Estructura del DNA - cad.unam.mx · Carlos A. FernÆndez M." Polinucleótido producido por la...

Carlos A. Fernández M.


Estructura del DNA


• Polinucleótido producido por la polimerización dedesoxirribonucleótidos

Grupo Fosfato + β – D - desoxirribofuranosa + Base nitrogenada

Desoxirribonucleósido

Desoxirribonucleótido


• Bases Nitrogenadas: Bases Púricas

Adenina Guanina


• Bases Nitrogenadas: Bases Pirimídicas

Timina Citosina


• Azúcar (Pentosa)

β – D - desoxirribofuranosa


• Grupo fosfato

O

O

O OP


•Nomenclatura de nucleósidos y nucleótidos (presentes en el DNA)

dTMPDesoxitimidina monofosfatoDesoxitimidinaTimina

dCMPDesoxicitidina monofosfatoDesoxicitidinaCitosina

dAMPDesoxiadenina monofosfatoDesoxiadeninaAdenina

dGMPDesoxiguanosina monofosfatoDesoxiguanosinaGuanina

AbreviaturaNucleótido(Nucleósido+Fosfato)

Nucleósido(Base+Pentosa)

Base


•Nomenclatura de nucleósidos y nucleótidos (presentes en el DNA)

Por consenso general el Nucleótido adquiere el nombrede la base nitrogenada que le dio origen


•Modelo de la Doble Hélice de Watson y Crick

Watson y yo hemosencontrado el

secreto de la vida


•El modelo de la doble hélice de Watson y Crick Los polímeros de

DNA estánconstituidos por doscadenas denucleótidos unidosen forma lineal porenlaces fosfodiesterlos cuales corren endireccionesopuestas(antiparalelas).


•El modelo de la doble hélice de Watson y Crick Cada nucleótido se encuentra en un plano perpendicular al de la cadena

polinucleotídica.


•El modelo de la doble hélice de Watson y Crick La composición de bases de DNA sigue las reglas de Chargaff (Cantidad

de Purinas = Cantidad de Pirimidinas).

TCGA

0.110.260.280.12Mycobacterium sp

0.290.150.180.30Sacharomyces cerevisiae

0.270.230.240.26Bos taurus

0.310.180.180.29Homo sapiens

•Composición de las bases nucleotídicas en el DNA de algunas especies


•El modelo de la doble hélice de Watson y Crick

•Reglas de Chargaff

1. La relación purinas/pirimidinas es igual a 1

Es decir, A+G = C+T

2. En todos los DNA estudiados, la proporción molar de A es igual a lade T, y la de G igual a la de C.

Es decir, A = T y G = C



Las fotografías del análisis dedifracción de rayos X de la salde DNA con alto contenido deagua indican que la moléculatiene una estructura helicoidaldoble (las cadenas giranalrededor de una línea centralimaginaria)


•El modelo de la doble hélice de Watson y Crick Las dos cadenas se encuentran apareadas por uniones de

hidrógeno establecidas entre los pares de bases



Propiedades de los enlaces tipo puente de hidrógeno

Son económicos (energéticamente hablando). Son lo suficientemente fuertes para mantener la estructura de la doble

hélice pero lo suficientemente débiles para romperse determinadosmomentos (replicación).

Confieren un estado dinámico de la estructura (horquillas) Son altamente direccionales, discriminan entre las distintas pares de

bases.


Los puentes de hidrógeno sonaltamente direccionales.


Guanina Citosina

Configuración tridimensional de los enlaces puente de hidrógeno


Adenina Timina

Configuración tridimensional de los enlaces puente de hidrógeno


•Fuerzas que determinan la conformación polinucleotídica

Los polinucleótidos tienden a formar hélices, lo que lespermite conciliar las fuerzas de interacción moleculares,distribuyéndolas a intervalos regulares.

Las Interacciones hidrófobas entre los anillos de las basesy fuerzas de Van Der Walls (Resultado de la diferenciaentre interacciones dipolo y las fuerzas de dispersión deLondon) producen una conformación apilada (Staking).


Las repulsiones entre los grupos fosfato cargadosnegativamente producen cierta rigidez en la estructura lascuales, en condiciones fisiológicas, se ven estabilizadaspor la cantidad de cationes (Mg2+) presentes en lasolución.



Puede formar enlaces que conectan dos moléculas. Dichos enlaces (llamados enlaces fosfodiéster) son sumamente estables

aunque pueden ser rotos facilmente mediante hidrólisis enzimática(Principio de conservación).

La carga negativa (debido a un Oxígeno ionizado) protege frente aataques nucleofílicos.

La ionización negativa total mantiene a los nucleótidos y al mismo DNAdentro de las membranas biológicas.

¿Por qué fosfatos?




La formación de puentes de hidrógeno cooperativosaltamente direccionales asegura una estabilidad relativaademás de un estado dinámico.


•Variaciones conformacionales del DNA

Se producen por cambios en los grupos pentosa-fosfatode la cadena polinucleotídica.

Variación entre la conformación anti y syn del ángulo deenlace entre las bases nitrogenadas y la pentosa.

Inclinación, giro o giro en hélice de los bares de bases delos nucleótidos.



Variación en la inclinación y giro de las bases nitrogenadas


DNA tipo A


•Doble hélice plectonémica ydextrógira

•Planos de bases oblicuosrespecto al eje de la doblehélica

•Propio de RNAs en doblehélice, o de híbridos DNA-RNA

•Más ancha y corta que DNA-B


DNA tipo Z


•Doble hélice plectonémica ylevógira

•Zonas de secuencia alternante -GCGC-

•Conformación de G es syn- enlugar de anti-

•Más estrecha y larga que DNA-B



A B Z

Grosor 2.6 2.4 1.8Giro Dextro Dextro LevoBases/vuelta 11 10.4 12P.de rosca 2.5 3.4 4.5Inclinación del plano 19º 1º 9ºde las bases

Cuadro Resumen de las Características de losdistintos tipos conformacionales


•Desnaturalización del DNA

Se llama así al proceso de transición entre la forma dedoble hélice apilada y el ovillo estadístico.



Se puede lograr provocando cambios en la temperatura,pH o agregando sustancias desnaturalizantes.

TºRotura de los enlacespuente de hidrógeno

pHCambio en laionización de loscomponentes

Agentes DNBloqueo de losenlaces puente dehidrógeno



Efecto hipercrómico de laDesnaturalización del DNA


•Renaturalización del DNA

Se produce mediante la llamada autoasociación porcomplementariedad.

Es dependiente de la concentración. Se favorece por la presencia de secuencias repetitivas

frecuentes. Inversamente proporcional a la complejidad del genoma.


•Hibridación del DNA

Se basa en la capacidad de autoasociación porcomplementariedad.

Es necesaria una relación elevada decomplementariedad.

Es dependiente de la concentración.


Útil para los siguientes propósitos:

1. Determinación de si una cierta secuencia de DNA sepresenta más de una vez en un determinado genoma.

2. Demostración de la existencia de relación genética oevolutiva entre organismos presentes.

3. Determinación del número de genes transcritos en unmRNA particular.

4. Determinación de la localización de una secuencia de DNA(Sonda).



Hibridación del DNA



1. Se desnaturaliza el DNA a hibridar2. Se inmovilizan las monohebras resultantes mediante fijación a un

polímero adecuado.3. Dichas monohebras se montan en una columna cromatográfica.4. Se hace pasar monohebras de DNA marcado radioactivamente (Timina

tritiada).

Procedimiento

*La velocidad de reasociación es proporcional a la que la radioactividad queda retenidaen la columna cromatográfica.


Factores que afectan la estabilidad del híbrido

a) Número de pares GC v/s pares ATA mayor número de puentes de hidrógeno,

mayor estabilidad

• 3 puentes de H entre G y C

• 2 puentes de H entre A y T



b) Grado de complementariedadMenor complementariedad de bases

Menos enlaces de H formadosMenor estabilidad



c) Largo de las hebras

– Mayor largo de las hebras (cDNAs) >200pb

más enlaces de H mayor estabilidad del híbrido.

– Menor largo de las hebras (oligos) <50pb Mayor especificidad Menor probalidad de hibridación cruzada



d) Concentración de sal en la solución

•Cationes monovalentes (Na+) o divalentes (Mg++)

•Las cargas negativas de los grupos fosfato se repelenunas a otras.

•Los iones positivos en solución reducen la repulsiónelectrostática entre las hebras.



e) Temperatura

•Mayor Tº aumenta la energía cinética de las hebras ydesestabiliza la estructura de los ácidos nucleicos.

las hebras se separan.


•Uso de Sondas de DNA

Las sondas de ácido nucleico son poderosas herramientas aportadas por la biotecnología que se

emplean tanto en la investigación básica como en el campo

diagnóstico. La posibilidad de utilizarlas con el fin de detectar diversos agentes patógenos, sea en el ser humano, en plantas o

animales, ya ha tenido importantes repercusioneseconómicas.


Sondas de DNA



Se pueden clasificar las sondas en :

• "calientes" cuando se utiliza productos radiactivos• "frías” cuando no se utilizan productos radioactivos



Autorradiografía

* Isotopos Radioactivos tanto de emisión alfa como beta:tritio, fósforo-32, azufre-35 o iodo-125

ADN

Isotopo radioactivo

Sondas “calientes”



Sondas “frías”

1. Enzimas (peroxidasa o fosfatasa que llevan a cabouna reacción detectable )

2. Marcadores de afinidad (biotina o digoxigenina, quese van a unir posteriormente a otra molécula)

3. Moléculas Quimioluminiscentes Y Fluorescentes(que producen luz y puede excitar una películafotográfica).


Sondas “frías”


Souther Blot


•Southren blot


FISH


•Citogenética moderna: FISH


Tipos de Estructurasdel DNA


•Tipos de estructuras del DNA

Los rasgos estructurales varían según el origen y funcióndel DNA.

Los DNA difieren en:

• Tamaño• Conformación• Topología


•Diferencias en Tamaño

•El tamaño de un DNA puede ser expresado en:

Número de pares de basesPeso molecularLongitud de las hebrasMasa real del DNA



Virus

Miles de pares de bases

Bacterias

Millones de pares de bases

Animales

Miles de Millones de paresde bases



•El tamaño del DNA tiende a aumentar con la complejidadde la función celular.

•El tamaño del DNA no siempre refleja mayor complejidadcelular.

El aumento de secuencias repetitivas aumenta el tamañopero no la complejidad del genoma.


•Formas de determinar el Tamaño de un DNA

•Centrifugación en equilibrio•Microscopía electrónica•Electroforesis en gel


Gradiente

de densidad

•Centrifugación en equilibrio

•La anchura de las bandas en equilibrio es proporcional ala masa molecular

DNACentrifugación

Formación de bandasen el lugar de

equilibrio entre ladensidad del DNA y el

medio externo


•Microscopía electrónica

•Se mide el largo de la hebra•El tamaño se obtiene usando patrones conocidos demasa por unidad.

+ + = DNA visible almicroscopio

Cubierta de proteína Película de metal


Conformacionesdel DNA


Continuará…

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