ESTUDIO DE RECEPTORES A TRAVÉS DE SISTEMAS...
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ESTUDIO DE RECEPTORES A TRAVÉS DE SISTEMAS DE EXPRESION HETERÓLOGA Dra. Carolina Wedemeyer INGEBI/CONICET Universidad Nacional de Quilmes
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ESTUDIO DE RECEPTORES A TRAVÉS DE SISTEMAS DE EXPRESION HETERÓLOGA
Dra. Carolina WedemeyerINGEBI/CONICET
Universidad Nacional de Quilmes
Un poco de historia…
Langley 1905 Concepto de RECEPTOR
Farmacología clásica en animal entero, órgano aislado, tejido
Antes de los 70’
Década del 70’ “Binding”
Clonado y secuenciaciónDécada del 80’
Biología MolecularDécada del 90’
CLASIFICACIÓN DE RECEPTORES
Ionotrópicos
AcetilcolinaAMPA, NMDA
GABAA5HT3
Glicina
Factores detranscripción
DNA
Núcleo
Citosol
17β-EstradiolProgesteronaAldosterona
Cortisol
Metabotrópicos
NH2
COOH
mGluRMuscarínicoAdrenérgicoDopaminaSerotonina
Receptores“protein-kinasas”
Citosol
Uniónligando
Catálisis
InsulinaCitokinasPéptidos
Factores de crecimiento
Respuesta biológica enanimal entero, órgano aislado,tejidos, etc
Estudios de “binding”en homogenatos o rebanadas de tejido Log Kd
Cómo se estudian los receptores?
Registros electrofisiológicos(intracelulares, “patch clamp”)
Clonado y secuenciación
Animalestransgénicos
Expresión en distintos modelos
Ingeniería genética y molecular
Bacterias, levaduras
Células de mamíferos
Modelos de expresión heteróloga
Cultivos organotípicos
Ovocitos de Xenopus laevis
http://www.nih.gov/science/models/
Remoción de ovarios y oviductos
Los ovocitos se encuentran dentro de lóbulos de tejido conectivo
Vasos sanguíneos
La apertura de los lóbulos permite observar ovocitos en distintos estadíos del desarrollo. En el ovocito maduro pueden observarse dos hemisferios bien diferenciados.
Hemisferio animal
Hemisferio vegetal
El ovocito es impalado por dos microelectrodos de 1µm de diámetro y de esa forma las corrientes iónicas son registradas a través de la técnica de ¨Fijación de voltajecon dos electrodos¨
Colagenización de ovocitos
Miledi, Parker and Sumikawa, 1989
Diferencias regionales en el ovocito en la sensibilidad a Ach
Kusano, Miledi and Stinnakre, J. Phisiol.1982
El receptor dopaminérgico D4 (D4R) es activado por dopamina, noradrenalina y
serotoninaNH2
COOH
Extracelular
IntracelularGS / Gi / Go
Transducción
The dopamine D4 receptor is a monoaminergic G-protein coupled receptor activated by dopamine, noradrenaline and serotonin.
Wedemeyer C., Goutman J.D, Avale E, Rubinstein M, Calvo D.J. Eur J Pharmacol, 2007.
Vías dopaminérgicas en los roedores
Receptores dopaminérgicosClasificación
D1 D2’70 a ’80
↓ cAMP↑ cAMP
Tipo D1 Tipo D2’90
D1 , D5 D2, D3 , D4
Quinpirol, clozapina, PD168077
SKF38393Agonistas
Spiperona,haloperidolSulpirida, PNU101387
Antagonistas SCH-23390
Receptores dopaminérgicosEstructura
NH2
COOH
Extracelular
Intracelular
GS / Gi / Go
Transducción
Expresión del D4R en roedores
Ariano et al., 1997
Polimorfismos en el gen del D4R humano
Repetición en tándem de de 48 pb (VNTR)
Duplicación de 120 pb enla región promotora
Gly→Arg
Duplicación de 12 pb
Deleción de 13 pb
Deleción de 21 pb
Val → Gly-521pbG→T
Exón 1 Exón 2 Exón 4Exón 3
D4R Humano
Duplicación en tándem del tercer dominiointracitoplasmático del DR4 Humano
D4.4 : 64 %
D4.7 : 20 %
D4.2 : 8 %
Frecuencias alélicas promedio en la población humana
El Receptor Dopaminérgico D4 (D4R)
-Expresión preferencial en corteza prefrontal.
-Gran cantidad de polimorfismos en el gen humano.
-Posible blanco de acción de neurolépticos atípicos.
Clínicos (85%)
Functionales(5%)Genéticos (10%)
Expresión de receptores en ovocitos de Xenopus laevis
NH2
COOH
D4.2, D4.4 oD4.7
+
GIRK 1
Dopamine
D4R GIRK1
Acoplamiento del receptor al canal de K+
en la membrana del ovocito
100nA
25seg
Dopamine
Dopamine
La modulación de la corriente GIRK depende de la activación del D4R
High K (96mM)
DA 100 nM
100nA
100seg
PNU 101387 1µM
Sulpiride 10µM
DA 100 nMHigh K (96mM)
50nA
100ms
GIRK1bloqueo por Ba2+
Ba2+
1mM
Alto K+
Lavado
100nA
10seg
- La corriente GIRK es bloqueada por Ba 2+
-Antagonistas específicos D4 (PNU-101387) y tipo-D2 (Sulpirida) suprimen la modulación de los canales GIRK.
Existen diferencias funcionales entre las distintas variantes polimórficas del D4R?
0.3 1 3 10 100
Dopamine (nM)
100nA
50seg
0.1 30
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5
D4.7D4.4
D4.2
1 10 100 1030.110-3 104
1
0
0.01
Concentration DA (nM)%
of m
axim
al D
A re
spon
se
Variantes Dopamina
EC50(nM) n Hill
D4.2 1.02±0.06 0.74±0.07
D4.4 4.89±0.28 1.11±0.17
D4.7 1.07±0.04 0.92±0.06
El D4R es activado por otras monoaminas además de la DA?
Noradrenaline Serotonin
100nA
25seg
Dopamine
SI !!!!!
Cómo es esa modulación?
D4.7D4.4 D4.2
DA
NE
5HT
1 10 100 1030.110-3 104 105 106
1
0
0.01
Concentration (nM)
% o
f max
imal
DA
resp
onse
Variantes EC50
NE (nM) 5HT (µM)
D4.2 40.8 ±0.97 1.14±0.10
D4.4 43.5 ±1.76 1.42±005
D4.7 58.8 ±2.31 1.73±0.06
CONCLUSIONES
• Existen diferencias funcionales entre las variantes polimórficas del D4R (D4.2=D4.7≠ D4.4).
• Esas diferencias funcionales no parecen estar relacionadas con el largo del 3er loop intracelular.
• El D4R es activado por DA, pero también por NE y 5HT.
• NE y 5HT no parecen discriminar entre las diferentes variantes polimórficas del D4R
Implicancias fisiológicas.
-Se ha demostrado la presencia del D4R en regiones en donde hay inervación noradrenérgica y serotoninérgica como la CPF y el hipocampo.
-Se ha descripto la presencia del D4R en hipotálamo, retina y riñon, en donde la concentración de EP es elevada.
-Recientemente se ha demostrado que cuando la concentración (extracelular) de 5HT es elevada, y ante el bloqueo del SERT la recaptación de 5HT es mediada por el DAT hacia las terminales dopaminérgicas.
-Las evidencias existentes sugieren que existiría un mecanismo de coordinación e integración entre las monoaminas, sus receptores y transportadores.-Esta “promiscuidad” podría tener implicancias fisiológicas relevantes en el CNS y periférico.
