Estudio de las concentraciones de flumequina en colon de ...

UNIVERSIDAD DE LEÓN

Departamento de Ciencias Biomédicas

Estudio de las concentraciones de flumequina en colon de cerdo tras la administración oral de una

formulación de uso veterinario

José Manuel Rodríguez Lago León, noviembre 2015.

UNIVERSIDAD DE LEÓN Departamento de Ciencias Biomédicas

Estudio de las concentraciones de flumequina en colon de cerdo tras la administración oral de una

formulación de uso veterinario

Memoria que presenta D. José Manuel Rodríguez Lago para la obtención del grado de Doctor por la Universidad de León. León, noviembre 2015.

Índice

Índice

i

Pág.

Introducción ............................................................................................... 1

Objetivos .................................................................................................. 2

Revisión bibliográfica ................................................................................ 3

Historia y origen ........................................................................................... 3

Relación estructura-actividad ....................................................................... 7

Propiedades físico-químicas ........................................................................ 13

Mecanismo de acción .................................................................................. 15

Actividad antibacteriana ............................................................................... 21

Espectro antibacteriano e indicaciones terapéuticas ............................... 23

Efecto posantibiótico de las quinolonas ................................................... 26

Resistencias................................................................................................. 29

Toxicidad y reacciones adversas ................................................................. 37

Interacciones................................................................................................ 43

Farmacocinética ........................................................................................... 45

Absorción ................................................................................................. 45

Distribución .............................................................................................. 50

Eliminación .............................................................................................. 54

Indicadores farmacocinéticos/farmacodinámicos (PK/PD) ...................... 57

Índice

ii

Pág.

Material y métodos ..................................................................................... 59

1. Animales empleados ......................................................................... 59

2. Administración de Flumesyva líquido 20% ........................................ 63

3. Recogida de muestras ....................................................................... 73

4. Método analítico para la determinación de flumequina ..................... 75

5. Extracción de flumequina .................................................................. 83

6. Identificación y cuantificación de flumequina ..................................... 89

7. Análisis estadístico ............................................................................ 90

Resultados y discusión ............................................................................. 91

1. Validación del método analítico para la determinación de flumequina en plasma de cerdo ........................................................... 91

2. Validación del método analítico para la determinación de flumequina en contenido intestinal de cerdo ...................................... 106

3. Validación del método analítico para la determinación de flumequina en pared intestinal de cerdo ............................................ 123

4. Determinación de flumequina en plasma, contenido intestinal y pared intestinal de colon de cerdo ................................... 139

Conclusiones ............................................................................................ 149

Bibliografía ................................................................................................ 151

Introducción

Introducción

1

La flumequina es un antibacteriano sintético perteneciente al grupo de las 4-quinolonas. Es una fluoroquinolona relacionada estructuralmente con el ácido nalidíxico de uso exclusivamente veterinario. Como otras fluoroquinolonas, es una sustancia bactericida que actúa inhibiendo la ADN-girasa y la topoisomerasa IV, enzimas necesarias para la normal finalización de la síntesis del ADN bacteriano.

Este compuesto ya no se utiliza en el hombre dado que se dispone de quinolonas con una actividad antibacteriana más amplia y una mejor distribución tisular (Lemeland et al., 1981; Crumplin, 1988). Es, por tanto, un principio activo de uso exclusivo en medicina veterinaria, en la que sigue estando indicado en diversas especies domésticas (cerdos, rumiantes y aves) así como en acuicultura (Dorrestein et al., 1983; Ziv et al., 1986; Pijpers et al., 1989; Mevius et al., 1989, 1990a y b, 1991; Delmas et al., 1997; Samuelsen, 1997; Hansen y Horsberg, 2000; Yeh, 2000) en el tratamiento de infecciones sistémicas causadas por un amplio rango de bacterias Gram negativas que incluye Escherichia coli, Salmonella spp. y Pasteurella spp. (Greenwood, 1978; Neuman, 1978; Steer et al., 1981; Janknegt, 1986), fundamentalmente por su bajo precio y su buena tolerabilidad, dos criterios de elección fundamentales en medicina veterinaria.

En España se dispone de varias formulaciones para administración oral a dosis que oscilan entre los 5-6 y los 24 mg/kg, que se administrarían cada 12-24 h durante 3-6 días consecutivos a ganado porcino, terneros, corderos, cabritos, pollos de engorde y pavos, así como de una premezcla medicamentosa indicada en truchas (Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios, 2014a).

Introducción

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La farmacocinética de la flumequina se ha estudiado en diversas especies animales, entre las que se incluyen el cerdo, el ganado vacuno, ovino, caprino, aves, perro, rata y diversas especies de interés en acuicultura (Goren et al., 1982; Dorrestein et al., 1983; Harrison et al., 1986; Ziv et al., 1986; Mevius et al., 1989, 1990a y b, 1991; Meijer et al., 1994; Delmas et al., 1997; Ruiz-García et al.,1999; Villa et al., 2005a y b).

En el ganado porcino este compuesto está indicado en el tratamiento de colibacilosis, enteritis y gastroenteritis, así como en el de diversas enfermedades neonatales producidas por bacterias Gram negativas. Villa et al. (2005a) describieron la farmacocinética de la flumequina en esta especie animal tras su administración intravenosa e intramuscular, pero no se dispone de datos acerca del comportamiento de este compuesto a nivel intestinal tras su administración por vía oral. Dado que en el colon asientan diversos microorganismos patógenos que pueden afectar a esta especie animal, es importante determinar las concentraciones alcanzadas en este tejido por los agentes antimicrobianos, y si estas serían adecuadas para eliminar estos microorganismos.

Por ello, el objetivo del estudio que se plantea en esta memoria es determinar la concentración de flumequina en plasma, pared del colon y contenido intestinal en cerdos tras la administración de una formulación de flumequina de uso veterinario de los Laboratorios Syva S.A. (solución Flumesyva© líquida 20%).

Previamente, y para ello, deberá validarse el método analítico para la determinación y cuantificación de la flumequina en plasma, contenido intestinal y pared del colon de cerdo, lo que se llevará a cabo siguiendo las normas establecidas en la Guía EMEA/CHMP/EWP/192217/2009 (European Medicines Agency, 2011).

Revisión bibliográfica

Historia y origen

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Historia y origen

Como ya se ha señalado anteriormente, las quinolonas son agentes antimicrobianos de origen sintético. El primer miembro de este grupo se sintetizó en 1962, el ácido nalidíxico. Este compuesto era una modificación de otro obtenido en el proceso de síntesis de la cloroquina (ácido 6-clor-1-H-4-oxoquinolina-3-carboxílico) por Georges Lesher en los laboratorios Sterling-Winthrop (Lesher et al., 1962), aprobándose para uso clínico en 1965. Su espectro antibacteriano se restringía a enterobacterias y, debido a que su absorción y distribución eran limitadas, se indicó únicamente en el tratamiento de infecciones urinarias.

Durante los años 60 del pasado siglo se sintetizaron nuevas quinolonas, como los ácidos oxolínico, piromídico, cinoxacino y pipemídico, aunque su indicación siguió limitándose al tratamiento de infecciones urinarias. La adición de un átomo de flúor en la posición 6 de la molécula así como la de un sustituyente piperacinilo en la posición 7 en la década de los 70 amplió enormemente su espectro de actividad, que pasó a abarcar bacterias tanto Gram negativas como Gram positivas, y mejoró sus características farmacocinéticas (Ball, 2000), dando lugar a un nuevo grupo de antibacterianos, las fluoroquinolonas (Carlucci, 1998; Orden y de la Fuente, 2001). Desde entonces se han sintetizado más 10.000 moléculas diferentes, buscando ampliar más si cabe su espectro de acción, aumentar su actividad antibacteriana y reducir sus efectos adversos.

Historia y origen

4

Así, en 1973 se sintetiza la flumequina, que fue la primera quinolona que presentaba un átomo de flúor en su molécula. Es un compuesto aproximadamente 10 veces más activo que el ácido nalidíxico frente a bacterias Gram negativas, y también presenta cierta actividad frente a bacterias Gram positivas (Rohlfing et al., 1976; Appelbaum y Hunter, 2000; Emmerson y Jones, 2003).

Pero es a partir de 1978 cuando se inicia la era de las fluoroquinolonas con la síntesis del norfloxacino a partir del ácido pipemídico, desarrollándose posteriormente otros compuestos como pefloxacino, ofloxacino, enoxacino, ciprofloxacino o amifloxacino. Todas ellos constituyen la denominada segunda generación de quinolonas. Estos compuestos presentan unas características cinéticas más favorables y un espectro antibacteriano más amplio que las de primera generación, aunque son poco eficaces frente a cocos Gram positivos aerobios y bacterias anaerobias.

Algo más tarde se sintetizaron las quinolonas de tercera generación, que presentan ventajas respecto a la generación anterior, tanto con relación a su espectro de acción como a su semivida de eliminación, y que incluye compuestos monofluorados (gatifloxacino, grepafloxacino), difluorados (esparfloxacino) y trifluorados (fleroxacino, temafloxacino y tosufloxacino). Ya se habla de una cuarta generación de quinolonas (genifloxacino, moxifloxacino, trovafloxacino y clinafloxacino), que se caracterizan por tener una gran actividad frente a cocos Gram positivos así como frente a algunos patógenos intracelulares, manteniendo la propia de este grupo farmacológico frente a Gram negativos (Bauernfeind, 1997; Lorenzo y Aleixandre, 2008), y se especula con que el prulifloxacino formaría ya parte de una quinta generación de quinolonas (Walsh y Wencewicz, 2014). El desarrollo de este grupo ha sido tal que de los 9 antibacterianos de origen sintético que han salido al mercado en los últimos 13 años, 8 han sido fluoroquinolonas (Walsh y Wencewicz, 2014) Otras fluoroquinolonas que se están desarrollando serían las moléculas WCK771 (Appelbaum et al., 2005), ABT-492 (Nilius et al., 2003) o JNJ-Q2 (Covington et al., 2012), con las que se pretende mejorar la actividad frente a bacterias Gram positivas, sobre todo neumococos y estafilococos.

Historia y origen

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Más recientemente se ha desarrollado un nuevo grupo que carece del átomo de flúor en posición 6, característico de las fluoroquinolonas, y que se han denominado desfluoroquinolonas o quinolonas no fluoradas (QNF), siendo el garenoxacino el primer representante del grupo. Este compuesto presenta un espectro de acción más amplio, que abarca a bacterias Gram positivas, Gram negativas y microorganismos anaerobios.

Al mismo tiempo que se sintetizan y evalúan nuevos antibacterianos de este grupo y otros grupos farmacológicos, se está desarrollando un nuevo grupo de antimicrobianos, los denominados antibióticos híbridos. En este caso, se fusionan los núcleos de dos moléculas antibacterianas diferentes en una sola, de forma que el compuesto resultante podría actuar sobre dos dianas distintas simultáneamente, reduciendo tanto la necesidad de buscar o sintetizar nuevos compuestos como la probabilidad de aparición de resistencias. El primer compuesto de este grupo surge en 1994 al unir una molécula de quinolona con una sulfamida, aunque la molécula híbrida no mantuvo la actividad de la sulfamida (Allemandi et al., 1994; Hubschwerlen et al., 2003). A partir de este momento se han sintetizado moléculas híbridas de quinolonas y oxazolidinonas o de quinolonas y rifamicinas (Robertson et al., 2008), manteniendo en este caso la doble actividad antimicrobiana de ambos grupos farmacológicos. Estos híbridos muestran una gran actividad frente a la gran mayoría de bacterias, incluyendo estafilococos multirresistentes, enterococos resistentes a vancomicina, estreptococos y bacterias Gram negativas.

Relación estructura-actividad

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Todas las quinolonas comparten una estructura básica común (figura 2): un anillo bicíclico aromático o heteroaromático con un átomo de nitrógeno en la posición 1, un grupo carboxilo en la posición 3 y un grupo cetona en la posición 4.

Figura 2. Estructura básica de las quinolonas.

Todas las quinolonas sintetizadas derivan de cuatro grupos: 4-oxo-cinolinas (4-cinolonas), 4-oxo-piridopirimidinas (4-pirimidonas), 4-oxo-quinolonas (4-quinolonas) y 4-oxo-naftiridinas (4-naftiridonas). De ellas, las que mayor interés han tenido para la industria farmacéutica han sido las 4-quinolonas y las 4-naftiridonas, ya que la introducción de un átomo de nitrógeno en posición 2 para las 4-cinolonas y en la posición 6 para las 4-pirimidonas reduce de forma importante su actividad (Gutierrez-Zufiaurre, 2004).

X N

COOH

O

R2

R1R8

R7

R6

R5

1

34

2

56

7 8


8

La posibilidad de modificar su estructura básica y de introducir hasta 6 radicales diferentes (se podrían alterar todas las posiciones de la molécula excepto la posición 3, que presenta un radical carboxilo, y la posición 4 que presenta un radical ceto) ha favorecido el desarrollo de este grupo farmacológico. Desde que se descubrieron los efectos terapéuticos del ácido nalidíxico se empezó a probar cada posición dentro del núcleo de las quinolonas con el fin de ampliar su espectro de actividad, mejorar su potencia, reducir sus efectos adversos o modificar sus características farmacocinéticas. El resultado ha sido que hasta la fecha se han sintetizado cerca de 10.000 moléculas diferentes (Andersson y MacGowan, 2003), aunque la gran mayoría no se ha llegado a utilizar en terapéutica bien porque no mejoran de forma sustancias las características de las ya existentes en el mercado bien por problemas de toxicidad.

La actividad antibacteriana de la quinolona va a depender de que se mantengan el núcleo básico intacto, de la naturaleza de los radicales que se introduzcan en la molécula y su relación espacial. Estos sustituyentes, además, van a alterar a su vez su afinidad por las enzimas diana, favorecer su penetración en las bacterias o alterar sus parámetros farmacocinéticos. Los estudios realizados han puesto de manifiesto que hay 4 componentes del núcleo 4-quinolona que, cuando se manipulan, incrementan su actividad antibacteriana: un grupo etilo en la posición 1; un grupo carboxilo en la posición 3; un átomo de oxígeno en la posición 4; y un átomo de flúor en la posición 6 (Wright et al., 2000). En la figura 3 se resume de forma esquemática la relación estructura-actividad de las quinolonas.

La presencia del grupo ceto en posición 4 y del grupo carboxilo en posición 3 son imprescindibles para que la molécula presente actividad antibacteriana: al unirse al ADN impiden que las topoisomerasas ejerzan su acción (Chu y Fernandez, 1989; Higgins et al., 2003).


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Figura 3. Relación estructura-actividad de las quinolonas.

Por lo que respecta a los radicales que se pueden introducir en la posición 1, estos van a tener un papel importante en la actividad antimicrobiana del fármaco, al encargarse de la unión de la molécula de quinolona a las topoisomerasas. En esta posición encontramos tres radicales distintos, los grupos etilo, ciclopropilo y 2,4-difluorofenilo. Las primeras quinolonas (ácido nalidíxico o norfloxacino) presentaban en N-1 un grupo etilo. La sustitución del grupo etilo por uno ciclopropilo, como en el caso del enrofloxacino, ciprofloxacino, danofloxacino y orbifloxacino (el ciprofloxacino tiene la misma estructura que el norfloxacino excepto la sustitución del grupo etilo por uno ciclopropilo), intensificó su actividad frente a bacterias tanto Gram positivas como Gram negativas. La potencia frente a bacterias Gram positivas aumenta al sustituir este último por el grupo 2,4-difluorofenilo, como ocurre con el difloxacino (Chu y Fernandez, 1989; Appelbaum y Hunter, 2000; Gutierrez-Zufiaurre, 2004).

X N

COOH

O

R2

R1R8

R7

R6

R5

1

34

2

56

7 8


10

La inclusión de un átomo de flúor en la posición 6 ha ampliado de forma sustancial el espectro de actividad antibacteriana de las quinolonas, siendo responsable de su mayor actividad frente a Gram negativos y Gram positivos, así como de una mayor biodisponibilidad oral y una mejor penetración tisular (Wright et al., 2000). Esta modificación dio lugar a las fluoroquinolonas, que constituyen el grupo mayoritario de quinolonas en el mercado.

Por lo que respecta a otras posiciones, de la posición 2 no existe demasiada información acerca de su papel, ya que no se han realizado muchos cambios en éste. La presencia de un radical de gran tamaño dificultaría la unión de la quinolona al ADN, al estar muy cerca del sitio de unión con éste, por lo que en muchos casos lo ocupa un hidrógeno.

Las sustituciones en la posición 5 pueden aumentar tanto la actividad de la molécula como su espectro de acción. La presencia de un grupo metilo en esta posición aumenta la actividad frente a bacterias Gram positivas, pero no frente a las Gram negativas (Yoshida et al., 1990b). Las sustituciones a este nivel reducen además la interacción con los cationes divalentes, por lo que se cree que podrían afectar a la formación y/o estabilidad de quelatos inabsorbibles (Appelbaum y Hunter, 2000; Peterson, 2001).

Las modificaciones en la posición 7 también van a influir en la unión de las quinolonas a las topoisomerasas, de su actividad y espectro de acción, y de sus características farmacocinéticas (Chu y Fernandez, 1989). En este caso, la introducción de sustituyentes lineales o de pequeño peso molecular hace que estos compuestos muestren poca actividad bactericida, mientras que la presencia de grupos heterocíclicos nitrogenados como el anillo piperacinilo (norfloxacino) se corresponde con una mayor actividad frente a Gram positivos y Gram negativos, incluyendo Pseudomonas aeruginosa. La presencia de un átomo de nitrógeno en la posición 4 del grupo 7-piperacinilo reduce la interacción de las quinolonas con la teofilina. Este tipo de sustituciones hace a las moléculas menos planares, siendo más improbables las interacciones farmacológicas que impliquen el citocromo P450, como ocurre con el danofloxacino (Martínez et al., 2006).


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Finalmente, las sustituciones en la posición 8 van a modificar tanto la estructura tridimensional de estos compuestos (Gutierrez-Zufiaurre, 2004), como sus características farmacocinéticas o su actividad frente a microrganismos anaerobios. En el caso de las 4-naftiridonas, estas no permiten ningún cambio en esta posición, lo que no ocurre con las 4-quinolonas. En este caso, nos podemos encontrar a este nivel un halógeno (cloro o flúor) como en el clinafloxacino o esparfloxacino, lo que mejora la actividad frente a anaerobios; un grupo metoxi (moxifloxacino) o metilo (gatifloxacino), que incrementan su actividad frente a anaerobios y bacterias Gram positivas; o una benzoxacina, que hace de puente entre los radicales 1 y 8, en el levofloxacino.

Se sabe que la inclusión de un radical u otro en la posición 8 influye en el mecanismo de acción de la quinolona, al menos en las bacterias Gram positivas: el sustituyente que se introduce es un halógeno, la diana principal es la ADN-girasa, mientras que si es un hidrógeno o un puente entre las posiciones 1 y 8, la diana principal sería la topoisomerasa IV. Además, aquellas moléculas que presentan un grupo metoxi actuarían indistintamente sobre cualquiera de las dos enzimas (Gutierrez-Zufiaurre, 2004; Peterson, 2001).

Por otro lado, los sustituyentes añadidos en esta posición pueden modificar asimismo sus características farmacocinéticas y su toxicidad. Así, la adición de un segundo átomo de flúor en C-8 aumenta tanto la biodisponibilidad oral del difloxacino como su semivida de eliminación, pero también aumenta su fototoxicidad (Ball, 2000). No obstante, la inclusión de un grupo metoxi en esta posición reduce la fototoxicidad (Rosen et al., 1997).

Propiedades físico-químicas

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Propiedades físicas y químicas

La flumequina (figura 1), ácido (RS)-9-fluoro-5-metil-1-oxo-6,7-dihidro-1H,5H-benzo[i,j]quinolizina-2-carboxílico (C14H12FNO3), es una fluoroquinolona que presenta un peso molecular de 261,3 Da.

Figura 1. Estructura de la flumequina.

Es un compuesto sintético, con estructura de 4-quinolona (4-oxo-1,4-dihidroquinoleína). De esta estructura básica común a las quinolonas derivan cuatro grupos (naftiridina, cinolina quinoleína y piridopirimidina) (4-quinolona), siendo la flumequina un derivado fluorado de la quinoleína. A esa estructura común (4-quinolona) se han incorporado diferentes radicales, entre los que destaca la del átomo de flúor en la posición 6, que amplía su espectro a bacterias Gram positivas, lo que se atribuye a una mayor penetración a través de la membrana celular bacteriana (Petersen y Schenke, 1998). Además, como se ha indicado anteriormente, la presencia de un grupo carboxilo en posición 3 y el grupo cetona en posición 4 son necesarias para su actividad antibacteriana (Papich y Riviere, 2003).

O

N

F COOH

CH3

Propiedades físico-químicas

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Este compuesto se presenta en forma de polvo microcristalino blanco o casi blanco. Su punto de fusión se sitúa en torno a los 253-255oC. Sólo presenta un grupo funcional ionizable relevante, y su punto isoeléctrico (pK1) es 6,50 (Park et al., 2002). Es una sustancia ácido débil con un pKa de 6,0 (Khandal et al., 1992). Es prácticamente insoluble en agua, bastante soluble en cloruro de metileno y poco soluble en metanol. Se disuelve fácilmente en disoluciones diluidas de hidróxidos alcalinos (O’Neil, 2001; Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios, 2014b): a pH = 7 su solubilidad es 71,0 mg/L aumentando hasta 6 g/L a pH = 9 (20oC) (Elema et al., 1995).

Mecanismo de acción

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Las quinolonas son sustancias antibacterianas dotadas de acción bactericida, aunque su mecanismo de acción no se conoce totalmente. Se sabe que penetran en el citoplasma bacteriano a través de los canales acuosos transmembrana denominados porinas (Hirai et al., 1986b), así como por difusión pasiva a través de la capa de los lipopolisacáridos (Nikaido y Thanassi, 1993), no afectándoles la integridad de la pared celular.

Hirai et al. (1986a) observaron que las quinolonas de baja hidrofobicidad relativa penetraban en las bacterias a través de las porinas OmpF, mientras que las de hidrofobicidad elevada lo hacían tanto a través de estas porinas como atravesando la bicapa lipídica. Según Sabada et al. (1998), estos compuestos aumentan la permeabilidad de la pared celular al desestructurar los enlaces entre los lipopolisacáridos de la pared celular.

La flumequina, de forma similar a otras fluoroquinolonas, actúa inhibiendo las enzimas ADN-girasa y topoisomerasa IV (Gellert et al., 1976 y 1977; Kato et al., 1992; Hooper, 2005). Estas enzimas son 2 topoisomerasas tipo II bacterianas que juegan un papel esencial en el funcionamiento de los ácidos nucleicos, al ayudar a controlar los niveles de ADN enrollado y desenrollado y eliminar nudos en el ADN cromosómico bacteriano. Ambas modulan el estado topológico del ADN, fragmentando de forma transitoria las hebras del ADN con el fin de evitar los superenrollamientos que se producen al abrir la doble hebra durante el proceso de replicación y sellando posteriormente estos cortes. Este proceso requiere el gasto de ATP (Levine et al., 1998; Anderson y Osheroff, 2001; Champoux, 2001; Gentry y Osheroff, 2013).


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A pesar de sus similitudes en cuanto a mecanismo y estructura, la ADN-girasa y la topoisomerasa IV presentan funciones fisiológicas diferentes. La primera, la ADN-girasa, es el único tipo de topoisomerasa II que puede introducir superenrollamientos negativos en el ADN. Es también la responsable de eliminar la tensión de torsión que se produce en el resto de la hebra (Levine et al., 1998; Champoux, 2001). Por ello, desempeña un papel fundamental en la mayoría de los procesos biológicos en los que está implicado el ADN (transcripción, recombinación, replicación y reparación) (Wolfson y Hooper, 1985; Reece y Maxwell, 1991; Lewis et al., 1996). Por esta razón, a las fluoroquinolonas también se las conoce con el nombre de inhibidores de la girasa.

Por su parte, la topoisomerasa IV también participa en el mantenimiento de la densidad de la superhélice cromosómica y la eliminación de la tensión de torsión de la doble hebra. Su función principal es eliminar los nudos que se producen en el cromosoma bacteriano como consecuencia del proceso de replicación del ADN (Khodursky y Cozzarelli, 1998; Levine et al., 1998; Champoux, 2001).

La ADN-girasa es un heterotetrámero formado por cuatro subunidades (dos subunidades A (GyrA) y dos subunidades B (GyrB), y tiene un peso molecular de 372 KDa (Wolfson y Hooper, 1989; Reece y Maxwell, 1991). Las cadenas de la doble hélice de ADN deben separarse para permitir la replicación o la transcripción del ADN, lo que da lugar a superenrollamientos positivos en las cadenas enfrente del punto de separación, que se producen en sentido contrario a la separación de la hélice. Para contrarrestar este inconveniente, la ADN-girasa introduce superenrollamientos helicoidales negativos en la molécula del ADN bacteriano, en una reacción dependiente del ATP, que requiere que se rompan ambas cadenas del ADN con el fin de permitir el paso de un segmento de ADN a través de la fractura.

Las subunidades GyrA (105.000 Da cada una) se anclan en ambas hebras del ADN mediante la formación de un enlace covalente con el ADN, provocando cortes en puntos específicos del ADN y uniendo posteriormente estos puntos de ruptura. Las subunidades GyrB (95.000 Da cada una), por su parte, estimuladadas por las subunidades GyrA, inducen los superenrollamientos en torno al núcleo de ARN, se unen al ATP (posee actividad ATP-asa) y participan en la transducción de la energía


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(Higgins et al., 1978; Mizuuchi et al., 1978; Taléns-Visconti et al., 2002; Costenaro et al., 2005). En estudios in vitro también se ha visto que puede eliminar superenrrollamientos positivos (Reece y Maxwell, 1991).

Las quinolonas actúan sobre las subunidades GyrA, impidiendo así la reparación de los cortes que se producen en el ADN. Estos compuestos inhiben el superenrollamiento del ADN mediado por la ADN-girasa a concentraciones que inhiben el crecimiento bacteriano (0,1-10 µg/mL) (Hooper, 2005). Macroscópicamente, su acción se manifiesta por una elongación anormal de las bacterias, al perder el ADN la forma superenrollada y aumentar de volumen.

Diversos estudios han demostrado que la ADN-girasa no puede unirse a las quinolonas en ausencia de ADN, y que la cantidad de principio activo unido al ADN está modulado por la concentración de Mg++ (Smith et al., 1988; Martínez et al., 1996a; Mizuki et al., 1996; Sanz-Nebot et al., 1997).

Por lo que respecta a la topoisomerasa IV, se sabe que algunas quinolonas pueden actuar inhibiéndola. Esta enzima es también un heterotetrámero formado dos 2 subunidades ParC y ParE en las bacterias Gram negativas y 2 subunidades GrlA y 2 subunidades GrlB en las bacterias Gram negativas (Levine et al., 1998; Champoux, 2001; Pommier et al., 2010), y presenta un alto grado de homología en su secuencia de aminoácidos con la ADN-girasa (Kato et al., 1990 y 1992). Es asimismo esencial en las células procariotas en el proceso de replicación del ADN, promoviendo la replicación y la separación de las cadenas de ADN eliminando los nudos que se forman en las moléculas de ADN durante el proceso de replicación (Marians y Hiasa, 1997; Anderson et al., 1998; Khodursky y Cozzarelli, 1998; Levine et al., 1998; Champoux, 2001).

Diversos investigadores (Ferrero et al., 1995; Brighty y Gootz, 1997; Drlica y Zhao, 1997; Kaatz y Seo, 1998; Fournier et al., 2000) han propuesto que en las bacterias Gram positivas (Staphylococcus aureus) la topoisomerasa IV constituiría la diana principal de algunas quinolonas. En el caso de las bacterias Gram negativas (Escherichia coli), la ADN-girasa sería la principal molécula diana (Alovero et al., 2000; Hooper, 2000 y 2005; Petri, 2011). Drlica y Zhao (1997) señalaron que probablemente la respuesta de las bacterias a las quinolonas variaría en función de cuál sea su diana


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principal. De hecho, se ha comprobado que la acción de ambas enzimas no es exactamente igual: en estudios llevados a cabo con E. coli se ha comprobado que la ADN-girasa actúa antes de la replicación de la horquilla, mientras que la topoisomerasa IV lo hace preferentemente después, de forma que existe un intervalo de tiempo que permitiría reparar el daño en el DNA inducido por las quinolonas (Zechiedrich y Cozzarelli, 1995). Por ello, se cree que la acción desarrollada a través de la ADN-girasa determinaría una muerte rápida en la bacteria, mientras que a través de la topoisomerasa IV sería un proceso más lento.

Debe señalarse además que para que se produzca la muerte bacteriana, es necesario que sobre las alteraciones provocadas por las quinolonas en el ADN bacteriano actúen las exonucleasas. Phillips et al. (1987) señalaron que algunas quinolonas como el ácido nalidíxico, difloxacino, enrofloxacino y su metabolito, el ciprofloxacino, inducen la respuesta de reparación del ADN SOS, lo que requiere, entre otras, la acción de las exonucleasas RecBC.

Por lo que respecta a las células eucariotas, éstas presentan una enzima topoisomerasa II que difiere estructuralmente de la ADN-girasa bacteriana y que, aunque realiza una función similar a ésta, no produce superenrollamientos negativos en las hebras del ADN, aunque sí hace cortes en éste (Hooper, 1995; Lewis et al., 1996). La actividad de las quinolonas sobre las células eucariotas de organismos superiores es escasa, siendo las concentraciones necesarias para inhibir la topoisomerasa II muy elevadas (100-1000 μg/mL), y muy superiores a las que inhiben la ADN-girasa (Mitscher y Ma, 2003; Petri, 2011), aunque diversos estudios han puesto de manifiesto una potencial genotoxicidad de las quinolonas sobre las células eucariotas (Takayama et al., 1995; Gorla et al., 1999).

En el caso de los virus, algunas familias (Asfaviridae, Phycodnaviridae e Irinoviridae) también presentan en su ADN genes que codifican la topoisomerasa II. Mottola et al. (2013) señalaron que diversas quinolonas interferían in vitro en la replicación del virus de la fiebre porcina africana al inhibir la topoisomerasa II vírica.


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Las quinolonas determinan una inhibición rápida de la síntesis del ADN, pero este efecto no resulta suficiente para explicar su acción bactericida. Para conseguir explicar esta acción bactericida se han descrito cuatro mecanismos de acción denominados A, B, B1 y C, que varían según la quinolona y el microorganismo considerado (Crumplin et al., 1984; Ratcliffe y Smith, 1984 y 1985; Lewis y Smith, 1988 y 1989; Lewin et al., 1989; Lewin y Amyes, 1990; Maxwell y Critchlow, 1998; Martínez et al., 2006):

• Mecanismo A: es común a todas las quinolonas y requiere que la bacteria esté en fase de multiplicación y que haya síntesis de ARN y proteínas, bloqueandose la replicación del ADN mediante la inhibición de la ADN-girasa. Es el único mecanismo que se manifiesta en las quinolonas clásicas, como el ácido nalidíxico o el ácido oxolínico (Dietz et al., 1966; Winshell y Rosenkraz, 1970; Lewis y Smith, 1989).

• Mecanismo B: presente en las fluoroquinolonas, además de los mecanismos A y C. El mecanismo B no requiere que se produzca síntesis de proteínas o de ARN en las bacterias para ejercer su efecto bactericida (Crumplin et al., 1984; Ratcliffe y Smith, 1984). En este caso, lo que se forma es un complejo ternario ADN/ADN-girasa/fluroquinolona que explicaría su acción bactericida (Ratcliffe y Smith, 1984; Smith, 1986; Lewis et al., 1991).

• Mecanismo B1: se ha identificado únicamente con el clinafloxacino, y no precisa la síntesis de proteínas o ARN, pero sí que la bacteria se esté multiplicando (Lewin y Amyes, 1990).

• Mecanismo C: requiere de la síntesis de proteínas y ARN, pero en este caso no es necesario que la bacteria esté en fase de multiplicación. El mecanismo se relaciona con la enzima topoisomerasa IV, y se ha descrito para el norfloxacino y el enoxacino (Ratcliffe y Smith, 1985; Lewin et al., 1989; Maxwell y Critchlow, 1998).

Debe señalarse que un mismo compuesto puede presentar mecanismos de acción diferentes en función de la especie bacteriana sobre la que actúe. Así, Brighty y Gootz (1997) indicaron que el ciprofloxacino desarrollaba los mecanismos A y B frente a E. coli, mientras que frente a S. aureus sólo mostraba el mecanismo A. Se cree que poseer más de


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mecanismo de acción explicaría por qué las fluoroquinolonas son más potentes que las quinolonas de primera generación, que sólo actúan a través del mecanismo A (Ramón et al., 1999).

Por otro lado, se ha comprobado que en algunas cepas bacterianas estos fármacos, a elevadas concentraciones, no son capaces de provocar la muerte de las bacterias de una forma tan efectiva como lo hacen a concentraciones más bajas. De hecho, diversos autores han descrito para distintas especies bacterianas (Crumplin y Smith, 1975; Lewis et al., 1991) y con gran número de quinolonas (Lewis y Smith, 1988 y 1989; Cantón et al., 1989; Lewin et al., 1989; Jiménez et al., 1990; Lewin y Amyes, 1990) que la proporción de bacterias supervivientes sigue una respuesta bifásica. En la primera fase, la actividad bactericida se incrementa con la concentración del fármaco hasta un máximo a partir del que, en la segunda fase del proceso, al aumentar la concentración se reduce la actividad bactericida. Este efecto se conoce como efecto Eagle o efecto paradójico, y descrito en 1948 por Eagle y Musselman para la penicilina, aunque también se ha observado para otros β-lactámicos, los aminoglucósidos (Lorian et al., 1979; Shah et al., 1979) y las quinolonas (Smith, 1986; Cantón et al., 1989; Lewin et al., 1989; Jiménez et al., 1990).

Entre las diversas hipótesis propuestas para explicar este efecto paradójico, la más aceptada es la realizada por Manes et al. (1983), para los que a elevadas concentraciones de principio activo se inhibe la síntesis de ARN y de algunas proteínas, si bien Chen et al. (1996) observaron que el ciprofloxacino desarrollaba su acción bactericida sin inhibir la síntesis de proteínas.

Actividad antibacteriana

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Las primeras quinolonas que se introdujeron en el mercado, como el ácido nalidíxico o el ácido oxolínico, tenían un espectro limitado a bacterias Gram negativas responsables de infecciones urinarias y gastrointestinales como Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteus mirabilis, Citrobacter spp., Serratia spp., Salmonella spp. o Shigella spp., entre otras (Martínez et al., 2006a).

Las fluoroquinolonas presentan un espectro mucho más amplio y una mayor actividad que las quinolonas de primera generación, que incluye, además de las bacterias Gram negativas sensibles a las primeras quinolonas, microorganismos Gram positivos, algunos anaerobios y micobacterias. Todas las fluoroquinolonas resultan muy activas frente a enterobacterias, sobre todo E. coli, Klebsiella spp., Citrobacter spp., Salmonella spp., Shigella spp, Enterobacter spp., Aeromonas hydrophila, Yersinia enterocolitica, Acinetobacter spp., Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Actinobacillus pleuropneumoniae, Histophilus somni, Mannheimia haemolytica y Pasteurella spp. También son sensibles a estos compuestos algunas cepas de Campylobacter spp., Bordetella bronchiseptica, Brucella spp., Haemophilus influenzae y H. ducreyi, Branhamella catarrhalis, Neisseria gonorrhoeae (incluidos gonococos productores de penicilinasa) y N. meningitidis (Papich y Riviere, 2003; Hooper, 2005; Sumano y Ocampo, 2006; Petri, 2011; Mediavilla et al., 2014).


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Estos antibacterianos son menos efectivos frente a bacterias aerobias Gram positivas y presentan una actividad escasa frente a microorganismos anaerobios Gram positivos. Ciprofloxacino, ofloxacino y pefloxacino pueden inhibir a Staphylococcus aureus (Ball et al., 1998; Zhanel et al. 2002). En el caso del moxifloxacino, su eficacia es superior a la observada con otros agentes como vancomicina, gentamicina y rifampicina frente a cepas de este microorganismo meticilin-resistentes. Staphylococcus epidermidis también es sensible a las fluoroquinolonas. La actividad de las fluoroquinolonas es menor frente a Streptococcus spp., aunque el moxifloxacino también ha demostrado una excelente actividad frente a Streptococcus pneumoniae (Hooper, 2005; Sumano y Ocampo, 2006; Petri, 2011).

Por lo que respecta a los microorganismos anaerobios obligados, la mayor parte de las fluoroquinolonas utilizadas en medicina veterinaria se consideran inefectivas, al presentar una actividad moderada o baja frente estas bacterias: Clostridium spp. y Bacteroides spp. son resistentes y Fusobacterium spp. sólo es moderadamente sensible al ciprofloxacino y ofloxacino. La excepción la constituye pradofloxacino, que es activo frente a especies anaerobias aisladas en perros y gatos de los géneros Clostridium, Bacteroides, Fusobacterium y Prevotella (Silley et al., 2007).

En cuanto a Gardnerella vaginalis, anaerobio facultativo, es sensible o moderadamente sensible a ciprofloxacino, pero no parece serlo a otras quinolonas de segunda generación. El mecanismo de resistencia intrínseca de este tipo de bacterias es poco conocido (McKellar, 1996).

En el caso de las micobacterias, ciprofloxacino, ofloxacino y las quinolonas de tercera generación son activas frente a la mayoría de estas, incluyendo Mycobacterium tuberculosis. Otros microorganismos como Chlamydia/Chlamydophila spp., Ureaplasma spp., Mycoplasma spp. y algunas cepas de Plasmodium spp. resistentes a la cloroquina han demostrado ser sensibles a estos compuestos (Papich y Riviere, 2003).

De las fluoroquinolonas más recientes no existen todavía muchos datos en medicina veterinaria, salvo los recogidos en diversos estudios experimentales (Caputo et al., 1997; Watts et al., 1997; Papich y Riviere, 2003). Grepafloxacino, trovafloxacino y premafloxacino presentan una mayor actividad frente a cocos Gram positivos y bacterias anaerobias, por lo que


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podrían resultar una buena opción de tratamiento en algunas infecciones (Brighty y Gootz, 1997). Premafloxacino es más activo frente a las bacterias Gram positivas que enrofloxacino, exhibiendo asimismo actividad frente algunas cepas de estafilococos meticilin-resistentes y enterococos vancomicina-resistentes. En el caso de bacterias Gram negativas, especialmente Pseudomonas aeruginosa, estos compuestos pertenecientes a las últimas generaciones de fluroquinolonas no son tan activos como ciprofloxacino. También se ha cuestionado su actividad frente a estreptococos, que no parece ser superior a un tratamiento estándar con un antibiótico β-lactámico (Legg y Bint, 1999).

Espectro antibacteriano e indicaciones terapéuticas

El objetivo de cualquier tratamiento antimicrobiano es conseguir que las concentraciones del antimicrobiano empleado sean varias veces superiores a la concentración mínima inhibitoria (CMI) de los microorganismos patógenos presentes en el lugar de infección. En las tablas 1 y 2 se recogen los rangos de la concentración mínima inhibitoria frente al 90% de las cepas (CMI90) para microorganismos sensibles a la flumequina. Para este compuesto, se ha establecido el punto de corte por debajo del que se considera que las cepas son sensibles en concentraciones ≤ 2 µg/mL, mientras que serían resistentes a concentraciones ≥ 8 µg/mL (Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2005).

La flumequina es particularmente activa in vitro frente a E. coli, Salmonella spp. y Pasteurella spp. (Greenwood, 1978; Steer et al., 1981), frente a los que está indicada en diversas especies animales destinadas a la producción de alimentos (rumiantes, ganado porcino, aves y peces) a pesar de disponer de fluoroquinolonas más recientes, con mayor espectro de acción y mejores características de distribución tisular, lo que se relaciona con su buena tolerabilidad y su relativamente bajo coste. No obstante, y de forma similar a lo recomendado para otras quinolonas, este compuesto sólo debería emplearse en aquellas situaciones que no responden o lo hacen escasamente a otros tipos de antibacterianos (European Agency for Evaluation of Medicinal Products, 2006).


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Tabla 1. Sensibilidad a la flumequina de diversas bacterias Gram negativas.

Microorganismo Origen de las

cepas CMI90

(µg/mL) Referencia

Actinobacillus pleuropneumoniae ganado porcino 64 Chang et al., (2002)

Aeromonas salmonicida salmón 0,3 Ledo et al. (1986)

Aeromonas hydrophila hombre 0,03-0,12 Felmingham et al. (1985)

Bacteroides spp. hombre 32-128 Felmingham et al. (1985)

Brachyspira hyodysenteriae ganado porcino 50-100 Aller-Morán et al. (2015)

Campylobacter jejuni hombre 0,12-2 Felmingham et al. (1985)

Escherichia coli ganado vacuno 4 Mevius et al. (1990a)

ganado porcino 64 Villa et al. (2005a)

Mannheimia haemolytica ganado vacuno 4 Mevius et al. (1990a)

Neisseria meningitidis hombre 0,06-0,12 Felmingham et al. (1985)

Pasteurella multocida ganado vacuno 4-8 Ziv et al. (1986) Mevius et al. (1990a) Raemdonck et al. (1992) Walker (2000)

Salmonella spp. hombre 0,5-1 Felmingham et al. (1985)

Salmonella dublin ganado vacuno 0,5 Mevius et al. (1990a)

Salmonella typhimurium hombre 0,5 Felmingham et al. (1985)

ganado vacuno 0,5 Mevius et al. (1990a)

ganado porcino 8 Villa et al. (2005a)

Shigella spp. hombre 0,5-1 Felmingham et al. (1985)

Vibrio anguillarum salmón 0,3 Ledo et al. (1986)

Vibrio cholerae hombre 0,06-0,12 Felmingham et al. (1985)

Vibrio parahaemolyticus hombre 0,12-0,25 Felmingham et al. (1985)

Yersinia enterocolitica hombre 0,15-0,5 Felmingham et al. (1985)

Yersinia ruckeri salmón 0,3 Ledo et al. (1986)


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Tabla 2. Sensibilidad a la flumequina de diversas bacterias Gram positivas.

Microorganismo Origen de las

cepas CMI90

(µg/mL) Referencia

Clostridium difficile hombre 64-128 Felmingham et al. (1985)

Clostridium welchii hombre 4-8 Felmingham et al. (1985)

Staphylococcus spp. hombre 1-4 Felmingham et al. (1985)

Staphylococcus aureus hombre 0,5-4 Felmingham et al. (1985)

Staphylococcus intermedius perro 4-8 Pellerin et al. (1998)

Streptococcus spp. hombre 16-64 Felmingham et al. (1985)

Streptococcus pneumoniae hombre 8-64 Felmingham et al. (1985)

A continuación se recoge la posología recomendada para este compuesto en las diversas especies domésticas en las que está indicado su uso en España:

o Ganado porcino: lechones: 12 mg/kg cada 12 h durante 3-5 días adultos: 6 mg/kg cada 12 h durante 3-5 días.

o Ganado vacuno (prerrumiante): 5-10 mg/kg cada 12 h durante 5 días.

o Ganado ovino (corderos): 6 mg/kg cada 12 h durante 4-6 días.

o Ganado caprino (cabritos): 6 mg/kg cada 12 h durante 4-6 días.

o Aves (pollos de engorde y pavos): 12-24 mg/kg durante 3-5 días.

o Truchas: 12 mg/kg durante 4-5 días.


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Efecto posantibiótico de las quinolonas

Como se ha señalado anteriormente, las fluoroquinolonas son antibacterianos bactericidas de acción rápida. Son activas a muy bajas concentraciones, y muestran efecto posantibiótico (EPA) (Vancutsem et al., 1990).

El término efecto posantibiótico se utiliza para describir la persistencia de la inhibición del crecimiento bacteriano tras una corta exposición del microorganismo a los agentes antimicrobianos. Es un fenómeno asociado a la actividad inhibitoria de la mayor parte de las sustancias con acción antibacteriana, y se produce cuando estas se ensayan a concentraciones iguales o superiores a la CMI (Craig y Vogelman, 1987). El EPA se demuestra por seguimientos microbiológicos después de la eliminación del antimicrobiano. Este efecto se ha observado para la mayoría de las familias de antibacterianos (Pastor et al., 1992a y b) y con varios antisépticos (Juliano et al., 1992) y antifúngicos (Turnidge et al., 1994), aunque la mayoría de los estudios publicados se refieren a los antimicrobianos más utilizados: β-lactámicos, aminoglucósidos, macrólidos y fluoroquinolonas.

Entre los factores que influyen en la duración del efecto posantibiótico se incluyen el tipo de microorganismo y de antimicrobiano, la concentración de este último y la duración de la exposición a este (Pastor et al., 1992a y b; Munckhof et al., 1997; Carbone et al., 2001). Este tiempo oscila entre una y dos horas tras una hora de exposición a concentraciones entre la CMI y diez veces esta concentración, aunque se han conseguido EPA de más de tres horas con concentraciones de 400 a 600 veces la CMI.

El efecto posantibiótico de las fluoroquinolonas se ha demostrado para diversas especies bacterianas, entre las que se incluyen K. pneumoniae y P. aeruginosa (Brown, 1996). Por compuestos, ciprofloxacino y norfloxacino exhiben un EPA de 1,8-2,4 h de duración sobre E. coli, S. aureus y P. aeruginosa; marbofloxacino ha demostrado un EPA de 2-3 h frente a S. intermedius.; y enrofloxacino muestra un EPA de 1-4 h (según dosis y


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microorganismo) frente a S. intermedius, P. multocida, E. coli, P. aeruginosa, S. typhimurium y S. aureus (Spreng et al., 1995; Cester et al., 1996; McKellar, 1996; Neu et al., 1997).

Durante el efecto posantibiótico los microorganismos pueden exhibir una mayor sensibilidad a bajas concentraciones del antimicrobiano, así como a la acción de los leucocitos polimorfonucleares, reduciéndose asimismo su actividad hemolítica y la producción de toxinas. También se ha asociado a una menor adherencia a las células: concentraciones 1000 veces inferiores a la CMI reducen la adherencia de S. aureus a las células bucales (Desnottes et al., 1987). Piddock (1994) indicó asimismo que durante el efecto posantibiótico se deprimen los mecanismos de expulsión activa desde la bacteria, lo que produce una acumulación de las fluoroquinolonas en el interior de las células.

La duración del EPA influye mucho a la hora de establecer la pauta de dosificación de los antimicrobianos. Así, se ha sugerido que el intervalo óptimo de dosificación no debería ser superior a la suma del tiempo en que la concentración sérica del antibacteriano excede la CMI más la duración del EPA. Para aquellos antimicrobianos que muestren una elevada actividad inhibitoria y un EPA duradero sería posible establecer intervalos de dosificación más espaciados sin perder efectividad, lo que resultaría óptimo en términos de eficacia, toxicidad y coste del tratamiento.

Resistencias

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Resistencias

Las fluoroquinolonas presentan ciertas características como un amplio espectro de actividad antimicrobiana, una elevada actividad a bajas concentraciones terapéuticas, acción bactericida y, en general, un excelente comportamiento farmacocinético, que las han convertido en compuestos muy atractivos para el tratamiento de enfermedades infecciosas severas, tanto en el hombre como en los animales. Sin embargo, y a consecuencia de su elevada prescripción tanto en el hombre como en los animales, en los últimos 25 años se han descrito numerosos casos de cepas resistentes en E. coli, Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae en el hombre (Hedin y Hambreus, 1991; Neu, 1992; Peña et al., 1995; Sanders et al., 1995; Murphy et al., 1997; Chen et al., 1999), así como en E. coli, P. aeruginosa, Enterobacter spp., Proteus spp. o Staphylococcus spp. en los animales (Bazile-Pham-Kac et al., 1996; Everett et al., 1996; Blanco et al., 1997; Lloyd et al., 1999; White et al., 2000; Cohn et al., 2003; Intorre et al., 2007).

En este sentido, ya en 1997 la Organización Mundial de la Salud (OMS) (World Health Organization, 1997) llamó la atención sobre el hecho de que el uso frecuente de las fluoroquinolonas en los animales podría incrementar la tasa de resistencias, sugiriéndose asimismo la posibilidad de transferencia de estas resistencias desde los animales al hombre en el caso de Campylobacter spp. (Endtz et al., 1991) y Salmonella typhimurium (Griggs et al., 1994; Threlfall et al., 1997). En la Unión Europea (UE), se ha recomendado que las fluoroquinolonas se reserven para el tratamiento de aquellas condiciones clínicas que respondan mal a otros tipos de

Resistencias

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antimicrobianos (European Agency for Evaluation of Medicinal Products, 2006).

Debe señalarse que las tasas de resistencia son muy variables en función del país considerado. Así, en Holanda se calcula que un 15-25% de las cepas de E. coli que tienen su origen en el ganado vacuno son resistentes a las quinolonas (Mevius et al., 2010), mientras que en Portugal llegaban al 74% en el caso del ácido nalidíxico, y del 38% en el del marbofloxacino para este mismo microorganismo (Jones-Dias et al., 2013).

Estas resistencias son además cruzadas entre los compuestos de primera generación (ácido nalidíxico o ácido oxolínico), y parecen serlo también entre las fluoroquinolonas entre sí, pero no se cree que existan resistencias cruzadas entre ambos grupos de quinolonas (Mediavilla et al., 2014).

Las resistencias a las quinolonas se pueden producir vía mutación de los genes que codifican la permeabilidad de la membrana celular externa, disminuyendo su penetración en la bacteria; los que codifican la ADN-girasa o la topoisomerasa IV; o los que desarrollan esta misma acción sobre los mecanismos de expulsión activa de los compuestos fuera de la bacteria (Oethinger et al., 2000). Todos estos mecanismos podrían llegar a desarrollarse incluso al mismo tiempo en una única bacteriana, confiriendo así elevados niveles de resistencia (Giguère y Dowling, 2013). De ellos, aunque la alteración tanto de la permeabilidad de la membrana como de los mecanismos de expulsión activa de la bacteria aumentan en 2-8 veces la CMI de los microorganismos, son las mutaciones a nivel de la ADN-girasa las que mayor influencia tienen a la hora de desarrollar resistencias bacterianas de importancia clínica (Giguère y Dowling, 2013).

No se ha descrito el desarrollo de enzimas bacterianas que inactiven o degraden las quinolonas en las bacterias en el medio intracelular (Wolfson y Hooper, 1989; Gold y Moellering, 1996). Giguère y Dowling (2013) señalaron que es poco probable que este tipo de mecanismo de resistencia se desarrolle al ser estos compuestos de carácter sintético.

Resistencias

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Las resistencias debidas a las mutaciones que se producen a nivel de la ADN-girasa o la topoisomerasa IV constituyen el principal mecanismo de resistencia a las fluoroquinolonas. Estas se producen de forma espontánea a nivel de los genes gyrA y gyrB que codifican la ADN-girasa y los genes parC y parE de la topoisomerasa IV (Sierra et al., 2005), dando lugar a las denominadas regiones determinantes de resistencia a las quinolonas (QRDR) dentro de la subunidad gyrA y parC (Wolfson y Hooper, 1989; Yoshida et al., 1990a; Nakamura, 1997; Khodursky et al., 1995; Hooper, 2001). Estas mutaciones pueden producirse de forma puntual en uno o en varios genes, pero también podrían producirse en más de un sitio del mismo gen, o incluso llegar a presentarse mutaciones múltiples, sobre todo en gyrA y parC (grlA).

Estas resistencias se dan sobre todo en los genes que codifican la ADN-girasa (Nakamura et al., 1989; Yoshida et al., 1990a) y, en menor proporción, sobre la topoisomerasa IV (Vila et al., 1996). Como se ha señalado anteriormente, en las bacterias Gram negativas como E. coli, Neisseria gonorrhoeae o Pseudomonas aeruginosa, la principal diana de las quinolonas es la ADN-girasa, por lo que en estas bacterias las primeras resistencias se producen por mutaciones de esta enzima, suponiendo un mecanismo de resistencia adicional las que se producen en la topoisomerasa IV. Diversos autores (Takiff et al., 1994; Taylor y Chau, 1997; Bébéar et al., 2003) han señalado que, en el caso de E. coli, la mayoría de las mutaciones asociadas con la resistencia a quinolonas se producen en la región QRDR a nivel de la serina 83 (Ser83) y aspartato 87 de la subunidad gyrA, y en la serina 79 y aspartato 83 de la subunidad parC, lugares que serían similares en otras especies, y que estarían cerca del centro de actividad de la ADN-girasa.

En bacterias Gram negativas, la resistencia a estos compuestos se desarrolla típicamente en varias fases. Así, una única mutación en la región QRDR, generalmente en posición Ser83, conferiría resistencia al ácido nalidíxico y reduciría la sensibilidad a las fluoroquinolonas (la CMI del ciprofloxacino pasaría de 0,015-0,03 μg/mL a 0,125-1 μg/mL). Mutaciones secundarias en la región QRDR de la subunidad gyrA determinan que la resistencia a las fluoroquinolonas se haga evidente (la CMI del ciprofloxacino pasaría a ser ≥ 4 μg/mL). No obstante, este fenómeno no es exactamente

Resistencias

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igual en todas las bacterias Gram negativas. En Campylobacter spp., bacterias que carecen de la topoisomerasa IV, una única mutación en la subunidad gyrA es suficiente para que la CMI del ciprofloxacino alcance valores muy elevados (32 μg/mL) (Wang et al., 1993), lo que explicaría la mayor prevalencia de resistencias en Campylobacter spp. en comparación con E. coli en animales cuyos productos se destinan al consumo y que han recibido un tratamiento a base de fluoroquinolonas (van Boven et al., 2003).

Por lo que respecta a las bacterias Gram positivas, como Staphylococcus aureus y Streptococcus spp., la situación sería diferente, ya que el blanco de acción de las fluoroquinolonas es la topoisomerasa IV (Hooper, 1995; Drlica y Zhao, 1997).

En cualquier caso, en ambos tipos de bacterias (Gram negativas y Gram positivas) las mutaciones determinan una menor afinidad de estos compuestos por el complejo ADN/enzima (Hooper y Wolfson, 1993; Piddock, 1995; Maxwell y Critchlow, 1998), haciendo posible la replicación del ADN en presencia de concentraciones de fármaco que resultarían letales para microorganismos que no presenten esa mutación.

Este tipo de mutaciones espontáneas son raras, dependiendo del principio activo empleado y su concentración, así como de la bacteria implicada. En bacterias Gram negativas expuestas a diversas fluoroquinolonas. Hooper (1995) calculó que la frecuencia de formas resistentes era ≥ 10-6 con concentraciones que doblaban el valor de la CMI e inferior a 10-10 con concentraciones entre 16 y 32 veces la CMI.

En las bacterias Gram negativas se ha descrito además otro mecanismo de resistencia, que consistiría en la alteración de la permeabilidad de la membrana celular externa al producirse alteraciones en los canales proteicos presentes en la membrana celular denominados porinas. Como ya se ha señalado anteriormente, muchas fluoroquinolonas penetran en las bacterias Gram negativas a través de las porinas (Nikaido y Vaara, 1985; Cohen et al., 1989), aunque algunas pueden difundir directamente a través de la bicapa lipídica. La reducción en la presencia de porinas se ha asociado con la aparición de resistencias en E. coli y Pseudomonas spp. Así, la mutación en los genes que codifican la porina OmpF en E. coli determinan un aumento en la CMI de 2 a 5 veces el valor

Resistencias

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inicial (Alekshun y Levy, 1999). Todo ello da lugar a una menor concentración intracelular del antimicrobiano y, con ello, una menor sensibilidad microbiana (Brighty y Gootz, 1997).

Por lo que respecta a los mecanismos de expulsión activa, debe señalarse que, en condiciones normales, la gran mayoría de las especies bacterianas presentan sistemas de expulsión activa que les permiten eliminar gran número de compuestos que, de otra manera, resultarían tóxicos para la bacteria. Así ocurre con antibióticos de diferentes familias estructurales, antisépticos, biocidas, o compuestos aromáticos y detergentes. Sanchez-Cespedes et al. (2003) indicaron que una única bacteria puede tener hasta 20 sistemas de expulsión activa diferentes.

No obstante, es difícil evaluar de forma independiente el papel de las porinas y de los sistemas de expulsión. Así, en E. coli se ha comprobado que en los denominados mutantes Mar (multiple antibiotic resistant) se produce un aumento importante en la expresión de los genes acrAB (codifican el sistema de transporte activo AcrAB, que bombea gran número de sustancias, incluidas las quinolonas), regulando a la baja la expresión de la porina OmpF y hacia arriba la expresión de la bomba AcrAB (Zeller et al., 1997; Giraud et al., 2000; Weber y Piddock, 2001). Por otro lado, la eliminación de los genes que codifican la bomba AcrAB en bacterias portadoras de mutaciones de la topoisomerasa IV reduce la CMI del enrofloxacino a nivel similares a los cuantificados en cepas que no hayan estado en contacto con este tipo de antibacterianos (Oethinger et al., 2000). En general, se cree que los cambios que se puedan producir en la captación y retención de las quinolonas conferirían bajos niveles de resistencia y que, en ausencia de otros mecanismos adicionales, no tendrían mayor importancia clínica (Poole, 2007), si bien una menor concentración intracelular de estos compuestos favorecería el desarrollo y propagación de otras formas de resistencia (Singh et al., 2012).

Debe señalarse que las resistencias debidas a alteraciones en la permeabilidad o la activación de los sistemas de expulsión activa pueden conferir resistencia a otros antibacterianos como cefalosporinas, carbapenemes y tetraciclinas (Everett et al., 1996; Piddock et al., 1998; van Bambeke et al., 2005; Gibson et al., 2010; Liu et al., 2012).

Resistencias

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Finalmente, y en relación a la posibilidad de que las resistencias a estos compuestos pudieran transmitirse vía plásmidos (plasmid-mediated quinolone resistance, PMQR), se creía que debido al propio mecanismo de acción de las quinolonas era poco probable que la diseminación de resistencias se produjera de esta manera. De hecho, varios investigadores señalaron no haber encontrado esta vía de transferencia (Burman, 1977; Smith, 1986a; Bryan et al., 1989). Sin embargo, ya en 1967, Barbour consiguió aislar cepas de E. coli resistentes al ácido nalidíxico que desarrollaban resistencias codificadas por un plásmido, describiéndose posteriormente en Shigella dysenteriae (Munshi et al., 1987). Más recientemente, se identificó un gen (qnr, quinolone resistance) presente en un plásmido que codificaba esa resistencia, primero en cultivos de Klebsiella pneumoniae (Martínez-Martínez et al., 1998) y, más tarde, en E. coli (Jacoby et al., 2003; Wang et al., 2003; Kirchner et al., 2011).

Este gen se localiza en secuencias qacEA¨ 1, sulI, asociadas con integrones de clase I (Tran y Jacoby, 2002). En E. coli se ha comprobado que el gen qnr actúa protegiendo tanto la ADN-girasa como la topoisomerasa IV de la inhibición del ciprofloxacino (Tran y Jacoby, 2002). Este gen confiere un bajo nivel de resistencia a las quinolonas, de forma que las cepas qnr + se consideran clínicamente sensibles a estos compuestos. Sin embargo, su presencia permite seleccionar mutantes de la ADN-girasa a concentraciones que normalmente resultarían tóxicas para las bacterias (Martínez-Martínez et al., 1998). Faltaría por determinar cómo interferiría en la unión de las quinolonas a la ADN-girasa (Pascual, 2003). Otros genes que también reducirían la sensibilidad de las bacterias a las quinolonas vía plásmido serían los genes aac(60)-Ib-cr (Robicsek et al., 2006), QepA (Yamane et al., 2007) y OqxAB (Hansen et al., 2007; Poirel et al., 2012). Los dos últimos genes codifican proteínas que forman parte de bombas de expulsión activa, y de ellas las proteínas OqxAB se han encontrado casi exclusivamente en infecciones animales (Hansen et al., 2005).

Todos los mecanismos de resistencia descritos anteriormente pueden manifestarse solos o combinados, aunque se cree que el aumento en el grado de resistencia a las quinolonas in vivo se debe a la existencia de varios mecanismos, que actuarían de forma simultánea o secuencial.

Resistencias

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Por otro lado, y aunque en general se ha asociado la resistencia a las quinolonas con la selección de mutaciones preexistentes en una determinada población bacteriana, en lo que se ha denominado mutaciones relacionadas con el crecimiento, se cree que también se podrían producir otro tipo mutaciones denominadas adaptativas. Estas se caracterizan porque se produce en bacterias que no están en fase de división o que lo hacen lentamente, y por estar bajo una determinada presión selectiva. No se conoce el mecanismo por el que se producirían este tipo de procesos, pero se cree que son un reflejo de actividades diferenciales de los sistemas de reparación (Riesenfeld et al., 1997; Janion, 2000). Este tipo de mutaciones se han descrito in vitro en cultivos de E. coli tratados con ciprofloxacino (Riesenfeld et al., 1997).

Toxicidad y reacciones adversas

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En general, se considera que las quinolonas son seguras y bien toleradas a las dosis terapéuticas recomendadas (Hooper, 1998; Fish, 2001), cuyos beneficios sobrepasan claramente sus posibles reacciones adversas. La mayor parte de estos efectos suelen ser leves y desaparecen al interrumpirse el tratamiento. La toxicidad de estos compuestos depende, en la mayoría de los casos, de la dosis y la especie animal de destino (Bertino y Fish, 2000).

En el hombre se han descrito casos de fototoxicidad (urticaria, eritemas y quemaduras solares), reacciones adversas a nivel del sistema nervioso central (ataxia, crisis epilépticas, desvanecimiento, somnolencia y tremores) y cristaluria, muchos de los cuales también se han referido en perros y gatos (McKellar, 1996; Stahlmann, 2002; Sprandel y Rodvold, 2003; Hayashi et al., 2004; Martinez et al., 2006). En los animales se han observado reacciones adversas de tipo gastrointestinal (náuseas, vómitos y diarrea); artropatías en animales jóvenes, sobre todo en cachorros y potros; y alteraciones oculares (degeneración retiniana en gatos y cataratas subcapsulares) (Schlüter, 1987; Takayama et al., 1995).

Las reacciones adversas de las fluoroquinolonas suelen ser leves a las dosis terapéuticas, y generalmente consisten en alteraciones gastrointestinales (náuseas, vómitos y diarrea) (Norrby, 1991), aunque en los caballos se han descrito ocasionalmente casos de enterocolitis (Yamarik et al., 2010; Barr et al., 2012). A dosis algo más elevadas se observan signos centrales de toxicidad, con aparición de mareos, inquietud, cefaleas, depresión, somnolencia o insomnio (Neu, 1989).


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Concentraciones plasmáticas elevadas tras la administración intravenosa de norfloxacino pueden producir reacciones tóxicas centrales en tan solo 2-3 min, probablemente debido a una gran liberación de histamina, e incluyen convulsiones, relajación de esfínteres y emesis, signos que se mantuvieron en los perros afectados durante varios minutos (Brown et al., 1990).

Otros autores (Akahane et al., 1989) indicaron que las fluoroquinolonas tenían actividad epileptógena, probablemente relacionada con que los sustituyentes presentes en la posición 7 de algunos compuestos tenían una estructura similar al ácido γ-aminobutírico (GABA), lo que les permitiría actuar como antagonistas del GABA. Vancutsem et al. (1990) observaron que el enrofloxacino incrementaba la frecuencia e intensidad de las convulsiones en perros epilépticos. En caballos, la administración intravenosa rápida de dosis elevadas de enrofloxacino también dio lugar a signos neurológicos, entre los que se incluían excitabilidad y crisis epilépticas (Giguère y Dowling, 2013).

Por lo que respecta a la cristaluria, su aparición no es constante para todas las fluoroquinolonas: se ha descrito tras la administración de dosis elevadas de norfloxacino en el hombre y el perro, aunque su presentación es rara con el ciprofloxacino, no observándose con danofloxacino o enrofloxacino. McKellar (1996) señaló que esta cristaluria podría deberse a la pobre estabilidad de estos compuestos, y que se produciría en animales que no se han hidratado adecuadamente.

Algunas fluoroquinolonas pueden también prolongar el intervalo QT tanto en el hombre (Cubeddu, 2003) como en los animales (Satoh et al., 2000), pudiendo llegar a producir en algún caso torsades de pointe (Owens y Ambrose, 2002a y b). Otros compuestos de este mismo grupo no aprobados para uso veterinario (gatifloxacino o moxifloxacino) se han asociado con la prolongación de la repolarización cardíaca en un modelo canino, aunque no es un efecto que se pueda generalizar a todas las fluoroquinolonas (no se ha observado con sitafloxacino) (Chiba et al., 2004).


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En animales en crecimiento tratados con fluoroquinolonas se han observado artropatías no inflamatorias y erosivas. Dosis elevadas de ácido nalidíxico o fluoroquinolonas administradas de forma crónica provocan alteraciones en el cartílago de crecimiento de ratas jóvenes y cachorros de la raza Beagle, con aparición de cojeras y un dolor tan severo que obligó al sacrificio de los animales (McQueen y Williams, 1987; Kato y Onedara, 1988; Burkhardt et al., 1992). Las primeras alteraciones histológicas se observaban en tan solo 5 h tras la administración de una elevada dosis de ofloxacino (Kato y Onedara, 1988). Se ha comprobado que la administración de una única dosis elevada o varias dosis moderadamente altas determinan la formación de vesículas en el cartílago articular, lo que puede dar lugar a la aparición progresiva de erosiones en el cartílago. Diversos autores (Hayem et al., 1994; Thuong-Guyot et al., 1994) han señalado que este efecto se debería a la afectación del metabolismo oxidativo de los condrocitos inmaduros (no el de las células maduras), lo que precipitaría la muerte celular. Vivrette et al. (2001) documentaron la aparición de artropatías en potros de 2 semanas de edad tras recibir 10 mg/kg de enrofloxacino por vía oral, lesiones que no se observaron en animales adultos a los que se les administró hasta 25 mg/kg de este mismo compuesto por vía intravenosa diariamente durante 3 semanas o 15 mg/kg por vía oral cada 12 horas (Bertone et al., 2000). Esto explicaría por qué no se recomienda el tratamiento con fluoroquinolonas en cachorros, sobre todo en el caso de las razas grandes.

También se han descrito casos de tendinopatías y rupturas espontáneas de tendones en el hombre tras seguir un tratamiento con fluoroquinolonas (Kim, 2010). En el caso de los animales domésticos, Yoon et al. (2004) investigaron el efecto del enrofloxacino en cultivos de células tendinosas obtenidas de caballos jóvenes y adultos, comprobando que este compuesto inhibía la proliferación celular, inducía cambios morfológicos en las células, reducía su contenido en monosacáridos y alteraba la síntesis de proteoglicanos de pequeño tamaño molecular. Todos estos efectos resultaron más marcados en cultivos celulares de animales jóvenes, por lo que no se recomienda el uso de enrofloxacino en potros jóvenes ya que podría ocasionar artropatías y defectos en el cartílago (Stahlmann, 2002).


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Por lo que respecta a las alteraciones oculares, puede producirse degeneración retiniana en gatos tratados con dosis elevadas de enrofloxacino (20 mg/kg/día), no estando asegurada la recuperación de la visión tras interrumpir el tratamiento (Wiebe y Hamilton, 2002). No se conoce el mecanismo exacto por el que se produce la lesión en la retina, pero se ha conseguido reproducir tras una inyección intravítrea del principio activo a dosis altas en animales de laboratorio. Se cree que entre los factores que influyen en su aparición se encuentran, además de las elevadas concentraciones tanto del compuesto como de sus metabolitos en la retina, su rápida administración por via intravenosa, que el tratamiento sea crónico, la edad avanzada de los animales, la exposición a la luz UV durante la terapia o la alteración del metabolismo o una excreción reducida del principio activo, de forma que se produzca una acumulación del compuesto o sus metabolitos. Esta reacción adversa no se ha demostrado para otras fluoroquinolonas como marbofloxacino, orbifloxacino o pradofloxacino (Messias et al., 2008).

La administración de fluoroquinolonas se ha asociado asimismo con la presentación del choque tóxico canino y fascitis necrotizantes causadas por Streptococcus canis (Miller et al., 1996), efecto que podría verse además exacerbado por el uso concurrente de glucocorticoides o antiinflamatorios no esteroideos (AINE) (Giguère y Dowling, 2013).

Dosis muy elevadas de fluoroquinolonas han provocado asimismo muertes embrionarias en animales de laboratorio, aunque este efecto no se ha observado en las especies de destino al administrar las dosis recomendadas en terapéutica (Sárközy, 2001). Por lo que respecta a su actividad mutagénica, aunque estos compuestos han dado resultados positivos en algunos test de mutagenicidad in vitro (Schluter, 1987), en cultivos de hepatocitos murinos se ha observado que su potencial mutagénico es bajo (Wolfson y Hooper, 1989; Ferguson, 1995).

Otras reacciones adversas ocasionales incluyen el aumento de los niveles de enzimas hepáticas (alanina aminotransferasa y aspartato aminotransferasa) y del nitrógeno ureico en sangre, así como la reducción del hematócrito (Sárközy, 2001).


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En algunos casos, los efectos adversos han sido tan importantes que han obligado a retirar algunas quinolonas del mercado, como ha ocurrido con el temafloxacino (provocaba síndrome urémico hemolítico), el grepafloxacino (prolongaba el intervalo QT y producía arritmias), el trovafloxacino (hepatotoxicidad y efectos en SNC) o el clinafloxacino (hipoglucemia, fototoxicidad e inhibición del citocromo P450) (Rubinstein, 2001; Stahlmann, 2002).

Por lo que respecta a su presencia en tejidos de origen animal, la Unión Europea (UE) ha fijado para la flumequina los límites máximos de residuos (LMR) que se recogen en la tabla 3 (Reglamento 37/2010 de la Comisión, de 22 de diciembre de 2009, relativo a las sustancias farmacológicamente activas y su clasificación por lo que se refiere a los límites máximos de residuos en los productos alimenticios de origen animal) con el fin de garantizar la seguridad de los alimentos de origen animal.

Tabla 3. Límites máximos de residuos (LMR) fijados por la Unión Europea (UE) para la flumequina.

Especie animal LMR (μg/kg)

Tejido diana

Bovinos, ovinos, caprinos y porcinos*

200 300 500

1500

músculo grasa

hígado riñón

Bovinos, ovinos y caprinos

50 leche

Aves de corral** 400 50 800

1000

músculo piel y grasa

hígado riñón

Peces 600 músculo y piel en proporciones normales

Todas las demás especies destinadas a la producción de alimentos

200 250 500

1000

músculo grasa

hígado riñón

* Para los porcinos, el LMR en la grasa se refiere a «piel y grasa en proporciones naturales». ** No debe utilizarse en animales que producen huevos para consumo humano

Interacciones medicamentosas

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La mayor parte de las interacciones medicamentosas descritas para las quinolonas se han documentado en el hombre, aunque dados los mecanismos por los que se producen podrían llegar a ser relevantes en medicina veterinaria.

Una de las interacciones más importantes resulta de la administración simultánea de algunas quinolonas con derivados de la xantina como la cafeína y, sobre todo, la teofilina. Se ha comprobado que la administración repetida de fluoroquinolonas reduce el aclaramiento hepático de la teofilina (Rybak et al., 1987; Bowles et al., 1988) y la cafeína (Harder et al., 1988) y, con ello, la semivida de eliminación de estos compuestos. La interacción se debería a una menor desmetilación de la teofilina por la isoforma CYP1A2 del citocromo P450 (Radandt et al., 1992), provocando la aparición de los síntomas cardíacos y neurológicos típicos de una intoxicación por xantinas (náuseas y vómitos, insomnio, cefalea, mareos, vértigos, temblores, taquicardia y convulsiones) (Brown, 1996; Niki et al., 1998; Blondeau, 1999; Lode, 2001). No obstante, Okazaki et al. (1988) señalaron que dosis orales de ofloxacino, enoxacino y norfloxacino no alteraron de forma significativa el contenido del citocromo P450, el citocromo b5, la NADPH-citocromo P450 reductasa, la etoxicumarin-O-desetilasa, la benzfetamina-N-desmetilasa o la anilin hidroxilasa. Esta interacción se ha demostrado, por ejemplo, para el ciprofloxacino, por lo que potencialmente tendría interés en medicina veterinaria para el enrofloxacino, al ser este compuesto su principal metabolito (Radandt et al., 1992). En el caso de la flumequina, se observado que la administración durante 5 días (400 mg 3 veces al día) de este compuesto no alteró la farmacocinética de la teofilina en el hombre (Lacarelle et al., 1994).


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La absorción oral de fluoroquinolonas se reduce de forma drástica tras su administración conjunta con antiácidos que contengan cationes metálicos como Mg++ y Al+++ (Nix et al., 1990), reduciendo la absorción intestinal de las quinolonas al formarse complejos inabsorbibles. Esta interacción afecta más a aquellas quinolonas que presentan menor número de sustituyentes en su estructura básica y en el anillo piperacínico, como ciprofloxacino, norfloxacino y enoxacino (Nix et al., 1990; Deppermann y Lode, 1993). Otros compuestos como el sucralfato también reducen la absorción de las quinolonas. Por su parte, la ranitidina no modifica la absorción oral de ciprofloxacino (Nix et al., 1990), aunque sí reduce la del enoxacino (Grasela et al., 1989), por lo que se cree que el pH gástrico podría influir sobre la absorción de algunas fluoroquinolonas.

La probenecida también puede disminuir el aclaramiento renal de las fluoroquinolonas (Aminimanizani et al., 2001). Asimismo, se han descrito alteraciones en la repolarización cardíaca tras la administración conjunta de fluoroquinolonas con eritromicina, disopiramida o amitriptilina, compuestos que también prolongan el periodo Q-T (Curtis et al., 2003; Owens and Ambrose, 2002a y b). La administración conjunta de quinolonas con warfarina o digoxina puede igualmente aumentar el riesgo de sufrir arritmias y/o problemas cardiacos (Bertino y Fish, 2000), y también se ha informado de un incremento en la frecuencia e intensidad de los ataques epilépticos al administrar enrofloxacino en perros que seguían un tratamiento con fenobarbital (Vancutsem et al., 1990).

Por último, con relación a los antiinflamatorios no esteroideos (AINE), la administración de fenbufeno y enoxacino determinó la aparición de crisis convulsivas en algunos pacientes, efecto que no se observó tras la administración de otras fluoroquinolonas y otros AINE (Wolfson y Hooper, 1991).

Farmacocinética

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Farmacocinética

Aunque existen variaciones en función del principio activo considerado y la especie de destino, las fluoroquinolonas presentan una características farmacocinéticas comunes a todas ellas, entre las que se incluyen su rápida absorción tras la administración oral o parenteral, su buena distribución tisular, con volúmenes de distribución de 2-4 L/kg, su excelente penetración tisular (que incluye fagocitos), su metabolización a nivel hepático y una excreción que es mayoritariamente renal, alcanzando concentraciones eficaces en la orina (Sörgel y Kinzig, 1993a y b; Brown, 1996).

Absorción

La absorción oral de las fluoroquinolonas es buena en la mayoría de las especies animales estudiadas. Estos compuestos se absorben rápidamente tras su administración oral en las especies monogástricas y animales prerrumiantes, mientras que en el caso de los rumiantes, las concentraciones sistémicas obtenidas tras su administración por esta vía se sitúan por debajo de los niveles terapéuticos (Vancutsem et al., 1990; Greene y Budsberg, 1993).

Por lo general, a menos que estos compuestos se administren con alimentos que contengan concentraciones elevadas de cationes divalentes, su biodisponibilidad oral no se ve afectada por estos de forma clínicamente significativa (Efthymiopoulos et al., 1997; Blondeau, 1999; Johnson et al., 1999; Allen et al., 2000; Gajjar et al., 2002). Blondeau (1999) describió un ligero aumento del tiempo al que se alcanzaba la concentración plasmática máxima (tmax) como consecuencia del retraso en

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el vaciado gástrico. Tan solo para aquellos compuestos con una elevada liposolubilidad podrían aumentar de forma importante tanto la concentración plasmática máxima (Cmax) como el área bajo la curva (AUC) (Coulet et al., 2005). Por otro lado, diversos autores (Agarwal et al., 2000; Al Omran et al., 2002; Chopra et al., 2002) han señalado que el enmascaramiento del sabor del producto mediante la adición de sustancias como resinas de intercambio iónico o el empleo de técnicas como recubrimiento con films o la microencapsulación, podría hacer que la presencia de alimento influyera en la liberación del compuesto desde el medicamento.

Por lo que respecta a la flumequina, los estudios que describen su farmacocinética en las distintas especies animales son muy escasos.

En el ganado porcino, los valores de Cmax y tmax obtenidos tras administrar una solución acuosa por vía intramuscular a una dosis de 15 mg/kg fueron 4,99 ± 0,92 µg/mL a las 2,44 ± 0,81 h, respectivamente. El tiempo medio de absorción (MAT) calculado fue 5,88 ± 0,50 h y su biodisponibilidad casi completa (84,9 ± 14,0%) (Villa et al., 2005a). Cuando la administración se llevó a cabo por la vía intravenosa a la misma dosis, el AUCtotal calculado por estos mismos autores fue de 63,57 ± 4,92 µg.h/mL.

En el ganado vacuno, la administración intramuscular a terneros neonatos de una formulación hidrosoluble de flumequina (dosis de 10 mg/kg) dio lugar a una Cmax de 6,2 µg/mL a los 30 min (tmax) de su administración, no modificándose el valor de Cmax tras la administración concomitante de probenecida (Ziv et al., 1986). Por esta misma vía, cuando la dosis fue 5 mg/kg, también a terneros neonatos, el valor de Cmax fue mucho menor (0,96 ± 0,21 µg/mL) a un tmax de 4,37 ± 1,01 h. Al inducir en estos mismos animales una infección respiratoria con Mannheimia haemolytica, Cmax aumentó hasta 1,42 ± 0,61 µg/mL y tmax se redujo hasta 3,17 ± 0,92 h (Mevius et al., 1991). Por su parte, la semivida de absorción fue de 1,31 ± 0,62 h en los animales sanos y 0,93 ± 0,39 h en los infectados, aunque las diferencias no fueron significativas para ningún parámetro excepto para la biodisponibilidad, que pasó de 78,5% en los sanos a 59,7% en los enfermos. Meijer et al. (1994) indicaron una

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biodisponibilidad intramuscular del 92 ± 14% en terneros de 12 semanas tras la administración de una suspensión acuosa de flumequina.

Por lo que respecta a la vía oral, Ziv et al. (1986) obtuvieron un valor de Cmax de 6,5 µg/mL a las 2 h (tmax) tras la administración de una dosis de 10 mg/kg a terneros neonatos. Por su parte, Mevius et al. (1990b) administraron un medicamento que contenía flumequina (10 mg/kg) a terneros de entre 1 y 18 semanas, obteniendo unos valores de Cmax que se iban reduciendo a medida que aumentaba la edad de los animales y la cantidad ingerida del alimento lactorreemplazante: 9,27 ± 1,96 µg/mL (animales de 1-2 semanas); 6,73 ± 0,59 µg/mL (terneros de 5-6 semanas) y 4,47 ± 1,45 µg/mL (animales de 18 semanas), con un tmax de 2,59 ± 0,82 h; 3,32 ± 0,46 h y 3,07 ± 2,01 h, respectivamente. La biodisponibilidad oral calculada fue muy elevada: 131% en crías de 1-2 semanas; 144% en animales de 5-6 semanas y 104-94% en terneros de 18 semanas. Cuando a los terneros de 1-2 semanas se les administró un medicamento diferente que contenía una combinación de flumequina (10 mg/kg) y colistina, Cmax se redujo hasta 6,06 ± 1,21 µg/mL, con un tmax bastante similar (2,87 ± 0,49 h) y una biodisponibilidad menor (76%). Estos mismos autores también administraron una solución de flumequina a la misma dosis (10 mg/kg) a los animales de 5-6 semanas, obteniendo un valor menor de Cmax (4,53 ± 0,54 µg/mL) a las 3,77 ± 0,70 h (tmax). A la vista de los resultados obtenidos, Mevius et al. (1990b) sugirieron que tanto la formulación utilizada como la edad de los animales y la cantidad de alimento ingerido (que, en este caso, contenía elevadas concentraciones de Ca++ y Mg++) podían influir en la absorción del compuesto. Mevius et al. habían realizado un estudio muy similar en 1989 en terneros de 1-2; 5-6 y 18 semanas a los que se les realizaron administraciones repetidas combinando las vías oral e intravenosa y dos dosis (5 y 10 mg/kg), obteniendo resultados similares a los descritos anteriormente

En el ganado ovino, la administración intramuscular de flumequina a la dosis de 6 mg/kg a ovejas adultas dio lugar a una Cmax de 1,83 ± 1,15 µg/mL a las 1,39 ± 0,71 h (tmax) (Delmas et al., 1997). Estos autores señalaron que el compuesto se absorbía rápidamente, con un valor para t1/2ka de 0,48 ± 0,28 h, siendo la biodisponibilidad muy similar a la

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determinada en otras especies (85,0 ± 30,1%). Cuando el compuesto se administró por la vía intravenosa, el AUC indicado fue de 19,58 ± 2,63 mg.h/L.

Por lo que respecta al ganado caprino, Villa et al. (2005b) administraron este compuesto a cabras en periodo de lactación por la vía intramuscular a una dosis de 20 mg/kg, obteniendo una Cmax de 7,40 ± 0,5 µg/mL a las 1,5 h (tmax), así como una biodisponibilidad muy elevada (92,9 ± 10,4%). Por lo que respecta a la vía intravenosa, el valor de AUCtotal calculado fue de 62,54 ± 6,46 mg.h/L con la misma dosis (20 mg/kg).

La farmacocinética de este compuesto también se ha estudiado en diversas especies de aves. Así, Goren et al. (1982) comprobaron que la flumequina se absorbía rápidamente tras administrarla por vía oral en pollos broiler y gallinas ponedoras a una dosis de 12 mg/kg, con una Cmax de 2,6 µg/mL en broilers y 3,0 µg/mL en gallinas ponedoras, en ambos casos a las 1,5 h (tmax). También observaron que la administración oral de una dosis doble de la anterior (24 mg/kg) no incrementaba de forma significativa las concentraciones plasmáticas del compuesto. Además, cuando el principio activo se administró en el agua de bebida o con el pienso a las dosis de 12, 18 y 24 mg/kg, las concentraciones plasmáticas alcanzadas en el día 2 posadministración fueron de 0,5-0,8; 0,8-1,3 y 1,2-1,9 µg/mL, respectivamente.

Anadón et al. (2008) también administraron flumequina a pollos broiler a la dosis de 12 mg/kg por vía oral, indicando unos valores de Cmax de 3,62 ± 0,29 µg/mL a un tmax de 1,43 ± 0,15 h. La constante de absorción (ka) fue de 1,30 ± 0,14 h-1, siendo la biodisponibilidad algo más baja que en otras especies animales (57,0 ± 5,9%). Cuando el compuesto se administró por vía intravenosa a la misma dosis, el valor del AUCtotal fue de 44,67 ± 3,34 mg.h/L.

En pavos, Ferraresi et al. (2013) obtuvieron un valor de Cmax de 10,76 ± 1,50 µg/mL tras la administración oral de una dosis de 15 mg/kg, a un tmax de 1,88 ± 0,35 h. Cuando la dosis utilizada fue el doble (30 mg/kg), Cmax subió hasta 18,93 ± 5,65 µg/mL, siendo muy similar el valor de tmax (1,75 ± 0,46 h). Por lo que respecta al AUCtotal, fue de 74,10 ±

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7,98 (15 mg/kg) y 123,07 ± 48,72 µg.h/mL (30 mg/kg). Al administrar la flumequina con el agua de bebida en un pulso de 10 h, los valores obtenidos con la dosis de 15 mg/kg para Cmax y tmax fueron 3,05 ± 0,36 µg/mL y 5,75 ± 2,71 h respectivamente; mientras que con la dosis de 30 mg/kg pasaron a ser 7,89 ± 1,73 µg/mL y 6,75 ± 2,12 h respectivamente.

Dorrestein et al. (1983) administraron este principio activo por vía intramuscular a palomas a dos dosis (10 y 60 mg/kg), calculando una biodisponibilidad a las 24 h posadministración del 22 y 23%, respectivamente. Cuando la administración se llevó a cabo por la vía oral (60 mg/kg), se obtuvo una Cmax de 2,68 ± 0,92 µg/mL a las 2 h (tmax), así como una biodisponibilidad mucho menor, de tan solo el 2,6 ± 0,8%.

En la rata, la administración de una dosis oral de 2 mg dio lugar a un valor de Cmax de 17 µg/mL a las 2 h (tmax). La absorción fue prácticamente total, con una biodisponibilidad oral del 94 ± 4% (Ruiz-García et al., 1999).

Se ha estudiado asimismo la farmacocinética de este compuesto en diversas especies de peces, al ser una de las quinolonas más empleadas en acuicultura. En la trucha arcoiris, Sohlberg et al. (1990) señalaron una Cmax de 1,15 µg/mL a las 48 h (tmax) de la administración de una única dosis de 5 mg/kg por vía oral (temperatura del agua inicial 6,8oC; que fue reduciéndose gradualmente durante 27 días hasta 1,8oC). Estos mismos autores indicaron cuatro años más tarde que la absorción de este compuesto tras su administración oral (5 mg/kg) dependía de forma importante de la temperatura del agua en la que se mantuvieran los peces: a 3oC Cmax tomó un valor de 1,07 µg/mL a las 54,5h (tmax), mientras que a 13oC Cmax fue casi el doble (1,91 µg/mL) y se alcanzó mucho más rápidamente (tmax = 19,1 h). O’Grady et al. (1988) ya habían comprobado previamente en la trucha común que la temperatura del agua tenía más importancia en la absorción de este compuesto que el aumento de la dosis: cuando la concentración del compuesto en el baño fue de 50 mg/L las concentraciones determinadas fueron de 4 µg/mL a 3oC y de 38 µg/mL a 13oC, prácticamente similares a las obtenidas cuando la concentración en el baño fue de 100 mg/L (3 µg/mL a 3oC y 38 µg/mL a 13oC).

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En el salmón atlántico, el tratamiento de una población afectada de forunculosis mediante baño con una concentración de flumequina de 50 mg/L a 11oC durante 3 h dio lugar a concentraciones de 34 ± 8,8 µg/mL inmediatamente después de interrumpir el baño (O’Grady et al., 1988). Rogstad et al. (1993) administraron este compuesto por vía oral a salmones en agua de mar (temperatura del agua de 5oC) a dosis de 25 y 50 mg/kg, indicando unos valores de Cmax de 2,26 y 3,83 µg/mL a las 12 y 24 h (tmax), respectivamente, calculando asimismo una biodisponibilidad del 46% para la dosis de 25 mg/kg y del 39% para la de 50 mg/kg. Por su parte, Elema et al. (1995) evaluaron la biodisponibilidad oral de la flumequina (25 mg/kg) presente en diversos piensos medicados y suspensiones en agua, aceite de pescado o aceite de maíz administrados a salmones mantenidos en agua de mar (temperatura del agua de 6-8oC), comprobando que la biodisponibilidad variaba muy poco en función de que se emplearan las suspensiones o los piensos medicados (38-47%). Las variaciones fueron mayores en los valores de Cmax y tmax, que fueron de 2,35-3,07 µg/mL y 8-14 h para las suspensiones y de 1,55-2,61 µg/mL y 10-27 h para los piensos medicados, respectivamente.

En el halibut, Hansen y Horsberg (1999) obtuvieron unos valores de 0,08 µg/mL para Cmax y una biodisponibilidad del 5% tras administrarlo en forma de baño a una concentración de 10 mg/L. En el bacalao común, tras la administración de un pienso medicado (10 mg/kg) a animales mantenidos en agua de mar (temperatura del agua 8oC), se alcanzó una Cmax de 3,5 µg/mL a las 24 h (tmax), siendo la biodisponibilidad del 65% (Hansen y Horsberg, 2000).

Distribución

Las fluoroquinolonas se caracterizan por ser compuestos liposolubles, presentar un bajo porcentaje de unión a las proteínas plasmáticas y distribuirse de forma amplia y rápida por los tejidos. Estos compuestos se asocian en la mayoría de las especies animales a un volumen de distribución aparente elevado, superior a 1 L/kg (Lode et al., 1998; Aminimanizani et al., 2001; Martinez et al., 2006a; Giguère y Dowling, 2013), mucho mayor que el calculado para antibióticos como los β-lactámicos o los aminoglucósidos (Brown, 1996).

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Diversos autores han puesto de manifiesto que estos compuestos alcanzan concentraciones elevadas en saliva; secreciones nasales; mucosa, epitelio y secreciones bronquiales; tejido alveolar, macrófagos y polimorfonucleares presentes en los alvéolos; cámaras anterior y posterior del ojo; hígado, tracto urinario y tejido prostático (Wolfson y Hooper, 1989 y 1991; Wise, 1991; Dorfman et al., 1995; McKellar et al., 1999). En el caso del líquido cefalorraquídeo y el tejido óseo, sus concentraciones son menores a las determinadas en plasma. No obstante, son superiores a la CMI de la mayoría de las bacterias sensibles a las fluoroquinolonas (Petri, 2011). Las fluoroquinolonas también atraviesan la placenta y se concentran en el líquido amniótico (Mediavilla et al., 2014). Varias fluoroquinolonas además acceden rápidamente a la glándula mamaria, distribuyéndose ampliamente por el tejido mamario (Ziv et al., 1990; Sumano y Ocampo, 2006).

Estos compuestos alcanzan concentraciones intracelulares muy elevadas en las células fagocíticas (macrófagos alveolares, leucocitos poliformonucleares y neutrófilos), por lo que presentan una importante actividad intracelular frente a gran número de microorganismos (Ballesta et al., 1996; Brown, 1996; García et al., 1996 y 2000; Pascual y García, 1998; Giguère y Dowling, 2013).

Por lo que respecta a su unión a las proteínas plasmáticas, se considera que es moderada, con unos porcentajes que oscilan entre el 20% del gatifloxacino y enoxacino y el 76% del trovafloxacino (Martínez et al., 2006), siendo del 70% para la flumequina (Neuman, 1978).

Por lo que respecta a los modelos utilizados para ajustar las curvas de concentración plasmática-tiempo de la flumequina, estos varían tanto con la especie como con la vía de administración. Así, tanto en el ganado porcino como en el caprino Villa et al. (2005a y b) emplearon el modelo bicompartimental abierto para la vía intravenosa y el monocompartimental para la intramuscular. En el ganado vacuno, Ziv et al. (1986) ajustaron los datos tras administración intravenosa mediante el modelo bicompartimental abierto, mientras que en la oveja Delmas et al. (1997) utilizaron el tricompartimental tanto para la vía intravenosa como para la intramuscular. En la rata, el modelo utilizado tanto para la

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vía intravenosa como para la oral fue el modelo bicompartimental abierto (Ruiz-García et al., 1999).

En el ganado porcino, la fase de distribución de la flumequina tras administración intravenosa es rápida, con una semivida de distribución (t1/2λ) de 1,40 ± 0,16 h y un volumen de distribución en el estado de equilibrio (Vss) de 0,75 ± 0,08 L/kg. El tiempo de residencia medio (MRT) calculado fue de 3,17 ± 0,22 h (Villa et al., 2005a).

En ganado vacuno, Ziv et al. (1986) indicaron una semivida de distribución (t1/2α) de tan solo 0,22 h; mucho menor que los determinados por Mevius et al. (1990b) en terneros de 1-2 semanas (0,850 ± 0,637 h), 5-6 semanas (1,090 ± 0,290 h) y 18 semanas (0,780 ± 0,298 h). Por lo que respecta al volumen de distribución, Mevius et al. (1990b) calcularon un valor para el Vss de 0,754 ± 0,157 L/kg para los animales de 1-2 semanas, menores que los determinados en animales de más edad (0,944 ± 0,130 y 0,956 ± 0,195 L/kg en terneros de 5-6 semanas y de 18 semanas, respectivamente), probablemente porque los animales neonatos presentan un menor contenido en tejido adiposo, lo que reduce su distribución en el organismo. Otros autores señalaron valores algo más elevados para el Vss en animales lactantes: 1,48 L/kg en el caso de Ziv et al. (1986) y 1,32 ± 0,71 L/kg en el de Meijer et al. (1994). En animales jóvenes pero ya rumiantes el valor de Vss fue menor (0,66 ± 0,17 L/kg), aunque el valor de Va fue muy elevado (2,83 ± 0,99 L/kg), probablemente por la influencia del rumen en la distribución del compuesto (Mevius et al., 1990b).

Por lo que respecta a la ratio k21/k12, osciló entre 0,72 en los animales de 18 semanas y 1,06 en los de 5-6 semanas Mevius et al., 1990b), acercándose a 1 en animales ya rumiantes (Mevius et al., 1991), lo que indicaría que en estos últimos animales no se produciría un atrapamiento de la flumequina en el rumen.

En el ganado ovino, Delmas et al. (1997) calcularon un Vss de 0,52 ± 0,24 L/kg y un volumen de distribución aparente (Vdλ3) muy elevado (5,05 ± 3,47 L/kg), lo que pondría de manifiesto una baja tasa de retorno del compuesto hacia el compartimento central. Tras administrar el compuesto a diversos animales durante 5 días, y transcurridas 18 h desde

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la última administración, las mayores concentraciones del compuesto se detectaron (de mayor a menor concentración) en el punto de inyección, riñón, hígado, músculo y tejido adiposo.

En la cabra, la flumequina también se distribuyó rápidamente, con un valor de t1/2α de 0,87 ± 0,15 h, un Vss de 1,22 ± 0,29 L/kg y un MRT de 3,76 ± 0,69 h (Villa et al., 2005b).

En el caso de las aves, Anadón et al. (2008) comprobaron que la distribución de este compuesto hacia los tejidos era rápida (t1/2α = 1,12 ± 0,11 h) y amplia (Vss = 1,60 ± 0,33 L/kg) Por otro lado, las constantes de distribución k12 y k21 tomaron valores muy similares (0,19 ± 0,05 h-1 y 0,18 ± 0,04 h-1, respectivamente), lo que pone de manifiesto que en estos animales la flumequina retorna rápidamente desde los tejidos para su eliminación del organismo. Tras administrar el compuesto por vía oral durante 5 días (24 mg/kg cada 24 h) y transcurridas 12 h desde la última administración, se detectaron concentraciones elevadas del compuesto en riñones, hígado, músculo y piel + tejido adiposo, mientras que trascurridos 4 días desde la última administración el compuesto sólo se detectó en riñones e hígado, y a muy bajas concentraciones. Estos autores indicaron un MRT para la vía intravenosa de 5,90 ± 1,06 h; valor que es algo más elevado que el MRT0-24 señalado por Ferraresi et al. (2013) tras su administración oral (4,01 ± 0,27 h).

Finalmente, por lo que respecta a diversas especies de peces, los volúmenes de distribución calculados por los diferentes autores oscilan entre 2,3 ± 0,2 L/kg a 9oC en agua salada para el halibut (Samuelsen y Ervik, 1997); 3,1 L/kg a 5oC para el salmón atlántico (Rogstad et al., 1993) y 3,2 L/kg a 13oC para la trucha arcoiris (Sohlberg et al., 1994). Elema et al. (1995) indicaron un MRT muy elevado (51,7 ± 7,3 h) en el salmón atlántico.

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Eliminación

Las fluoroquinolonas se pueden clasificar en función de su principal ruta de eliminación, que incluye la excreción renal, el metabolismo hepático o ambos (Vancutsem et al., 1990; Dudley, 1991; Karablut y Drusano, 1993).

El grado en el que estos compuestos son metabolizados a nivel hepático varía mucho con el principio activo y de unas especies a otras. Las rutas metabólicas más comunes de estos agentes son la N-desalquilación, la conjugación con el ácido glucurónico, la oxidación, la hidroxilación, la sulfoxidación, la acetilación, la formilación y la ruptura del anillo piperacínico (Brown, 1996). Generalmente estas reacciones las llevan a cabo las enzimas del citocromo P450 (Bergogne-Berezin, 2002).

Uno de los mecanismos de excreción de la fluoroquinolonas es mediante secreción activa a través de la membrana intestinal, mecanismo que también puede contribuir a la elevada eficacia de estos antibacterianos en las enteritis bacterianas (McKellar, 1996). Las concentraciones a nivel intestinal pueden ser asimismo función de la secreción biliar (Martínez et al., 2006).

En el caso de la flumequina, este compuesto se metaboliza en el hígado a glucuroconjugados y 7-hidroxiflumequina, permaneciendo una parte del compuesto inalterado. Las proporciones de los metabolitos varían de unas especies a otras. Así, la 7-hidroxiflumequina es el principal metabolito en la rata (Harrison et al., 1986), mientras que en el ganado vacuno, la oveja y en el perro es minoritario (Mevius et al., 1990b). La 7-hidroxiflumequina tiene actividad antibacteriana, que será más o menos importante desde el punto de vista clínico en función de la concentración que alcance en la especie correspondiente. En el ganado porcino, la flumequina no sufre metabolización hepática (Villa et al., 2005a).

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Los glucuroconjugados pueden sufrir el circuito enterohepático y reabsorberse a nivel intestinal, lo que podría incrementar su tiempo de residencia en el organismo y prolongar su acción. Para la flumequina se ha demostrado la existencia del circuito enterohepático en el hombre (Testa y Jenner, 1976), ganado vacuno (Ziv et al., 1986) y la oveja (Delmas et al., 1997), mientras que en la rata es prácticamente insignificante (Ruiz-García et al., 1999).

Por lo que respecta a su excreción, las fluoroquinolonas se excretan de forma predominante como compuestos inalterados en la orina por filtración glomerular y secreción tubular activa (Brown, 1996; Bregante et al., 1999), lo que les permite alcanzar elevadas concentraciones en la orina. Tanto los metabolitos como el compuesto original se pueden excretar por orina y bilis, así como con las heces (Giguère y Dowling, 2013).

La flumequina se excreta principalmente vía bilis y orina, en proporciones que varían en función de la especie: en la rata, el 90% de la dosis se excreta por vía renal (Ruiz-García et al., 1999), el 60% en perros (Harrison et al., 1986) y aproximadamente el 50% en el ganado vacuno (Mevius et al., 1990b). En la orina, la mayor parte de la dosis se excreta en forma de glucuroconjugados y, en menor proporción, como 7-hidroxiflumequina y compuesto inalterado en el hombre, el perro, la rata, el ganado vacuno y ovino (Edelson et al., 1977; Dorrestein et al., 1983; Schupann et al., 1985; Ziv et al., 1986; Mevius et al., 1990b y 1991; Delmas et al., 1997).

En el ganado vacuno, a las 48 h de la administración intravenosa del compuesto, un 3,2-6,5% se excretaba inalterado en la orina, aproximadamente el 29,0-37,4% lo hacía en forma de glucuroconjugados y el 2,7% en forma de derivado hidroxilado. Cuando el compuesto se administró por vía oral, aproximadamente el 37-42% de la dosis se excretó en forma de glucuroconjugados en la orina. Esta mayor excreción urinaria de los glucuroconjugados tras la administración oral se relacionó con el efecto de primer paso que se podría producir a nivel hepático en la mucosa del duodeno o íleon. Por lo que respecta al resto de la dosis, se cree que se eliminaría vía bilis (Mevius et al., 1990b). Mevius et al. (1991) observaron que la proporción de las concentraciones urinarias de los

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diferentes metabolitos en el ganado vacuno adulto era flumequina: 7-hidroxiflumequina:glucuroconjugados 2:1:10; y que la presencia de una infección por pasterelas alteraba la metabolización por hidroxilación y glucuroconjugación, de forma que la ratio pasaba a ser 6:1:15.

En la oveja, Delmas et al. (1997) comprobaron que tan sólo el 2,3% de la dosis se excretaba en forma de 7-hidroxiflumequina, porcentaje que se incrementó hasta el 19% en pollos (Anadón et al., 2008).

En el ganado porcino, el aclaramiento (Cl) fue de 0,24 ± 0,18 L/kg.h (Villa et al., 2005a), similar al indicado en ganado vacuno adulto (0,24 ± 0,02 L/kg.h) (Mevius et al., 1991), la oveja (0,31 ± 0,03 L/kg.h) (Delmas et al., 1997); el ganado caprino (0,32 ± 0,03 L/kg.h) (Villa et al., 2005b); y en pollos broiler (0,27 ± 0,02 L/kg.h) (Anadón et al., 2008).

La presencia de infección reducía el aclaramiento en el ganado vacuno a 0,15 ± 0,01 L/kg.h (Mevius et al., 1991). En terneros, el valor calculado no se aleja demasiado de los indicados anteriormente en animales de 5-6 semanas (0,19 ± 0,02 L/kg.h) y 18 semanas (0,19 ± 0,03 L/kg.h), siendo más bajo en los de 1-2 semanas de edad (0,11 ± 0,02 L/kg.h) (Mevius et al., 1990b). En el halibut, tomó un valor de 0,052 ± 0,002 L/kg.h a 9oC (Samuelsen y Ervik, 1997), mientras que en el salmón atlántico fue de 0,095 L/kg.h 5oC (Rogstad et al., 1993) y de 0,073 ± 0,006 L/kg.h a 6-8oC (Elema et al., 1995).

Por lo que respecta a la semivida de eliminación, fue de 6,35 ± 1,69 h (t1/2λ2) en el ganado porcino (Villa et al., 2005b); 8,21 ± 1,95 h en ganado vacuno rumiante (Mevius et al., 1991); 7,12 ± 1,7 h (t1/2β) en el ganado caprino (Villa et al., 2005b); 6,91 ± 1,44 h (t1/2β) en pollos (Anadón et al., 2008); 6,07 ± 0,02 h (t1/2β) en la rata (Ruiz-García et al., 1999); y 4,01 ± 0,57 h (t1/2e) en pavos (Ferraresi et al., 2013). En terneros de 5-6 semanas y de 18 semanas este parámetro tomó un valor de 1,68 ± 0,19 h y de 1,50 ± 0,50 h; que fueron inferiores al indicado en animales de 1-2 semanas (2,48 ± 0,78 h) (Mevius et al., 1990b). Ziv et al. (1986) indicaron valores cercanos a estos últimosautores en terneros neonatos (t1/2β) (2,25 h). En los peces, la semivida de eliminación toma valores más elevados al ser estos animales ectotérmicos: 23 h (t1/2β) a 5oC (Rogstad et al., 1993) y 40 h (t1/2β) a 6-8oC (Elema et al., 1995) en el salmón

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atlántico; 43 ± 8 h (t1/2γ) a 9oC en el halibut (Samuelsen y Ervik, 1997); 736 h a 3oC y 285 h a 13oC (t1/2β) en la trucha arcoíris (Sohlberg et al., 1994).

Indicadores farmacocinéticos/farmacodinámicos (PK/PD)

En el tratamiento de cualquier enfermedad infecciosa, la eficacia de la terapia antimicrobiana dependerá de la capacidad del microorganismo patógeno para responder a la terapia elegida, las condiciones en que se produce la exposición al compuesto y la habilidad para alcanzar las concentraciones de fármaco necesarias en el lugar de la infección. Los indicadores PK/PD permiten establecer la relación existente entre la exposición sistémica al compuesto y sus correspondientes efectos microbiológicos y clínicos y, de esta manera, fijar la posología (dosis, intervalo entre dosis y duración del tratamiento) necesaria para conseguir el efecto deseado (Martínez et al., 2013).

A efectos de esta relación PK/PD, los antimicrobianos se clasifican en compuestos concentración-dependientes y tiempo-dependientes. Las quinolonas se consideran compuestos concentración-dependientes (Zhanel, 2001), y los índices más apropiados para valorar la adecuación del tratamiento son AUC/CIM y Cmax/CMI. Ambos parámetros están estrechamente relacionados, y son importantes para asegurar la eficacia del tratamiento.

El cociente Cmax/CMI es particularmente importante en el caso de bacterias con CMI elevados o con una tasa de proliferación rápida (Craig y Dalhoff, 1998). En el caso de estas últimas, las de rápida proliferación, tienen una elevada probabilidad de sufrir una mutación que pueda dar lugar a una población bacteriana menos sensible (Craig y Dalhoff, 1998; Drusano et al., 1993). Con el fin de asegurar la máxima acción bactericida, la ratio Cmax/CMI debe tomar un valor de 10-12 (Drusano et al., 1993; Preston et al., 1998), de forma que sobrevivan menos microorganismos que luego puedan ser eliminados por el sistema inmune.

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AUC/CMI también es un indicador PK/PD a tener en cuenta cuando las bacterias que causan la infección son de crecimiento lento, cuando el efecto posantibiótico es escaso o nulo o cuando la CIM es relativamente baja. Diversos estudios han señalado que este índice CMI debe tomar un valor igual o superior a 100 con el fin de asegurar la supervivencia del paciente (Craig, 1998; Craig y Dalhoff, 1998; Thomas et al., 1998). El valor de 100 se traduce en que se deberían alcanzar concentraciones del fármaco aproximadamente 4 veces la CMI con un intervalo entre dosis de 24 h (Walker, 2000). En el caso de las bacterias Gram negativas, se ha establecido un valor de aproximadamente 125 para asegurar el éxito del tratamiento y evitar la selección de cepas resistentes (Forrest et al., 1993). Sin embargo, para las bacterias Gram negativas el valor es considerablemente más bajo, de aproximadamente 30-50 (Preston et al., 1998; Wright et al., 2000; Ibrahim et al., 2002)

Material y métodos

Material y métodos

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1. Animales empleados

Para la realización de este trabajo se utilizaron cerdos de raza Landrace de 2,5-3 meses de edad aproximadamente, procedentes de la granja experimental asociada a la Facultad de Veterinaria de la Universidad de León, donde se mantuvieron en alojamientos individuales durante todo el estudio (Figura 4).

Figura 4. Disposición de los animales en sus cubículos.

Material y métodos

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En la granja, tras el destete, los lechones comienzan su alimentación con un estárter (pienso de iniciación que incluye leche) para continuar con un pienso de transición, que es el que se les administró en el momento del ensayo. Se trata de un pienso granulado formulado por el nutrólogo de la granja y elaborado por NUTECAL a base de cebada, trigo, soja, manteca y corrector vitamínico-mineral (componentes analíticos: 17,5% de proteína bruta, 4,5% de aceites y grasas brutas, 4% de fibra bruta, 5% de ceniza bruta, minerales, aminoácidos, vitaminas, oligoelementos y enzimas).

Antes de comenzar con el tratamiento de la solución Flumesyva® líquido 20%, los animales fueron sometidos a un período de aclimatación de 4 días, durante los cuales se les controló la ingesta diaria de agua (Tabla 5).

Los animales se eligieron al azar y se distribuyeron de forma aleatoria en tres lotes de 4 cerdos cada uno. Además, para poder realizar la validación del método analítico se utilizaron otros dos animales que no recibieron ningún tipo de tratamiento.

En la tabla 4 se recoge el peso y el sexo de los animales de cada lote.

Material y métodos

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Tabla 4. Sexo y peso de los animales al inicio del periodo de aclimatación (4 días antes del inicio de la fase experimental del estudio).

LOTE Animal Sexo Peso de los animales

4 días antes del inicio de la fase experimental del estudio

(kg)

72 Hembra 14,64 65 Macho 14,56 1 66 Hembra 15,72 75 Hembra 14,1 media 14,8 desviación 0,7 CV (%) 4,6 64 Macho 14,66 244 Macho 14,1 2 71 Macho 14,12 74 Hembra 15,68 media 14,6 desviación 0,7 CV (%) 5,1 67 Hembra 14,5 69 Hembra 14,28 3 68 Macho 15,5 70 Macho 13,72 media 14,5 desviación 0,7 CV (%) 5,1 media 14,7 desviación 0,6 CV (%) 4,3

Material y métodos

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Tabl

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Material y métodos

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2. Administración de Flumesyva® líquido 20%

Una vez finalizado el periodo de aclimatación se inició la fase experimental del estudio durante la cual, todos los animales recibieron el mismo tratamiento, 1 dosis de flumequina (12 mg/kg/día) disuelta en el agua de bebida durante 5 días.

Cada día de la fase experimental del estudio, a primera hora de la mañana (aproximadamente a las 9 horas), se pesaba a los animales y se calculaba la cantidad de Flumesyva® líquido 20% a administrar, procediéndose a añadir esa cantidad a 1 L de agua, que se depositaba en el bebedero de cada cerdo. Pasadas 10 h, se comprobaba la cantidad de agua consumida y se volvía a añadir una cantidad controlada de agua si era necesario.

Como se comentó al inicio del capítulo los animales se distribuyeron en 3 lotes. En el lote 1 se incluyeron los animales que serían sacrificados el día 3, en el lote 2 los animales que se sacrificarían el día 6, un día después de finalizar el tratamiento y en el lote 3 se incluyeron los animales que se sacrificarían el día 7, dos días después de haber finalizado el tratamiento.

En las tablas 6 a 12 se recogen los pesos de los animales, las cantidades a administrar de Flumesyva® líquido 20% cada día a cada cerdo, así como el volumen de agua consumido y la dosis final ingerida de Flumesyva® líquido 20%.

Como resumen de la fase experimental, se recoge para cada animal y día el control del peso (Tabla 13) y de la ingesta de agua (Tabla 14).

Material y métodos

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Tabl

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0 a1

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)

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R

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de

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12

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15,5

12

18

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200

0,93

M

enos

de

1000

R

esto

has

ta 1

000

1000

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244

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0,95

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19

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74

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6,4

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200

0,95

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500

1500

19

0,8

12

69

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R

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* E

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Material y métodos

65

Tabl

a 7.

Dat

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* E

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Material y métodos

66

Tabl

a 8.

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72

65

SAC

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mL

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Material y métodos

67

Tabl

a 9.

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72

65

SAC

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3

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* E

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Material y métodos

68

Tabl

a 10

. Dat

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65

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* El v

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Material y métodos

69

Tabl

a 11

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1

72

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SAC

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1925

* El v

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los

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100

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l agu

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Material y métodos

70

Tabl

a 12

. Dat

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de

la fa

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Material y métodos

71

Tabl

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Material y métodos

72

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9

Material y métodos

73

Durante los días que duró la fase experimental se realizó el registro de las temperaturas máxima y mínima, como queda recogido en la tabla 15.

Tabla 15. Temperaturas máxima y mínima registradas durante los días de la fase experimental del estudio.

Día de la fase experimental del estudio

Fecha Temperatura

máxima (oC)

Temperatura mínima

(oC)

1 22/05/2013 20 5 2 23/05/2013 20 7 3 24/05/2013 20 6 4 25/05/2013 21 5 5 26/05/2013 20 6 6 27/05/2013 22 8

3. Recogida de muestras

En la fase experimental del estudio, el día 3 (antes de administrar la dosis correspondiente de Flumesyva® líquido 20%), el día 6 y el día 7 se procedía a la toma de muestras de los animales correspondientes a cada lote.

En primer lugar se recogía sangre de cada animal de la vena yugular utilizando para ello tubos Vacutainer® de 8 mL con heparina de sodio, que se introducían en una caja de poliespán con hielo picado. Inmediatamente después se sacrificaban los animales con la administración por vía intravenosa de Solución para eutanasia T-61®. En la misma granja se realizaba la necropsia de los cerdos, se identificaba el colon y se procedía a anudar la parte inicial y final del mismo. A continuación se aislaba dicha porción, se introducía en una bolsa de plástico hermética, y esta a su vez en la caja de poliespán con hielo picado para proceder a su traslado inmediato al laboratorio de trabajo junto con los Vacutainer® que contenían la sangre

Material y métodos

74

de los animales. El tiempo utilizado en todo el proceso fue de alrededor de 1 h y 30 min incluyendo el empleado en el traslado, que fue de aproximadamente 10 min, ya que la granja se encuentra situada aproximadamente a 3 km del laboratorio.

Una vez en el laboratorio, se identificaban los tres segmentos del colon (ascendente, trasverso y descendente) y se tomaba una muestra de cada porción del contenido del colon (contenido intestinal) y una de cada segmento de la pared del colon (tejido). La muestra de tejido recogida se lavaba en un recipiente con agua antes de proceder a su congelación. Todas las muestras (contenido intestinal y tejido) se introducían de forma individual en tubos de polipropileno de 25 mL de capacidad y se congelaban a -80º C hasta su procesamiento.

La sangre se centrifugaba durante 20 min a 1.500 rpm, extrayéndose el plasma sobrenadante por aspiración con pipetas Pasteur de vidrio, congelándolo a -80ºC hasta su utilización en tubos de polipropileno de 1,5 mL de capacidad.

3.1. Material empleado:

- Solución para eutanasia T-61® (embutramida 0,2 g; mebezonio ioduro 0,05 g; tetracaína clorhidrato 0,005 g; excipientes csp 1 mL.)

- Armario congelador -80ºC (Skadi).

- Bolsas de plástico hermética.

- Caja de poliespán con tapa con hielo picado.

- Centrifuga refrigerada modelo 5804 (Eppendorf).

- Pipetas Pasteur de vidrio.

- Tubos de polipropileno de 1,5 mL de capacidad (Treff AG).

- Tubos de polipropileno de 25 mL de capacidad (Treff AG).

- Vacutainer® de 8 mL con heparina de sodio.

Material y métodos

75

4. Método analítico para la determinación de la flumequina

La determinación de la flumequina en los tres tipos de muestras a analizar (en plasma, contenido intestinal y tejido) se realizó mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) en fase reversa con detección ultravioleta (UV), basándonos en métodos previamente descritos por otros autores (Yorke y Froc, 2000; Prat et al., 2006; Evaggelopoulou y Samanidou, 2013), así como en la Farmacopea Europea (European Directorate for the Quality and Health Medicines, 2011).

Como paso previo para la cuantificación de flumequina en las muestras de plasma, tejido y contenido intestinal de los animales objeto de este estudio, se procedió a realizar la validación del método para la identificación y cuantificación de flumequina en plasma, contenido intestinal y pared intestinal siguiendo las recomendaciones de la Unión europea recogidas en la Guía EMEA/CHMP/EWP/192217/2009El (European Medicines Agency, 2011), utilizando en todos los casos como estándar interno el ácido oxolínico.

4.1. Reactivos, material y equipos empleados en la extracción, identificación y cuantificación de la flumequina

• Acetato de etilo (C4H8O2) HiPerSolv Chromanorm para HPLC (Merck).

• Acetonitrilo (CH3CN) calidad grado gradiente para cromatografía líquida (Merck).

• Ácido oxolínico (C13H11NO5) (Sigma-Aldrich) (estándar interno).

• Agua tipo I grado ultrapura.

• Flumequina CRS (C14H12FNO3) (European Pharmacopoeia, Council of Europe).

• Hidróxido sódico (NaOH) 1 mol/L (Panreac).

• Potasio dihidrogenofosfato (KH2PO4) calidad AnalaR Normapur (VWR).

o Agitador rotativo modelo Orbit 300445 (Selecta).

http://en.wikipedia.org/wiki/Carbon

http://en.wikipedia.org/wiki/Hydrogen

http://en.wikipedia.org/wiki/Fluorine

http://en.wikipedia.org/wiki/Fluorine

http://en.wikipedia.org/wiki/Oxygen

Material y métodos

76

o Balanza analítica (modelo AS 220/X, Radwag).

o Bomba de vacío/presión modelo DOA-P504-BN (Gast).

o Bombona de N2 técnico X50S (Carburos metálicos).

o Centrifuga refrigerada modelo 5804R (Eppendorf).

o Columna XBridge® C18 5 µm, 4,6 x 250 mm (Waters).

o Cromatógrafo HPLC modelo e2695 (Waters) equipado con detector Photodiode Array (Waters) modelo 2998.

o Dispensador (Dispensette III).

o Equipo de filtración 47 mm (Afora).

o Filtros de membrana de nylon 0,45 µm (47 mm) (Whatman).

o Homogeneizador Omni-Mixer (Omni 17106).

o Matraces aforados, vasos de precipitados, embudos, palomillas magnéticas, pipetas Pasteur de vidrio.

o Matraz de evaporación de vidrio de 50 mL.

o pH-metro modelo GLP21 (Crison).

o Pipeta automática modelo 10-100 μL (Eppendorf).

o Pipeta automática modelo 100-1000 μL (Eppendorf).

o Pipetas Pasteur de vidrio.

o Rotavapor refrigerante vertical (Buchi).

o Sistema de purificación Autwomatic Tipo II grado analítico (Wasserlab).

o Sistema de purificación Ultramatic Tipo I grado ultrapura (Wasserlab).

o Tubos de polipropileno con tapón (10 mL).

o Tubos de vidrio (10 mL).

o Tubos de vidrio (15 mL).

Material y métodos

77

4.2. Parámetros de calidad de la validación del método para la determinación de las concentraciones de flumequina

Los parámetros de calidad determinados fueron:

4.2.1. Selectividad

En el cromatograma se diferenciaron claramente el analito (flumequina), el estándar interno y las posibles interferencias del plasma. La selectividad se probó utilizando al menos 6 muestras de matriz blanca (sin analito ni estándar interno). La respuesta debería ser inferior al 20% del límite inferior de cuantificación (LLOQ) para el analito y del 5% para el estándar interno.

4.2.2. Arrastre

Para comprobar que no existe arrastre se inyectó en el cromatógrafo una fase móvil al finalizar la inyección de las muestras de concentración más alta (solución patrón y controles de calidad en la matriz biológica, y soluciones en fase móvil).

El arrastre no podría superar el 20% del LLOQ para el analito y el 5% para el estándar interno.

4.2.3. Límite inferior de cuantificación (LLOQ)

Para este método se consideró como límite inferior de cuantificación (LLOQ) el estándar de calibración más bajo, de forma que la señal del analito para este patrón debería ser al menos 5 veces la señal de la muestra blanco (matriz biológica blanca de cerdo sin analito ni estándar interno).

4.2.4. Curva de calibrado

Se prepararon las siguientes soluciones, tanto del analito como del estándar interno:

Material y métodos

78

• Solución stock de 1 mg/mL de flumequina. Se pesan 10 mg de flumequina y se transfieren a un matraz aforado de 10 mL. Se disuelven con 100 µL de NaOH 1M y 1 mL de agua tipo I, enrasando al volumen final con agua tipo I.

• Solución stock de 1 mg/mL de ácido oxolínico (estándar interno) Se pesan 10 mg de ácido oxolínico y se transfieren a un matraz aforado de 10 mL. Se disuelven con 100 µL de NaOH 1M y 1 mL de agua tipo I, enrasando al volumen final con agua tipo I.

• Solución patrón de 100 µg/mL de flumequina y 100 µg/mL de ácido oxolínico. Se transfieren con la pipeta automática 1 mL de la solución stock de 1 mg/mL de flumequina y 1 mL de la solución stock de 1 mg/mL de ácido oxolínico a un matraz aforado de 10 mL, enrasando al volumen final con agua tipo I.

• Solución patrón de 80 µg/mL de flumequina y 100 µg/mL de ácido oxolínico. Se transfieren con la pipeta automática 0,8 mL de la solución stock de 1 mg/mL de flumequina y 1 mL de la solución stock de 1 mg/mL de ácido oxolínico a un matraz aforado de 10 mL, enrasando al volumen final con agua tipo I.


• Solución patrón de 20 µg/mL de flumequina y 100 µg/mL de ácido oxolínico. Se transfieren con la pipeta automática (0,2 mL de la solución stock de 1 mg/mL de flumequina y 1 mL de la solución stock de 1 mg/mL de ácido oxolínico a un matraz aforado de 10 mL, enrasando al volumen final con agua tipo I.

Material y métodos

79



• Solución stock de 100 µg/mL de ácido oxolínico. Se transfieren con la pipeta automática 1 mL de la solución stock de 1 mg/mL de ácido oxolínico a un matraz aforado de 10 mL, enrasando al volumen final con agua tipo I.

• Solución stock de control de calidad (QC4) de 75 µg/mL de flumequina y 100 µg/mL de ácido oxolínico. Se transfieren con la pipeta automática 0,75 mL de la solución stock de 1 mg/mL de flumequina y 1 mL de la solución stock de 1 mg/mL de ácido oxolínico a un matraz aforado de 10 mL, enrasando al volumen final con agua tipo I.



Material y métodos

80


4.2.5. Linealidad

El cálculo de la recta de calibrado se llevó a cabo mediante el método de los mínimos cuadrados, representando la relación de alturas (analito/estándar interno) en el eje de ordenadas frente a la concentración teórica de flumequina en las muestras fortificadas, expresada en µg/mL, en el eje de abscisas.

Para el cálculo de la recta no se tuvieron en cuenta ni las muestras de matriz blanca ni las de matriz cero (con estándar interno pero sin analito).

Los criterios de aceptación fueron que la media de las concentraciones estimadas con la recta calibrado estuviesen dentro del ± 15% del valor nominal excepto para el límite inferior de cuantificación (LLOQ), en el que se acepta un ± 20%. Al menos el 75% de las muestras deberían cumplir este criterio.

4.2.6. Reproductibilidad y precisión

De forma independiente a las muestras fortificadas para obtener las curvas de calibrado se prepararon de la misma forma los controles de calidad (QC).

Para controlar la reproductibilidad y precisión diaria se analizaron 5 muestras de cada una de las concentraciones de los controles de calidad, tras cada curva de calibrado.

La reproductibilidad y precisión entre días se controló analizando el control de calidad 2 y 4 durante varios días.

Los criterios de aceptación fueron que la media de las concentraciones calculadas utilizando la recta teórica de calibrado deberían estar dentro del 15% del valor nominal excepto para el LLOQ, para el que se aceptó un 20%.

Material y métodos

81

En el caso de la precisión el coeficiente de variación no debería superar el 15% excepto para el 20% (LLOQ).

4.2.7. Estabilidad

Se comprobó la estabilidad del analito en la matriz biológica utilizando los controles de calidad PQC2 y PQC4 (1,5 y 7,5 μg/mL), en diferentes condiciones de temperatura y a distintos tiempos.

Las condiciones valoradas fueron:

• 24 h a temperatura ambiente.

• 24 h a temperatura ambiente tras extracción

• 24 h a 4ºC

• 24 h a 4ºC tras extracción

• 24 h a -80ºC

• 48 h a 4ºC

• 48 h a -80ºC

• 72 h a -80ºC

• 5 días a -80ºC

Cada día, y tras la secuencia de inyecciones de los patrones para las rectas de calibrado y para la reproductibilidad y precisión, se procedió a la inyección también por duplicado de las muestras para la estabilidad.

La estabilidad del analito en fase móvil se probó con la inyección de los distintos patrones y controles de calidad disueltos en fase móvil, preparándose las soluciones con los valores recogidos en las tablas 16 y 17.

Material y métodos

82

Tabla 16. Soluciones patrón de flumequina y estándar interno (ácido oxolínico) y volúmenes empleados en la preparación de las soluciones en fase móvil.

Soluciones patrón (μg/mL)

Volumen de fortificación (μL/10 mL)

Concentración en fase móvil

(μg/mL)

5 1000 0,5

10 1000 1

20 1000 2

40 1000 4

80 1000 8

100 1000 10

Tabla 17. Soluciones stock de control de calidad (QC) de flumequina y estándar interno (ácido oxolínico) y volúmenes empleados en la preparación de las soluciones en fase móvil.

Soluciones stock de control de calidad

(μg/mL)

Volumen de fortificación (μL/10 mL)

Concentración en fase móvil

(μg/mL)

5 1000 0,5

15 1000 1,5

50 1000 5

75 1000 7,5

4.2.8. Condiciones de integración

El cromatógrafo realizó la integración de los picos de forma automática utilizando las condiciones de integración de BV (línea de base a valle) o VV (valle a valle).

Material y métodos

83

4.2.9. Causas y criterios de repetición de muestras

Al final de cada sesión se analizaban los resultados obtenidos. Si se detectaba algún error en el procesado de las muestras se decidía de forma individual la manera de actuar. Si los errores afectaban a la preparación de las soluciones stock o controles de calidad o el procesamiento de las muestras era necesario repetir el proceso.

5. Extracción de flumequina

5.1. Extracción de flumequina de muestras de plasma de cerdo

La extracción de la flumequina y el estándar interno (ácido oxolínico) de las muestras de plasma se llevó a cabo de acuerdo con el procedimiento que se describe a continuación.

En un tubo de polipropileno con tapón, se depositó 1 mL de plasma con una pipeta automática al que se añadieron 4 mL de acetato de etilo con un dispensador. Los tubos se colocaron en un agitador rotativo de tubos durante 5 min, y a continuación se centrifugaron durante 10 min a 3000 rpm para separar el sobrenadante.

El sobrenadante se extrajo con la ayuda de una pipeta Pasteur de vidrio, se colocó en un tubo de vidrio y se evaporó a sequedad con corriente de nitrógeno. Posteriormente se reconstituyó con 1 mL de fase móvil y se realizaron dos inyecciones de 20 µL de la muestra en el cromatógrafo para proceder a la cuantificación de la flumequina.

Cada día del análisis se prepararon y analizaron las muestras de plasma fortificadas en el rango especificado en la tabla 16. Además, se utilizó una matriz blanca que no contenía ni flumequina ni estándar interno, y una matriz cero que no contenía la flumequina pero sí estándar interno (ácido oxolínico 10 µg/mL).

Material y métodos

84

Tabla 18. Soluciones patrón de flumequina y estándar interno (ácido oxolínico) y volúmenes empleados en la fortificación de las muestras de plasma.


Volumen de fortificación

(μL/mL)

Concentración en plasma

(μg/mL)

5 100 0,5

10 100 1

20 100 2

40 100 4

80 100 8

100 100 10

Todas se procesaron por duplicado siguiendo el método descrito, realizándose dos inyecciones de cada una de las muestras en el cromatógrafo.

De forma independiente a las muestras fortificadas para obtener las curvas de calibrado se prepararon de la misma manera los controles de calidad (QC) teniendo en cuenta los valores recogidos en la tabla 19.

Tabla 19. Soluciones stock de control de calidad (QC) de flumequina y estándar interno (ácido oxolínico) y volúmenes empleados en la fortificación de las muestras del control de calidad.


(μg/mL)


(μL/mL)

Concentración de plasma (μg/mL)

5 100 0,5 15 100 1,5 50 100 5 75 100 7,5

Material y métodos

85

5.2. Extracción de flumequina de muestras de contenido intestinal de cerdo

La extracción de la flumequina y el estándar interno (ácido oxolínico) de las muestras de contenido intestinal se llevó a cabo de acuerdo con el siguiente procedimiento: la noche anterior a comenzar la extracción de flumequina se colocaron en el frigorífico los tubos que tenían el contenido intestinal previamente congelado a -80oC.

Una vez descongelada la muestra se pesaron porciones de 0,5 ± 0,05 g que se depositaban en un tubo de polipropileno con tapón. Se añadieron 5 mL de agua tipo I y se llevaron, de forma individual, a un homogeneizador Omni-Mixer durante 20 segundos a velocidad 3. El contenido del vaso del homogeneizador se trasfirió al tubo correspondiente de polipropileno con tapón, lavándose dos veces con 1 mL de agua. A continuación se centrifugaron durante 10 min a 3000 rpm para separar el sobrenadante. Esta fase acuosa se transfirió a otro tubo de vidrio con tapón de rosca de 15 mL al que se le añadieron 4 mL de acetato de etilo.

Los tubos se colocaron en un agitador rotativo de tubos durante 5 min, centrifugándose a continuación durante 10 min a 3000 rpm para separar el sobrenadante. El sobrenadante se extrajo con la ayuda de una pipeta Pasteur de vidrio, depositándose en el matraz de evaporación de vidrio de 50 mL de capacidad.

A la fase acuosa se le añadieron de nuevo 4 mL de acetato de etilo, y se repitió el proceso dos veces. El contenido del matraz de evaporación de vidrio se evaporó con ayuda de un rotavapor, finalizando la evaporación en corriente de nitrógeno. Posteriormente se reconstituyó con 1 mL de fase móvil y se realizaron dos inyecciones de 20 μL de la muestra en el cromatógrafo.

Cada día del análisis se prepararon y analizaron las muestras de contenido intestinal fortificadas en el rango especificado en la tabla 20. Además, se utilizó una matriz blanca que no contenía ni flumequina ni estándar interno, y una matriz cero que no contenía flumequina pero sí elestándar interno (ácido oxolínico 10 µg/mL).

Material y métodos

86

Tabla 20. Soluciones patrón de flumequina y estándar interno (ácido oxolínico) y volúmenes empleados en la fortificación de las muestras de contenido intestinal.



(μL/0,5 g)

Concentración en contenido intestinal

(μg/g)


(μg/mL)

5 100 1 0,5

10 100 2 1

20 100 4 2

40 100 8 4

80 100 16 8

100 100 20 10





(μg/mL)


(μL/0,5 g)


(μg/g)

Concentración de contenido intestinal

(μg/mL)

5 100 1 0,5 15 100 3 1,5 50 100 10 5 75 100 15 7,5

Material y métodos

87

5.3. Extracción de flumequina de muestras de muestras de pared intestinal de cerdo

La extracción de la flumequina y el estándar interno (ácido oxolínico) de las muestras de pared intestinal se llevó a cabo de acuerdo con el procedimiento descrito a continuación.

La noche anterior a comenzar la extracción de flumequina se colocaron en el frigorífico los tubos que contenían la pared intestinal previamente congelada. Una vez descongelada la muestra se troceó con la ayuda de una tijera y se pesaron porciones de 1 ± 0,05 g.

En un tubo de polipropileno con tapón, se depositó 1 ± 0,05 g de tejido al que se añadieron 5 mL de agua tipo I y se llevaron, de forma individual, a un homogeneizador Omni-Mixer durante 30 segundos a velocidad 3. El contenido del vaso del homogeneizador se trasfirió al tubo correspondiente de polipropileno con tapón lavándose dos veces con 1 mL de agua. A continuación se centrifugaron durante 10 min a 3000 rpm para separar el sobrenadante. Esta fase acuosa se transfirió a otro tubo de vidrio con tapón de rosca de 15 mL al que se le añadieron 4 mL de acetato de etilo.

Los tubos se colocaron en un agitador rotativo de tubos durante 5 min, centrifugándose a continuación durante 10 min a 3000 rpm para separar el sobrenadante. El sobrenadante se extrajo con la ayuda de una pipeta Pasteur de vidrio, depositándose en el matraz de evaporación de vidrio de 50 mL de capacidad.

A la fase acuosa se le añadieron de nuevo 4 mL de acetato de etilo, y se repitió el proceso dos veces. El contenido del matraz de evaporación de vidrio se evaporó con ayuda de un rotavapor, finalizando la evaporación en corriente de nitrógeno. Posteriormente se reconstituyó con 1 mL de fase móvil y se realizaron dos inyecciones de 20 μL de la muestra en el cromatógrafo para proceder a la cuantificación de la flumequina.

Material y métodos

88

Cada día del análisis se prepararon y analizaron las muestras de pared intestinal fortificadas en el rango especificado en la tabla 22. Además, se utilizó una matriz blanca que no contenía ni flumequina ni estándar interno, y una matriz cero que no contenía flumequina pero sí el estándar interno (ácido oxolínico 10 µg/mL).

Tabla 22. Soluciones patrón de flumequina y estándar interno (ácido oxolínico) y volúmenes empleados en la fortificación de las muestras de pared intestinal.



(μL/g)

Concentración en pared intestinal

(μg/g)


(μg/mL)

5 100 0,5 0,5 10 100 1 1 20 100 2 2 40 100 4 4 80 100 8 8 100 100 10 10



Material y métodos

89



(μg/mL)


(μL/g)


(μg/g)

Concentración de pared intestinal

(μg/mL)

5 100 0,5 0,5

15 100 1,5 1,5

50 100 5 5

75 100 7,5 7,5

6. Identificación y cuantificación de flumequina

En este caso, y para todos los tipos de muestras, la identificación y cuantificación de flumequina y el estándar interno se realizó, siguiendo siempre el mismo procedimiento, mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) en fase reversa con detección ultravioleta (UV).

Las condiciones operativas fueron las siguientes:

Longitud de onda del detector: 320 nm.

Flujo: 1 mL/min.

Fase móvil: mezcla de una disolución de potasio dihidrógenofosfato (1,36 g/L) y acetonitrilo en la proporción 51:49 (v/v).

Columna XBridge® C18 5 µm, 4,6 x 250 mm (Waters).

Material y métodos

90

7. Análisis estadístico

Con los valores obtenidos tras el procesado de las distintas muestras se calcularon los parámetros de calidad que sirvieron para validar en cada caso el método.

Se realizó la estadística descriptiva de los resultados (media, desviación estándar y coeficiente de variación).

Las rectas de calibrado se calcularon mediante la regresión lineal, utilizando para su validación el coeficiente de determinación (r2) y el grado de significación de p ≤ 0,05. Para ello se utilizaron los programas informáticos SPSS (versión 21, con licencia de la Universidad) y Microsoft Excel 2010.

Los criterios de aceptación fueron que la media de las concentraciones estimadas con la recta calibrado estuviesen dentro del ± 15% del valor nominal excepto para el límite inferior de cuantificación, para el que se acepta un ± 20%. Al menos el 75% de las muestras cumplieron este criterio.

Resultados y discusión


91

1. Validación del método analítico para la determinación de flumequina en plasma de cerdo

A continuación se exponen los resultados obtenidos para cada uno de los parámetros de calidad determinados.

1.1. Selectividad

En los cromatogramas obtenidos se diferencian claramente el analito (flumequina, tiempo de retención = 5,0 min), el estándar interno (ácido oxolínico, tiempo de retención = 3,6 minutos) y las interferencias del plasma (tiempo de retención = 3,2 minutos). La selectividad se probó utilizando 6 muestras de plasma blanco (sin analito ni estándar interno), 2 cada día que se realizaron las curvas de calibrado. En la figura 5 se muestra un ejemplo de un cromatograma de la matriz blanca (sin analito ni estándar interno).

Figura 5. Cromatograma obtenido tras la inyección de la matriz blanca.


92

La figura 6, por su parte, recoge un cromatograma obtenido tras la inyección de la matriz cero (muestra de plasma con estándar interno, ácido

oxolínico).

Figura 6. Cromatograma obtenido tras la inyección de la matriz cero.

En la figura 7 se observa el cromatograma de una matriz con el analito (flumequina) y el estándar interno (ácido oxolínico).

Figura 7. Cromatograma obtenido tras la inyección de la muestra de patrón en plasma (plasma con flumequina (10 μg/mL) y ácido oxolínico (10 μg /mL).


93

Tras la integración de los cromatogramas de las 6 muestras de matriz blanca se comprobó que no había señal en los tiempos de retención correspondientes al analito pero sí en el estándar interno. En todo caso, se cumplió el criterio de calidad establecido: la respuesta debía ser inferior al 20% del LLOQ para el analito y del 5% para el estándar interno.

1.2. Arrastre

En cada una de las secuencias del ensayo se realizaron 2 inyecciones de fase móvil tras la inyección del patrón más alto de la curva de calibrado, tras el control de calidad más alto, tras la solución patrón en fase móvil más alta y tras la solución stock de control de calidad en fase móvil más alta. En ninguna de ellas aparece señal al tiempo del analito ni del estándar interno.

En la figura 8 se recoge un ejemplo de un cromatograma de la inyección de una fase móvil tras la inyección del patrón más alto de calibrado.

Figura 8. Cromatograma obtenido tras la inyección de fase móvil.


94

1.3. Límite inferior de cuantificación (LLOQ)

Para este método se consideró como límite inferior de cuantificación (LLOQ) la solución patrón de calibración más baja de flumequina (0,5 μg/mL) en plasma de cerdo. Como se puede comprobar en el cromatograma se cumplió el criterio de que la señal del analito para este patrón fue al menos 5 veces la señal de la matriz blanca (plasma de cerdo sin analito ni estándar interno).

Figura 9. Cromatograma obtenido tras la inyección del LLOQ la (plasma con flumequina (0,5 μg/mL) y ácido oxolínico (10 μg /mL).

1.4. Curva de calibrado

La mejor correlación entre la concentración de flumequina en plasma de cerdo y la relación de las alturas de los picos de flumequina y el estándar interno, el ácido oxolínico, se obtenía con una línea recta (figura 10 y tabla 24).

Para el primer calibrado, la ecuación de la recta fue:

Y = 0,098 X + 0,007; r2 = 0,996 p < 0,001

donde Y = concentración de flumequina en plasma de cerdo, y

X= relación de las alturas de los picos de flumequina y el estándar interno.


95

Figura 10. Recta de calibrado de la primera secuencia.

Tabla 24. Condiciones del calibrado para la primera secuencia.

Conc. experimental

(μg/mL) Relación de

alturas Conc. teórica (μg/mL)

X ± DE (μg/mL)

CV (%)

Porcentaje sobre el valor

nominal

0,5 0,042 0,526 0,535 ± 0,013 2,4 107,0 0,043 0,544 1 0,098 1,104 1,092 ± 0,016 1,5 109,2 0,096 1,081 2 0,200 2,112 1,987 ± 0,178 9,0 99,3 0,175 1,861 4 0,398 4,160 3,903 ± 0,364 9,3 97,6 0,347 3,646 8 0,749 7,747 8,071 ± 0,458 5,7 100,9 0,813 8,395

10 1,003 10,338 10,025 ± 0,442 4,4 100,2 0,942 9,712

X : media; DE: desviación estándar; CV: coeficiente de variación.

Concentración (µg/mL)

0 2 4 6 8 10

Rel

ació

n de

altu

ras

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0


96

Para el segundo calibrado (figura 11 y tabla 25), la ecuación fue

Y = 0,088 X + 0,005; r2 = 0,992 p < 0,001


X = relación de las alturas de los picos de flumequina y el estándar interno.


0 2 4 6 8 10

Rel

ació

n de

altu

ras

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Figura 11. Recta de calibrado de la segunda secuencia.


97

Tabla 25. Condiciones del calibrado para la segunda secuencia.

Conc. experimental



X ± DE (μg/mL)

CV (%)


nominal

0,5 0,042 0,536 0,532 ± 0,006 1,0 106,3 0,041 0,528 1 0,077 0,931 0,934 ± 0,004 0,4 93,4 0,077 0,937 2 0,175 2,049 2,069 ± 0,027 1,3 103,4 0,179 2,088 4 0,336 3,873 4,006 ± 0,189 4,7 100,2 0,359 4,140 8 0,617 7,064 7,620 ± 0,786 10,3 95,2 0,714 8,175

10 0,874 9,990 10,239 ± 0,352 3,4 102,4 0,918 10,488


Para el tercer calibrado (figura 12 y tabla 26), la ecuación fue

Y = 0,087 X + 0,004; r2 = 0,990 p < 0,001




98


0 2 4 6 8 10

Rel

ació

n de

altu

ras

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Figura 12. Recta de calibrado de la tercera secuencia.

Tabla 26. Condiciones del calibrado para la tercera secuencia.

Conc. experimental



X ± DE (μg/mL)

CV (%)


nominal

0,5 0,041 0,512 0,506 ± 0,008 1,6 101,2 0,040 0,500 1 0,081 0,975 0,962 ± 0,018 1,9 96,2 0,079 0,949 2 0,180 2,110 2,094 ± 0,023 1,1 104,7 0,177 2,077 4 0,359 4,168 4,040 ± 0,180 4,5 101,0 0,336 3,913 8 0,710 8,212 7,570 ± 0,908 12,0 94,6 0,599 6,928

10 0,914 10,547 10,293 ± 0,359 3,5 102,9 0,869 10,039



99

En todos los casos se cumplieron los criterios de aceptación establecidos para la validación del método, es decir, las concentraciones calculadas utilizando las rectas teóricas obtenidas estuvieron dentro del 15% del valor nominal y del 20% para el LLOQ.

1.5. Reproductibilidad y precisión

En las tablas 27, 28 y 29 se recogen los valores de la reproductibilidad y precisión de las tres secuencias de trabajo

Tabla 27. Valores de la reproductibilidad y precisión para la primera secuencia.

Conc. experimental

(μg/mL)

Relación de alturas

Conc. teórica (μg/mL)

X ± DE (μg/mL)

CV (%)


nominal

0,5 0,046 0,542 0,493 ± 0,059 11,9 98,6

0,036 0,439

0,034 0,420 0,045 0,534 0,045 0,532

1,5 0,131 1,405 1,437 ± 0,070 4,9 95,8

0,135 1,446

0,124 1,335 0,139 1,491 0,141 1,509

5 0,492 5,089 4,663 ± 0,466 10,0 93,3

0,415 4,309

0,506 5,239 0,409 4,242 0,428 4,434

7,5 0,615 6,351 7,154 ± 0,682 9,5 95,4

0,629 6,494

0,756 7,781 0,749 7,711 0,721 7,431



100

Tabla 28. Valores de la reproductibilidad y precisión para la segunda secuencia.

Conc. experimental

(μg/mL)



X ± DE (μg/mL)

CV (%)


nominal

0,5 0,043 0,541 0,540 ± 0,028 5,1 108,0

0,039 0,494

0,043 0,545 0,045 0,570 0,043 0,548

1,5 0,135 1,589 1,514 ± 0,103 6,8 100,9

0,134 1,576

0,136 1,600 0,119 1,413 0,117 1,390

5 0,421 4,844 4,645 ± 0,320 6,9 92,9

0,368 4,242

0,397 4,564 0,441 5,070 0,391 4,503

7,5 0,576 6,606 7,193 ± 0,367 5,1 95,9

0,653 7,474

0,628 7,195 0,625 7,156 0,658 7,532



101

Tabla 29. Valores de la reproductibilidad y precisión para la tercera secuencia.

Conc. experimental

(μg/mL)



X ± DE (μg/mL)

CV (%)


nominal

0,5 0,039 0,492 0,534 ± 0,024 4,5 106,8

0,043 0,540

0,044 0,549 0,043 0,544 0,043 0,545

1,5 0,133 1,578 1,517 ± 0,104 6,8 101,1

0,135 1,595

0,117 1,391 0,135 1,602 0,119 1,416

5 0,376 4,367 4,674 ± 0,278 6,0 93,5

0,418 4,845

0,389 4,513 0,394 4,580 0,437 5,063

7,5 0,645 7,463 7,173 ± 0,409 5,7 95,6

0,562 6,501

0,652 7,538 0,622 7,196 0,620 7,168


En la tabla 30 se recogen los valores de reproductibilidad y precisión de las tres secuencias, calculados a partir de los controles de calidad 2 (1,5 μg/mL) y 4 (7,5 μg/mL). Se puede ver que el coeficiente de variación está siempre por muy por debajo del 15% permitido.


102

Tabla 30. Reproductibilidad entre días con los controles de calidad (QC).

Conc. experimental

(μg/mL)

Número de muestras

Porcentaje sobre el valor nominal DE CV

(%)

0,5 15 104,5 8,554 8,2 1,5 15 99,3 6,317 6,4 5 15 93,2 6,738 7,2

7,5 15 95,6 6,249 6,5

DE: desviación estándar; CV: coeficiente de variación.


1.6. Estabilidad

Para comprobar la estabilidad de las soluciones stock tras la primera secuencia se inyectaron todas las soluciones patrón y los controles de calidad en fase móvil.

La mejor correlación entre la concentración de flumequina de las soluciones patrón en fase móvil y la relación de las alturas de los picos de flumequina y el estándar interno, el ácido oxolínico, se obtenía si se consideraba una línea recta (figura 13 y tabla 31).

La ecuación de la recta era:

Y = 0,090X + 0,002; r2 = 1 p < 0,001

donde Y = concentración de flumequina en la solución en fase móvil, y



103

Figura 13. Recta para las soluciones patrón de flumequina en fase móvil.

En las tablas 31 y 32 se recogen los valores de las soluciones en fase móvil tanto de los patrones como de los controles de calidad.

Tabla 31. Valores de las soluciones patrón de flumequina y estándar interno en fase móvil.

Soluciones patrón

Conc. experimental

(μg/mL)



Porcentaje sobre el valor nominal

SP1 0,5 0,045 0,520 103,9 SP2 1 0,087 0,989 98,9 SP3 2 0,177 1,992 99,6 SP4 4 0,357 3,990 99,8 SP5 8 0,726 8,086 101,1 SP6 10 0,893 9,945 99,5


0 2 4 6 8 10

Rel

ació

n de

altu

ras

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0


104

Tabla 32. Valores de los controles de calidad (QC) en fase móvil.

Control de calidad (QC)

Conc. experimental

(μg/mL)




SQC1 0,5 0,043 0,497 99,4 SQC2 1,5 0,137 1,547 103,1 SQC3 5 0,452 5,040 100,8 SQC4 7,5 0,684 7,622 101,6

En la tabla 33 se recogen los valores calculados para la estabilidad de las soluciones patrón y controles de calidad en fase móvil. Para valorar esta estabilidad las soluciones se colocaban en el carrusel de inyección, y eran inyectadas al final de cada sesión de las curvas de calibrado.

Tabla 33. Estabilidad de las soluciones patrón y de los controles de calidad en fase móvil.

Soluciones en fase móvil

Conc. experimental




Patrones SP1 0,5 0,045 0,526 105,1 SP2 1 0,089 1,006 100,6 SP3 2 0,180 2,018 100,9 SP4 4 0,359 4,009 100,2 SP5 8 0,727 8,096 101,2 SP6 10 0,893 9,940 99,4

Control de calidad SPQC1 0,5 0,044 0,511 102,2 SPQC2 1,5 0,139 1,565 104,3 SPQC3 5 0,453 5,054 101,1 SPQC4 7,5 0,685 7,637 101,8


105

En la tablas 34 y 35 se recogen los valores calculados para la estabilidad de los controles de calidad en plasma de cerdo a diferentes condiciones de temperatura y a distintos tiempos.

Tabla 34. Estabilidad de los controles de calidad en la matriz biológica (plasma de cerdo) a los distintos tiempos y diferentes temperaturas.

Condiciones Conc

experimental (μg/mL)

Número de muestras


nominal X ± DE

(%) CV (%)

Control de calidad 2 Tª ambiente 24 h 1,5 2 100,5 99,5 ± 8,551 8,6 Tª ambiente 24 h extraído 1,5 2 104,1

4º C 24 h 1,5 2 93,7 4º C 24 h extraído 1,5 2 100,3 -80 º C 24 h 1,5 2 87,5 4º C 48 h 1,5 2 111,1 -80 º C 48 h 1,5 2 104,2 -80 º C 72 h 1,5 2 102,5 -80 º C 5 días 1,5 2 91,6

Control de calidad 4 Tª ambiente 24 h 7,5 2 94,6 95,0 ± 5,877 6,2 Tª ambiente 24 h

extraído 7,5 2 104,5




106

Tabla 35. Tabla resumen de la estabilidad de los controles de calidad en la matriz biológica (plasma de cerdo) a los distintos tiempos y distintas temperaturas.

Condiciones Conc.


Número de muestras


X ± DE

CV (%)

Control de calidad 2 (bajo) 1,5 18 99,5 ± 8,551 8,6

Control de calidad 4 (alto) 7,5 18 95,0 ± 5,887 6,2


En todos los casos, se cumplió que los criterios de aceptación establecidos para la validación del método, es decir, las concentraciones calculadas utilizando las rectas teóricas obtenidas estuvieron dentro del 15% del valor nominal y del 20% para el LLOQ.

2. Validación del método analítico para la determinación de flumequina en contenido intestinal de cerdo


2.1. Selectividad

En los cromatogramas se diferencian claramente el analito (flumequina, tiempo de retención = 5,0 min), el estándar interno (ácido oxolínico, tiempo de retención = 3,6 minutos) y las interferencias del contenido intestinal (tiempo de retención = 3,0 minutos). La selectividad se probó utilizando 6 muestras de contenido intestinal blanco (sin analito ni estándar interno), 2 cada día que se realizaron las curvas de calibrado.

En la figura 14 se muestra un ejemplo de un cromatograma de la matriz blanca (sin analito ni estándar interno).


107


La figura 15 muestra un cromatograma obtenido tras la inyección de la matriz cero (muestra de contenido intestinal con estándar interno, ácido oxolínico).


Por su parte, en la figura 16 se puede observar el cromatograma de una matriz con el analito (flumequina) y el estándar interno (ácido oxolínico).


108

Figura 16.Cromatograma obtenido tras la inyección de la muestra de patrón en contenido intestinal (contenido intestinal con flumequina (10 μg/mL) y ácido oxolínico (10 μg /mL)

Tras la integración de los cromatogramas de las 6 muestras de matriz blanca se comprobó que no había señal en los tiempos de retención correspondientes al analito pero sí en el estándar interno. En todo caso, se cumplió el criterio de calidad establecido: la respuesta debía ser inferior al 20% del LLOQ para el analito y del 5% para el estándar interno.

2.2. Arrastre

En cada una de las secuencias del ensayo, se realizaron 2 inyecciones de fase móvil tras la inyección del patrón más alto de la curva de calibrado, tras el control de calidad más alto, tras la solución patrón en fase móvil más alta y tras la solución stock de control de calidad en fase móvil más alta. En ninguna de ellas aparece señal al tiempo del analito ni del estándar interno.

En la figura 17 se recoge un ejemplo de un cromatograma de la inyección de una fase móvil tras la inyección del patrón más alto de calibrado.


109



Para este método se consideró como límite inferior de cuantificación (LLOQ) la solución patrón de calibración más baja de flumequina (0,5 μg/mL) en contenido intestinal de cerdo. Como se puede comprobar en el cromatograma de la figura 17, se cumplió el criterio de que la señal del analito para este patrón fue al menos 5 veces la señal de la matriz blanca (contenido intestinal de cerdo sin analito ni estándar interno).

Figura 17. Cromatograma obtenido tras la inyección del LLOQ la (contenido intestinal con flumequina (0,5 μg/mL) y ácido oxolínico (10 μg /mL).


110


La mejor correlación entre la concentración de flumequina en contenido intestinal de cerdo y la relación de las alturas de los picos de flumequina y el estándar interno, el ácido oxolínico, se obtenía con una línea recta (figura 18 y tabla 36).


Y = 0,064 X+ 0,005; r2= 0,998; r2 = 0,996 p < 0,001

donde Y = concentración de flumequina en contenido intestinal de cerdo, y



0 2 4 6 8 10

Rel

ació

n de

altu

ras

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0



111


Conc. experimental



X ± DE (μg/mL)

CV (%)


nominal

0,5 0,028 0,513 0,506 ± 0,011 2,1 101,1 0,027 0,498

1 0,057 0,968 0,958 ± 0,015 1,5 95,8

0,056 0,947

2 0,120 1,956 1,968 ± 0,016 0,8 98,4

0,122 1,979

4 0,252 4,018 4,115 ± 0,137 3,3 102,9

0,265 4,212

8 0,528 8,330 8,095 ± 0,332 4,1 101,2

0,498 7,860

10 0,636 10,009 9,954 ± 0,077 0,8 99,5 0,629 9,900



Y = 0,064 X + 0,013; r2 = 0,998 p < 0,001




112


0 2 4 6 8 10

Rel

ació

n de

altu

ras

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0



Conc. experimental



X ± DE (μg/mL)

CV (%)


nominal

0,5 0,021 0,530 0,530 ± 0,001 0,1 105,9 0,021 0,529

1 0,048 0,955 0,941 ± 0,020 2,1 94,1

0,046 0,926

2 0,117 2,030 1,979 ± 0,072 3,6 98,9

0,110 1,928

4 0,247 4,058 4,138 ± 0,114 2,8 103,5

0,257 4,219

8 0,514 8,231 8,007 ± 0,318 4,0 100,1

0,485 7,782

10 0,644 10,265 10,056 ± 0,294 2,9 100,6 0,617 9,848



113


Y = 0,065 X +0,016; r2 = 0,998 p < 0,001




0 2 4 6 8 10

Rel

ació

n de

altu

ras

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0



114


Conc. experimental



X ± DE (μg/mL)

CV (%)


nominal

0,5 0,031 0,503 0,492 ± 0,015 3,0 98,4 0,029 0,482 1 0,058 0,928 0,943 ± 0,021 2,2 94,3 0,060 0,958 2 0,125 1,961 1,966 ± 0,008 0,4 98,3 0,126 1,971 4 0,271 4,199 4,109 ± 0,128 3,1 102,7 0,259 4,018 8 0,506 7,815 8,065 ± 0,354 4,4 100,8 0,538 8,315

10 0,642 9,907 9,857 ± 0,071 0,7 98,6 0,635 9,807




En las tablas 39, 40 y 41 se recogen los valores de la reproductibilidad y precisión de las tres secuencias de trabajo.


115


Conc. experimental

(μg/mL)



X ± DE (μg/mL)

CV (%)


nominal

0,5 0,030 0,546 0,530 ± 0,024 4,4 106,0

0,028 0,508

0,027 0,504 0,031 0,558 0,029 0,534

1,5 0,094 1,545 1,570 ± 0,014 0,9 104,7

0,096 1,574

0,096 1,581 0,096 1,575 0,096 1,573

5 0,308 4,887 4,935 ± 0,148 3,0 98,7

0,319 5,058

0,317 5,032 0,315 5,001 0,296 4,698

7,5 0,443 7,002 7,227 ± 0,130 1,8 96,4

0,464 7,324

0,462 7,303 0,460 7,260 0,459 7,247



116


Conc. experimental

(μg/mL)



X ± DE (μg/mL)

CV (%)


nominal

0,5 0,023 0,565 0,546 ± 0,023 4,2 109,3

0,022 0,549

0,023 0,568 0,020 0,510 0,022 0,540

1,5 0,081 1,473 1,488 ± 0,080 5,4 99,2

0,081 1,476

0,091 1,625 0,079 1,437 0,078 1,428

5 0,307 4,998 5,106 ± 0,203 4,0 102,1

0,320 5,200

0,294 4,801 0,323 5,248 0,325 5,284

7,5 0,458 7,367 7,439 ± 0,181 2,4 99,2

0,448 7,206

0,472 7,571 0,460 7,385 0,478 7,666



117


Conc. experimental

(μg/mL)



X ± DE (μg/mL)

CV (%)


nominal

0,5 0,031 0,511 0,500 ± 0,026 5,2 100,0

0,029 0,471

0,029 0,479 0,033 0,535 0,031 0,504

1,5 0,093 1,468 1,519 ± 0,029 1,9 101,2

0,098 1,539

0,098 1,535 0,097 1,528 0,097 1,524

5 0,313 4,846 4,886 ± 0,139 2,8 97,7

0,318 4,923

0,321 4,962 0,325 5,031 0,301 4,668

7,5 0,467 7,220 7,132 ± 0,096 1,3 95,1

0,452 6,991

0,467 7,223 0,460 7,108 0,461 7,117


118

En la tabla 42 se recogen los valores de reproductibilidad y precisión de las tres secuencias. Los controles de calidad utilizados fueron el 2 (1,5 μg/mL) y el 4 (7,5 μg/mL), situándose el coeficiente de variación siempre por muy por debajo del 15% permitido.


Conc. experimental

(μg/mL)

Número de muestras


(%)

0,5 15 105,1 5,986 5,7 1,5 15 101,7 3,853 3,8 5 15 99,5 3,640 3,7

7,5 15 96,9 2,476 2,6



2.6. Estabilidad

Para comprobar la estabilidad de las soluciones stock tras la primera secuencia se inyectaron todas las soluciones patrón y los controles de calidad en fase móvil.



119


Y = 0,091 X – 0,002; r2 = 1,000 p < 0,001






0 2 4 6 8 10

Rel

ació

n de

altu

ras

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0


120


Soluciones patrón

Conc. experimental

(μg/mL)




SP1 0,5 0,468 0,470 94,1 SP2 1 0,946 0,954 95,4 SP3 2 2,052 2,062 103,1 SP4 4 4,048 4,065 101,6 SP5 8 7,975 7,996 100,0 SP6 10 9,956 9,995 99,9



Conc. experimental

(μg/mL)




SQC1 0,5 0,468 0,472 94,5 SQC2 1,5 1,558 1,568 104,5 SQC3 5 5,004 5,019 100,4 SQC4 7,5 7,413 7,425 99,0

En la tabla 45 se recogen los valores calculados para la estabilidad de las soluciones patrón y controles de calidad en fase móvil. Para valorar esta estabilidad se colocaban en el carrusel de inyección las soluciones, siendo inyectadas al final de cada sesión de las curvas de calibrado.


121



Conc. experimental




nominal



Por su parte, en la tablas 46 y 47 se recogen los valores calculados para la estabilidad de los controles de calidad en contenido intestinal de cerdo a diferentes condiciones de temperatura y a distintos tiempos.


122

Tabla 46. Estabilidad de los controles de calidad en la matriz biológica (contenido intestinal de cerdo) a los distintos tiempos y diferentes temperaturas.

Condiciones Conc


Número de

muestras


nominal X ± DE

(%) CV (%)

Control de calidad 2

Tª ambiente 24 h 1,5 2 93,9 96,8 ± 4,098 4,2 Tª ambiente 24 h extraído 1,5 2 98,9


Control calidad 4

Tª ambiente 24 h 7,5 2 104,6 96,1 ± 5,961 6,2 Tª ambiente 24 h





123

Tabla 47. Tabla resumen de la estabilidad de los controles de calidad en la matriz biológica (contenido intestinal de cerdo) a los distintos tiempos y distintas temperaturas.

Condiciones Conc.


Número de muestras


X ± DE

CV (%)





3. Validación del método analítico para la determinación de flumequina en pared intestinal de cerdo


3.1. Estabilidad

En la figura 22 se muestra un ejemplo de un cromatograma de la matriz blanca (sin analito ni estándar interno). En él se puede diferenciar claramente el analito (flumequina, tiempo de retención = 5,0 min), el estándar interno (ácido oxolínico, tiempo de retención = 3,6 minutos) y las interferencias del pared intestinal (tiempo de retención = 3,2 minutos). La selectividad se probó utilizando 6 muestras de pared intestinal blanco (sin analito ni estándar interno), 2 cada día que se realizaron las curvas de calibrado.


124


La figura 23 muestra un cromatograma obtenido tras la inyección de la matriz cero (muestra de pared intestinal con estándar interno, ácido oxolínico).


Por su parte, en la figura 24 se puede ver el cromatograma de una matriz con el analito (flumequina) y el estándar interno (ácido oxolínico).


125

Figura 24.Cromatograma obtenido tras la inyección de la muestra de patrón en pared intestinal (plasma con flumequina (10 μg/mL) y ácido oxolínico (10 μg /mL).

Tras la integración de los cromatogramas de las 6 muestras de matriz blanca se comprobó que no había señal en los tiempos de retención correspondientes al analito pero sí en el estándar interno. En todo caso se cumplió el criterio de calidad establecido: la respuesta debía ser inferior al 20% del LLOQ para el analito y del 5% para el estándar interno.

3.2. Arrastre

En cada una de las secuencias del ensayo, se realizaron 2 inyecciones de fase móvil tras la inyección del patrón más alto de la curva de calibrado, tras el control de calidad más alto, tras la solución patrón en fase móvil más alta y tras la solución stock de control de calidad en fase móvil más alta. En ninguna de ellas aparece señal al tiempo del analito ni del estándar interno.

En la figura 25 se muestra un cromatograma correspondiente a la inyección de una fase móvil tras la inyección del patrón más alto de calibrado.


126



Para este método se consideró como límite inferior de cuantificación (LLOQ) la solución patrón de calibración más baja de flumequina (0,5 μg/mL) en pared intestinal de cerdo. Como se puede comprobar en el cromatograma que se presenta en la figura 26, se cumplió el criterio de que la señal del analito para este patrón fue al menos 5 veces la señal de la matriz blanca (pared intestinal de cerdo sin analito ni estándar interno).

Figura 26.Cromatograma obtenido tras la inyección del LLOQ la (pared intestinal con flumequina (0,5 μg/mL) y ácido oxolínico (10 μg /mL).


127


La mejor correlación entre la concentración de flumequina en pared intestinal de cerdo y la relación de las alturas de los picos de flumequina y el estándar interno, el ácido oxolínico, se obtenía con una línea recta (figura 27 y tabla 48).


Y = 0,098 X + 0,008; r2 = 0,998 p < 0,001

donde Y = concentración de flumequina en pared intestinal de cerdo, y



0 2 4 6 8 10

Rel

ació

n de

altu

ras

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0



128


Conc. experimental



X ± DE (μg/mL)

CV (%)


nominal

0,5 0,047 0,564 0,554 ± 0,006 1,2 110,8 0,046 0,555

1 0,093 1,030 1,022 ± 0,026 2,6 102,2

0,091 1,009

2 0,196 2,081 2,073 ± 0,059 2,9 103,7

0,194 2,057

4 0,333 3,479 3,751 ± 0,362 9,6 93,8

0,385 4,009

8 0,793 8,173 8,167 ± 0,180 2,2 102,1

0,775 7,993

10 0,963 9,905 9,959 ± 0,030 0,3 99,6 0,985 10,135



Y = 0,098 X + 0,003; r2 = 0,999 p < 0,001




129


0 2 4 6 8 10

Rel

ació

n de

altu

ras

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0



Conc. experimental



X ± DE (μg/mL)

CV (%)


nominal

0,5 0,049 0,527 0,539 ± 0,006 1,2 107,9 0,049 0,532 1 0,095 1,004 1,022 ± 0,018 1,8 102,2 0,097 1,021 2 0,198 2,055 2,064 ± 0,038 1,8 103,2 0,201 2,086 4 0,390 4,008 3,772 ± 0,322 8,5 94,3 0,353 3,633 8 0,781 7,998 8,138 ± 0,170 2,1 101,7 0,797 8,163

10 0,990 10,132 9,959 ± 0,036 0,4 99,6 0,969 9,922



130


Y = 0,087 X + 0,021; r2 = 0,987 p < 0,001




0 2 4 6 8 10

Rel

ació

n de

altu

ras

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0



131

Tabla 50. Condiciones del calibrado para la tercera secuencia.

Conc. experimental



X ± DE (μg/mL)

CV (%)


nominal

0,5 0,028 0,565 0,574 ± 0,007 1,2 114,8 0,027 0,556 1 0,058 0,910 0,932 ± 0,008 0,9 93,2 0,056 0,881 2 0,170 2,191 2,196 ± 0,072 3,3 109,8 0,167 2,165 4 0,305 3,744 3,582 ± 0,223 6,2 89,5 0,281 3,467 8 0,727 8,598 8,421 ± 0,060 0,7 105,3 0,725 8,573

10 0,771 9,100 9,809 ± 0,314 3,2 98,1 0,857 10,089




En las tablas 51, 52 y 53 se recogen los valores de la reproductibilidad y precisión de las tres secuencias de trabajo.


132


Conc. experimental

(μg/mL)



X ± DE (μg/mL)

CV (%)


nominal

0,5 0,047 0,561 0,524 ± 0,028 5,4 104,8

0,046 0,551

0,044 0,528 0,041 0,497 0,044 0,534

1,5 0,137 1,480 1,477 ± 0,088 5,9 98,5

0,118 1,286

0,142 1,532 0,133 1,442 0,142 1,535

5 0,457 4,749 4,743 ± 0,199 4,2 94,9

0,431 4,476

0,455 4,721 0,454 4,714 0,428 4,448

7,5 0,656 6,777 7,383 ± 0,218 3,0 98,4

0,698 7,200

0,704 7,270 0,723 7,464 0,715 7,373



133


Conc. experimental

(μg/mL)



X ± DE (μg/mL)

CV (%)


nominal

0,5 0,047 0,546 0,528 ± 0,027 5,1 105,6

0,048 0,562

0,041 0,490 0,045 0,535 0,045 0,526

1,5 0,121 1,303 1,469 ± 0,086 5,9 97,9

0,139 1,489

0,144 1,539 0,142 1,525 0,134 1,440

5 0,436 4,517 4,718 ± 0,206 4,4 94,4

0,463 4,801

0,459 4,756 0,429 4,453 0,457 4,739

7,5 0,706 7,271 7,351 ± 0,216 2,9 98,0

0,707 7,290

0,666 6,866 0,723 7,447 0,724 7,456



134


Conc. experimental

(μg/mL)



X ± DE (μg/mL)

CV (%)


nominal

0,5 0,020 0,471 0,517 ± 0,032 6,2 103,4

0,017 0,441

0,019 0,459 0,023 0,501 0,017 0,443

1,5 0,121 1,629 1,611 ± 0,062 3,8 107,4

0,109 1,490

0,119 1,612 0,120 1,621 0,114 1,557

5 0,382 4,633 4,689 ± 0,130 2,8 93,8

0,389 4,716

0,411 4,967 0,389 4,716 0,382 4,627

7,5 0,628 7,460 7,285 ± 0,161 2,2 97,1

0,632 7,506

0,633 7,514 0,641 7,606 0,607 7,213


En la tabla 54 se recogen los valores de reproductibilidad y precisión de las tres secuencias, calculados a partir de los controles de calidad 2 (1,5 μg/mL) y 4 (7,5 μg/mL). En la tabla se puede ver que el coeficiente de variación está siempre por muy por debajo del 15% permitido.


135


Conc. experimental

(μg/mL)

Número de muestras


(%)

0,5 15 104,6 5,447 5,2 1,5 15 101,3 6,658 6,6 5 15 94,3 3,391 3,6

7,5 15 97,9 2,533 2,6



3.6. Estabilidad

Con el fin de comprobar la estabilidad de las soluciones stock tras la primera secuencia se inyectaron todas las soluciones patrón y los controles de calidad en fase móvil.



Y = 0,090 X - 0,001; r2 = 1,000 p < 0,001




136


0 2 4 6 8 10

Rel

ació

n de

altu

ras

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0




Soluciones patrón

Conc. experimental

(μg/mL)




SP1 0,5 0,046 0,522 104,4 SP2 1 0,090 1,007 100,7 SP3 2 0,180 2,016 100,8 SP4 4 0,360 4,007 100,2 SP5 8 0,726 8,083 101,0 SP6 10 0,890 9,905 99,1


137



Conc. experimental

(μg/mL)




SQC1 0,5 0,044 0,504 100,7

SQC2 1,5 0,140 1,569 104,6

SQC3 5 0,452 5,062 101,2

SQC4 7,5 0,685 7,628 101,7

En la tabla 58 se recogen los valores calculados para la estabilidad de las soluciones patrón y controles de calidad en fase móvil. Para valorar esta estabilidad las soluciones se colocaban en el carrusel de inyección, inyectándose al final de cada sesión de las curvas de calibrado.



Conc. experimental




nominal




138

En la tablas 59 y 60 se recogen los valores calculados para la estabilidad de los controles de calidad en pared intestinal de cerdo a diferentes condiciones de temperatura y a distintos tiempos.

Tabla 59. Estabilidad de los controles de calidad en la matriz biológica (pared intestinal de cerdo) a los distintos tiempos y diferentes temperaturas.

Condiciones Conc.


Número de

muestras

Porcentaje sobre el

valor nominal

X ± DE (%)

CV (%)

Control de calidad 2 Tª ambiente 24 h 1,5 2 85,6 97,9 ± 10,395 10,6 Tª ambiente 24 h extraído 1,5 2

94,3


Control calidad 4 Tª ambiente 24 h 7,5 2 88,2 92,6 ± 4,241 4,6 Tª ambiente 24 h





139

Tabla 60. Tabla resumen de la estabilidad de los controles de calidad en la matriz biológica (pared intestinal de cerdo) a los distintos tiempos y distintas temperaturas.

Condiciones Conc.


Número de muestras


X ± DE

CV (%)




En todos los casos, se cumplieron los criterios de aceptación establecidos para la validación del método, es decir, las concentraciones calculadas utilizando las rectas teóricas obtenidas estuvieron dentro del 15% del valor nominal y del 20% para el LLOQ.

4. Determinación de flumequina en plasma, contenido intestinal y pared intestinal de colon de cerdo

Una vez validados cada uno de los métodos empleados para la identificación y cuantificación en plasma, contenido intestinal y pared intestinal de flumequina, se determinó la concentración de este principio activo en cada una de las porciones del colon de todos los animales.

Por lo que respecta a las muestras de plasma, no se determinaron concentraciones detectables del compuesto. En la tabla 61 se refleja que en todos los casos las concentraciones están por debajo del límite de cuantificación del método validado.


140

Tabla 61. Concentraciones de flumequina (µg/mL) determinadas en muestras de plasma de cerdo.

Días de sacrificio Animal

Concentración de flumequina en plasma (µg/mL)

3

72 No cuantificado

65 No cuantificado

66 No cuantificado

75 No cuantificado

6

64 No cuantificado

244 No cuantificado

71 No cuantificado

74 No cuantificado

7

67 No cuantificado

69 No cuantificado

68 No cuantificado

70 No cuantificado

Al analizar las muestras de contenido intestinal de cada segmento de colon de los 12 cerdos se pudo cuantificar flumequina en alguna de las muestras, como se recoge en la tabla 62. En ella se puede ver que el compuesto se detecta en tres de los cerdos sacrificados el día 3, si bien no en todos los segmentos del colon; sólo en dos de los sacrificados el día 6 del estudio, y no se detecta en ningún segmento de los cerdos sacrificados el día 7.

En las figuras 31 y 32 se representan las concentraciones de flumequina determinadas en el contenido intestinal del colon en los animales sacrificados los días 3 y 5.


141

Tabla 62. Concentraciones de flumequina (µg/g) determinadas en muestras de contenido intestinal de colon de cerdo.

Días de sacrificio Animal

Concentración de flumequina en contenido intestinal de colon

(µg/g)

3

Ascendente No cuantificado 72 Trasverso 1,646

Descendente 2,837 Ascendente No cuantificado

65 Trasverso No cuantificado Descendente No cuantificado Ascendente No cuantificado

66 Trasverso 1,498 Descendente 1,137 Ascendente No cuantificado

75 Trasverso 0,947 Descendente No cuantificado

6

Ascendente No cuantificado 64 Trasverso 0,992

Descendente 1,190 Ascendente No cuantificado

244 Trasverso 0,952 Descendente 0,944 Ascendente No cuantificado


74 Trasverso No cuantificado Descendente No cuantificado

7

Ascendente No cuantificado 67 Trasverso No cuantificado

Descendente No cuantificado Ascendente No cuantificado





142

Figura 31. Concentraciones de flumequina (µg/g) determinadas en muestras de contenido intestinal de colon de cerdos sacrificados el día 3.

Figura 32.Concentraciones de flumequina (µg/g) determinadas en muestras de contenido intestinal de colon de cerdos sacrificados el día 5.

Con

cent

raci

ón (µ

g/g)

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Animal 72Animal 66Animal 75

Ascendente Descendente Trasverso C

once

ntra

ción

(µg/

g)

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Animal 64Animal 244

3 0

Ascendente Descendente Trasverso


143

Finalmente, por lo que respecta a las muestras de pared intestinal, no se obtenían concentraciones cuantificables de flumequina en las muestras de ninguno de los segmentos del colon de los cerdos objeto de estudio, como queda reflejado en la tabla 63, porque en ningún caso las concentraciones llegaron al límite inferior de cuantificación de 0,5 µg/mL.

La parte inicial de este estudio se ha centrado en la validación de tres métodos que permitieran la determinación de flumequina en plasma, pared intestinal y contenido intestinal de cerdo. La legislación actual obliga a validar los métodos para la determinación de cualquier principio activo en el animal y muestra de destino. En el momento actual es necesario seguir las recomendaciones de la Agencia Europea del Medicamento recogidas en la Guía EMEA/CHMP/EWP/192217/2009 (European Medicines Agency, 2011).

En nuestro estudio, el límite de cuantificación es 0,5 µg/mL en los tres tipos de muestra. El método cumple con todos los criterios requeridos en la Guía EMEA/CHMP/EWP/192217/2009 (European Medicines Agency, 2011).

Por lo que respecta al objetivo de este estudio, que era determinar las concentraciones que alcanzaba la flumequina en plasma, contenido intestinal y pared intestinal de colon con el fin de comprobar si resultaría eficaz para tratar procesos infecciosos que asientan en esta parte del intestino del cerdo, debe señalarse que las enfermedades infecciosas gastrointestinales son relativamente frecuentes en el ganado porcino, y constituyen la principal causa de pérdidas económicas (directas e indirectas) en esta industria. Entre los agentes patógenos que causan estos procesos se incluyen Escherichia coli, Salmonella spp., Clostridium spp., Lawsonia intracellularis o Brachyspira hyodysenteriae y Brachyspyra pilosicoli, y pueden afectar a un grupo de edad concreto (p. ej., las enfermedades neonatales) o bien a todos los animales de la explotación. En esta especie, se considera que a nivel intestinal existen 3 regiones con significado clínico: la parte inicial e intermedia del intestino delgado (duodeno y yeyuno), para infecciones provocadas por E. coli; la parte final del intestino delgado (íleon) para las infecciones por L. intracellularis y, en el intestino grueso, el colon para B. hyodysenteriae y B. pilosicoli (Burch, 2012).


144

Tabla 63. Concentraciones de flumequina (µg/g) determinadas en muestras de pared intestinal de colon de cerdo.

Días de sacrificio Animal Concentración de flumequina en pared intestinal (colon)

(µg/g)

3






6






7

Ascendente No detectado 67 Trasverso No cuantificado

Descendente No detectado Ascendente No cuantificado





145

En esta especie, además, las posibilidades de tratamiento y control de estos procesos gastrointestinales de origen infeccioso son relativamente limitadas. Aunque el uso de los antimicrobianos (de forma terapéutica, profiláctica o metafiláctica) sigue siendo esencial para mantener la salud, el bienestar y la productividad de estos animales, se dispone de otras medidas como vacunas, el control de la dieta o diversas opciones de manejo (control de vectores, protocolos de limpieza y desinfección y sistemas todo dentro-todo fuera).

En el caso de los antibacterianos, la elección de uno u otro es una decisión de gran importancia que debe tomar el veterinario, y debe basarse, entre otros, en criterios microbiológicos como el microorganismo a tratar o la sensibilidad de éste al principio activo en cuestión; criterios farmacológicos como las características farmacocinéticas del compuesto, la vía de administración más adecuada o las reacciones adversas que pueda producir (en general, su administración va a modificar de forma importante la composición de la microbiota digestiva y puede incrementar los fenómenos de resistencia); o criterios puramente económicos como el coste del tratamiento.

La medicación por vía oral, bien administrada en el agua de bebida bien en forma de pienso medicamentoso, se considera que es efectiva para tratar infecciones intestinales, siempre que se alcancen concentraciones eficaces en el contenido intestinal. La administración en el agua de bebida tiene además la ventaja sobre el pienso medicamentoso que en este último la ingestión puede verse reducida como consecuencia de la anorexia que suele aparecer en los animales enfermos.

Aunque la farmacocinética de la flumequina se ha estudiado en diversas especies animales, los estudios realizados en la especie que nos ocupa son muy escasos. En la bibliografía revisada tan solo hemos encontrado un estudio (Villa et al., 2005a) en el que se describa su farmacocinética tras administración intravenosa o intramuscular en el ganado porcino, no existiendo datos acerca de su comportamiento farmacocinético o de su distribución tisular tras su administración oral. Como señalan Villa et al. (2005a), entre las razones que explican por qué son escasos en general los datos acerca de la farmacocinética de los


146

antibacterianos en el ganado porcino se encuentra la dificultad de insertar un catéter intravenoso para la toma de muestras.

En nuestro estudio, tras la administración de flumequina por vía oral en el agua de bebida a la dosis recomendada (12 mg/kg/día durante 5 días) no se alcanzaron concentraciones cuantificables de este compuesto en los días 3, 6 y 7 ni en el plasma ni en la pared intestinal. Goren et al. (1982) administraron este compuesto en el agua de bebida a pollos broiler durante 5 días, comprobando que con una dosis de 6 mg/kg no se detectaba el principio activo el día 2 de la administración. Cuando las dosis empleadas fueron de 12; 18 y 24 mg/kg, las concentraciones plasmáticas el día 2 tomaron valores de 0,5-0,8 µg/mL; 0,8-1,3 µg/mL y 1,2-1,9 µg/mL. Por su parte, Ferraresi et al. (2013) administraron este compuesto a pavos a una dosis media de 12 mg/kg en el agua de bebida durante 5 días (pulso de 10 h), situándose la concentración de principio activo en aproximadamente 0,5 µg/mL en el día 6, y por debajo de 1 µg/mL ese mismo día si la dosis media administrada era de 20 mg/kg, también durante 5 días.

Por lo que respecta a la presencia de flumequina en las muestras de pared intestinal, la ausencia de principio activo a este nivel podría relacionarse con el efecto de primer paso intestinal. Dorrestein et al. (1983) indicaron que la flumequina sufría el efecto de primer paso en palomas, que podría deberse bien a su metabolización en la mucosa intestinal o a nivel hepático, o bien a su inactivación en el tracto digestivo antes de su absorción. Este efecto, sin embargo, no se ha observado en el ganado vacuno (Ziv et al., 1986), y hasta donde nosotros hemos encontrado, no se ha descrito en el ganado porcino. Los transportadores intestinales pueden ser un mecanismo de eliminación importante en el caso de las fluoroquinolonas, lo que resultaría en una secreción activa desde el torrente sanguíneo al intestino (Martinez et al., 2006). Este mecanismo de transporte se ha descrito para diversos compuestos como ciprofloxacino, norfloxacino y perfloxacino (Griffiths et al., 1994; Dautrey et al., 1999), y puede implicar diferentes transportadores: en el caso del ciprofloxacino, está mediado por un transportador de cationes y/o aniones orgánicos, mientras que esparfloxacino es un sustrato de la glucoproteína P (Dautrey et al., 1999). Ninguno de estos mecanismos ha sido descrito tampoco para la flumequina.


147

Finalmente, y por lo que respecta a las concentraciones determinadas en contenido intestinal en nuestro estudio, en aquellos animales en los que se llegó a determinar flumequina (0,944-2,837 µg/g), estas concentraciones son claramente inferiores a las CIM establecidas para los microrganismos patógenos aislados en el ganado porcino responsables de infecciones intestinales. Así, las concentraciones determinadas no resultarían eficaces frente al principal microorganismo patógeno causante de infecciones a nivel de colon/intestino grueso en el cerdo, B. hyodysenteriae (MIC50 = 50 µg/mL; MIC90 = 100 µg/mL) (Aller-Morán et al., 2015), pero tampoco frente a otros microorganismos responsables de infecciones intestinales como E. coli (MIC50 = 32 µg/mL; MIC90 = 64 µg/mL) (Villa et al., 2005a). El compuesto presentaría cierta eficacia frente a Salmonella entérica (MIC50 = 2 µg/mL; MIC90 = 8 µg/mL), en un animal y en la parte inicial del colon.

El estudio realizado ha permitido determinar las concentraciones de flumequina que se alcanzan en el colon en la especie porcina tras su administración a la posología recomendada. Creemos que sería necesario realizar nuevos estudios que lo completen y en los que se defina la farmacocinética de este compuesto en el cerdo tras su administración por vía oral, lo que ayudará a mejorar los resultados del tratamiento con este principio activo y a reducir las posibilidades de desarrollo de resistencias.

Conclusiones

Conclusiones

149

1. Se han validado 3 métodos de determinación de flumequina en el plasma y en la pared intestinal y contenido del colon de cerdo. Estos métodos se han validado para el rango de concentraciones de 0,5 a 100 µg/mL.

2. Los métodos cumplen con los parámetros de calidad representados por: selectividad, arrastre, límite inferior de cuantificación (LLOQ), curva de calibrado, reproductibilidad y precisión y estabilidad establecidos en la Guia EMEA/CHMP/EWP/192217/2009.

3. Tras la administración de flumequina a cerdos a la dosis de 12 mg/kg en el agua de bebida durante 5 días, no se alcanzaron concentraciones cuantificables de flumequina en plasma a los 3, 6 y 7 días del estudio

4. Tras el mismo tratamiento, no se alcanzaron concentraciones cuantificables de flumequina en la pared intestinal de colon de los cerdos a los 3, 6 y 7 días del estudio.

5. Sin embargo, con el mismo tratamiento, las concentraciones flumequina en el contenido del colon oscilaron entre 0,944 y 2,837 µg/g en colon descendente y entre 0,952 y 1,646 µg/g en colon trasverso en los días 3 y 6 tras la primera administración, no observando niveles cuantificables en el colon ascendente. No se alcanzaron concentraciones cuantificables de flumequina a los 7 días del estudio en ninguno de los tramos del colon analizados.

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