"Estudio comparativo de los métodos de análisis para

anticuerpos anti-proteínas citrulinadas"

Dra. J. Rodríguez y Dra. A. Carbonell (H. General )Dra. P. Laporta y FIR L. Aranda (H. Clínico)

Dra. RM. Pascual y Dra. MJ. Moreno (H. La Fe) Dr. Jose María López-Ortega (H. Dr. Peset)

Exploraciones del laboratorio para el diagnóstico de la artritis reumatoide

• Están incluidos en los nuevos criterios de ACR/EULAR de clasificación de AR los siguientes análisis:– Velocidad de sedimentación globular (VSG)– Proteína C reactiva (PCR)– Factor reumatoide– Anticuerpos anti-proteína cíclica citrulinada

Marcadores serológicos de A. R.

• El factor reumatoide está incluido en los criterios diagnósticos de AR desde 1987.

• Pero es un marcador tardío y poco específico

Patrón típico de anti-Factor perinuclear. Célula de la mucosa oral. (1964)

Evolución histórica de los anticuerpos anti-proteína citrulinada (APCA)

1964 APF 1979 AKA 1993 AFA 1999 ACA

Actualidad CCP anti-Sa

etc.

Ac. Anti-factor perinuclear

Mandema y

Nienhuis

Ac. Anti-queratina

Young et al.

Ac. Anti-filagrina

Girbal et al.

Ac. Anti-citrulina

Serrer et al

Ac. Anti-péptido cíclico citrulinadoSchellekens

et al.

¡¡ESTANDARIZACIÓN!!!

Anticuerpos frente a isoformas específicas de proteínas citrulinadas

• CCP-1: Anticuerpos frente a péptidos derivados de la proteína profilagrina/filagrina.

• CCP-2: Anticuerpos frente a antígeno más inmunogénico a partir del estudio de gran cantidad de péptidos en el suero de pacientes con AR.

• CCP-3: Cambio de la estructura para aumentar el epítopo expuesto y su inmunorreactividad.

Demoruelle, MK et al. Curr Athritis Rheum 2013; 2243-2252

Otros autoantígenos

• Vimentina cíclica citrulinada (VCM): ¿Se asocia a enfermedad más agresiva?

• Ra33: Presente en el 25-30% de los pacientes con ACPA negativo: ¿asociado con enfermedad más leve?

• Antígenos carbamilados, homocitrulina: Presente en 15-30% de pacientes con ACPA negativo. ¿Asociado a enfermedad muy agresiva?

• Los análisis de ACPA multiplex array no tienen más valor diagnóstico y dificultan la interpretación de los resultados.

Trouw LA, et al. Autoimmun Rev. 2012;12:318-322

van Heemst, et al. Arthritis Research & Therapy (2015) 17:276

Citrulinización

PADs)

Arginina Citrulina

Enzima arginina desaminasa

Presente en otros procesos inflamatorios, infecciosos y degenerativos

Marcadores serológicos de A. R.

Anticuerpos CCP-2

� Sensibilidad 80 %� Especificidad 94-99 %� Precoz y detectable en pacientes FR Ø� Incluido como criterio de la clasificación de AR

de 2010 por el American College of Rheumatology (ACR) y de la European League Against Rheumatism (EULAR)

� Otros Ac: MCV, Sa, CCP3 etc� No sirven para controlar la evolución del

paciente…¿o sí?

Schellekens GA, et al. Arthritis Rheum. 2000;43:155-163

Otros mecanismos que influyen en los niveles de ACPA

• HLA-DRB1 y los alelos del epítopo compartido

• Reumatismo palindrómico.

• Tabaquismo• Infección periodontal Porphyromonas

gingivalis. (α-enolasa)• Tuberculosis: Pueden encontrarse ACPA + y

debería controlarse con un péptido no citrulinado. (Prasanthi Kakumanu)

Kokkonen H, et al. Arthritis Res Ther. 2015;17:125

Objetivos

1. Dado que no existe un estándar internacional para el análisis de ACPA , pretendemos comparar los resultados obtenidos mediante los métodos de 46 laboratorios distribuidos por toda la geografía española.

2. Identificar las causas de las diferencias si existieran y siempre que sea posible.

• Se seleccionaron 29 pacientes diagnosticados de AR y con niveles altos de APCA, medios y bajos.

• 21 mujeres con una mediana de edad de 55 años.• 8 varones con una mediana de edad de 58 años• Media de edad total 58• Fueron clasificados según los criterios de 2010

(ACR/EULAR) y en base a los datos del resumen de la historia clínica.

Selección de pacientes

Pacientes seleccionados

2

1

3

2

4

2

4

2 2

4

2

0

1

2

3

4

5

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

De los 29 pacientes, 14 pacientes cumplían los criterios de clasificación de AR de 2010 con una puntuación superior a 6/10.

ACPA analizados por los laboratorios participantes

CCP-2; 29

CCP-3; 13

CCPHS; 1

MCV; 1

CCPAESKU; 1

CCP-2 CCP-3 MCV CCPAESKU CCPHS

Métodos análisis utilizados

CLIA; 13

ELISA; 14

FPIA; 17

Multiplex; 2

CLIA ELISA FPIA Multiplex

Analizadores utilizados

17

8

5

3 32 2 2

12

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Imm

unoCap2

50

Zenit-

Ra

BioFlas

hXan

tus E

LISA

Tritur

us

Dynex

Tech

nologie

s

DS2

Alegria

Zenit-

Up

Bioplex

United Kingdom National External Quality Assessment Service

Premisas para el análisis de resultados

• Asumimos como un valor “dudoso” aquel que está entre el punto de corte y tres veces su valor (criterios 2010).

• Asumimos como positivo alto, el que está 3 veces por encima del punto de corte (criterios 2010).

• Asumimos como valor teórico verdadero el obtenido por la mayoría.

ResultadosPacientes con puntuación ≥ 6

MTX + etanercept

MTX + sulfasalazina

Bio

Flash

Zenit-

Ra

Imm

unoCap

250

EuroD

iagnost

ica

3 IN

OVA

Bio

plex

EUR

OIM

MU

NA

esku

MC

V

Ale

gria C

CPhs

Men

arin

i ELIS

APuntu

ació

n

1 0 11 4 9 19 2 1 2,88 22 10 12 6

2 111 32 51 79 45 20 14 39,3 34 59 125 8

5 0 0 1 6 3 0 1 2,12 22 7 1 6

8 298 58 131 196 263 64 38 116 58 99 470 9

9 2661 428 651 1647 293 2130 141 372 121 123 1402 9

12 147 23 24 29 80 20 9 15,6 44 25 108 8

15 2482 564 909 2204 340 5145 182 516 606 396 6564 10

16 265 232 477 770 297 260 109 246 21 44 673 10

17 2257 492 1019 1759 344 1344 200 537,8 1000 224 1819 7

18 55 198 533 614 316 28 117 393 81 92 641 7

19 1879 555 751 1872 342 1264 200 475 1000 117 3540 6

20 2152 578 900 1859 344 2980 200 497 1000 394 23 9

23 403 279 605 139 342 280 49 286 18 860 195 6

25 97 63 79 118 246 217 20 69,6 33 96 161 9

27 619 316 692 909 334 929 126 407 217 57 1197 7

N<20 N<5 N<7 N<25 N<20 N<3 N<5 N<20 N<20 N<25

ResultadosPacientes con puntuación < 6

Con CCP: 3

No cumplen criterios

Bio

Flash

Zenit-

Ra

Imm

unoCap

250

EuroD

iagnost

ica

3 IN

OVA

Bio

plex

EUR

OIM

MU

NA

esku

MC

V

Ale

gria C

CPhs

Men

arin

i ELIS

APuntu

ació

n

3 4644 533 1296 2285 339 1427 200 263 1000 220 4762 34 0 11 10 21 6 5 4 6,64 12 31 28 46 0 0 1 6 2 0 1 0,42 5 4 15 27 3706 365 603 1179 340 1299 136 301 1000 285 4161 0

10 8 0 1 4 11 3 1 0,36 11 13 0 011 32 18 16 25 132 8 6 24,8 32 43 60 313 14 10 15 14 32 1 3 8,97 10 14 54 514 0 0 1 7 4 0 2 2,78 17 14 3 521 0 0 1 5 2 0 1 1,55 7 5 1 222 9 0 1 4 2 0 2 1,22 12 6 1 224 0 81 121 180 24 266 32 62,6 54 23 261 426 0 2 1 5 1 0 2 2,12 12 18 4 128 0 0 1 4 1 1 2 0,92 10 6 1 429 0 0 1 4 1 2 1 1,05 8 1 1 4

N<20 N<5 N<7 N<25 N<20 N<3 N<5 N<20 N<20 N<25

Observaciones

• Vimentina (MCV) parece tener defecto de sensibilidad. Sólo un laboratorio participante.

• CCPhs es muy parecido a MCV.• No hemos encontrado diferencias entre CCP-2 y

CCP-3.• Probable interferencia de CCP-2 con TBC(?)• No se encuentran diferencias entre

enzimoinmunoanálisis y quimioluminiscencia.

Efecto de los fármacos biológicos en los niveles de ACPA

S Modi, M Soejima, M C Levesque, Clin Exp Immunol. 2013 Jul; 173(1): 8-17

• Rituximab– Depleciona los linfocitos B (CD20+): disminuye el

FR y anti-CCP.

Efecto de los fármacos biológicos en los niveles de ACPA

• Anti-TNFα– Reduce FR . No es concluyente para anti-CCP.

Efecto de los fármacos biológicos en los niveles de ACPA

Efecto de los fármacos biológicos en los niveles de ACPA

• Inhibidores JAK (Tofacitinib)– En modelos animales se ha visto que disminuye IL-17

e IL-6. Podría disminuir la producción de ACPA.

• Modificadores de la enfermedad: metotrexato, sulfasalazina, hidroxicloroquina– Disminuyen APCA en pacientes con enfermedad

temprana.– Disminuyen FR con la mejoría de la enfermedad.

• Anti-IL-6 (Tocilizumab)– Reduce los niveles totales de IgG e IgA.– No reduce FR. ACPA no informado. (Roll et al.)

• Abatacept– Parece reducir ACPA (Yin H. et al.)

– FR y ACPA+, responden mejor a Abatacept (Gotemberg et al.)

Efecto de los fármacos biológicos en los niveles de ACPA

Abatacept es una proteína quimérica que consiste en un dominio extracelular de la molécula receptora humana CTLA4 (CD 152) y la región constante de la cadena pesada de la IgG1.

Paciente 15

• Puntuación 10/10• Tratamiento: leflunomida,

corticoides, oseína hidroxiapatita.

• Actualmente libre de síntomas

Paciente 16

• Puntuación 10/10• Tratamiento actual:

corticoides, leflunomida, certolizumab

• Actualmente libre de síntomas

• FR negativo

Paciente 18

• Puntuación 7/10• Tratamiento actual:

metotrexato, corticoides• FR se mantiene elevado

(>100/14)• Actualmente libre de

síntomas

Mujer de 47 años

Mayo 2014 Diag: Epiescleritis, AR e hipotiroidismo. Mantoux +

Tto. Isoniazida 6 meses, eutirox.

Noviembre 2014 MTX

Agosto 2015: Ca Mama QT y cirugía

Evolución de anticuerpos

0

50

100

150

200

250

300

350

may

-14

jul-1

4

sep-

14

nov-1

4en

e-15

mar

-15

may

-15

jul-1

5

sep-

15

nov-1

5en

e-16

FR

CCP-2

Conclusiones

• En la práctica clínica diaria, no es frecuente encontrar variaciones en los niveles de anticuerpos (ACPA) a lo largo del tiempo.

• En la bibliografía, solo abatacept parece reducir los ACPA.

• En los laboratorios participantes no se encuentra gran diferencia de los resultados, con las siguientes salvedades: – Vimentina (MCV) y CCPhs parecen tener defecto

de sensibilidad. Sólo un laboratorio participante. – Probables interferencias con procesos infecciosos.

• No hemos encontrado diferencias entre las técnicas de enzimoinmunoanálisis y las de quimioluminiscencia.

EUROIMMUNE

Agradecimientos

• A los 29 pacientes que han querido participar de manera entusiasta.

• Al personal de enfermería que ha colaborado con admirable amabilidad.

• A los Servicios de Reumatología de los hospitales participantes.

• A EUROIMMUN por haber colaborado eficazmente en la distribución de las muestras.

• A PALEX por la distribución gratuita de estuches de reactivo.

BIOPLEXINOVA ELISA CCP3