Estrategias de Secuenciación Estrategias de Secuenciación de Genomasde Genomas

José Guillermo Dávila RamosJosé Guillermo Dávila Ramos

Centro de Ciencias Genómicas, UNAMCentro de Ciencias Genómicas, UNAM

Secuenciación del DNASecuenciación del DNA

Principios y Métodos más Principios y Métodos más empleados empleados

Genomas SecuenciadosGenomas Secuenciados

En años recientes, se ha logrado la secuenciación a gran En años recientes, se ha logrado la secuenciación a gran escala del genoma de organismos eucariotesescala del genoma de organismos eucariotesLos 5 primeros genomas secuenciados de organismos Los 5 primeros genomas secuenciados de organismos pluricelulares son:pluricelulares son:1998 1998 Caenorhabditis elegansCaenorhabditis elegans - 8 x 10 - 8 x 1077 pb - un nemátodo pb - un nemátodo2000 2000 Homo sapiensHomo sapiens - 3 x 10 - 3 x 1099 pb - el Humano pb - el Humano2000 2000 Arabidopsis thalianaArabidopsis thaliana - 1.15 x 10 - 1.15 x 1088 pb- una planta pb- una planta2000 2000 Drosophila melanogasterDrosophila melanogaster - 1.65 x 10 - 1.65 x 1088 pb - la mosca pb - la mosca de la frutade la fruta2002 2002 Anopheles gambiaeAnopheles gambiae - 2.78 x 10 - 2.78 x 1088 pb - el mosquito pb - el mosquito vector de la malariavector de la malaria

Secuenciación Tipo SangerSecuenciación Tipo Sanger

El método de secuenciación de Sanger aprovecha la El método de secuenciación de Sanger aprovecha la forma normal de la replicación del DNAforma normal de la replicación del DNAPara extender la cadena de DNA, usando la DNA Para extender la cadena de DNA, usando la DNA polimerasa, deberá estar presente un grupo hidroxilo polimerasa, deberá estar presente un grupo hidroxilo en el carbono 3’ de la deoxiribosaen el carbono 3’ de la deoxiribosaLos fragmentos se generan al agregar pequeñas Los fragmentos se generan al agregar pequeñas cantidades de 2’ 3’ dideoxinucleótidos a la reacción cantidades de 2’ 3’ dideoxinucleótidos a la reacción lo que interrumpe la polimerización cada vez que son lo que interrumpe la polimerización cada vez que son incorporados en la cadena de DNAincorporados en la cadena de DNALa polimerasa usada deberá de carecer de la actividad La polimerasa usada deberá de carecer de la actividad de la exonucleasa de corrección 3’ > 5’ para que de la exonucleasa de corrección 3’ > 5’ para que funcione el métodofuncione el método

H

P

O

OH

OH

HO

O

O

CH2

NH2

N

N N

N

Azucar

Base

Fosfato

3’

5’

2’

1’4’

DideoxinucleótidosDideoxinucleótidosLa secuenciación de DNA usando La secuenciación de DNA usando el método de Sanger emplea 2’3’-el método de Sanger emplea 2’3’-dideoxinucleótidos trifosfatados dideoxinucleótidos trifosfatados ademas de los normales 2’-ademas de los normales 2’-deoxinucleótido trifosfatadodeoxinucleótido trifosfatadoYa que los 2’3’-dideoxinucleótidos Ya que los 2’3’-dideoxinucleótidos trifosfato carecen del grupo 3’ trifosfato carecen del grupo 3’ hidroxilo, y la polimerización del hidroxilo, y la polimerización del DNA ocurre solo en la dirección 3’, DNA ocurre solo en la dirección 3’, cada vez que un 2’3’-cada vez que un 2’3’-dideoxinucleótido trifosfato es dideoxinucleótido trifosfato es incorporado la extención se detieneincorporado la extención se detiene

H

2’3’-dideoxinucleótido monofosfato

2’-deoxinucleótido monofosfato

E

SQ

UE

LE

TO

AZ

UC

AR

-FO

SF

AT

O

H

P

O

HO

O

O

CH2

HOH

P

O

O

HO

O

O

CH2

H

P

O

OH

HO

O

O

CH2

NH2

N

N

N

N

O

O

NH2N

NH

N

N

N O

NH2

N

B A

S E

S

Los 2’3’Los 2’3’dideoxi-dideoxi-

nucleótidosnucleótidosterminanterminan

la síntesis la síntesis del DNAdel DNA

OH

P

O

HO

O

O

CH2

HO

O

H 2N

NHN N

N H

H OH

P

O

OH

O

O

CH2

CH 3

O

O

HNN

OH

H

P HO

O

O

CH2

HO

N

O

H 2N

N

H2O

2’3’did

eoxinucleótid

o

Secuenciación de DNASecuenciación de DNA

Plásmido con un fragmento clonado

de DNA

Sitios de Prímeros

fragmento Clonado

Prímero

La Reacción con ddATPLa Reacción con ddATP

5’TTATCG3’AATAGCATGGTACTGATCTTACGCTAT5’

5’TTATCGTACCATGACTAGATGCGA

5’TTATCGTACCA

5’TTATCGTACCATGACTA

5’TTATCGTA

5’TTATCGTACCATGA

5’TTATCGTACCATGACTAGATGCGATA

5’TTATCGTACCATGACTAGA

Pol.5’TTATCGTA Ya no

puedes!

Pol.5’TTATCGTACCATGA

Otravez!

Pol.5’TTATCGTACCATGACTAGA

NoDe nuevo!

Pol.5’TTATCGTACCATGACTAGATGCGATA

A que la!

Separación de los FragmentosSeparación de los Fragmentos

Todos los métodos actuales de Todos los métodos actuales de secuenciación requieren que la secuenciación requieren que la separación de los fragmentos de separación de los fragmentos de DNA detecten diferencias en longitud DNA detecten diferencias en longitud de una basede una baseEsto se logra por una electroforesis Esto se logra por una electroforesis ya sea en geles de poliacrilamida o ya sea en geles de poliacrilamida o en capilares con polímeros líquidosen capilares con polímeros líquidos

Separación de Fragmentos (Sanger)Separación de Fragmentos (Sanger)Los productos de las 4 Los productos de las 4 reacciones, cada una reacciones, cada una conteniendo una pequeña conteniendo una pequeña cantidad de uno de los cantidad de uno de los cuatro dideoxinucleótidos, cuatro dideoxinucleótidos, son cargadas en el gel y son cargadas en el gel y sometidas a electroforesissometidas a electroforesisComo la polimerización es Como la polimerización es solo en dirección 5’ a 3’, los solo en dirección 5’ a 3’, los fragmentos más cortos fragmentos más cortos estarán en 5’ y los más estarán en 5’ y los más largos que se encontrarán largos que se encontrarán en la dirección 3’en la dirección 3’

ddTTPddCTP ddGTPddATP

Lec

tura

5’

a 3’

des

de la

bas

a al

tope

Applied BiosystemsApplied Biosystems

Applied Biosystems (ABI) ha desarrollado colorantes Applied Biosystems (ABI) ha desarrollado colorantes fluorescentes más sensibles, mejorado el método de fluorescentes más sensibles, mejorado el método de cargado de la muestra y la electroforesiscargado de la muestra y la electroforesisCuatro colorantes que fluoresen a una longitud de onda Cuatro colorantes que fluoresen a una longitud de onda distinta, pero con el mismo impacto en la movilidad distinta, pero con el mismo impacto en la movilidad electroforética, pueden ser usados para marcar ya sea electroforética, pueden ser usados para marcar ya sea los prímeros o los nucleótidos que terminan la reacciónlos prímeros o los nucleótidos que terminan la reacciónSi se usan los dideoxinucleótidos fluorados, la reacción Si se usan los dideoxinucleótidos fluorados, la reacción de secuenciación completa se realiza en un solo tubode secuenciación completa se realiza en un solo tuboEn lugar de los geles de poliacrilamida, se emplea un En lugar de los geles de poliacrilamida, se emplea un solo capilar con un polímero líquido que se remplaza al solo capilar con un polímero líquido que se remplaza al final de cada corridafinal de cada corrida

3’AATAGCATAACGTTAACGTTACGCTAT5’Pol.

Oh comeon!

5’TTATCGTACCACPol.

5’TTATCGTACCATAATTNot

Again!

Pol.

Agggg….

5’TTATCGTACCATAATTGCA

Secuencia con Terminadores FluoradosSecuencia con Terminadores Fluorados

5’TTATCG

5’TTATCGTATTGCAATTGCA

5’TTATCGTATTGCAATT

5’TTATCGTA

5’TTATCGTATTGCAAT

5’TTATCGTATTGCAATTG

5’TTATCGTATTGCAA

5’TTATCGTATTGCAATTGC

5’TTATCGTATTGCA

5’TTATCGTAT

5’TTATCGTATTG5’TTATCGTATT

5’TTATCGTATTGC

Pol.5’TTATCGTA Let me

Through!

Como la base al final de cada fragmento esta marcada con un fluoróforo único, la reacción total se puede hacer en un solo tubo

…..

Placa caliente

Pol. líquido

ATTGC A

Sistema Prisma 310 ABISistema Prisma 310 ABI

Laser

Prisma

Detectores

-

+Ventana

Reacción Secuencia

Capilar

El ABI Prisma 3700El ABI Prisma 3700

ABI Prism 3700

El Estado del ArteEl Estado del ArteEl ABI Prisma 3730XL, representa la última El ABI Prisma 3730XL, representa la última generación de equipos de secuenciación capilar generación de equipos de secuenciación capilar automáticaautomáticaEl 3730XL puede secuenciar hasta 1,500,000 de bases El 3730XL puede secuenciar hasta 1,500,000 de bases diariasdiariasCon esta capacidad el genoma de una bacteria de Con esta capacidad el genoma de una bacteria de 5,000,000 de pares de bases, puede ser totalmente 5,000,000 de pares de bases, puede ser totalmente secuenciado en un messecuenciado en un mesEl desarrollo más reciente es la piro-secuencia, que El desarrollo más reciente es la piro-secuencia, que incrementa en un orden de magnitud el número de incrementa en un orden de magnitud el número de bases obtenidas por díabases obtenidas por día

Estrategias para la Estrategias para la Secuenciación de GenomasSecuenciación de Genomas

Secuenciación al Azar ySecuenciación al Azar ySecuenciación Jerárquica al Secuenciación Jerárquica al

AzarAzar

Método de Secuenciación al AzarMétodo de Secuenciación al Azar

Fragmentación

clonación

Plásmido

Genoteca del genoma

Secuenciación y alineamientode los insertos

ATTCGCTGGCGGT TTGCTGCAAAATTG CGGTATTGCGCTTGCTGC

Refinamiento

ATTCGCTGGCGGTATTGCGCTTCTGCAAAATTG

Secuencia final

Genoma

Secuenciación Jerárquica al AzarSecuenciación Jerárquica al Azar

1. Fragmentación

2. Clonación

BAC

Genoteca de BACs

Genoma

3. Secuencia de los bordes de los insertos de los BACs y alineamiento para crear un mapa de CONTIGS

4. Secuenciación y alineamientode los insertos de cada BAC

ATTCGCTGGCGGT TTGCTGCAAAATTG CGGTATTGCGCTTGCTGC

Refinamiento

ATTCGCTGGCGGTATTGCGCTTCTGCAAAATTG

Secuencia final

RhizobiumRhizobium

NHNH44++

HH22OO

COCO22

HH22OO

NN22

nódulo

OO22

OO22

Rizósfera

NN22

suelo

fed

cab

Cromosomacircular

Cromosomacircular

PlásmidosPlásmidos

= plásmidosimbiótico

El Genoma de Rhizobium etli

El primer genoma completo hecho en México