CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYT- SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -SENACYT-

FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT- UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA-UVG

INFORME FINAL

Estudio del ciclo de transmisión de Trypanosoma cruzi entre Rhodnius prolixus y Triatoma dimidiata mediante

la tipificación genética de este parásito

PROYECTO FODECYT No. 085-2006

Laura María Grajeda Díaz Investigador Principal

GUATEMALA, ENERO 2009.

Agradecimientos:

La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del

Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por La Secretaría

Nacional de Ciencia y Tecnología -SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y

Tecnología -CONCYT-.

INDICE

Lista de cuadros

Lista de figuras

Resumen i

Abstract ii

I.1 Introducción 1

I.2 Planteamiento del Problema 3

I.2.1 Antecedentes 3

I.2.2 Justificación 5

I.3 Objetivos e hipótesis 6

I.3.1 Objetivos 6

I.4 Metodología 8

I.4.1 Variables 8

I.4.2 Indicadores 8

I.4.3 Estrategia metodológica 9

I.4.4 Método 9

I.4.5 Técnica estadística 12

I.4.6 Instrumentos a utilizar 13

II.1 Marco teórico 14

II.4.1 Enfermedad de Chagas 14

II.4.2 Vectores 14

II.4.3 Trypanosoma cruzi 15

II.4.4 Trypanosoma rangeli 17

II.4.5 Análisis de minicírculo 17

II.4.6 Diversidad genética de T. cruzi 18

II.4.7 Trabajos realizados en Guatemala 24

III.1 Resultados y discusión 26

III.1.1 Análisis de minicírculo para muestras (n=57) de Jalapa y Zacapa 26

III.1.2 Análisis de miniexón para muestras (n=160) de Chiquimula, Jalapa

y Zacapa

29

III.1.3 Análisis de microsatélites para muestras (n=57) de Jalapa y Zacapa 33

IV.1 Conclusiones 42

IV.2 Recomendaciones 43

IV.3 Referencias bibliográficas 44

IV.4 Anexos 50

IV.4.1 Diagrama de flujo de estrategia metodológica 50

IV.4.2 Electroferogramas de muestras de T. cruzi aisladas de heces de

triatominos recolectadas en Chiquimula

51

IV.4.3 Electroferogramas de muestras de T. cruzi aisladas de heces de

triatominos recolectas en Jalapa y Zacapa

66

Lista de figuras

Página

1. Detección de T.cruzi y T. rangeli en heces de vectores 3

2. Electroferograma que muestra los alelos del microsatélite MS5. 13

3. Tiempos estimados de divergencia para los riboclados de Trypanosoma cruzi

y su correlación con grupos definidos mediante otros métodos.

20

4. Esquema de la estrategia de amplificación del gen miniexón y localización

de sondas específicas para determinar el grupo al que pertenece

23

5. Detección de T. cruzi y T. rangeli en heces de vectores colectados en Jalapa

y Zacapa mediante el ensayo de minicírculo

27

6. Detección de T. cruzi y T. rangeli en heces de vectores colectados en Jalapa

y Zacapa mediante el ensayo de miniexón

28

7. Resultados obtenidos mediante el marcador del miniexón para muestras de

heces de triatominos colectadas en Jalapa, Zacapa y Chiquimula

31

8. Electroferograma que muestra tetrámeros o dímeros de cebadores en la

región menor a 100 pares de bases.

33

9. Electroferograma que muestra la señal debida a ruido, menor a 50 unidades

de fluorescencia y tres picos verdaderos.

34

10. Electroferograma que muestra un microsatélite con un múltiplo de repetición

de 3 bases.

34

11. Electroferograma que muestra artefactos de la amplificación que no son

picos verdaderos.

35

12. Distribución de alelos para el locus MS3 37

13. Distribución de alelos para el locus MS5 38

14. Árbol filogenético que relaciona aislados de T. cruzi de heces de R. prolixus

y T. dimidiata. Outgroup PR6456. 1000 reiteraciones.

40

Lista de cuadros

Página

1. Diferenciación genética y genotípica de cepas de T. cruzi 4

2. Clasificación sistemática de T. cruzi según The Taxomicon & Sistema

Naturae, 2000

16

3. Diferencias entre el género Rhdonius y Triatoma 21

4. Detección de T. cruzi y T. rangeli en heces de vectores colectados en Jalapa

y Zacapa mediante el ensayo del minicírculo

26

5. Detección de T. cruzi y T. rangeli en heces de vectores de Jalapa/Zacapa y

Chiquimula

28

6 Resultados obtenidos mediante el marcador del miniexón para muestras de

heces de triatominos colectadas en Jalapa, Zacapa y Chiquimula

31

7. Distribución de TCI y TCI/TCII en T. dimidiata y R. prolixus (Fisher exacto) 32

8. Frecuencia de alelos que no se consideraron picos verdaderos 35

9. Diferencia estadística entre la frecuencia de alelos no verdaderos entre los

vectores

36

10. Diferenciación génica y genotípica (Fisher exacto) de la distribución de

alelos según locus

38

11. Diferenciación génica y genotípica (Chi2) evaluando ambos loci 38

Resumen

La enfermedad de Chagas es causada por Trypanosoma cruzi. En Guatemala, este

parásito es transmitido por las heces de Rhodnius prolixus y Triatoma dimidiata. Se ha

observado que los vectores tienen diferentes hábitats, nichos ecológicos, focos y

reservorios siendo R. prolixus arborícola y T. dimidiata terrestre. En Sur América se

identificaron dos grandes linajes de T. cruzi asociados a los ciclos de transmisión arbóreo

y terrestre. En Guatemala, estudios preliminares (n = 28) mostraron que posiblemente hay

diferencia génica (p = 0.00000) y genotípica (p = 0.00355) entre las cepas de T. cruzi que

están infectando las heces de cada vector. Estos estudios sugieren la existencia de

coespeciación vector-parásito. Este proyecto tiene el objetivo de profundizar en el estudio

del ciclo de transmisión mediante la tipificación genética del parásito usando los

marcadores moleculares de minicírculo, miniexón y microsatélites y además estudiar su

asociación con diferentes vectores. Con el marcador de Miniexón se encontró que a nivel

de linajes, no hay diferencia significativa entre los aislados de cada vector. Sin embargo,

con los microsatélites que tienen una tasa de mutación más alta se encontró una

diferencia génica (p = 0.00000) y genotípica (p=0.00551) significativa. Estos resultados

dan evidencia que los ciclos de transmisión son diferentes y de la necesidad de analizar

con más detalle el comportamiento ecológico de los linajes en Guatemala. Se

recomienda aumentar el número de muestras de triatominos así como estudiar aislados de

reservorios o casos humanos.

ABSTRACT Chagas is a disease caused by Trypanosoma cruzi. In Guatemala this parasite is

transmitted by the feaces of the triatomines vectors Rhodnius prolixus y T. dimidiata. It

has been observed that these vectors have different habitats, ecological niches, focus and

reservoirs being R. prolixus arboreal and T. dimidiata terrestrial. In South America were

identified two major lineages of T. cruzi associated to the arboreal or terrestrial

transmission cycle. In Guatemala, preliminary studies (n = 28) showed a possible genic

(p = 0.00000) and genotypic (0.00355) differences between the strains of T. cruzi

infecting the feaces of each vector. These studies suggest the existence of coespiciation

vector-parasite. This Project has the objective of getting a deeper understanding about the

transmission cycle, using a genetic typification of the parasite based on molecular

markers such as minicírculo, miniexon and microsatellites, also study their association

with each vector. With the miniexon marker it was find no significant difference

between the isolates from each vector. Nevertheless, with the microsatellites, which have

a higher mutation rate, it was find a genic (p = 0.00000) and genotypic (p = 0.00551)

differences statistically significant. These results give evidence that the transmission

cycles are different and that there is a necessity of analyze the ecological behavior of the

lineages in Guatemala. Furthermore, we recommend increasing the number of triatomine

samples, study isolates from reservoirs and include human cases.

1

PARTE I

I.1 INTRODUCCIÓN

Entre el género de los Trypanosomas se encuentra la especie T. cruzi y la T.

rangeli, el primero es el causante de la enfermedad de Chagas, la cual afecta a 18

millones de personas en Latinoamérica (WHO, 1991), mientras que el segundo es un

parásito entomopatógeno no patogénico para humanos. Ambos parásitos son transmitidos

por insectos de la familia Reduviidae.

En Guatemala destacan como principales vectores Rhodnius prolixus y Triatoma

dimidiata. R. prolixus es considerada una especie doméstica en Guatemala, ya que no se

han identificado focos silvestres. Su nicho silvestre es arborícola y los principales

reservorios asociados a este nicho son marsupiales. En cambio, T. dimidiata se encuentra

en hábitats domésticos y silvestres, siendo considerado un vector cavernícola asociado

posiblemente a roedores (Nakagawa et al, 1999). Estas diferencias ecológicas sugieren

una evolución independiente y separada en los dos vectores.

Se ha descrito una amplia variabilidad genética en T. cruzi, por ejemplo, en base a

comportamiento biológico la especie se ha subdividido en biodemos; mientras que por

análisis bioquímicos se habla de zimodemos. Así mismo, estudios realizados

principalmente en Sur América mediante métodos moleculares basados en el gen del

miniexón, han diferenciado dos grandes linajes de T. cruzi. Estos linajes se han asociado

a diferentes ciclos de transmisión: el TCI se ha encontrado asociado a marsupiales y a

ecótopos domésticos en toda América mientras el TCII se encuentra asociado a mapaches

en Norte América y a armadillos en Sur América y a ecótopos domésticos principalmente

en Sur América. Gaunt y Miles propusieron en el 2000 una asociación entre Rhodnius

spp. Y TCI y T. rangeli y entre miembros de la tribu Triatomini y TCII.

La diferencia entre la ecología de los triatominos, la extensa variabilidad genética

de T. cruzi y las asociaciones estudiadas por Gaunt y Miles permiten sugerir la existencia

2

de coespeciación vector-parásito que puede ser aplicada a Guatemala. Esta información

es relevante a nivel clínico porque la mayor parte de la evidencia relaciona a los

hospederos humanos con TCII y a su vez con la tribu Triatominii. Además, las estrategias

de control y prevención deben ser estratificadas y enfocadas considerando esta

información.

En el marco de la competencia vectorial, en Sur América, se ha propuesto que R.

prolixus es un mejor vector para la enfermedad de Chagas, esto se ha dicho basándose en

patrones biológicos de alimentación, defecación y comportamiento. No obstante, por

métodos moleculares se ha observado que R. prolixus esta frecuentemente infectado por

T. rangeli en lugar de con T. cruzi. En el microscopio es fácil confundir entre ambos

tripanosomas ya que la morfología es similar, produciendo en algunos casos falsos

positivos. Por esas razones, es necesario prestar atención a T. dimidiata pues se encuentra

más asociado a los reservorios y a humanos. Además el control mediante la aplicación de

insecticida residual a probado ser inefectiva ya que por habitar en el área peridoméstica

ocurre reinfestación.

Para este estudio se propuso utilizar marcadores moleculares basado en miniexón

y microsatélites para estudiar la diversidad genética de T. cruzi en los principales

vectores: R. prolixus y T. dimidiata. Debido a la potencial infección de R. prolixus con

T. rangeli, se utilizaron métodos moleculares para verificar la especie del parásito

flagelado observado en el vector. Esta información permitirá determinar si hay diferencia

en los ciclos de transmisión asociados a estos vectores.

3

I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

I.2.1 Antecedentes

En algunos países se ha propuesto que R. prolixus es un mejor vector para la

enfermedad de Chagas, en Guatemala es necesario prestar atención a T. dimidiata

pues se encuentra más asociado a los reservorios y R. prolixus esta

frecuentemente infectado por T. rangeli. Así pues, la ampliación de este estudio

es de suma importancia para entender con más detalle el ciclo de transmisión y

que esto ayude en los programas de control.

En un estudio anterior se estudiaron 103 muestras de Chiquimula de ADN

extraídas de heces de los vectores, 31 de T. dimidiata y 72 de R. prolixus. En el

análisis de minicírculo, en todas las muestras provenientes de T. dimidiata se

detectó T. cruzi. Por el contrario, en R. prolixus sólo se detectó T. cruzi 5

muestras, mientras que 59 resultaron T. rangeli, hacer referencia a figura 1. Sin

embargo, existe la posibilidad de que haya una infección mixta en donde la alta

concentración de T. rangeli no permita la detección de T. cruzi. Aún así se

sugirió, que en Guatemala R. prolixus se encuentra más frecuentemente infectado

que con T. rangeli que con T. cruzi.

Figura 1: Detección de T.cruzi y T. rangeli en heces de vectores

5

31

59 0

8

0

01020304050607080

R.prolixus T. dimidiata

Vectores

Mue

stra

s no amplificóT. rangeliT. cruzi

4

El estudio continuó con el análisis con microsatélites desarrollados por

Rivera 2001, se tamizaron las 103 muestras de heces además de 9 de los

reservorios. Los resultados obtenidos en Genepop muestran que en base a MS3 y

MS5 hay diferencia genética (p = 0.00000) y genotípica (p = 0.00355) en las

cepas transmitidas por cada vector. Así mismo se encontró diferencia genética (p

= 0.00101) entre las cepas detectadas en R. prolixus y reservorios, hacer

referencia a cuadro 1. Los datos encontrados son determinantes porque indican

que el ciclo de transmisión en cada vector es diferente y que por lo tanto las

características del ciclo también lo podrían ser. Además el vector que más se

relaciona con las cepas encontradas en los reservorios es T. dimidiata. De modo

que los resultados resaltan la importancia de diseñar programas de control que

tomen en cuenta la diferencia en los ciclos de transmisión y que los focos

silvestres de T. dimidiata que pueden volver a reinfestar ciclos domésticos.

Cuadro 1: Diferenciación genética y genotípica de cepas de T. cruzi.

No obstante en el locus MS3 únicamente amplificaron 22 muestras de T.

dimidiata, 6 muestras de R. prolixus y 7 de reservorios; y en MS5 fueron 16

muestras de T. dimidiata, 8 de R. prolixus y 3 de reservorios. Como se dijo

anteriormente, la mayor parte de las muestras de R. prolixus estaban infectadas

con T. rangeli. Además, fue necesario optimizar un PCR anidado puesto que las

heces poseen inhibidores que no permiten la amplificación. También existen los

casos de alelos nulos porque algunas muestras solo amplificaron con un locus.

5

I.2.2 Justificación del trabajo de investigación

El ciclo de transmisión de T. cruzi es muy complejo, aún no esta bien

entendido ni se conoce con profundidad. El ciclo vectorial abarca R. prolixus y T.

dimidita, estudios en Sur América indican que sus reservorios y hábitats son

diferentes. Por otro lado, se han diferenciado dos grandes linajes de T. cruzi, los

cuales se han asociado a diferentes ciclos de transmisión: por un lado se encuentra

Rhodnius spp. infectado con TCI y T.rangeli y por el otro están los miembros de

la tribu Triatomini y TCII. Esto permite sugerir la existencia de coevolución

vector-parásito. Mediante moléculas antigénicas de superficie de tripomástigotes

se puede diferenciar infecciones por TCI y TCII. El resultado de estos análisis

realizados en muestras de pacientes de Argentina indica que las infecciones en

humanos están fuertemente asociadas con TCII.

Si se detecta diferencia significativa entre las cepas de T. cruzi que son

transmitidas por T. dimidiata de las que son transmitidas por R. prolixus se dirá

que los ciclos de transmisión en los vectores son diferentes. Esta información es

de gran utilidad para el control y prevención de la enfermedad puesto que cada

ciclo requerirá diferentes estrategias para su control y prevención. Un ejemplo es

que lo insecticidas residuales resultan eficientes con R. prolixus pero no en T.

dimidiata ya que esta última es capaz de reinfestar. De modo que el conocimiento

de los ciclos de transmisión ayudarán a predecir el rol que jugará T. dimidiata

cuando R. prolixus sea eliminado.

En Sur América, se ha propuesto que R. prolixus es un mejor vector para

la enfermedad de Chagas, esto se ha dicho basándose en patrones biológicos. No

obstante, en Guatemala es necesario prestar atención a T. dimidiata pues se

encuentra más asociado a los reservorios y R. prolixus esta frecuentemente

infectado por T. rangeli. Así pues, este estudio es de suma importancia para

entender con más detalle el ciclo de transmisión y que esto ayude en los

programas de control.

6

I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS

I.3.1 Objetivos

I.3.1.1 General

• Determinar si existen diferencias en los ciclos de transmisión de

Trypanosoma cruzi entre Rhodnius prolixus y Triatoma dimidiata

mediante la tipificación genética de los parásitos encontrados en estos

vectores.

I.3.1.2 Específicos

• Utilizar un marcador molecular basado en la secuencia del minicírculo

para diferenciar la infección de Trypanosoma cruzi y Trypanosoma

rangeli en contenidos fecales de Triatoma dimidiata o Rhodnius prolixus.

• Utilizar un marcador molecular basado en la secuencia del mini-exón para

diferenciar la infección con Trypanosoma cruzi I o Trypanosoma cruzi II

en contenidos fecales en Rhodnius prolixus o Triatoma dimidiata.

• Determinar si existe diferencia significativa entre la frecuencia alélica de

Trypanosoma cruzi en contenidos fecales de Triatoma dimidiata o

Rhodnius prolixus simpátricos, mediante el análisis de dos microsatélites.

7

I.3.1.3 Hipótesis

• Existe diferencia entre el linaje de Trypanosoma cruzi encontrado en el

ADN extraído de heces de Rhodnius prolixus y Triatoma dimidiata.

Ho: Los linajes de Trypanosoma cruzi encontrados en Rhodnius prolixus y

Triatoma dimidiata son iguales.

Ha: Los linajes de Trypanosoma cruzi encontrados en Rhodnius prolixus y

Triatoma dimidiata no son iguales.

• Existe diferencia genética entre las cepas de Trypanosoma cruzi

transmitidas por Triatoma dimidiata y Rhodnius prolixus en condiciones

simpátricas.

Ho: Las cepas de Trypanosoma cruzi en contenidos fecales de Triatoma

dimidiata y Rhodnius prolixus simpátricos son genéticamente iguales.

Ha: Las cepas de Trypanosoma cruzi en contenidos fecales de Triatoma

dimidiata y Rhodnius prolixus simpátricos no son genéticamente iguales.

8

I.4 METODOLOGIA

Localización: Este estudio se realizó con muestras de triatominos obtenidas en la

encuesta entomológica basal casa por casa (2002) el en los departamentos de Chiquimula

municipios: Chiquimula (latitud 14°48’0N, longitud 89°32’60W, altitud 419m), Olopa

(14°40’60N, 89°20’60W, 1243m), Camotán (14°49’0N, 89°22’0W, 576m), Jocotán

(14°49’0N, 89°22’60W, 480m), San Juan Ermita (14°46’0N, 89°25’60W, 601m),

Quezaltepeque (14°37’60N, 89°27’0W, 684m), Concepción las Minas (14°31’0N,

89°27’0W, 802m) y Esquipulas (14°34’0N, 89°20’60W, 765m); Jalapa: San Pedro

Pinula (14°40’0N, 89°50’60W, 1044m), Monjas (14°30’0N, 89°52’0W, 955m),

Mataquescuintla (14°31’45N, 90°11’3W, 1727m); Zacapa: la Unión (14°58’0N,

89°16’60W, 1228m), Zacapa (14°58’45N, 89°31’20W, 185m), Usumatlán (14°56’60N,

89°46’60W, 246m) y Río Hondo (15°4’0N, 89°34’60W, 379m).

I.4.1 Las Variables

1.4.1.1 Variables dependientes

La variable dependiente de este estudio es el perfil genético que se

encuentre en las cepas de T. cruzi aisladas de los vectores. Específicamente, el

perfil genético se refiere al linaje y a la distribución de alelos de microsatélites.

1.4.1.2 Variables Independientes

Las variables independientes son los vectores de la enfermedad de Chagas

en Guatemala, R. prolixus y T. dimidita. A partir de las heces se aisló ADN de T.

cruzi, con el fin de analizarlo genéticamente.

I.4.2 Indicadores

Los indicadores de este proyecto para el análisis de minicírculo y de

miniexón es el tamaño de los fragmento de ADN amplificados mediante PCR. El

Tamaño de la banda indica si una muestra de heces de vectores es positiva para T.

9

cruzi (330 pb) o para T. rangeli (450 pb) en el ensayo del minicírculo. Por su

parte, en el ensayo de miniexón, las bandas de 250, 200, 150, 100 pares de bases

corresponden a la presencia de T. cruzi I, T. cruzi II, zimodemo 3 y T. rangeli

respectivamente.

El indicador para el análisis de microsatélites es la distribución del

tamaño de los alelos de T. cruzi que se encuentre en las heces de cada vector. En

este caso el tamaño de los alelos se determinó mediante electroforesis capilar.

I.4.3 Estrategia Metodológica

I.4.3.1 Población y Muestra

Se recolectaron chinches del departamento de Chiquimula (103 muestras):

municipios de Chiquimula, Olopa, Camotán, Jocotán, San Juan Ermita,

Quezaltepeque, Concepción las Minas y Esquipulas; Jalapa (16 muestras): San

Pedro Pinula, Monjas, Mataquescuintla; Zacapa (41): La Unión, Zacapa,

Usumatlán, Río Hondo. Los especimenes del campo fueron disectados en el

laboratorio y las heces se recolectaron por punción rectal en tubos Eppendorf

1.5mL. Estas se preservaron dejándolas secar bajo campana.

I.4.4 El Método

1. Extracción de ADN:

Se extrajo el ADN de las heces preservadas en seco de Jalapa y

Zacapa con el Kit de Isoquick, Orca Research Inc, siguiendo las instrucciones del

manufacturador y la modificación de acuerdo a Schwartz et al 1997. El ADN de

las muestras provenientes de Chiquimula fue previamente extraído.

10

2. Análisis del minicírculo para muestras (n=57) de Jalapa y Zacapa:

a. PCR y tamizaje: El locus del ADN del minicírculo se amplificó usando el

cebador degenerado S35: 5´AAA TAA TGT ACG GGK GAG ATG CAT GA 3´

y el cebador S36: 5´GGG TTC GAT TGG GGT TGG TGT 3´(Avila et al 1990).

La reacción se realizó a un volumen final de 25uL con: buffer Taq 1x; 1mM

MgCl2 (cf: 1.5mM buffer Taq + 1mM extra = 2mM total); 0.025mM dNTP´s c/u;

0.4 uM cada cebador; 0.4U/uL Taq ADN polimerasa y 1uL de templado. El

programa (Icycler, Biorad, Hércules CA) consiste en desnaturalización inicial de

94°C por 5 minutos seguido de 30 ciclos de: 30 segundos a 94°C, 30 segundos a

64°C y 50 segundos a 72°C. Luego una extensión final de 7 minutos a 72°C.

Los amplicones se analizaron con un gel de agarosa 2% por 30 minutos y tinción

con bromuro de etidio. Los productos esperados son de 330 y 450 pares de bases

característico de T. cruzi y T. rangeli respectivamente (Vallejo et al 1999).

3. Análisis del miniexón para muestras (n=160) de Chiquimula, Jalapa y

Zacapa:

a. La amplificación se realizó utilizando un volumen final de 20 µL con 1

µL de ADN; 0.20 µM de cada cebador KMe1F (TTC TGT ACT ATA TTG GTA)

y KMe1R (CAA TAT AGT ACA GAA ACT G)(Sturn et al 1989); mix de dNTPs

0.15mM c/u; 1.5mM de MgCl2(CLP), 0.04U/µL de Taq Polimerasa (CLP) en

Buffer de Amonio 1X (CLP). Se agregó 2 gotas de aceite mineral a cada tubo, con

una pipeta de 1000 µl. El programa de amplificación (Icycler Biorad, Hercules,

CA). consistió en desnaturalización inicial a 94º C por 5 min., seguido de 30

ciclos de: desnaturalización 30 seg a 94º C, hibridación 30 seg a 48º C,

extensión 30 seg a 72º C. Por último una extensión final de 10 min a 72º C.

11

b. Reacción interna múltiplex. La reacción interna se preparó con: 1 µL de

ADN de la reacción externa , cebadores TC1F(ACA CTT TCT GTG GCG CTG

ATC G), TC3F(CCG CGA ACA ACC CCT AAT AAA AAT G), TRF(CCT ATT

GTG ATC CCC ATC TTC G), MER (TAC CAA TAT AGT ACA GAA ACT G)

(Fernandes et al 2001) todos 0.15 µM; mix de dNTPs 0.15mM c/u; 1.5mM de

MgCl2(CLP, San Diego, CA); 0.04U/µL de Taq Polimerasa (CLP, San Diego,

CA) en Buffer de Amonio 1x (CLP, San Diego, CA). El programa de

amplificación (Icycler Biorad, Hercules, CA) consistió en desnaturalización

inicial a 94º C por 5 min., seguido de 30 ciclos de: desnaturalización 30 seg a

94º C, hibridación 30 seg a 55º C, extensión 30 seg. a 72º C. Por último una

extensión final de 10 min a 72º C. Los productos de amplificación son de

200pb para T. cruzi I, 150pb para T. cruzi Zimodemo 3 y 100 pb para T. rangeli.

c. Reacción interna para T. cruzi II. Se utilizó el producto de la reacción

externa del PCR anidado anterior para realizar el PCR interno. La reacción

interna se preparó usando: 1 µL de ADN, cebadores TC2F(TTG CTC GCA CAC

TCG GCT GCA T) y MER a 0.15 µM c/u; dNTPs 0.15mM c/u; 1.5mM de

MgCl2(CLP); 0.04U/µL de Taq Polimerasa (CLP, San Diego, CA) en Buffer de

Amonio 1x (CLP, San Diego, CA). El programa de amplificación (Icycler

Biorad, Hercules, CA) consistió en desnaturalización inicial a 94º C por 5 min.,

seguido de 30 ciclos de: desnaturalización 30 seg a 94º C , hibridación 30 seg a

55º C, extensión 30 seg a 72º C. Por último una extensión final de 10 min a 72º

C. El producto de amplificación es de 250 pb.

4. Análisis de microsatélites para muestras (n=57) de Jalapa y Zacapa:

a. Cada microsatélite se amplificó por separado en un PCR anidado (MS5) y

semianidado (MS3) de un solo tubo, es decir sobre el producto de la primera

reacción, se agrega el segundo master mix. La reacción se realizó a un volumen

total de 40uL, 20uL para cada etapa. Las concentraciones finales (c.f.) de ambas

12

reacciones son las siguientes: buffer 1X, 1.5mM MgCl2, 0.15mM dNTP´s,

0.20uM cada primer externo y 0.125uM (sobre el volumen total) para cada

interno. 0.04U/uL Taq ADN polimerasa únicamente en la primera reacción y 1uL

de templado. El programa consistió en: desnaturalización inicial 5 min a 94°C;

25 ciclos de: 30 s a 94°C, 30 s a 58°C y 30 s a 72°C; extensión final de 45 s a

72°C. Se tamizó mediante una electroforesis nativa en geles de poliacrilamida

29:1 al 10% y el revelado se hizo con tinción plata siguiendo el protocolo de

Castillo 2002 (información no publicada).

b. Análisis de Fragmentos por electroforesis capilar: se realizó en la

Universidad de Arizona con el equipo ABI 3100 de Applied Biosystems. Los

electroferogramas se analizaron con el programa Peak Scanner v 1.0 (Applied

Biosystems). Con este programa se obtuvo el tamaño de los picos en pares de

bases su intensidad y área. El método utilizado consiste en incluir en cada

muestra una escalera estándar de pares de bases, en este caso fue Rox, a la cual se

le aplica el método “Local Southern” para obtener la mejor línea recta y de ahí se

extrapola para aproximar el tamaño del fragmento. En la figura 2 se muestra un

ejemplo de un electroferograma.

I.4.5 La Técnica Estadística

Se realizó una prueba exacta de Fisher (Fisher’s exact test)

comparando los linajes de T. cruzi encontrados en las heces de los vectores R.

prolixus y T. dimidiata. También se compararon los linajes encontrados en T.

dimidiata en cultivos y heces. Las diferencias fueron consideradas

estadísticamente significativas con p≤0.05.

Los picos obtenidos para cada muestra poseen un tamaño en pares

de bases cuantificado como números reales. Para hacer la aproximación al

número discreto correspondiente se usó el programa Allelogram desarrollado por

Idury y Cardon en 1997 que se basa en una aproximación por mínimos cuadrados.

13

Una vez obtenidos los picos verdaderos se obtuvieron distribuciones de

frecuencias para muestras de Triatoma dimidiata y Rhodnius prolixus por

separado. Se compararon las frecuencias mediante el análisis genético y

genotípico con el programa GenePop proporcionado por la Escuela de Ciencias

Biomédicas, Universidad de Tecnología Curtin, Australia y disponible en línea en

http://wbiomed.curtin.edu.au/genepop/.

Figura 2: Electroferograma que muestra los alelos del microsatélite MS5. Este

microsatélite es un trinucleótido amplificado mediante una estrategia anidada. El

eje “y” muestra la intensidad de fluorescencia (unidades arbitrarias) y el eje “x” es

el tamaño del fragmento en pares de bases.

I.4.6 Los Instrumentos a utilizar

En este estudio se utilizó el termiciclador Apolo 201 de la casa

comercial CLP y el iClycler de BIORAD para la amplificación del minicírculo, el

gen del miniexón y los microsatélites. Así mismo se utilizó equipo de

elctroforesis horizontal para los geles de agarosa y vertical para los geles de

poliacrilamida. La electroforesis capilar se llevó a cabo en un Genetic Analyser

de Applied Biosytems en la Universidad de Arizona.

14

PARTE II MARCO TEÓRICO

1. Enfermedad de Chagas

La enfermedad de Chagas o tripanosomiasis americana, es una zoonosis producida

por el protozoario flagelado Trypanosoma cruzi. Es una enfermedad crónica debilitante

que afecta la salud, el bienestar y la productividad de un gran número de seres humanos y

representa un problema de salud pública en América Latina. Se estima que en

Latinoamérica 16 a 18 millones de personas son infectadas por la enfermedad de Chagas

y de los infectados, 50,000 morirán cada año (CDC, 2003). En la República de

Guatemala se estima que 730,000 personas están infectadas y la incidencia anual

estimada es de 30,000 casos (OPS, 2000).

2. Vectores

La infección se propaga a los seres humanos de varias maneras: la principal es

vectorial y ocurre después de la picadura una “chinche picuda” que deposita heces en la

piel de la persona y cuando esta se frota introduce los parásitos en la herida, o bien puede

infectarse cuando las heces están en contacto con un corte abierto, ojos o boca (CDC,

2003). Los vectores de la enfermedad de Chagas que se consideran en Guatemala de

importancia epidemiológica son: Rhodnius prolixus (Stal, 1859) Triatoma dimidiata

(Latreille, 1811), son insectos hematófagos del orden Hemiptera, familia Reduviidae y

subfamilia Triatominae.

En Centroamérica R. prolixus es estrictamente domiciliar y sus poblaciones son

genéticamente muy restringidas inhábiles de colonizar diferentes hábitats (Schofield y

Dujardin, 1997). Se asocia principalmente con viviendas construidas con material

vegetal, frecuentemente es encontrado en la cara interna de los techos y paredes palma,

donde son muy activos y están protegidos de los factores climáticos (Tabaru et al, 1999).

T. dimidiata, por su lado, se encuentra en casas de adobe y bajareque y se desarrolla en el

área domiciliar, peridomocialiar y selvática (Zeledón 1981). Los vectores no son

comunes en casa de blocks de concreto (Tabaru et al, 1999). La estricta condición

15

intradomiciliar de R. prolixus los hace susceptibles a los insecticidas de acción residual y

a los cambios socioeconómicos de modo que permite tener un mejor control vectorial, a

diferencia de T. dimidiata que vive en las profundidades de las grietas.

Se ha sugerido que los vectores pueden diferir en su habilidad de transmitir T. cruzi,

ya que se han encontrado diferentes frecuencias de infecciones en humanos dependiendo

del vector con el que están relacionados. En el departamento de Zacapa donde R. prolixus

es el principal vector la seroprevalencia fue de 38.8% mientras que en Santa Rosa donde

habita T. dimidiata se encontró 8.9% (Paz-Bailey et al, 2002). Estos datos proponen a R.

prolixus como principal vector de la enfermedad de Chagas en Guatemala. Se ha

reportado que R. prolixus esta más frecuentemente infectado y se encuentra en mayor

densidades que T. dimidiata, lo que lo hace ser un mejor vector (Ponce, 1999; WHO,

2002). Por otro lado, la habilidad de transmitir T. cruzi está directamente asociado con el

comportamiento del vector respecto a patrones de alimentación y defecación, y en este

ámbito R. prolixus no parece evidenciar una coevolución con T. cruzi que favorezca su

transmisión (Takano y Edman, 2002). No obstante T. dimidiata tiene la ventaja de que

esta más ampliamente distribuido en Guatemala y además está adaptado tanto al ciclo

selvático como el doméstico.

3. Trypanosoma cruzi

Es un parásito unicelular que altera su vida entre dos hospedadores multicelulares,

uno invertebrado y uno vertebrado, presentando un ciclo de vida digenético. Los

tripanosomas tienen los componentes celulares típicos de los eucariotas: núcleo,

microtúbulos, retículo endoplasmático, aparato de Golgi y mitocondria. También posee

un kinetoplástido que es el componente celular al cual se debe el orden taxonómico.

Hacer referencia a cuadro 2. El kinetoplástido es una condensación de ADN extranuclear

que se encuentra cerca de la base del flagelo dentro de la región ocupada por la

mitocondria y que tiene forma de bastón. Este DNA conforma el 30% del total y es

análogo ADN mitocondrial encontrado en otros eucariotas (de Souza, 1999).

Básicamente esta formado por maxicírculos y una red de 20,000 a 30,000 minicírculos

16

altamente asociados, los primeros con un largo de 6 a 11um y los segundos de 0.45um

que corresponde a 1440 pares de bases (Englund et al, 1996).

Cuadro 2. Clasificación sistemática de T. cruzi según The Taxomicon & Sistema

Naturae, 2000

Dominio Eucariota

Reino Protozoa (Goldfuss, 1818; R.Owen, 1858)

Subreino Biciliata

Infrareino Excavata (Cavalier-Smith, 2002)

Filo Euglenozoa (Cavalier-Smith, 2002)

Subfilo Saccostoma (Cavalier-Smith, 2002)

Clase Kinetoplastea (Honigberg, 1963; L.Margulis, 1974)

Orden Trypanosomatida (Kent, 1880; Hollande, 1952)

Familia Trypanosomatidae (Doflein, 1901)

Género Trypanosoma (Gruby, 1843)

Subgénero Trypanosoma Schizotrypanum (Chagas, 1909)

Especie cruzi

(Brands, 2007)

a. Ciclo de transmisión de T. cruzi:

• Ciclo silvestre: prefiere ambientes ecológicamente cerrados o semiabiertos,

variando en las proporciones de hospederos a vectores dependiendo de una serie

de factores como el clima, altitud, humedad, características fauno florísticas y

disponibilidad de alimentos. En este contexto se encuentra en toda América,

albergándose el parásito en mamíferos de medio y pequeño tamaño y en los

insectos vectores. (Rodríguez et al, 2004)

• Ciclo doméstico: Se caracteriza en que el hombre es el principal reservorio de la

infección. Este ciclo resulta como producto de la tasa de migraciones desde áreas

rurales hacia zonas urbanas, acciones sobre el medio natural como quema o

deforestación y construcción de viviendas con materiales que pueden prestar

abrigo a los vectores. (Rodríguez et al, 2004)

17

• Ciclo peridoméstico: en este ciclo intervienen mamíferos (roedores domésticos,

marsupiales, gatos, perros) que libremente entran y salen de las domicilios así

como los triatomas silvestres que son atraídos por la luz de las casas y por el

alimento. Este ciclo sirve de unión a los ciclos silvestre y doméstico. (Rodríguez

et al, 2004)

4. Trypanosoma rangeli (Tejera, 1920)

En América latina este es el segundo tripanosoma de importancia por su infección en

humanos. Este parásito hemoflagelado perteneciente a la familia Stercoria, se caracteriza

por poder ser transmitido tanto mediante las heces como por las glándulas salivales.

Posee un kinetoplasto subterminal redondo que es más pequeño que en T. cruzi, el núcleo

esta cerca de la mitad del cuerpo y la membrana ondulante está bien desarrollada.

T. rangeli puede infectar a humanos y a una amplia variedad de animales selváticos y

domésticos, sin embargo no es patogénico para el hospedero (D’Alessandro, 1992). En

algunos casos se pueden presentar infecciones mixtas de T. cruzi con T. rangeli lo que

dificulta el diagnóstico de la enfermedad de Chagas ya que se han encontrado reacciones

serológicas cruzadas (Guhl & Marinkelle, 1982). Se ha observado que los triatominos,

particularmente los des género Rhodnius, son susceptibles a cepas de T. rangeli que

poseen el mismo origen geográfico (Machado et al. 2001).

5. Análisis de Minicírculo: Diferenciación de T. cruzi y T. rangeli.

Se han desarrollado varias pruebas para la detección específica de T. cruzi y T.

rangeli, algunas están basadas en ADN nuclear o del kinetoplástido. Los métodos que

usan el ADN del kinetoplástido como blanco parecen ser más sensibles en la detección de

la infección por T. cruzi: 0.015fg de ADNk minicírculo, aproximadamente 10 moléculas

(Sturm et al, 1989). De modo que es posible detectar la presencia de una sola célula de T.

cruzi en 20mL de sangre humana (Avila et al, 1991).

Las moléculas de minicírculo de T. cruzi, poseen una extensión de 1.4 kb y están

organizadas en cuatro segmentos, cada uno consiste en una región corta de ADN

18

altamente conservado entre T. cruzi, además posee una región más larga que exhibe alta

variabilidad en la secuencia (Degrave et al, 1988). Los cebadores para amplificar la

región variable se encuentran en la parte conservada alrededor de la misma y generan un

producto de 330 pares de bases (Avila et al, 1990; Sturm et al, 1989). En algunos casos

se detecta una banda a 660 o 990 pb que corresponde a múltiplos de la región variable del

minicírculo (Avila et al, 1993). La presencia de T. rangeli es determinada mediante la

detección de un fragmento de 760 pb y un juego de bandas entre 300–450 pb,

especialmente la banda a 450 (Vallejo et al, 1999).

6. Diversidad genética de T. cruzi

El parásito T. cruzi es considerado como una especie heterogénea que consiste en

varias subpoblaciones que circulan entre los vectores y sus reservorios (Review by

Devera et al, 2003). La diversidad genética puede ser el resultado de la propagación de

los clones con poco o ausente intercambio genético (Souto et al, 1996). En este contexto,

el mismo hospedero podría estar simultáneamente infectado por cepas diferentes, estas

cepas también corresponden a clones que se distribuyen en áreas geográficas específicas.

Entre las formas de clasificación de las cepas de T. cruzi se encuentra la realizada por

Souto et al, 1996. Basándose en los genes del ADNr y el miniexón se indicó un claro

dimorfismo del taxón que definió el grupo T. cruzi I y T. cruzi II; esta será la

nomenclatura que se usará en este trabajo.

a. Características biológicas

La diversidad genética ha sido apoyada por estudios de comportamiento biológico.

Se demostró que las cepas aisladas de reservorios humanos y de vectores en áreas

geográficas diferentes muestran un comportamiento distinto en los animales de

laboratorio (Review by Devera et al, 2003). El uso de parámetros biológicos acerca de la

interacción parásito-ratón dio lugar a tres subgrupos llamados biodemos. Estos

caracterizan por diferentes parasitemias, morfologías, tropismo por tejidos y lesiones

histopatológicas (Andrade, 1974). La teoría del modelo clonal histotrópico apoya que los

diferentes genotipos presentan una distribución favoritaria en tejidos sugiriendo que la

variabilidad genética influye en la forma clínica (Vago et al. 2000).

19

b. Análisis evolutivo

Kawashita et al, 2001, realizó un análisis filogenético (“maximun likelihood”) de 20

cepas representatives de T. cruzi basándose en comparaciones directas de las secuencias

de 18S y D7-24Sa ADNr, con lo cual se confirmó una subdivisión primaria en dos

linajes, hacer referencia a figura 3 (Souto et al. 1996; Stothard et al. 1998; Fernandes et

al. 1998a). El riboclado 1 corresponde a T. cruzi II y se encontró principalmente en el

ciclo doméstico y en pacientes. Por su lado, T. cruzi I (riboclado 2) y Z3 (riboclado 4) se

ha asociado con el ciclo selvático aislándose de zarigueyas, roedores salvajes y

triatominos (Miles & Cibulskis 1986; Zingales et al. 1998; Fernandes et al. 2001).

Posiblemente la variabilidad encontrada entre los riboclados 2, 3 y 4 se explica con la

evolución y la distribución específica de sus hospederos y vectores que evolucionaron en

Sur América durante el Cenozóico (Marcilla et al. 2001).

El ancestro hipotético de los riboclados 1, 2, 3 y 4 se esparció en todo sur y norte

América hace 84.4 millones de años atrás cuando Sur América y África aún estaba

unidos. Cuando estos continentes se separaron, en el período Cenozoico, la fauna de Sur

América estaba compuesta por marsupiales, edentates y ungulates. Se propone que los

riboclados 2, 3 y 4 evolucionaron de los marsupiales sur americanos que estaban aislados

de los placentales de Norte América infectados con el riboclado 1, esto posiblemente

ocurrió en el período cenozoico. De acuerdo con esta hipótesis, el riboclado 1 puede

haber llegado a Sur América durante el oligoceno junto con los roedores y los primates

que migraban de isla en isla, o durante el gran intercambio de fauna que ocurrió durante

el plioceno-pleistoceno cuando Sur y Norte América se conectaron mediante el istmo de

Panamá (Kawashita et al, 2001). En Norte América la asociación entre riboclado 1 y

mamíferos placentales y por otro lado riboclado 2 y marsupiales es fuerte y puede ser

evidencia de la evolución independiente de estos clados por un largo período de tiempo

(Clark et al, 1994). De modo que la divergencia entre T. cruzi I y II posiblemente ocurrió

en el período cretácico (144-65 millones de años atrás) y los subclados divergieron en el

20

período terciario de la era cenozoica (65 a 1.8 millones de años atrás) (Kawashita et al,

2001).

Figura 3: Tiempos estimados de divergencia para los riboclados de Trypanosoma cruzi y

su correlación con grupos definidos mediante otros métodos.

(Adaptado de Kawashita et al, 2001)

Otra alternativa….

Al asumir una razón de evolución más alta (4% de divergencia por 100 millones de

años) para la secuencia de ADNr 18S en T. cruzi. Esto sugeriría que la divergencia de las

cepas ocurrió recientemente, menos de 18 millones de años y que puede ser el resultado

de la coevolución con los vectores o las barreras geográficas en Sur América que aislaron

a los marsupiales de los mamíferos placentales (Kawashita et al, 2001).

Virtualmente, todas las especies de Rhodnius están asociadas principalmente con

árboles de palma, (Miles 1979, Carcavallo et al. 1998), lo que podría deberse a una

historia evolutiva común (Gaunt & Miles, 2000). La adaptación de Rhodnius a las palmas

puede evidenciarse por la coloración, los órganos escaladores y en que la distribución de

estos dos grupos coincide notablemente. Además muchas especies de este género se

alimentan de pájaros que comúnmente viven en estas plantas. Una investigación que

21

asocia a las especies de Triatoma con su hábitat (Miles 1979), revela que al menos 20

especies están asociadas con cavernas o madrigueras de roedores. La preferencia de un

género por su hábitat influencia la distribución dentro de las casas, por ejemplo, R.

prolixus se encuentra en techos de palma.

Se ha observado que T. cruzi I y T. rangeli han sido consistentemente aislado a partir

de zarigüeyas (marsupiales del género Didelphis), que se encuentran infectando especies

de Rhodnius (Povoa et al. 1984, Carrasco et al. 1996) y que la distribución geográfica de

parásitos, reservorios e insectos coincide. La diferencia principal es que T. cruzi I se

transmite por contaminación fecal mientras que T. rangeli por saliva. Por su lado, T.

cruzi II predomina en el ciclo de transmisión doméstica en países de Sur América (Miles

et al. 1984, Chapman et al. 1984), mientras que T. cruzi I en los ciclos de transmisión del

norte del amazonas. Esto lleva a hipotetizar que hay una asociación entre T. cruzi II,

Triatoma y roedores (Gaunt & Miles, 2000). Además, en el sur de Brazil se le ha

asociado con primates (Fernandes et al. 1999). En el cuadro 3 se sintetizan estas

asociaciones las cuales se sugieren un patrón de evolución (Gaunt & Miles, 2000), no

obstante pueden existir excepciones.

Basado en estas observaciones se propone que T. cruzi 1 evolucionó en palmas con

especies Rhodniini y en asociación con zarigüeyas (Didelphis). Mientras que, T. cruzi II

y Z3 evolucionaron de hábitats y madrigueras terrestres en lugares rocosos con los

insectos Triatomini y en asociación con edentates y posiblemente marsupiales. Así, los

edentates son el hospedero primario de T. cruzi II y Z3 y las subdivisiones pudieron ser

contemporáneas en Sur América desde hace 65 millones de años. (Gaunt & Miles, 2000).

Cuadro 3: Diferencias entre el género Rhdonius y Triatoma

Rhodnius Triatoma

Ecotopo silvestre Arboreal: palmas Terrestre: rocas

Tripanosomas asociados T. cruzi I y T. rangeli T. cruzi II

Hospederos asociados Marsupiales Roedores y primates

(Adaptado de Gaunt & Miles, 2000)

22

c. Características bioquímicas

La electroforesis enzimática evaluando las enzimas ALAT, ASAT, isomerasa

glucofosfato (GPI), glucosa 6 fosfato dehidrogenasa (G6PDH), enzima málica (ME) y

fosfofoglucomutasa (PGM) se obtuvieron los zimodemos 1 y 2 (Miles et al.1981). El

zimodemo 1 agrupa a los marsupiales y los triatominos salvajes, el Z2 son domésticos y

se derivan de humanos y mamíferos domiciliares. Estudios adicionales mostraron un

tercer zimodemo asociado a ambientes selváticos (Review by Devera et al, 2003).

d. Características moleculares

Mediante análisis de Esquizodemos, amplicación random de ADN polímórfico

(RAPD) y fragmentos de restricción de ARN ribosomal se ha confirmado la

heterogenicidad de T. cruzi y su subdividión en dos grupos pricipales.

• El análisis del miniexón, que es tema de esta propuesta, será a continuación

explicado. El gen del miniexón está presente en el genoma nuclear de los organismos del

orden Kinetoplástida en casi 200 copias repetidas en tandem, las cuales consisten en tres

diferentes regiones: exón, intrón y región intergénica. El exón es una secuencia de 39

pares de bases, altamente conservada dentro del orden y que es agregada post

transcripcionalmente en todos los ARNm. El intrón, por su parte, es moderadamente

conservado entre el género o subgénero mientras que la región intergénica, también

llamado espaciador no transcrito (NTS-ME) es particularmente diferente entre especies

(Devera et al., 2003). El espacio intergénico puede ser amplificado con PCR haciendo

posible la clasificación de T. cruzi en dos grupos taxonómicos principales I y II

(Fernández, 1996; Souto et al, 1996; Fernandes et al, 1998). Hacer referencia a figura 4

en donde se muestra la estrategia de amplificación y la localización de sondas específicas,

los cebadores ME-L y ME-R reconocen secuencias del exón (cuadro gris), el intrón se

localiza en el cuadro negro y finalmente la línea que conecta representa el espaciador no

transcrito y variable. T. cruzi I se observa principalmente en animales y triatominos

salvajes, mientras que T. cruzi II está en humanos (Fernandes et al. 1998, Zingales et al.

1998).

23

Figura 4: Esquema de la estrategia de amplificación del gen miniexón y localización de

sondas específicas para determinar el grupo al que pertenece.

(Adaptado de Fernandes et al, 1998)

Estos subgrupos también pueden relacionarse con los zimodemos propuestos

mediante electroforesis enzimática, T. cruzi I corresponde al zimodemo 1 y T. cruzi II al

zimodemo 2, sin embargo, la posición del zimodemo 3 no esta clara. (Fernandes, 2001).

Este proyecto usa el multiplex PCR basado en el espaciador no transcrito del gen

miniexón para determinar la presencia de T. cruzi I, II, Z3 o T. rangeli. Esta técnica se

ve favorecida ya que el gen está repetido en tandem. El procedimiento se hace usando un

pool de 5 cebadores, 4 de ellos “foward” y un “reverse”. Los “foward consisten en tres

oligonucleótidos que se derivan de la región hipervariable y repetida del miniexón (TC1:

5’ACA C T TTC TGT GGC GCT GAT CG 3´; TC2: 5’ TTG CTC GCA CAC TCG GCT

GCA T 3´ y TC3: 5’ CCG CGW ACA ACC CCT MAT AAA AAT G 3´) y un

oligonucleótido de la región específica del espaciador no transcrito de T. rangeli (TR: 5’

CCT ATT GTG ATC CCC ATC TTC G 3´). Como cebador “reverse” se usa un

oligonucleótido que corresponde a una secuencia presente en casi toda la región

conservada de los genes del miniexón (ME: 5’ TAC CAA TAT AGT ACA GAA ACT G

3´) (Fernandes, 2001).

• Análisis con microsatélites: Este tipo de ADN consiste en unidades de

nucleótidos que se repiten en tandem, se usan como marcadores genéticos puesto que el

número de repeticiones en un locus dado puede variar de un individuo a otro. Según el

tamaño de la unidad y la cantidad de veces en que se repite, este ADN se ha divido en

tres clases conocidas como satélites, minisatélites y microsatélites (Bennett 2000).

24

Los microsatélites se pueden organizar en una forma simple que consiste en varias

repeticiones de dos o más nucleótidos, o pueden posee una estructura más compleja: dos

o mas motivos repetidos, (CA)n(GT)n, o (dC-dA)n(dG-dT)n. Se les denominan

imperfectos o complejos cuando tienen espaciadores entre motivos repetidos varias

veces, (GA)n (N)n (CT)n. El número de copias de la unidad de repetición en un loci

específico es extremadamente polimórfico y la variación del número de repeticiones

puede ocurrir entre alelos. La razón de mutación varia entre 10-6 a 10-2 . Esta razón

cambia de acuerdo al número de repeticiones en el arreglo (Harr et al, 2000).

Gracias a su tamaño son versátiles en su manipulación en el laboratorio; se pueden

elaborar cebadores de las regiones flanqueantes conservadas, ser amplificados por la

reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) y luego separados en

medio de alta resolución, como lo es la acrilamida, en donde la diferencia de una

repetición puede ser resuelta sin ambigüedad. Se han desarrollado tecnologías que ayudan

en el análisis electroforético de los alelos de cada muestra. Actualmente el PCR se lleva a

cabo con cebadores marcados covalentemente con fluorescencia. La separación se hace

bajo el principio de la electroforesis haciendo migrar los amplicones a través de capilares.

Estas moléculas absorben la luz proveída por un láser y la emiten a una longitud de onda

específica para cada fluorocromo. Al final del capilar, se encuentra un detector que

analiza las emisiones y las traduce a un patrón de diferentes colores que corresponden a

una longitud de onda particular. La computadora registra, como en el caso de un

cromatógrafo, el tiempo de elusión, el tamaño en pares de bases, el área y la altura de

cada pico. Este sistema permite trabajar varios microsatélites siempre y cuando posean

tamaño y fluorocromos diferentes.

7. Trabajos realizados en Guatemala

En Guatemala Rivera (2003) identificó locus correspondientes a microsatélites

polimórficos en el genoma del T. cruzi. A partir de estas secuencias se diseñaron

cebadores específicos para amplificar 11 locus, de estos únicamente tres (MS3, MS5 y

MS6) mostraron polimorfismo. Luego estos tres se amplificaron usado aislados de T.

cruzi localizados en seis departamentos endémicos de Guatemala, en una región cercana

25

al canal de Panamá en Panamá, en la provincia de Manabi de Ecuador y en dos estados

del Brasil. Las muestra provienen de vectores: Triatoma dimidiata, Rhodnius prolixus y

Rhodnius pallescens; reservorios y humanos. (Rivera, 2003).

El locus MS3 se caracteriza por presentar una serie de alelos no esperados espaciados

del alelo más cercano por 23 pares de bases. Cuando se incluyó este alelo espaciado y los

tres microsatélites descritos, el análisis filogenético reveló una segregación marcada en

dos grupos denominados I y II. A estas muestras se les hizo un análisis mediante los

marcadores TC1 y TC2, según esto, el grupo II corresponde principalmente a TC2 y ellos

circulan en un ambiente silvestre pero tienen la capacidad de colonizar asentamientos

humanos. Mientras que en el tipo I se observa una mezcla de linajes, que sugieren que

hay una subdivisión basada en el hospedero del cual fueron aislados. Cabe mencionar

que estos subgrupos presentan una fuerte distancia genética entre ellos. Por su parte, al

analizar las muestras eliminando los alelos espaciados de MS3 se observó también la

presencia de dos grandes grupos, sin embargo la división no parece estar basado en los

linajes sino que en los genotipos. Además, el menor valor de la distancia genética de Nei

obtenida podría suponer una estructuración poco real (Rivera, 2003).

En este proyecto a tipificación genética de T. cruzi en contenidos fecales de R.

prolixus y T. dimidiata, se basa en los locus MS3 y MS5 desarrollados por Rivera, 2003.

El locus MS3 corresponde a un dinucleótido (TG)20, su alelo predominante es 190pb, sin

embargo también puede presentarse como 231pb, para el análisis, el cebador “Foward”

esta marcado con el fluorocromo 6FAM (azul). Por otro lado, el locus MS5 es un

trinucleótido (CAA)7, con alelo predominante 230pb, su cebador “Foward” esta marcado

con HEX (verde).

26

PARTE III

III. RESULTADOS Y DISCUSION

1. Análisis de minicírculo para muestras (n=57) de Jalapa y Zacapa

Se recolectaron insectos de Jalapa y Zacapa, 57 de estos presentaron heces

positivos por microscopía para tripanosomas. A estas muestras se les extrajo el ADN y a

continuación se sometieron a un análisis basado en la secuencia del minicírculo que es

capaz de discriminar entre aquellas infectadas por T. cruzi o T.rangeli. En el cuadro 4 y

en la figura 5 puede verse que R. prolixus esta infectado similarmente por T. cruzi (9/38,

23.7%) y por T.rangeli (8/38, 21.1%) mientras que T. dimidiata se encuentra únicamente

infectado con T.cruzi (9/19, 47.4%). Los resultados de infección para R. prolixus no son

los esperados según ensayos previos, hacer referencia a Marco Teórico. Anteriormente en

aislados de Chiquimula, se había registrado infección principal por T. rangeli (59/72,

81.9%) y secundaria por T. cruzi (5/72, 6.9%).

Cuadro 4: Detección de T. cruzi y T. rangeli en heces de vectores colectados en Jalapa y

Zacapa mediante el ensayo del minicírculo

Vector Parásito Frecuencia %

T. cruzi 9 23.7

T. rangeli 8 21.1

No amp 21 55.3

R. prolixus Total 38 100.0

T. cruzi 9 47.4

T. rangeli 0 0.0

No amp 10 52.6

T. dimidiata Total 19 100.0

27

Figura 5: Detección de T. cruzi y T.rangeli en heces de vectores colectados en Jalapa y Zacapa mediante el ensayo de

Minicírculo

9 9

80

21

10

05

10152025303540

R. prolixus T. dimidiataVectores

Mue

stra

sNo ampT. rangeliT. cruzi

No obstante, a diferencia del ensayo con aislados de Chiquimula, la mitad de estas

muestras, R. prolixus (21/38, 55.3%); T. dimidiata (10/19, 52.6%) no amplificaron. La no

amplificación no descarta una infección positiva porque existe la posibilidad de que se

haya errado en alguno de los pasos previos a este ensayo. Sería necesario evaluar, el

método de preservación de las heces, la eficiencia de la extracción, los inhibidores de

PCR, la preparación del master mix, la sensibilidad en la detección de las bandas, entre

otros. Se recomienda desarrollar un control interno positivo que descarte la presencia de

inhibidores o errores en la reacción para el futuro.

Con el fin de tener un mejor entendimiento de la distribución de T. cruzi y T.

rangeli en las heces de los vectores, se procedió a realizar este análisis usando el

marcador basado en la secuencia del mini-exón en lugar de usar el minicírculo. En el

cuadro 5 y figura 6 se presenta la comparación de las frecuencias encontradas en los

aislados de los diferentes departamentos. Se debe hacer la aclaración que esta

comparación da una idea de lo que ocurre pero no puede tomarse como absoluta porque

los ensayos son diferentes. Sería necesario hacer un análisis de sensibilidad y

especificidad de cada uno antes de compararlos. Sin embargo, se observa que las

frecuencias de infección son similares. En ambos casos R. prolixus se encuentra

principalmente infectado con T.rangeli, mientras que T. dimidiata con T. cruzi.

28

Cuadro 5: Detección de T. cruzi y T. rangeli en heces de vectores de Jalapa/Zacapa

(n= 57) y Chiquimula (n= 103)

Jalapa/Zacapa

Ensayo Miniexón

Chiquimula

Ensayo Minicírculo

Vector Parásito Frecuencia % Frecuencia %

T. cruzi 9 23.7 5 6.9

T.cruzi/T.rangeli 4 10.5 0 0.0

T. rangeli 18 47.4 59 81.9

No amp 7 18.4 8 11.1

R. prolixus

Total 38 100 72 100.0

T. cruzi 8 42.1 31 100.0

T.cruzi/T.rangeli 0 0.0 0 0.0

T. rangeli 0 0.0 0 0.0

No amp 11 57.9 0 0.0

T. dimidiata

Total 19 100 31 100.0

Figura 6: Detección de T. cruzi y T. rangeli en heces de vectores colectados en Jalapa y Zacapa mediante el ensayo del Miniexón

9 8

40

18

0

7

11

05

10152025303540

R. prolixus T. dimidiata

Vectores

Mue

stra

s No ampT. rangeliT.cruzi/T.rangeliT. cruzi

Los resultados descritos concuerdan con la teoría de Gaunt y Miles 2000 que

sugiere una alta asociación evolutiva entre el género Rhodnius y T. rangeli. A su vez

29

estos resultados destacan la importancia de estudiar la influencia de T. rangeli en el ciclo

de transmisión de T.cruzi. T. rangeli es una especie no patógenica para humanos que

puede ser fácilmente mal diagnosticada con T.cruzi. Por esa razón se recomienda que se

revisen las técnicas de diagnóstico y los índices de prevalencia de la enfermedad de

Chagas en regiones en donde Rhodnius esta presente.

A su vez, es necesario estudiar la competencia entre ambos tripanosomas a través

de todo el ciclo de transmisión, en reservorios, en hospederos y en vectores. Este estudio

incluiría la interrelación entre T.rangeli y cada uno de los linajes de T.cruzi.

2. Análisis de miniexón para muestras (n=160) de Chiquimula, Jalapa y

Zacapa.

Utilizando el gen del mini-exón, en Guatemala y México se ha encontrado TCI

tanto en vectores como en hemocultivos de muestras humanas (ciclo doméstico y

selvático), y se cree que juega un papel importante en infecciones humanas (Ruíz-

Sánchez, et. al. 2005; Higo, et. al. 1997), así también en Panamá el TCI se ha encontrado

en hemocultivos de muestras humanas y en el vector R. pallescens, siendo éste el

principal genotipo en el ciclo doméstico/peridoméstico y selvático y el responsable de la

enfermedad en éste país (Sousa, et.al. 2006, Samudio, et.al., 2007). Mientras que en

Brazil TCII es preferencialmente asociado con infecciones humanas y TCI es asociado a

ambos ciclos. (Fernandes, et. al. 1998,1998a, 1999, 2001, Miles, et. al 1977, O´Connor,

et. al. 2007).

Existen varias hipótesis que explican que la evolución de de los linajes de T. cruzi

se encuentra relacionado con la evolución sus hospederos. Una de las hipótesis sugiere

que el TCII evolucionó en América del Sur junto con los placentales, mientras que el TCI

evolucionó en América del Norte junto con marsupiales y edentados, cuando ambos

continentes se encontraban separados. Se propone que no importando el origen de los

30

linajes, el gran intercambio de fauna durante la conexión de las Américas a través del

istmo de Panamá debió permitir el movimiento del TCII y el TCI en Centro América.

En las muestras analizadas, recolectadas en ambientes domésticos se encontró que

un 13%(3/24) de muestras provenientes de T. dimidiata y un 2%(2/89) de R. prolixus se

encontraban infectadas con ambos linajes, TCI y TCII; mientras que un 33%(8/24) de T.

dimidiata y 8%(7/89) de R. prolixus se encontraban infectados sólo con TCI. Un

39%(35/89) de las muestras de R. prolixus se encontraban infectadas únicamente con T.

rangeli, mientras que un 4%(4/89) se encontraban infectadas simultáneamente con TCI y

T. rangeli (Cuadro 6, Figura 7). No se encontró el TCII sólo en ninguno de los vectores.

Estos resultados señalan la presencia de cepas TCII en el ámbito doméstico en la

región. Estudios anteriores que han analizado muestras de T. cruzi de Guatemala han

demostrado la presencia de TCI pero no se ha comprobado la presencia de TCII en

humanos o vectores. (Ruíz-Sánchez, et. al. 2005). Nuestros resultados sugieren que en

Guatemala existen tanto el TCI como el TCII circulando en el ciclo doméstico de

transmisión.

Una adecuada caracterización de T. cruzi es esencial para determinar el rol que los

diferentes linajes puedan jugar en la patogénesis, manifestaciones clínicas y diferencia en

la respuesta a la quimioterapia. Se conoce que T. cruzi I son más resistentes a las drogas

(benznidazol e itraconazol) que T. cruzi II; así también que una mezcla en linajes de T.

cruzi presenta una respuesta distinta al tratamiento con benznidazol que una infección

con un solo linaje. Así también se conoce que el TCII es más patogénico, siendo asociado

a los mega síndromes; mientras que el TCI es menos patogénico y es asociado a las

manifestaciones cardíacas.

La presencia de ambos linajes de T. cruzi en las heces de los vectores puede

generar una epidemiología más compleja ya que tanto vectores como hospederos podrían

estar infectados con ambos linajes, y en éstos últimos, darse un tropismo diferencial a

tejidos ocasionando así manifestaciones clínicas diversas. Por esto es importante conocer

31

el genotipo de T. cruzi causante de la enfermedad de Chagas en Guatemala ya que el

tratamiento adecuado para pacientes depende de dicho genotipo; por lo mismo se

recomienda utilizar esta metodología modificada para analizar muestras de humanos

(hemocultivos, tejidos) con casos de enfermedad Chagas.

Cuadro 6: Resultados obtenidos mediante el marcador del miniexón para muestras de

heces de triatominos colectadas en Jalapa, Zacapa y Chiquimula.

T. dimidiata R. prolixus

Frecuencia % Frecuencia %

TCI 8 33 7 8

TCII 0 0 0 0

TCI y II 3 13 2 2

TCI y T. rangeli 0 0 4 4

T. rangeli 0 0 35 39

no amplificó 13 54 41 46

Total 24 100 89 100

*Los números indican el total de muestras positivas para cada linaje de T. cruzi: TCI

(T. cruzi I), TCII (T. cruzi II) así también para T. rangeli.

Figura 7: Resultados obtenidos mediante el marcador del miniexón para muestras de heces de triatominos

colectadas en Jalapa, Zacapa y Chiquimula

0

10

20

30

40

50

60

TCI TCII TCI y II TCI y T.rangeli

T. rangeli noamplificó

Frec

uenc

ia

R. prolixus (n=69)T. dimidiata (n=24)

32

Para determinar si existe diferencia significativa en los linajes de T. cruzi entre T.

dimidiata y R. prolixus se realizó una prueba exacta de Fisher, cuadro 7.

Cuadro 7: Distribución de TCI y TCI/TCII en T. dimidiata y R. prolixus (Fisher exacto)

T. dimidiata R. prolixus

TCI 8 11

TCI/TCII 3 2

P=0.6299

Se determinó que no existe diferencia significativa entre los linajes de T. cruzi

encontrados entre T. dimidiata y R. prolixus. En este estudio no se observó la relación

descrita por Gaunt & Miles, en el cual proponen que las especies de Rhodnius están

asociadas con TCI y Triatoma con TCII. La presencia de ambos linajes se puede deber

al traslape que existe entre el ciclo doméstico y selvático, ya que los vectores selváticos

como T. dimidiata acarrean el parásito de ecótopos silvestres (cuevas, selvas,

madrigueras, palmeras, chultunes, cúmulos de piedra, troncos secos) a las viviendas

humanas atraídos por la luz. Así también con la migración de asentamientos humanos se

han invadido zonas silvestres y las viviendas se han construido cercanas a estos ecótopos

en los que se encuentran las chinches, las cuales pueden ser atraídas por la luz de las

viviendas y llegar a estas (Menes et.al. 2007). Los reservorios selváticos como Didelphis

spp. y roedores pueden invadir temporalmente ecótopos peridomésticos y domésticos en

búsqueda de alimento o refugio (Cordón-Rosales, Pennington, 2007).

Las muestras se deben analizar mediante otros métodos para descartar que las

mezclas de TCI y TCII encontradas sean híbridos, lo cual indicaría que en algún

momento hubo eventos de reproducción sexual en T. cruzi (Higo, et. al. 2000) y que

posteriormente estos híbridos se propagaron clonalmente (Freitas et. al., 2006). Esto es

de mucha importancia ya que aunque haya un bajo nivel de intercambio genético, esto

permitiría la recombinación de cualquier atributo biológico o de marcadores genéticos

como la sensibilidad hacia drogas (Higo, et. al. 2000).

33

3. Análisis de microsatélites para muestras (57) de Jalapa y Zacapa.

Se analizaron las muestras de ADN extraído de heces de 57 triatominos, 17 de T.

dimidiata y 40 de R. prolixus de Jalapa y Zacapa mediante un PCR que amplifica

microsatélites. Los amplicones se enviaron a la Universidad de Arizona para su análisis

mediante electroforesis capilar y a continuación se visualizaron con el software Peak

Scanner 1.0 de Applied Biosystems. Según este software el 26.3% (15/57) de las

muestras, 7% (4/57) de T. dimidiata y 19.3% (11/57) de R. prolixus no se pudieron

analizar porque estaban fuera de escala (“offscale”) o la señal es de mala calidad. De

modo que el número de muestras se redujo a 13 de T. dimidiata y 29 de R. prolixus.

La selección de picos verdaderos se hizo aplicando a las muestras una serie de

criterios: (1) Eliminación de la señal menor a 100 pares de bases producida por

tetrámeros o dímeros de cebadores, figura 8; (2) la intensidad mínima fue de 50unidades

de fluorescencia para no confundir picos verdaderos con ruido, figura 9; (3) el múltiplo

de repetición del nucleótido, figura 10; (4) el límite inferior del tamaño del amplicón por

la ausencia total del microsatélite; (5) la adición de adeninas por la polimerasa; (6) la

formación de productos que poseen el múltiplo de repetición pero que son artefactos del

PCR creados por la polimerasa al amplificar el fragmento (stturers), figura 11.

Figura 8: Electroferograma que muestra tetrámeros o dímeros de cebadores en la región

menor a 100 pares de bases (51.89 y 92.11 pb). Estos no son picos producidos por el

microsatélite.

34

Figura 9: Electroferograma que muestra la señal debida a ruido, menor a 50

unidades de fluorescencia y tres picos verdaderos (254.4, 257.95, 263.47 pb).

Figura 10: Electroferograma que muestra un microsatélite con un múltiplo de repetición

de 3 bases (225.32, 232.22 pb).

Se encontraron tres alelos que no cumplen con los criterios anunciados

anteriormente, sin embargo por la frecuencia en que se observaron se discuten en este

apartado. Para MS5 se encontró un alelo alredor de 161 (157-163) pares en todos los

casos el pico aparece partido de la punta (pick-split). Esta señal está presente en 10

muestras, 3 de T. dimidiata (23%(3/13)) y 7 de R. prolixus (24%(7/29)), hacer referencia

a cuadro 7.

35

Figura 11: Electroferograma que muestra artefactos de la amplificación (236.84, 264.23,

268.67 pb) pero que no son picos verdaderos (238.73 y 266.09 pb). Estos se reconocen

por su proporción respecto al pico principal y por su comportamiento en que la

fluorescencia va aumentando conforme se acerca al pico principal y luego disminuye.

Así mismo, se encontró un posible alelo de 114 pares de bases para MS3 presente

en 7 muestras, 4 de T. dimidiata (30.8% (4/13)) y 3 de R. prolixus (10.3% (3/29)). En este

caso la señal tiene un área muy grande comparado con la altura del pico. Además se

encontró un posible alelo alrededor de 156 (154-157) pares de bases para MS3 presente

en 14 muestras, 8 de T. dimidiata (61.5% (8/13)) y 6 de R. prolixus (20.7% (6/29)). Este

pico tampoco se consideró verdadero por ser pick-split, hacer referencia a cuadro 8.

Todas las señales que no cumplieron con los criterios para considerarse

verdaderos, no se incluyeron en los análisis posteriores.

Cuadro 8: Frecuencia de alelos que no se consideraron picos verdaderos.

MS Alelo T. dimidiata

(n=13)

R. prolixus

(n=29) Total (n=42)

5 161 23%(3/13) 24%(7/29) 23.8% (10/42)

3 114 30.8% (4/13) 10.3% (3/29) 16.7% (7/42)

3 156 61.5% (8/13) 20.7% (6/29) 33.3% (14/42)

36

Se investigó si hay diferencia en la frecuencia con que estos alelos aparecen en los

vectores de la enfermedad de Chagas. Para esto se hizo un análisis de Fisher exacto con

dos colas y se consideró diferente los valores P menores a 0.05. Hacer referencia a cuadro

9. Según esto no hay diferencia estadísticamente significativa en la frecuencia de dos de

los alelos, sin embargo en el alelo 156 de MS3 sí se observó diferencia. Este dato

contribuye a fortalecer la hipótesis planteada en este estudio, de que las cepas de T. cruzi

que transmiten ambos vectores son diferentes. Se debe considerar que se usó una prueba

no paramétrica y que por lo tanto se necesitan 5 o más datos para cada categoría en la

tabla de contingencia.

Cuadro 9: Diferencia estadística entre la frecuencia de alelos no verdaderos entre los

vectores

MS AleloValor P para

dos colas

5 161 1.000

3 114 0.176

3 156 0.015

Fisher Exacto p<0.05.

Una vez seleccionados los picos principales, estos fueron sometidos a una

normalización estadística. Las muestras fueron analizadas en diferentes equipos y esto se

ve afectado por el límite de detección de cada aparato particular. Además la cantidad de

ADN en la muestra no fue previamente cuantificada y por lo tanto no fue estándar para

cada ensayo. Las muestras con mayor concentración de ADN tienen mayor ventaja de

amplificar los alelos que se encuentran en menor proporción. Es decir que en cualquiera

de los dos casos hay alelos que se podrían ver favorecidos según el equipo y la

concentración de ADN inicial. Hacer referencia a Grajeda 2006 para procedimiento de

normalización.

La siguiente prueba estadística hizo uso del programa Allelogram, (Idury y

Cardon 2007) el objetivo fue aproximar el alelo obtenido por Peak Scanner al entero más

37

apropiado basándose en una aproximación por mínimos cuadrados. Con esto se

obtuvieron números discretos y fue posible graficarlos en un distribución de frecuencias.

Hacer referencia a figuras 12 y 13. En el locus MS3 hay una mayor frecuencia de los

alelos 190 y 192 para T. dimidiata mientras que 190 y 256 para R. prolixus. En cambio en

el locus MS5 hay una prevalencia de 230 y 236 para T. dimidiata y 230 y 239 para R.

prolixus. La diferencia en la distribución fue evaluada estadísticamente mediante el

programa Genepop proporcionado por la Escuela de Ciencias Biomédicas, Universidad

de Tecnología Curtin, Australia y disponible en línea en

http://wbiomed.curtin.edu.au/genepop/.

Figura 12: Distribución de alelos para el locus MS3

05

10152025303540

146 154 174 180 190 192 220 226 228 230 234 246 248 254 256

Alelos

Frec

uenc

ia

T. dimidiata (n=26)R. prolixus (n=11)

Los resultados de GenePop se resumieron los cuadros 9 y 10. La diferencia génica

se refiere a la distribución de alelos en varias poblaciones, es decir compara la

probabilidad de que un alelos por si solo puede encontrarse en otro individuo. La

diferencia genotípica se refiere a la distribución de genotipos en varias poblaciones, es

decir compara la probabilidad de que una pareja de alelos específicos se encuentren en

dos individuos. Este análisis se hizo tanto para los locus por individual, (cuadro 10) como

para los dos loci como un conjunto, cuadro 11. Las diferencias significativas se marcan

en negrita.

38

Figura 13: Distribución de alelos para el locus MS5

02468

1012141618

206 221 227 230 233 236 239 242 245

Alelos

Frec

uenc

ia

T. dimidiata (n=22)R. prolixus (n=17)

Cuadro 10: Diferenciación génica y genotípica (Fisher exacto) de la distribución de alelos

según locus.

3 5 Génica <0.000 0.02228

Genotípica 0.00253 0.26187Valor p < 0.05.

Cuadro 11: Diferenciación génica y genotípica (Chi2) evaluando ambos loci.

Chi2 df p Génica Infinito 4 Altamente significativo

Genotípica 14.639 4 0.00551

Según estos resultados se observa que si hay diferencia génica y genotípica entre

las frecuencia de alelos de T. cruzi que se encuentran en las heces de R. prolixus y las que

se encuentran en T. dimidiata. Este resultado parece contradecir lo encontrado mediante

el análisis del miniexón, sin embargo se debe de considerar la tasa de mutación de ambos

de marcadores. Los microsatélites se caracterizan por tener una tasa de mutación muy

alta la cual varía de 10-6 a 10-2 (Harr et al, 2000). Esto significa que puede encontrarse

hasta 1 mutación cada 100 generaciones, lo que se traduce a que se mide una diferencia

más sutil que con el uso de miniexón.

39

La diferencia en la frecuencia genética de las cepas mediante los microsatélites,

demuestra que los ciclos de transmisión entre los vectores de Guatemala son diferentes.

Este es un resultado esperado debido a las diferentes ecologías del las tribus tritominii y

rhodninii; Triatoma tiene un ciclo peridomestico-selvático mientras que Rhodnius es

doméstico y de distribución focalizada en Guatemala. Esto es una evidencia a favor de la

teoría de coespeciación vector-parásito que ocurrió a través del tiempo, indicando que las

cepas tienen un alto grado de adaptación con su vector correspondiente. Estos datos son

determinantes porque las relaciones específicas de los vectores con sus parásitos influyen

en las diferencias en los ciclos de transmisión de la enfermedad, especialmente cuando un

vector reemplaza a otro después del tratamiento con insecticidas.

Sería interesante evaluar la competencia vectorial de T. dimidiata para las cepas

encontradas en R. prolixus y evaluar si la colonización de esta especie en regiones

previamente infestadas por R. prolixus tendrá un efecto importante la transmisión de la

cepa de T. cruzi asociada a R. prolixus. Las estrategias de control, prevención y

tratamiento deben considerar estas diferencias ser efectivas.

Finalmente, se elaboró un análisis filogenético de las muestras de heces

amplificadas con microsatélites. Para esto se utilizó el programa Phylip 3.67, con un

boostrap de 1,000 reiteraciones, la distancia genética se midió mediante el método de

Cavali Sforza y el árbol se construyó mediante un Neighbor Joining. El outgroup es una

muestra de T. cruzi aislada de un marsupial, Didelphis marsupialis de Ecuador. Hacer

referencia a figura 14. En este árbol filogenético no se encontró una relación entre las

cepas de T. cruzi aisladas de los vectores.

40

Figura 14: Árbol filogenético que relaciona aislados de T. cruzi de heces de R. prolixus

(Rp) y T. dimidiata (Td). Las muestras de Jalapa y Zacapa están diferenciadas por JZ.

Outgroup PR6456. 1000 reiteraciones. En negrita se señalan los bootstrap significativos.

41

754

La ausencia de amplificación pudo deberse a una muy baja cantidad de ADN del

parásito para ser detectada por PCR ó que el ADN de las muestras sin amplificación

contenían algún compuesto que inhibió el PCR o que degradó el ADN; ésto debido a que

dichas chinches fueron disectadas en diferentes períodos antes o después de alimentadas,

por lo tanto el proceso de digestión pudo haber liberado diferentes productos del

metabolismo para cada insecto. También se pudo deber al proceso de disección de dichas

chinches, lo cual pudo causar que las heces tuvieran contacto con otros compuestos

inhibidores, como el grupo hemo (Comunicación personal, Pamela Pennington). Para

evaluar la inhibición se podrían realizar diluciones de las muestras, ya que en éste

proceso se diluyen los inhibidores hasta cierto punto donde ya no perjudique la

amplificación del PCR. Sin embargo, no se puede descartar infección de tripanosoma en

estas muestras fecales que no amplificaron.

42

PARTE IV. IV.1 CONCLUSIONES

• Mediante el marcador molecular basado en la secuencia del minicírculo se

detectó que el 47.4% (9/19) de las muestras de heces con microscopia

positiva para tripanosoma obtenidas de T. dimidiata estaban infectadas

con T. cruzi y 52.6% (10/19) no amplificaron.

• Mediante el marcador molecular basado en la secuencia del minicírculo se

detectó que el 23.7% (9/38) de las muestras de heces con microscopia

positiva para tripanosoma obtenidas de R. prolixus estaban infectadas con

T. cruzi, 21.1% (8/38) con T. rangeli y 55.3% (21/38) no amplificaron.

• Mediante el marcador molecular basado en la secuencia del miniexón se

detectó que el 33.3% (8/24) de las muestras de heces obtenidas de T.

dimidiata estaban infectadas con TCI, 12.5% (3/24) con infección mixta

TCI/TCII y 54.2% (13/24) no amplificaron.

• Mediante el marcador molecular basado en la secuencia del miniexón se

detectó que el 7.9% (7/89) de las muestras de heces obtenidas de R.

prolixus estaban infectadas con TCI, 2.2% (2/89) con infección mixta

TCI/TCII, 4.5% (4/89) con infección mixta TCI/T. rangeli, 39.3% (35/89)

con T. rangeli y 46.1% (41/89) no amplificaron.

• La distribución de linajes I y II de T. cruzi encontrados en R. prolixus y T.

dimidiata son iguales (p=0.6299).

• Existe diferencia entre la frecuencia alélica, génica (p = altamente

significativo) y genotípica (p = 0.00551) entre las cepas de T. cruzi

aisladas de contenidos fecales de R. prolixus y T. dimidiata simpátricos en

Guatemala.

43

IV.2 RECOMENDACIONES

• Aumentar el número de muestras de T. dimidiata para aumentar la

significancia estadística.

• Realizar análisis de loci para verificar que las mezclas de TCI y TCII no

sean híbridos, como realizar el equilibrio de Hardy-Weinberg y diferencias

entre heterozigocidad observada y esperadas

• Realizar el mismo estudio con muestras provenientes de casos humanos y

vectores/reservorios del ciclo selvático de transmisión.

• Utilizar un control interno para control de amplificación.

44

IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Andrade SG. 1974. “Caracterização de cepas de Trypanosoma cruzi isoladas do

Recôncavo Baiano: contribuição ao estudo da patologia geral da doença de

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45

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trypanosomiasis in Brazil based on dimorphisms of rRNA and mini-exon

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50

IV.4 ANEXOS

IV.4.1 Anexo 1: Diagrama de Flujo de la Estrategia Metodológica

51

IV.4.2. Anexo 2: Electroferogramas de muestras de T. cruzi aisladas de heces de triatominos recolectadas en Chiquimula.

IV.4.2.1 Locus MS5

52

53

54

55

56

57

IV.4.2.2 Locus MS3

58

59

60

61

62

63

64

65

66

IV.4.3 Electroferogramas de muestras de T. cruzi aisladas de heces de triatominos recolectadas en Jalapa y Zacapa.

IV.4.3.1 Locus Ms3

67

68

69

70

IV4.3.2 Locus MS5

71

72

73

74

75

76

77

PARTE V V.1 INFORME FINANCIERO

UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA OFICINA ADMINISTRATIVA DEL INSTITUTO DE INVESTIGACIONES

Registros correspondientes 31 de Octubre del 2007

Nombre del Proyecto: Estudio del ciclo de transmision de Trypansoma cruzi mediante la tipificación genetica de este parasito

Código del Proyecto: FODECYT 085-2006 Investigador Principal : Licda. Laura María Grajeda Díaz Fecha: 01 de Noviembre del 2006 al 31 de Octubre del 2007 Duración: 12 meses

FICHA DE EJECUCIÓN PRESUPUESTARIA DEL PROYECTO

RENGLÓN DESCRIPCIÓN AUTORIZADO

TRANSFERENCIAS

AJUSTADO EJECUTADO SALDO

GRUPO 1

121 Publicidad y propaganda 1,400.00 (1,400.00) - - - -

122 Impresión, encuadernación y reproducción - -

300.00

300.00 300.00 -

79

142 Fletes 400.00 (400.00) - - - -

163

Mantenimiento y reparación de equipo médico sanitario y de laboratorio 4,000.00 (3,995.28)

4.72 -

4.72

181 Estudios, investigaciones y proyectos de factibilidad 24,000.00 -

-

24,000.00 24,000.00 -

181

Estudios, investigaciones: Evaluación externa de resultados e impacto 8,000.00 -

-

8,000.00 8,000.00 -

182 Servicios médicos sanitarios 1,250.00 (300.00) 1,690.00

2,640.00 2,640.00 -

GRUPO 2

243 Productos de papel o cartón - (300.00) 300.00 - -

261 Elementos y compuestos químicos 5,400.00 -

7,435.28

12,835.28 12,830.48

4.80

291 Útiles de oficina - - 180.00

180.00 - 180.00

295 útiles menores médico-quirúrgicos y de laboratorio 6,177.50 (1,230.00)

-

4,947.50 4,942.20

5.30

GRUPO 3

323 Equipo médico-quirurgicos y de laboratorio 12,280.00 (3,230.00)

950.00

10,000.00 10,000.00 -

Gastos Administrativos 6,290.75 - -

6,290.75 -

6,290.75

TOTALES Q 69,198.25 Q (10,855.28) Q 10,855.28

Q 69,198.25 Q 62,712.68

Q 6,485.57

80