Estructura y propiedades de los canales de iones Jueves 16 de abril: 14.30-17.30 Cursos_2009...

Estructura y propiedades de los canales de iones

Jueves 16 de abril: 14.30-17.30

ftp://einstein.ciencias.uchile.cl/Cursos_2009 CursoTroncal Clase 1er semestre

Canales de iones dependientes de potencial eléctrico.

Artículos para el seminario del martes 20 de abril:•Doyleetal1998Science_280_69.pdf•JiangEtal2003Nature423_42.pdf•JiangEtal2003Nature_423_33.pdf

Los archivos pdf están en el disco compacto.Hay además un archivo ppt con las figuras.

Axón de jibiaElectrodo que inyecta corriente Electrodos para medir

el potencial

Con este sistema podemos observar la propagación del impulso nervioso a lo largo del axón.

Vx(t)

Estímulo en de 25 microamperes en x = 0. Dura 0,5 milisegundos y empieza a t = 0 milisegundo.

Registro del potencial eléctrico intracelular a lo largo del nervio.

0.00 ms

0.04 ms0.12 ms0.52 ms1.24 ms1.88 ms2.28 ms2.92 ms3.72 ms4.60 ms5.48 ms6.44 ms8.04 ms8.84 ms9.80 ms10.76 ms15.12 ms

Arreglo experimental para controlar el potencial eléctrico de la membrana. (Voltage Clamp)

Vcomando

El potencial de la membrana es igual al potencial de comando en todos los puntos a lo largo del axón. El amplificador se encarga de pasar tanta corriente como sea necesario para mantener esta igualdad.

Voltage clamp

Vm

1x 105x

Arreglo experimental para controlar el potencial eléctrico de la membrana. (Voltage Clamp)

El potencial de la membrana es igual al comando.

El ampérmetro A mide la corriente que pasa por la membrana contenida en 1 cm lineal de axón.

A

Voltage clamp

Vcomando

Vm

1x 105x

Hodgkin y Huxley 1952 J. Physiol (London) 117:500-544Latorre et al Biofísica y Fisiología Celular. Sevilla,1996

Voltage clamp de un axón de jibia

Voltage clamp de un axón de jibia en presencia de TTX, bloqueador de los canales de Na. La corriente que queda es la llevada por los canales de potasio

La corriente de llevada por los canales de sodio es la diferencia de la corriente control – corriente con TTX.

IK

INa

IL

IC

Im

LNaKm IIIdtdV

CI

LmLNamNaKmKm VVGVVGVVGdtdV

CI

Con voltage clamp:

Vm

IK

INa

IL

IC

Im=0

LmLNamNaKmK VVGVVGVVGdtdV

C 0

LLNaNaKKLNaKr VGVGVGGGGV

LNaK

LLNaNaKKr GGG

VGVGVGV

Sin voltage clamp:

Vm

En reposo Vm = Vr y dV/dt = 0:

LrLNarNaKrK VVGVVGVVG 0

Potencial de acción de membrana.

Tiempo, (ms)

Vm

, (m

V)

Im, (

mA

cm-2)

LNaK

LLNaNaKK

dt

dVm GGGVGVGVG

V

0

VNa

VL

VK

NaLK GGG


Tiempo, (ms)

Vm

, (m

V)

Im, (

mA

cm-2)

LNaK

LLNaNaKK

dt

dVm GGGVGVGVG

V

0

VNa

VL

VK

LKNa GGG


Tiempo, (ms)

Vm

, (m

V)

Im, (

mA

cm-2)

LNaK

LLNaNaKK

dt

dVm GGGVGVGVG

V

0

VNa

VL

VK

NaLK GGG

The Nerve Impulse. This is a brief Textbook that covers the basics of the initiation and propagation of the nerve impulse using equivalent circuits with reference to ionic conductances. Voltage dependent conductances are explained on the basis of single channel properties. The text contains links to the simulation programs.

http://nerve.bsd.uchicago.edu/med98a.htm

Para saber más sobre impulso nervioso consulte el libro de texto del Dr. Francisco Bezanilla:

Los canales responsables del potencial de acción en el axón gigante de jibia tienen dos atributos importantes.

•Selectividad. Conducen Na+ o K+ en forma excluyente.

•Excitabilidad. Capacidad de cambiar su capacidad de conducir iones en función del voltaje.

Estructura

Topología de los canales de Ca2+, Na+ y K+ sugerida de sus perfilesde hidrofobicidad

x4

x4

x2

x2

Los canales pueden formarse a partir de una sola molécula de proteína, pueden ser tetrámeros o dímeros

En los canales de K+ dependientes de potencial el segmento S4 y el poro (P)están muy conservados

Doyle et al 1998 Science 280:69-77

KCsA de Streptomyces lividans

Tema de seminario martes 22


KCsA de Streptomyces lividans

Zhou et al 2001 Nature 414:43-48

KCsA de

Streptomyces lividans. El filtro de selectividad a más resolución

oio KF ][

RTFVioi eKF /][

RTFV

i

o

oi

io eK

K

F

F /

][

][

i

oK K

K

FRT

V][

][ln

RTFV

K

K

F

F

i

o

oi

io

][

][lnln

58log10

K

oi

io VVFF

RT

VVFF

F K

oi

io )(ln

Razones de flujos unidireccionales

Armstrong 2003 PNAS 100:6257-6262

Hodgkin y Huxley 1955. The potasium permeability of a giant nerve fibre. J. Physiol ( London) 128:61-68.

Los iones difunden en fila india a lo largo del canal.

-+

-+

El ion + es atraído por la carga negativa.

El ion + es atrapado por la carga negativa.

La ocupación múltiple del poro permite un tránsito rápido de los iones

-+ +

-+ +

El ion + se acerca a un par con carga neta cero

El ion + se aleja de un par con carga neta cero.

La ocupación múltiple del poro permite un tránsito rápido de los iones

Morais-Cabral et al 2001 Nature 413:37-42

Ion K+Molécula de H2O

Optimización energética de la rapidez de por el filtro de selectividad del potasio.

Potenciales de flujo

Corrientes de flujo

Un canal en que el agua y los iones se mueven en fila india

Pongo igual concentración de potasio a ambos lados del canal

Pongo igual potencial eléctrico a ambos lados del canal

Que flujo neto de K se espera?

Agrego un no electrolito a un lado del la membrana con el canal

Que flujo neto de K se espera?

Esta es la corriente de flujo. A que potencial el flujo se hace cero?

Este es el potencial de flujo.

Corriente de K a través de un canal de potasio en presencia de un gradiente osmótico.

Las concentraciones de K a ambos lados de la membrana son iguales por lo que el potencial de Nernst para el K es 0 mV.

El gradiente osmótico lleva el potencial de inversión de la corriente a 4 mV.

El flujo de agua por los canales arrastra potasio.

Hay entre 2 y 4 moléculas de agua en el canal. Su longitud es de 6 a 12 angstrom.

Alcayaga et al 1989 Biophysical J. 55:367-371


12Å

6 a 12 AAlcayaga et al 1989

Morais-Cabral et al 2001 Nature 413:37-42

2-4 aguas/canalAlcayaga et al 1989


•Selectividad. Conducen Na+ o K+ en forma excluyente.

•Excitabilidad. Capacidad de cambiar su capacidad de conducir iones en función del voltaje.

Movimiento en un medio viscosoVelocidad = movilidad · fuerza (m s-1)

La “fuerza” que impulsa el movimiento de los iones es su gradiante de potencial químico.

dx

dfuerza

J mol-1m-1

movilidad = velocidad por unidad de fuerza ( ms-1 N-1mol)

N mol-1

velocidad = movilidad · fuerza (m s-1)

Esta caja es un elemento de volumen de un sistema más grande. En la caja hay moléculas que se están moviendo impulsadas por un gradiente de potencial químico. La velocidad de las moléculas es v ms-1

Todas las moléculas que están a una distancia vt atraviesan la pared de la izquierda en un tiempo t

v

vt

A

Todas las moléculas que estaban en la caja a tiempo t han atravesado la pared al tiempo t + t.

El número de moles del soluto presente en la caja es igual a su concentración c multiplicada por el volumen de la caja. c A v t.

c

Todas las moléculas que están a una distancia vt atraviesan la pared de la izquierda en un tiempo t

v

vt

A

Todas las moléculas que estaban en la caja a tiempo t han atravesado la pared al tiempo t + t. c A v t

El número de moles presentes en la caja es igual a su concentración c multiplicada por el volumen de la caja. c A v t.

c

El número de moles que atraviesa cada unidad de área por unidad de tiempo se llama Flujo, J.

cvJ mol m-2s-1

v

vt

A

Todas las moléculas que estaban en la caja a tiempo t han atravesado la pared al tiempo t + t. c A v t

El número de moles presentes en la caja es igual a su concentración c multiplicada por el volumen de la caja. c A v t.

c

El número de moles que atraviesa cada unidad de área por unidad de tiempo se llama Flujo, J.

cvJ mol m-2s-1

J = c • movilidad • fuerza

J = c • movilidad • fuerza

Para estudiar la selectividad de los canales compararemos los flujos de los iones medidos al aplicar la misma fuerza a todos.

Los factores que gobiernan la selectividad son entonces la concentración y la movilidad.

J = concentración • movilidad • fuerza

Movilidades relativas a la del K en el agua

H+ 4.76Li+ 0.53Na+ 0.68K+ 1.00Rb+ 1.06Cs+ 1.05

F- 0.75Cl- 1.04Br- 1.06I- 1.04

En un poro acuoso las diferencias de movilidades entre Na y K son pequeñas

Examinemos entonces las concentraciones

Suponiendo que el flujo es pequeño, se puede usar el coeficiente de partición, , para expresar la concentración en el borde de la membrana en función de la concentración en el seno de la solución.

C (membrana) C (solución)

soluciónmembrana CC

¿Cuál es la concentración dentro de una membrana?

J = csol • • movilidad • fuerza

RTe0

)ln(0memmemmem CRT

)ln(0solsolsol CRT

eqsol

memsolmem C

CRT

ln0 00

ln)( 000 RTsolmem

En el equilibrio ( J = 0 ) los potenciales químicos son iguales

Ver artículo de Armstrong en: Hille Armstrong MacKinnon 1999 NatureMedicine 5:1105-1119

La posición de mínima energía para el ion es equidistante de los grupos C=O.La energía de interacción es igual para todos los iones

Estados de referencia: 1 mol por litro de ion en fase gaseosaSolución 1 molal de iones en agua

RTe0

Gran diferencia de coeficiente de partición entre fase acuosa y gaseosa.

Robinson and Stokes “Electrolyte Solutions” Butterworths,London 1959.

Gran diferencia de coeficiente de partición entre fase acuosa y una membrana que no interactúe con los iones.

Gran diferencia de coeficiente de partición entre fase acuosa y gaseosa.

J = csol • • movilidad • fuerzaPregunta: ¿Cual será la selectividad de una membrana que interactúa por igual con todos los iones?

J = csol • • movilidad • fuerzaPregunta: ¿Cual será la selectividad de una membrana que interactúa por igual con todos los iones?

Muy bien: la selectividad será Cs > Rb > K > Na > Li

Agreguemos ahora un efecto de tamiz: discriminación por tamaño.

Por la energía de hidratación: la selectividad es Cs > Rb > K > Na > Li

¿Cuál será el ion preferido si se excluye el Cs y el Rb por tamaño?.

¿Cuál será el ion preferido si se excluye el Cs, Rb y K por tamaño?.

El potasio

El sodio


•Selectividad. Conducen Na o K en forma excluyente.

•Excitabilidad. Capacidad de cambiar capacidad de conducir iones en función del voltaje.

Los canales tienen una compuerta en la entrada intracelular.

CH3

N

CH2

CH3

CH2

CH2 CH3CH2CH3

Tetra Etil AmonioTEA

El TEA bloquea los canales de K con una cinética muy rápida

CH3

N

CH2

CH3

(CH2)8

CH2 CH3CH2CH3

C9

C9 también bloquea pero su cinética es lenta.

+ +

Armstrong 1971 JGP 58:413

Control


+C9


++C9


+++C9

También en: Hille Armstrong MacKinnon 1999 NatureMedicine 5:1105-1119


En: Hille Armstrong MacKinnon 1999 NatureMedicine 5:1105-1119


Conclusiones 1971:

El canal de K es un poro

La compuerta está por dentro

Hay un vestíbulo interno amplio capaz de alojar C9

Las paredes del vestíbulo son hidrófobas.

Salto en el tiempo al siglo XXI


El cristal de KcsA corresponde a un canal cerrado

Bicapa

KcsAMthK

Jiang et al 2002 Nature 417:515-522

El cristal de MthK corresponde a un canal abierto

Methanobacterium thermoautotrophicum

Mecanismo de activación por ligandos intracelulares

MthK, canal de potasio activado por calcio intracelular de Methanobacterium thermoautotrophicum.


417515a-s2.mov 417523a-s2.mov

KcsA MthK

Apertura 4 Ǻ 26Ǻ

La compuerta cerrada deja una abertura de 4 Ǻ de diámetro. Pero el K+ tiene sólo 2 Ǻ de diámetro. ¿Por qué el K+ no puede pasar?

Max Born

Born: 11 Dec 1882 in Breslau, Germany (now Wroclaw, Poland)

Died: 5 Jan 1970 in Göttingen, Germany

1-

0

20 Jmol

8

)(

rπε

zeNU auto

mnewtoncoulomb 108542.8 -2-12120

-123 mol 10022.6 N

coulomb 106.1 190

e

Energía necesaria para cargar un ion en medios de diferente constante dieléctrica. Self energy. Energía de Born

Ver LaEnergiadeBorn.ppt en einstein.ciencias.uchile.cl

Parsegian V. A 1969. ParsegianNature_221_844_1969

Ion en una membrana ion en un poro ion en un carrier


Dibujo esquemático del canal KcsA mostrando tres iones potasio en su interior

Energía libre de transferencia del ion K+ desde el agua al centro de una bicapa

de 40 Ǻ de espesor y = 2

RTGe /286.0/38 103 e

kcal/mol 38G

Benoît Roux an Roderick Mackinnon 1999 Science 285:100-102

Energía libre de transferencia del ion K+ desde el agua al centro de la proteína

puesta en la bicapa = 2

RTGe /286.0/38 103 e

kcal/mol 38G


Energía libre de transferencia del ion K+ desde el agua al centro de la cavidad

kcal/mol 3.6G

RTGe /56.0/3.6 103 e

kcal/mol 38G


Energía libre de transferencia del ion K+ desde el agua al centro de la cavidad, estando dos iones en el filtro de selectividad

RTGe /126.0/3.16 105.1 e

kcal/mol 3.6Gkcal/mol 38G

kcal/mol 3.16G


RTGe /66.0/5.8 105.1 e


kcal/mol 3.16Gkcal/mol 5.8G

Energía libre de transferencia del ion K+ desde el agua al centro de la cavidad, estando dos iones en el filtro de selectividad, considerando el efecto de las cargas de la proteína


RTGe /36.0/5.4 102e


kcal/mol 3.16Gkcal/mol 5.8Gkcal/mol 5.4G

Energía libre de transferencia del ion K+ desde el agua al centro de la cavidad, estando dos iones en el filtro de selectividad, considerando sólo el efecto de las hélices del poro.


kcal/mol 7.6G

Energía libre de transferencia del ion K+ desde el agua al canal de entrada cerrado


RTGe /56.0/7.6 105.1 e

Energía libre de transferencia del ion K+ desde el agua al canal de entrada abierto

kcal/mol 0Gkcal/mol 7.6G

RTGe /16.0/0 e

Identificación de las cargas del sensor de potencial

Un Condensador eléctrico consiste en dos placas conductoras separadas por un aislante.

Al cargar un condensador con una carga Q, se genera una diferencia de potencial eléctrico, V:

CVQ Un condensador de una capacidad de 1 Farad adquiere una diferencia de potencial de 1 Volt al cargarlo con 1 Coulomb.

La intensidad de una corriente eléctrica, I, se mide en Amperes.Una corriente de 1 Amper transporta 1 Coulomb por segundo. Un condensador de una capacidad de 1 Farad se demora un segundo al cargarlo con una corriente de 1 Amper.

CVtI

CVtI

t = 0s, V = 0 Volts

1A 1A

t = 1s, V = 1 Volt

Vacío entre las placas

CVtI

t = 0s, V = 0 Volts

1A 1A

t = 10s, V = 1 Volt

Un diléctrico entre las placas

CVtI

t = 0s, V = 0 Volts

+

+

+

+ -

--

-

1A 1A

t = 10s, V = 1 Volt

+

+

+

+

-

-

-

-

Un diléctrico entre las placas

V = 1.0 VoltV = 1.0 Volt

+

+

+

+

+

+

+

+

-

--

-

-

-

-

-

Las cargas del dieléctrico se mueven en el campo eléctrico produciendo una corriente de desplazamiento:

Las corriente de desplazamiento representa movimiento de cargas positivas desde el lado positivo hacia el lado negativo. Esta corriente transportó 9 Coulombs en 10 segundos. Representa la polarización del dieléctrico.

-40 mV

-100 mV

+40 mV

Animación sensores.exe

Oocitos sin Shaker

Oocitos con Shaker

Aggarwal y MacKinnon Neuron 16:1169-1177

Canal de potasio Shaker de Drosophila

Oocito de Xenopus expresado el canal Shaker de Drosophyla bloquados por AGTX

Sin ShakerCon Shaker


Oocito de Xenopus expresado el canal Shaker de Drosophyla bloquados por AGTX

Sin ShakerCon Shaker

CerradosAbiertos

TransiciónCarga desplazada

Q = 40 nC, pero ¿de cuántos canales?Aggarwal y MacKinnon Neuron 16:1169-1177

El número de canales se determina con AGTX radiactiva de actividad específica conocida.

Resulta 13.6 cargas por canalAggarwal y MacKinnon Neuron 16:1169-1177

Nú

me

ro d

e c

arg

as e

lem

en

tale

s

Número de canales

>shaker 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1 MAAVAGLYGL GEDRQHRKKQ QQQQQHQKEQ LEQKEEQKKI AERKLQLREQ 50 51 QLQRNSLDGY GSLPKLSSQD EEGGAGHGFG GGPQHFEPIP HDHDFCERVV 100101 INVSGLRFET QLRTLNQFPD TLLGDPARRL RYFDPLRNEY FFDRSRPSFD 150151 AILYYYQSGG RLRRPVNVPL DVFSEEIKFY ELGDQAINKF REDEGFIKEE 200201 ERPLPDNEKQ RKVWLLFEYP ESSQAARVVA IISVFVILLS IVIFCLETLP 250251 EFKHYKVFNT TTNGTKIEED EVPDITDPFF LIETLCIIWF TFELTVRFLA 300301 CPNKLNFCRD VMNVIDIIAI IPYFITLATV VAEEEDTLNL PKAPVSPQDK 350351 SSNQAMSLAI LRVIRLVRVF RIFKLSRHSK GLQILGRTLK ASMRELGLLI 400401 FFLFIGVVLF SSAVYFAEAG SENSFFKSIP DAFWWAVVTM TTVGYGDMTP 450451 VGVWGKIVGS LCAIAGVLTI ALPVPVIVSN FNYFYHRETD QEEMQSQNFN 500501 HVTSCPYLPG TLGQHMKKSS LSESSSDMMD LDDGVESTPG LTETHPGRSA 550551 VAPFLGAQQQ QQQQPVASSL SMSIDKQLQH PLQHVTQTQL YQQQQQQQQQ 600601 QQNGFKQQQQ QTQQQLQQQQ SHTINASAAA ATSGSGSSGL TMRHNNALAV 650651 SIETDV

Estructura primaria del producto de expresión de un gen que le falta al mutante Shaker de Drosophila.

Hay 7 cargas positivas en el posible sensor de potencial

13.6 -9.7 = 3.9 cargas para R1


13.6 -9.7 = 3.9 cargas para R113.6 -8.8 = 4.8 cargas para R2 suman 8.1



13.6 -10.0 = 3.6 cargas para R3 suman 11.7





13.6 -11.5 = 2.1 cargas para K5 suman 15.6


13.6 -9.7 = 3.9 cargas para R1







Experimentos de reactivos de grupos SH.MTSET CH3-S02-S-CH2-CH2-N+-(CH3)3

Hacer una mutación puntual, por ejemplo R326C

Comparar la rapidez de la reacción de cisteína-MTSET para el canal abierto y el canal cerrado, poniendo MTSET ya sea por el interior o por el exterior.

R1 R362R2 R365R3 R368R4 R371K5 K374

Esquema resumen de la accesibilidad de los residuos del segmento S4

Larsson et al 1996 Neuron 16:387-397

Modelo 1966 del funcionamiento del sensor de potencial eléctrico


El desplazamiento vertical es de 16 Ångström

Estructura cristalina del canal de potasio activado por potencial eléctrico KvaPde Aeropyrum pernix.Vista desde el lado intracelular


Fragmento de anticuerpo

S4


La estructura cristalina difiere de la esperada.

Los segmentos de hélices alfa no están perpendiculares al plano de la membrana.

El segmento S4 está fuera de la membrana.

El segmento S3 está dividido en dos segmentos S3a y S3b.

El segmento S6 está quebrado: el canal está abierto

Esta estructura está distorsionada por la inmovilización del S3b-S4 por el Fab.


Estructura cristalina del sensor de potencial aislado de KvaP

Cristal completo

Composición de los dos cristales

Para saber como sigue la historia del modelo de sensor de potencial en canales de eucariontes vea:

Long et al Science 2005 309:897-903Long et al Science 2005 309:903-908

Long et al Science 2007 450:367-383


Canal de potasio de mamífero Kv1.2


Quimera del Canal Kv1.2 con el sensor de potencial de Kv2.1 cristalizado con fosfolípidos y detergente

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