como una de estas
propiedades debido a que provee beneficios a la salud como la reducción de riesgo
de enfermedades cardiovasculares y cáncer, al combatir a los radicales libres (Pérez,
2006).
El cedrón es una especie vegetal considerada hipocalórica con altas propiedades
antioxidantes, lo cual indica contiene diversos compuestos polifenólicos como son:
fenoles y flavonoides (Paucar, 2018). También se ha detectado la presencia de
compuestos fenólicos derivados de ácidos hidroxicinámicos, taninos y flavonoides
(Ricco et al., 2011) Se emplean principalmente sus hojas bajo la forma de infusión y
cocimiento (Wernert et al., 2009). El cedrón es un arbusto que puede medir hasta
1.5 m, es de tipo aromático, originario de Chile, Perú y Argentina, posee propiedades
medicinales aromáticas de gran interés terapéutico y pertenece a la familia de las
Verbenáceas (Rojas et al., 2012). Se ha demostrado que el cedrón en infusión posee
propiedades medicinales como tranquilizante, calmante nervioso, expectorante,
sedante, analgésico, diurético; además su aceite esencial compuesto de: limoneno,
linalol, cineol, terpineol y cariofileno presenta acción eupéptica y espasmolítica
(Barrios et al., 2010).
Es por ello que el objetivo del presente trabajo fue el estudio de los compuestos
fitoquímicos presentes en los extractos metanólicos de las hojas de cedrón (Aloysia
citrodora) así como la determinación de su potencial antioxidante por medio del
radical libre ABTS.
Materiales y métodos
Material biológico. La especie vegetal cedrón (Aloysia citrodora) fue recolectada en
un campo local del Valle de México (Latitud: 19.5649, Longitud: -99.6966). Se
seleccionaron aquellas hojas que no presentaron alteración morfológica visible, ni
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indicios de afecciones patógenas. Cada muestra fue lavada con agua corriente para
eliminar excesos de tierra (en tres ocasiones), posteriormente se enjuagaron en
agua destilada (en tres ocasiones); finalmente se secaron para proceder con los
análisis correspondientes.
Preparación del material vegetal fresco. A 1 g de las hojas secas y molidas se le
adicionaron 10 mL de metanol acuoso al 80% (MeOH ac. 80% v/v); la suspensión fue
sonicada por 15 min a temperatura ambiente y se dejó reposar por 24 h. Finalmente
los extractos metanólicos fueron filtrados y centrifugados por 10 min a 1409 x g, los
sobrenadantes fueron colectados y mantenidos a 4°C para su posterior uso en las
próximas 24 h (Wojdylo et al., 2007).
Cuantificación de antocianinas. Se empleó el método por diferencia de pH,
descrito por Giusti y Wrolstad (2001) con algunas modificaciones, para el cual se
utilizaron dos sistemas tampón: 1) ácido clorhídrico-cloruro de potasio (HCl/KCl) con
pH = 1.0 y 2) ácido acético-acetato de sodio (CH3COOH/C2H3O2Na*3H2O) con pH = 4.5.
Se prepararon 2 tubos de ensaye con 0.2 mL de los extractos metanólicos
previamente preparados; a uno de ellos se le adicionaron 1.8 mL de la solución
tampón con pH = 1.0 y a otro 1.8 mL de la solución tampón con pH= 4.5; las mezclas
fueron agitadas con un vórtex y se midió la absorbancia a longitudes de onda () de
510 y 700 nm cada tubo. Como blancos se utilizaron las correspondientes soluciones
tampón. Se calculó la absorbancia total de la muestra a partir de la siguiente
ecuación: At = [(A510-A700)](pH=1.0) – [(A510-A700)](pH=4.5).
La concentración de pigmentos monoméricos en el extracto se expresa como mg
de cianidina-3-glucósido equivalente a 100 g de peso freso (pf). Y se calculó por
medio de la siguiente ecuación: Antocianinas momoméricas (mg/L) =
(At*PM*FD*1000)/(ε*1) con base al volumen y peso de la muestra preparada.
Estimación del contenido de flavonoides. Se empleó el método colorimétrico con
cloruro de aluminio; en donde a se tomaron 0.5 mL del sobrenadante de los
extractos metanólicos previamente preparados, se les agregaron 1.5 mL de metanol
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(MeOH) acuoso al 95% (v/v), 0.1 mL de cloruro de aluminio al 10% (AlCl3, p/v), 0.1 mL
de acetato de potasio (0.1 M) y 2.8 mL de agua destilada (Chang et al., 2002). La
mezcla se agitó y se incubó por 30 min a temperatura ambiente, transcurrido el
periodo de incubación se leyó la absorbancia a una longitud de onda de 415 nm en
un espectrofotómetro Genesys 10S. Para su cuantificación se elaboró una curva
patrón de la flavona quercetina de (0-300 mg/L). Los resultados del contenido de
flavonoides totales se reportaron como mg equivalentes de quercetina en 100 g-1 de
peso fresco (mg EQ 100 g-1 pf). Los resultados se presentan con la media ± desviación
estándar (DE, n=3). El contenido total de flavonoides se cuantificó empleando la
siguiente formula: (mg de quercetina)/(100 g de pf)=[(Abs-b)/m)/C]*100. En dónde:
Abs corresponde a la absorbancia de la mezcla después de adicionar la muestra o
el estándar, b es la ordenada al origen de la curva estándar, m es la pendiente de la
curva estándar y, C es la concentración de la muestra (g/L).
Determinación de fenoles totales. Se utilizó el método espectrofotométrico
descrito por Folin y Ciocalteu, (1927) con algunas modificaciones de Madhujith y
Shahidi (2005), esta técnica se fundamenta en el carácter reductor del reactivo
Folin-Ciocalteu, con coloración azul. De las muestras previamente preparadas
(extractos MeOH) se tomaron 0.5 mL a los cuales se les agregaron 0.5 mL del reactivo
Folin-Ciocalteu (0.2 N) y 4 mL de Na2CO3 (0.7 M), la mezcla fue agitada
vigorosamente en un equipo vórtex e incubada a temperatura ambiente y en
oscuridad durante aproximadamente 2 h. Una vez finalizada la incubación, la
mezcla se leyó en un espectrofotómetro Genesys 10S a una longitud de onda de 765
nm, registrando de este modo su absorbancia. El blanco empleado fue agua,
siguiendo la misma metodología antes descrita. El control empleado fue ácido
gálico en gradientes de concentración (0-400 mg/L). Las pruebas se realizaron por
cuatriplicado; los resultados se reportan como el promedio de las mismas con su
respectiva desviación estándar y se expresan en mg equivalentes de ácido gálico en
100 g-1 de peso fresco (mg EAG 100 g-1 pf); calculados mediante la siguiente fórmula:
[(Abs-b)/m]/([C]). En dónde: Abs corresponde a la absorbancia después de
adicionada la muestra a analizar o la referencia, m es la pendiente de la curva
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estándar, b = ordenada al origen de la curva estándar y, C es la concentración de la
muestra (g/L).
Determinación de la actividad antioxidante. El potencial antioxidante de la
muestra fue determinado por el método del reactivo ABTS (ácido 2,2’-azino-bis(3-
etilben-zotiazolin)-6-sulfónico). La AAO y el porcentaje de inhibición se
determinaron usando la metodología descrita por Ré et al., (1999) el cual se basa en
la generación del radical catión ABTS•+ (cromóforo azul-verde) mediante la oxidación
del reactivo con persulfato de potasio (K2S2O8); el radical generado se oxida debido
a la presencia de compuestos donadores de hidrógeno, es decir de antioxidantes.
Este método es ampliamente empleado por sus ventajas, entre la que destacan, su
sensibilidad, rapidez, reproducibilidad, estabilidad química, solubilidad en agua;
además de poseer un espectro de absorción en la zona visible (Kuskoski et al., 2005).
Se preparó una solución del radical ABTS•+ (7 mM) con persulfato de potasio (K2S2O4,
2.45 mM); la mezcla se dejó en reposo a temperatura ambiente (~25ºC), en oscuridad
durante aproximadamente 16 h antes de ser empleado en los análisis siguientes, la
coloración el azul/verde intenso que permanece estable durante las primeras 48 h,
después de su preparación. Una vez formado el radical libre de ABTS•+, se diluyó con
cantidad suficiente de etanol (a 1 mL del radical se le adicionan de 75 a 100 mL de
etanol) hasta lograr obtener una absorbancia de 0.7 ± 0.1 a una longitud de onda de
734 nm a una temperatura media de 30ºC. Una vez cumplido este objetivo, se tomó
1 mL del radical formado, se colocó en tubos de ensaye y se le adicionaron 10 µL de
las muestras previamente preparadas (extractos metanólicos). La mezcla fue
agitada vigorosamente en un vórtex y posteriormente se incubo en baño María a
30°C. Finalmente se tomaron lecturas de absorbancia a una longitud de onda de
734 nm de las mezclas a los minutos 1 y 7 después de la incubación. Es importante
mencionar que el blanco de reacción fue etanol puro. El antioxidante de referencia
empleado fue trolox en gradientes de concentración (0-2.0 mM), los resultados se
expresaron como mg equivalentes de trolox por cada 100 g de peso fresco (mg ET
100 g-1 pf). Los ensayos se realizaron por cuatriplicado y los resultados se reportaron
como la media de los tres valores con su respectiva desviación estándar; es
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importante mencionar que la actividad antioxidante al final se calculó en base al
peso y volumen de la muestra preparada (concentración de la muestra). La AAO se
calculó mediante la siguiente fórmula: mg ET 100 g-1 pf = [(Abs-b)/m)*PM)/([C]). En
dónde: Abs corresponde a la absorbancia después de adicionada la muestra a
analizar o la referencia, m es la pendiente de la curva estándar, b es la ordenada al
origen de la curva estándar, PM es el peso molecular del trolox (g/mol) y, C es la
concentración de la muestra (g/L). El porcentaje de inhibición fue calculado con la
fórmula: % Inhibición = [(A0-AF)/A0]*100. En dónde: A0 corresponde a la absorbancia
inicial del radical libre a 734 nm y AF a la absorbancia después de la reacción.
Resultados y discusión
En el presente trabajo se obtuvieron los resultados del perfil fitoquímico de los
extractos metanólicos de las hojas de cedrón (Figura 1), en los que se observa un alto
contenido de fenoles y flavonoides, en comparación al contenido de antocianinas.
Las especies vegetales de uso tradicional ofrecen una gran variedad de beneficios
al consumidor debido a la diversidad de efectos biológicos que ofrecen; las
propiedades medicinales y alimenticias se debe a la presencia de diversas
sustancias químicas (fitoquímicos) con efectos benéficos para la salud (Chirino et
al., 2013). Diversos estudios e investigaciones demuestran la importancia del
consumo y usos de especies vegetales como una fuente de sustancias
nutracéuticas; ya que tienen un papel determinante en la prevención de
enfermedades como diabetes, hipertensión, arterioesclerosis, obesidad, cáncer,
Alzheimer, Parkinson, entre otros (Chao et al., 2012; Mecocci et al., 2014). El contenido
de fenoles y flavonoides puede verse afectado por factores genéticos, bióticos,
abióticos, condiciones edafoclimáticas, tipo de cultivo entre otros (Duarte-Martino
et al., 2012; Ricco et al., 2011). Existen pocos trabajos que exploran la presencia de
antocianinas en las hojas de cedrón; Chirinos et al. (2013), estudió el contenido de
antocianinas en el extracto metanólico de las hojas liofilizadas de cedrón; no
reportando resultados de la presencia de este fitoquímico. El contenido de fenoles
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totales de esta especie vegetal se ha reportado empleando diferentes formas de
extracción; Olmedo et al. (2012) realizó una extracción de los aceites esenciales
presentes en cedrón; reporta que los compuestos mayoritarios son geranial, neral y
espatulenol; mismos que presentan un contenido de fenoles de 1400.06 ± 0.06 mg
EAG * g-1 ps; por otro lado Vieitez et al. (2017), realizó extracciones de fluidos
supercríticos en hexano (1270 mg EAG*100 g-1 extracto) y etanol (9760 mg EAG*100
g-1 extracto) de los extractos crudos de cedrón. Finalmente, Wernert et al. (2009),
realizó comparaciones entre dos métodos de cocción de las hojas de cedrón;
observó que el contenido de compuestos fenólico (5000 mg de EAG * 100 g-1 ps) eran
similares entre la infusión y decocción de las hojas de cedrón.
Figura 1. Contenido de antocianinas, fenoles y flavonoides de las hojas secas de cedrón. La concentración de metabolitos se expresó como antocianinas en: mg de ciandina-3-glucósido*100 g-1 ps; flavonoides en: mg EQ*100 g-1 ps; compuestos fenólicos en: mg EAG*100 g-1 ps. Los valores son presentados como promedio, n=4.
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Es importante mencionar que los resultados presentados por otros trabajos para la
especie vegetal cedrón superan a los que se reporta en la presente investigación;
cabe resaltar que todos tienen diferentes procesos de extracción y tratamientos en
el material biológico. Respecto al potencial antioxidante de los extractos
metanólicos de las hojas de cedrón, los resultados de la actividad antioxidante y
porcentaje de inhibición de radicales libres se presentan en el Cuadro 1.
Cuadro 4. Determinación de la actividad antioxidante y porcentaje de inhibición del extracto metanólico de las hojas de cedrón por el método del radical libre ABTS.
Referencia MIN 1 MIN 7 % DE INHIBICIÓN MIN 7 TROLOX 311.878 ± 36.35 367.944 ± 42.84 81.38 ± 7.26 Vitamina C 366.630 ± 40.83 454.022 ± 50.85 80.66 ± 9.48 AAERef (Actividad antioxidante equivalente a Ref) expresados en mg de referencia/100 g de peso seco. Los valores se presentan como promedio ± desviación estándar (D.E.), n=4.
Los nutraceúticos son productos alimenticios que ejercen una acción benéfica a la
salud o bien previenen enfermedades; los antioxidantes son un tipo específico de
nutracéutico (Chaturvedi et al., 2011). Un antioxidante (eliminador de radicales libres)
es un compuesto que inhibe o retrasa la oxidación de sustratos, incluso si el
compuesto está presente en una concentración significativamente más baja que es
la del sustrato oxidado. Entre los antioxidantes más eficaces se encuentran la
vitamina C y E, carotenoides, flavonoides, ácidos fenólicos (Wojdylo et al., 2007;
Serrano y Saura-Calixto 2007). La capacidad antioxidante se determinó por el
método ABTS (ácido 2,2´-azino-bis(3-etilbenzotiazolin)-6-sulfónico) empleando
como referencia TROLOX (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromo-2-ácido
carboxílico 97%) y ácido ascórbico. Chirinos et al. (2013), emplearon las muestras
liofilizadas y realizaron la extracción con HCl, metanol y agua; reportan 448.7 ± 4.2
mol ET g-1 ps lo que corresponde a 112.3 mg ET g-1 ps; valor superior a lo reportado
en el presente estudio; es importante mencionar que estos resultados son de una
especie de cedrón obtenida de la región andina peruana. Se ha reportado la
actividad antioxidante de otras especies vegetales de hoja que son ampliamente
utilizadas en la medicina tradicional. Román et al. (2010) reportó 68.4 ± 0.6% de
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inhibición de radicales libres del extracto metanólico de romero (Thymus vulgaris)
por el método ABTS, valor inferior a lo reportado en el presente estudio.
Este trabajo abre el panorama para el estudio más profundo de los componentes
del cedrón permitiendo la incorporación de los compuestos funcionales como
aditivos en la industria de los alimentos propiciando el consumo de compuestos
naturales con actividad biológica positiva para el ser humano. De tal manera que se
generen antioxidantes, fenoles, polifenoles y antocianinas provenientes de
extractos de hojas de cedrón como potenciales productos de consumo cotidiano.
Conclusiones
1. En el presente estudio el extracto metanólico de las hojas de cedrón presentó
diversos niveles de fitoquímicos presentes, mismos que no se encuentran
reportados ampliamente o relacionados con trabajos ya descritos, debido a que
muchos trabajos exploran la presencia de metabolitos secundarios en las
infusiones, con otros métodos de extracción o con otros solventes.
2. Se resalta que el contenido de compuestos fitoquímicos como fenoles y
flavonoides presentes en los extractos analizados se relaciona directamente con
el porcentaje de inhibición de radicales libres; pese a ello esta especie vegetal
puede ser considerada una fuente de compuestos nutracéuticos y bioactivos que
a través del consumo frecuente pueden contribuir a prevenir enfermedades
crónico-degenerativas.
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