Luis Alejandro Barrera Ph.D.Director Instituto Errores Innatos del Metabolismo

Universidad Javeriana. Bogotá

ESTUDIO DE LOS ERRORES INNATOS DEL ESTUDIO DE LOS ERRORES INNATOS DEL METABOLISMO. Del DiagnMETABOLISMO. Del Diagnóóstico a las alternativas stico a las alternativas

terapeterapeúúticasticas

ServicioServicioDocenciaDocencia

InvestigaciInvestigacióónn

•Construcción Vectores Para TG.

•Terapia de Reemplazo Enzimatico.

•Estudio Mutaciones EnfemedadesLisosomales

1111AcidemiaAcidemia cadena mediacadena media

55221122AcidemiaAcidemia PropiPropióónicanica

1111AcidemiaAcidemia PiroglutPiroglutáámicamica

1111AcidemiaAcidemia MetilmalMetilmalóónicanica

332211AcidemiaAcidemia IsovalIsovalééricarica

1111AcidemiaAcidemia IsobutIsobutííricarica

1111AcidemiaAcidemia GlutGlutááricarica IIII

1111AcidemiaAcidemia GlutGlutááricarica II

1111AcidemiaAcidemia 33--OHOH--3ME3ME--glutglutááricarica

TOTAL TOTAL DIAGNOSDIAGNOSTICADOSTICADOS

De 1995 De 1995 a 2002a 2002

De 1992 De 1992 a 1995a 1995

De 1987 De 1987 a 1992a 1992

TRASTORNOS TRASTORNOS IDENTIFICADOSIDENTIFICADOS

Acidemias Organicas

46 8

5

12

36

met

ilmal

oni

co

tiros

inem

ia

isov

aler

ica

prop

ioni

ca

lact

ica

cicl

o de

Kreb

s

otra

s

Total 42

Otras Otras AcidemiasAcidemias

11CicloCiclo de la urea de la urea

11AcilAcil CoACoA deshidrogenasadeshidrogenasa

11succinilsuccinil CoACoA transferasatransferasa

11AcetoacilAcetoacil CoACoA tiolasatiolasa

22GlutaricasGlutaricas

113 3 metilcrotonilglicinametilcrotonilglicina

3333CistinuriaCistinuria1010442244FenilcetonuriaFenilcetonuria2222CannavanCannavan11RefsumRefsum

10105555AdrenoleucodistrofiaAdrenoleucodistrofia

1111AciduriaAciduria 4 OH 4 OH ButButííricarica

3333Acidosis LAcidosis Láácticactica

221111Def. Beta Def. Beta cetotiolasacetotiolasa

55113311HomocistinuriaHomocistinuria

332211HiperglicemiaHiperglicemia No No cetcetóósicasica

2222HiperfenilalaninemiaHiperfenilalaninemia

AMINOACIDOPATIAS

442222GlicogenGlicogenóósissisTipo ITipo I

2222MCardleMCardle

331122PompePompe

4444GalactosemiaGalactosemia

442222FructosuriaFructosuria

DESORDENES CARBOHIDRATOS

771166LeucodistrofiaLeucodistrofiaMetacromMetacromááticatica

331122LeshLesh-- NyhanNyhan

2222KrabbeKrabbe

36363636GaucherGaucher

332211TayTay SachsSachs

NEURODEGENERATIVAS

SINDROME DE SINDROME DE MORQUIO:MPSMORQUIO:MPS IVAIVA

•• DDeficiencia eficiencia galactosaminagalactosamina--66--sulfato sulfato sulfatasasulfatasa(GALANS)(GALANS) ..

•• protusiprotusióónn del del esternonesternon, , cuello corto, baja cuello corto, baja estatura, estatura, hipoplasiahipoplasiaodontoideaodontoidea, , cardiopatcardiopatíía, a, coxacoxa valga, valga, genugenu valgumvalgum

INTRODUCCIONINTRODUCCION

•• HHerenciaerencia :: autosautosóómicamicarecesiva.recesiva.

•• NN--acetilgalactosaminaacetilgalactosamina--66--sulfatasasulfatasa (IVA)(IVA)::16q24.3.16q24.3.

•• 7272 mutaciones mutaciones puntuales (puntuales (IVAIVA)), , 3 en 3 en pacientepacientes cs colombianosolombianos. . (F69V/2, S162F/5, (F69V/2, S162F/5, G301C/9).G301C/9).

•• 50 de las 72 (20.8%) 50 de las 72 (20.8%) TransiciTransicióón (Cn (C------G)G)

MATERIALES Y METODOS:MATERIALES Y METODOS:POBLACIONES DE ESTUDIOPOBLACIONES DE ESTUDIOSABOYA

PAUNA

VIEJO CALDAS

MEDELLIN

DIAGNOSTICO

•Estudios moleculares:

PCRs , PCRs largos

•Fragmentos 14 Exones

F1------ Exon 1------------- 200 pb

F2------ Exon 2, 3, 4------- 2.0 kb

F3-1--- Exon 5,6,7,8------- 2.7 kb

F3-2--- Exon 9-------------- 3.0 kb

F4------ Exon 10,11,12 ---- 5.0 kb

F5------ Exon 13, 14-------- 3.7 kb

R386C/?SeveroM16

R386C/R386CSeveroF15

A75G/A75GSeveroM14

A75G/A75GSeveroF13

G301C/G301CSeveroF12

G301C/G301CSeveroM11

S162F/?SeveroF10

G301C/?SeveroM9

S162F/S162FSeveroM8

S162F/S162FSeveroM7

G301C/G301CSeveroM6

G301C/G301CSeveroF5

F69V/?SeveroM4

G301C/G301CSeveroF3

G301C/G301CSeveroM2

G301C/G301CSeveroM1

GenotipoFenotipoGéner

oPaciente

GenotipoGenotipo de de loslos pacientespacientes colombianoscolombianos con MPS IVAcon MPS IVA

Pares de pacientes con fondo gris son hermanos

0.1540.154??

0.1150.115R386CR386C

0.0380.038F69V/F69V/

0.0770.077A75GA75G

0.1150.115S162FS162F

0.5000.500G301CG301C

FrecuenciaFrecuenciaMutacionMutacion

FrecuenciaFrecuencia de de laslas mutacionesmutaciones

Kato et al, 1997 Human Genetics

Tomatsu et al, 2004 Human Genetics

GAUCHER TIPO 1GAUCHER TIPO 1

Inicialmente, el paciente Inicialmente, el paciente presenta un severo presenta un severo envolvimiento hepenvolvimiento hepáático y tico y esplespléénico. Ilustracinico. Ilustracióón:paciente n:paciente postesplenectomizado. postesplenectomizado. El hEl híígado ocupa toda la gado ocupa toda la cavidad abdominal.cavidad abdominal.Desarrollo de brazos en forma Desarrollo de brazos en forma de arco, debido al compromiso de arco, debido al compromiso óóseo.seo.Los signos de enfermedad Los signos de enfermedad progresiva rprogresiva ráápida son mas pida son mas comcomúúnmente observados en nmente observados en niniñños.os.

GAUCHER TIPO 2GAUCHER TIPO 2

VisceromegaliaVisceromegaliaEstrabismoEstrabismoPulgares corticalesPulgares corticalesRetroflexionRetroflexion del cuellodel cuelloCaquexiaCaquexiaFalla para medrar.Falla para medrar.

GAUCHER TIPO 3GAUCHER TIPO 3

PresentaciPresentacióón tn tíípica de pica de manifestaciones severas a manifestaciones severas a temprana edad.temprana edad.Agrandamiento visceral Agrandamiento visceral masivo.masivo.Desarrollo progresivo Desarrollo progresivo retardado.retardado.

NOMENCLATURA PARA ALELOS COMUNES NOMENCLATURA PARA ALELOS COMUNES EN ENFERMEDAD DE GAUCHEREN ENFERMEDAD DE GAUCHER

cDNAcDNANomenclaturaNomenclatura

1226G1226G84GG84GG1448C1448CIVS2IVS21297T1297T1604160406990699

AminoacidoAminoacidoCambio/ResultadoCambio/Resultado

N370SN370SFrameshiftFrameshiftL444PL444PDeleciDelecióónn exonexon 22V394LV394LR463CR463CR496HR496H

EtapasEtapas

DeterminarDeterminar la prevalencia de la prevalencia de laslas mutacionesmutaciones masmasfrecuentementefrecuentemente encontradasencontradas en en otrasotraspoblacionespoblaciones (N370S, L444P, 84GG e IVS2+, (N370S, L444P, 84GG e IVS2+, V394L, D409H). Pronto Gaucher Kit.V394L, D409H). Pronto Gaucher Kit.DeterminarDeterminar la prevalencia de la prevalencia de laslas mutacionesmutacionesmasmas comunmentecomunmente halladashalladas en la en la poblacipoblacióónnEspaEspaññolaola. (G377S, T134P y 1451delAC).. (G377S, T134P y 1451delAC).DeterminarDeterminar la la existenciaexistencia de de nuevasnuevas mutacionesmutacionesusandousando SSCP y SSCP y secuenciacisecuenciacióónn..HacerHacer laslas correlacionescorrelaciones genotipogenotipo--fenotipofenotipo

Anormalidades Anormalidades exonexon 66

Gen Gen GBAGBA y Sus Mutaciones y Sus Mutaciones

Mutaciones causantes de la EGCerca de 200 mutaciones hasta ahora reportadas en el gen GBA

85% Mutaciones puntuales

15% Inserciones, Deleciones y Alelos Complejos

N370S = 5841A-GL444P = 6433T-C D309H = 5957G-C

84insGGRecNciI

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

I II III IV V VI VII VIII IX X

5’ 3’

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

I II III IV V VI VII VIII IX X

5’ 3’

7 kb 16 Kb 5 Kb

5’ 3’GBAGBA GBAP GBAP 1q21

Resultados Resultados

Frecuencia de Mutaciones en Frecuencia de Mutaciones en el gen el gen GBAGBA en 26 pacientes en 26 pacientes

ColombianosColombianos

1,00Total

0,06Sin identificar

0,02898 del G

0,02G195W

0,04E236K

0,04Y313H

0,06D380H

0,06K198E

0,06RecNciI

0,08595-96 del CT

0,12L444P

0,44N370S

FrecuenciaMutación

Alelos totales esperados = 52

Total alelos N370S = 23

19 pacientes Heterocigotos

N370S

2 pacientes Homocigotos

N370S

18

15

Total Pacientes Analizados 17Total Pacientes Analizados 17

GBA →h = 0,767

Objetivos Objetivos GeneralGeneral

Identificar cuáles de los alelos de cinco marcadores moleculares de la región 1q21 están asociados con mayor significancia a la mutación N370S en el gen de la β-Glucosidasa Ácida en el grupo de pacientes colombianos con EG.

EspecEspecííficosficos

Establecer las frecuencias de los alelos encontrados para el locus GBA junto con su heterocigosidad (h), en el grupo de pacientes colombianos con Enfermedad de Gaucher.De igual modo, determinar las frecuencias alélicas, en el grupo de pacientes, de cinco de los microsatélites cercanos al gen GBA.

Determinar cuáles de los distintos alelos de los marcadores estudiados en los pacientes se han heredado junto con las mutaciones causantes de la EG, especialmente la mutación mas frecuente, e inferir los haplotipos correspondientes

Estimar por medio de análisis estadístico el Desequilibrio de Ligamiento entre cada uno de los alelos de los cinco loci microsatélites estudiados y la mutación del gen GBA con mayor frecuencia en el grupo de pacientes colombianos con EG.

D1S305: 164/172, D1S2624: 201/209, 5GC3.2: 220/222, D1S2777: 260/262 e ITG6.2: 314/318

Electroferograma: Alelos de los cinco STRs amplificados en uno de los controles

Resultados Resultados

1622012642643143142222222

1682092602603143142222221

1682072602603143142222221

1722032602603143142222221

1742012602603143142222221

1702012602603143142222221

1722012602603143142222224

D1S305D1S2624D1S2777ITG6.25GC3.2No. Cromosomas

Marcadores

Haplotipos para la mutaciHaplotipos para la mutacióón N370Sn N370S

ResultadosResultados

Alelo 201 pb = 73%

Alelo 172 pb = 45%

Fracción Conservada82% y 18%

Fracción Variable

Haplotipo consenso : 36%

Fase GamFase Gamééticatica

A haplotipos Españoles y Judíos

Haplotipos: Sección Conservada Comparten un Ancestro común

¿¿De dDe dóónde proviene ese cromosoma?nde proviene ese cromosoma?

DiscusiDiscusióónn

222 318264 N370S

222 314264 N370S

222 314262 N370S

222 314260 N370S

IntroducciIntroduccióón de la Mutacin de la Mutacióónn

Tres eventos de mutación Step-Wise

Presente

Origen de N370S hace 6700 años

Hace 500 años

Hace 1200 años

Colombia

Tronco Ancestral CaucTronco Ancestral Caucáásicosico

AsquenazíEuropa

Historia de N370SHistoria de N370S

D1S2624 alelo de 201 pb

δ = 0,62θ( D1S2624-GBA) = 0.025

Cormand et al, 1997

La asociación 201-N370S tuvo lugar hace 18.8 generaciones,

esto es hace 470 aproximadamente

RecomendacionesRecomendaciones

Determinar la fase gamética para los ocho cromosomas N370S colombianos que no fueron incluidos en el análisis de Desequilibrio deLigamento y estudiar de manera similar los pacientes recientemente diagnosticados, portadores de la mutación N370S.

Ampliar los haplotipos N370S con al menos un STR mas de la región conservada, localizado a una distancia similar del locus D1S2777 y los polimorfismos localizados en el interior del locus GBA de modo que estos puedan ser comparables con los cromosomas N370S de otras poblaciones.

Una vez obtenido el número máximo posible de haplotipos N370S, llevar a cabo un nuevo análisis de Desequilibrio de Ligamento y emplear las herramientas de coalescencia que permitan datar con mayor certeza la mutación N370S colombiana.

Incluir a la mutación colombiana, 595-96 del CT en un estudio como el que se ha llevado a cabo hasta ahora con la mutación N370S

SINTOMATOLOGÍA

•FASCIES TOSCAS

•DISOSTOSIS MULTIPLE

•ANORMALIDADES ESQUELÉTICAS

•HEPATOESPLENOMEGALIA

•OPACIDAD CORNEAL

•ENFERMEDAD DEL MIOCARDIO

•HIPERTENSIÓN PULMONAR

•ALTERACIONES DE SNC

Iduronato 2-sulfato sufatasa 550 aminoacidos

Modelo de predicción de estructura terciaria de la GALNS

R94CR94CM318RM318RD344ND344NE450VE450VP151SP151SA291TA291TG96VG96VS80LS80LG290SG290SF69VF69VG96CG96CQ111RQ111RW141RW141RG247DG247DA291DA291D

Ubicación (con relación al sitio activo) de 15 mutaciones estudiadas

Todas las mutaciones que se encuentran en regiones conservadas, parecen estar directamente relacionadas con el fenotipo severo.

A291D

Todas las mutaciones que se encuentran en regiones alejadas del sitio activo, parecen estar directamente relacionadas con el fenotipo interemedio o leve.

G247D

Expresion de la iduronato 2-sulfato sulfatasa en E. coli

Vector: pUC13-IDS

-Células E. coli JM109 competentes-Transformación en E. coli JM109 -Amplificación-Purificación-Verificación por corte con enzimas de

restricción,-Induccion de la expression en medio

adecuado

Transformación

Escherichia coli

Pichia pastoris

Levaduras:

Línea 1: P. pastoris nativa,Línea 2 a 5, P. pastoris/IDS28 a las 0, 24, 48 y 72 horas.

Western blot para la Iduronato 2-sulfato sulfatasa humana recombinante expresada en P. pastoris/IDS28.

Expresión de la iduronato 2-sulfato sulfatasa en Pichia pastoris

MEDIO / CONCEPTO BMGliY YPGli YPG MG MGliP. Pastoris clon IDS-10Densidad celular inicial (Xo) (g/l) 0,011 0,091 0,121 0,153 0,091Sustrato crecimiento (S) (g/l) 12,45 20,41 22,22 19,34 13,67Sustrato inducción (S) (%v/v) 0,50 0,50 0,50Densidad celular (X máxima) (g/l) 0,616 6,62 4,34 7,41 4,19X inducción (g/l) Inicial 3,96 4,31 3,59X inducción (g/l) Final 10,22 7,22 7,23Proteinas extra-celulares Promedo (g/l) creci. 12,75 14,34 8,23 1,35 0,91Actividad proteolítica máxima (UP/mg min) inducción 5,27 (144 h) 6,25 (96 h) 4,93 (48 h)Productividad Máxima ( U*1000/ h) 4,99 (48 h) 8,31 (96 h) 5,50 (96 h)Rendimiento Máxino (U/g Metanol) 6,79 (72 h) 1.47 (96 h) 1,76 (48 h)Actividad IDS-hr Máxima (nmol/mg h) 0,36 (120 h) 0,8 (96 h) 0,53 (96 h)

MEDIO / CONCEPTO BMGliY YPGli YPG MG MGliP. Pastoris clon IDS-28Densidad celular inicial (Xo) (g/l) 0,018 0,091 0,103 0,062 0,091Sustrato crecimiento (S) (g/l) 12,45 15,98 20,41 19,99 12,45Sustrato inducción (S) (%v/v) 0,50 0,50 0,50Densidad celular (X máxima) (g/l) 0,67 4,73 4,50 4,02 2,89X inducción (g/l) Inicial 2,09 3,15 2,53X inducción (g/l) Final 5,61 6,74 8,74Proteinas extra-celulares Promedo (g/l) creci. 13,09 12,93 8,42 2,30 0,77Actividad proteolítica máxima (UP/mg min) induccion 5,48 (144 h) 7,51 (48 h) 5,69 (144 h)Productividad Máxima ( U*1000/ h) 5,06 (48 h) 9,60 (144 h) 24,25 (96 h)Rendimiento Máxino (U/g Metanol) 1,69 (48 h) 1,63 (144 h) 2,34 (96 h)Actividad IDS-hr Máxima (nmol/mg h) 0,24 (48 h) 1.38 (144h) 2,33 (96 h)

Cultivo / Concepto M2 M3 M4 M6 M7 M8 M9Inóculo MG MG MGli MGli MGli MGli MGliMedio BMGliY BMGliY BSM-PTM1 BSM-PTM1-sF BSM-PTM1-sF BSM-PTM1-sF BSM-PTM1-sFDO inicial a 600 nm 0.56 0.53 0.51 0.57 0.25 0.24 0.27Sustrato crecimiento (S) (%w/v) 1.38 1.34 1 1.13 2.55 4.01 8.34Sustrato inducción (S) (g) 9.56 21.86 28.99 35.15 40.54 30.53 17.08Velocidad de agitación (rpm) 250 250-650 250-900 250-700 250-900 250-950 300-1000Flujo de aire (vvm) 0.4 - 2.5 0.4 - 3.7 0.4 - 1.2 2.0 - 2.5 2.0 - 2.5 2.0 - 2.5 2.0 - 2.5pH 5.37(SinC) 6.36 (SinC) 6.27 5.9 5.86 6.06 6.04T (°F) 83.7 85.9 85.9 85.6 85.7 85.7 85.6Densidad celular (X máxima) (g/l) 7.14 16.27 28.02 11.49 17.88 22.13 (83h) 26.03 (120h)Densidad celular (X inicial inducción) (g/l) 1.55 (24h) 5.99 (24h) 8.82 (22h) 7.01 (20h) 12.08 (26h) 18.29 (28h) 25.53 (108h)Proteinas extra-celulares Promedo (g/l) crecimiento 0.15 0.22 0.16 0.12 0.13 0.16 0.19Proteinas extra-celulares Promedo (g/l) inducción 0.18 0.32 0.3 0.28 0.17 0.11 0.16Actividad proteolítica Máxima (UP/ml min) inducción 5,530 (24 h) 4,024 (48 h) 0,540 (94 h) 0.175 (57h) 0.185 (95 h) 0.216 (83h) 0.421(132h)Productividad específica Maxima( U*103/h) 5.68 (26 h) 8.47 (35 h) 55.32 (35 h) 327.16 (33 h) 462.03 (47 h) 113.94 (47 h) 0.00Rendimiento Máxino (U/g Metanol) 0.02 (95 h) 0.17 (35 h) 0.09 (58 h) 2.32 (33 h) 1.34 (47 h) 2.44 (47 h) 0.00Actividad IDS-hr Máxima (U) 0.29 (95 h) 0.40 (35 h) 2.75 (58 h) 15.42 (94 h) 29.5 (47 h) 7.67 (71 h) 0.00

Actividad Enzimática de fracciones de IDShrseparadaspor cromatografía de afinidad (Superosa 6 GP-anti-IDS)

14.4214.420.780.78MM--13.313.358.7858.781.111.11MM--13.213.237.6737.671.731.73MM--13.113.12.712.711.161.16MM--1212

32.2132.210.910.91MM--77

Actividad IDSActividad IDS((nmnm/h//h/mgmg de de proteinaproteina))

ProteProteíína total na total ((mgmg//mlml))

Muestra Muestra (Cultivo)(Cultivo)

SULFATASAS HUMANAS LOCALIZACIÓN SUBCELULAR

SUSTRATO NATURAL ENFERMEDAD

Arilsulfatasa A Lisosoma Sulfato de Cerebrósido

MLD, MSD

Arilsulfatasa B Lisosoma Dermatán Sulfato Maroteaux-Lamy (MPS VI)

Arilsulfatasa C Microsomas Esteroides sulfatados

XLI, MSD

Arilsulfatasa D Retículo Endoplasmático

No conocido No conocido

Arilsulfatasa E Aparato de Golgi No conocido MSD, Condrodisplacia punctata

Arilsulfatasa F Retículo Endoplasmático

No conocido No conocido

Arilsulfatasa G No conocido No conocido No conocido

N-Acetilgalactosamina-6-sulfatasa Lisosoma Queratán sulfato Condroitin sulfato

Morquio A (MPS IVA), MSD

N-Acetilglucosamina-6-sulfatasa Lisosoma Heparán sulfato Queratán sulfato

Sanfilipo D (MPS IIID)

Iduronato-2-sulfato sulfatasa Lisosoma Dermatán Sulfato Heparán sulfato

Hunter (MPS II)

Sulfamidasa Lisosoma Heparán sulfato Sanfilipo A (MPS IIIA)

Sulfatase 1 (KIAA 1077) No conocido No conocido No conocido

Sulfatase 2 No conocido No conocido No conocido

VENTAJAS PRODUCCIVENTAJAS PRODUCCIÓÓN N IgYIgY

Distancia Distancia FilogenFilogenééticatica entre aves y entre aves y mammamííferos: alta producciferos: alta produccióón de anticuerpos.n de anticuerpos.No hay sacrificio del animalNo hay sacrificio del animal1 Huevo puede producir 11 Huevo puede producir 1--10mg/ml de 10mg/ml de IgYIgYespecespecíífico.fico.No presentan reactividad cruzada con No presentan reactividad cruzada con IgGsIgGsde mamde mamííferosferos

TTéécnica de Dotcnica de Dot--blot. Se utilizaron los anticuerpos extrablot. Se utilizaron los anticuerpos extraíídos dos de yema de huevo de las Gallinas inmunizadas. Se evidencide yema de huevo de las Gallinas inmunizadas. Se evidencióóel reconocimiento de la proteel reconocimiento de la proteíína IDS por parte de los na IDS por parte de los anticuerpos de gallinas A1, A2, A3, B1 y B3. CP (control anticuerpos de gallinas A1, A2, A3, B1 y B3. CP (control positivo). CN (Control negativo).positivo). CN (Control negativo).

ELISA ELISA ““SANDWICHSANDWICH””

00.5

11.5

22.5

33.5

1/200 1/800 CP

Diluciones anticuerpo

ELISA INDIRECTA IgY A2

Las placas fueron sensibilizadas con antLas placas fueron sensibilizadas con antíígeno (IDS) a una geno (IDS) a una concentraciconcentracióón de 1.7n de 1.7µµg/ml y se realizaron diluciones dobles g/ml y se realizaron diluciones dobles

seriadas de los Anticuerpos A2 seriadas de los Anticuerpos A2