Inmovilizacin celular

El empleo de clulas enteras inmovilizadas presenta una serie de ventajas frente a las enzimas aisladas:

Se evita los procesos de aislamiento y purificacinenzimtica.

Las enzimas de inters se hallan en su ambiente celularnatural con lo que aumenta su estabilidad y consecuentementela vida til del sistema permitiendo la reutilizacin del materialcataltico.

El ambiente celular provee a las enzimas de los cofactores, coenzimas y dems compuestos necesarios para asegurar una ptima actividad, adems de brindar buenas condiciones de temperatura y pH.

Los sistemas celulares permiten el desarrollo de reacciones multienzimticas.

Inmovilizacin celular

Condiciones bsicas que debe reunir un mtodo

Sencillez de preparacin Baja toxicidad de la matriz y de los elementos de preparacin Bajo costo Alta resistencia mecnica Baja o nula interferencia en los procesos de purificacin de productos Posibilidad de alternar ciclos de crecimiento y ciclos de produccin y/o biotransformacin

Inmovilizacin celular

Por adsorcin Por entrampamiento

Adsorcin a soportes inertes

Entrampamiento en matricespolimricas

Inclusin en estructuras preformadas

Inmovilizacin celular

Adsorcin a soportes inertes

Inclusin en estructuras preformadas

Bolillas de vidrio Virutas de madera, etc

Biorreactores de fibra hueca Espumas de poliuretanoMembranas de nylon

Inmovilizacin celular: en esferas alginato

OO

OO

OH

O

OH

n

Alginato (Acido manurnico b 1,4)

O

O

CaCl2+

OO

O

O-

O

O-

O

O

OO

OO

O-

O

O-

O

O

OO

O

O-

O

O-

O

O

OO

OO

O-

O

O-

O

O

CaCa

CaCa

Ca Ca

Inmovilizacin celular: Metodologa de trabajo

Mezcla de solucin de alginatoY cultivo celular en medio libre De agentes complejantes de Ca++

Solucin de Ca++

Algunos ejemplos de metabolitos de inters comercialproducidos en sistemas de clulas vegetalesinmovilizadas

Especie Matriz Producto ComentariosCatharanthus roseus Agarosa Catelamina Suministro de

ajmalicinaCatharanthus roseus Alginato Alcaloides

indlicosProlonga capacidad biosinttica

Catharanthus roseus Alginato Ajmalicina Prolonga estabilidad ycapacidad biosinttica(220 dias con cambiode medio)

Catharanthus roseus Xantanos/poliacrilamida

Serpentina Prolonga estabilidad ycapacidad biosinttica(180 dias con cambiode medio)

Algunos ejemplos de metabolitos de inters comercialproducidos en sistemas de clulas vegetalesinmovilizadas

Daucus carota Alginato 5-b-hidroxidigi-toxigenina

Tcnica: Suministro de precursor

(digitoxigenina)Daucus carota Alginato fenoles No hay variaciones con

respecto a cultivosno inmovilizados

Especie Matriz Producto Comentarios

Algunos ejemplos de metabolitos de inters comercialproducidos en sistemas de clulas vegetalesinmovilizadas

Especie Matriz Producto Comentarios

Digitalis lanata Alginato b-metildigoxina Suministro de precursor:b-metildi-gitoxina

Digitalis lanata Alginato digoxina Suministro de precursor:digitoxina

Algunos ejemplos de metabolitos de inters comercialproducidos en sistemas de clulas vegetalesinmovilizadas

Especie Matriz Producto Comentarios

Beta vulgaris Nylon Betacianina Incrementaacumulacin

Capsicum frutescen Espuma de

poliuretano

Capsaicina Incrementarendimiento

Algunos ejemplos de metabolitos de inters comercialproducidos en sistemas de clulas vegetalesinmovilizadas

Especie Matriz Producto Comentarios

Morinda citrifolia Alginato Antraquinonas Incrementa acumulacinintracelular

Talictrum minus Alginato Berberina Incrementa liberacin

Solanum surretense Alginato Solasodina Incrementa liberacin

Lithospermunerithrorhysum

Fibrahueca

fenoles Incrementa rendimiento.

Solanum

El empleo de clulas inmovilizadas ofrece una serie de ventajasvinculadas al estado fisiolgico y al diseo y modo de operacin del proceso fermentativo.

El entrampamiento en matrices inertes permite un gran contacto intercelular y la generacin de gradientes fsicos y qumicos que conducen a un mayor grado de diferenciacin.

Al estar minimizada la tasa de reproduccin celular la inestabilidad gnica se disminuye notablemente.

Se alcanzan fases estacionarias prolongadas lo cual es muy importante cuando la produccin esta asociada a la idiofase o al final de la etapa exponencial

Estos sistemas permiten desacoplar las fases de crecimiento y produccin facilitando el empleo de estrategias como la elicitacin bitica y abitica o la permeabilizacin para incrementar la produccin

Es posible realizar ciclos alternantes de rejuvenecimiento/crecimientopara mantener la viabilidad y capacidad biosinttica.

las clulas inmovilizadas permiten operar en sistemas continuos a altas velocidades de disolucin sin riesgo de lavado de los cultivos

Es posible controlar el tamao de los agregados celulares en caso de ser importante esa variable para la acumulacin y/o produccin de metabolitos.

Con la biomasa entrampada es ms sencillo trabajar con procesos en dos fases, lo ms comn es realizar una de crecimiento previo a la inmovilizacin y la segunda de produccin inmovilizando cuando el cultivo ha llegado a su etapa estacionaria.

En cultivos inmovilizados se facilita la remocin de inhibidoresmetablicos

se protege a las paredes celulares de las fuerzas de corte

Con inmovilizacin es posible lograr: sistemas de produccin de metabolitos de una vida til prolongada puesto que se puede reutilizar la biomasa y realizar una recuperacin continua de los productos.

Es posible inducir la liberacin al medio extracelular los metabolitos de inters que naturalmente no son excretados mediante el empleo de agentes permeantes, especialmente DMSO

El empleo de estos sistemas se encuentra limitado a la produccin de compuestos secundarios y la realizacin de procesos de bioconversin dnde los productos de inters se liberen al medio de cultivo.

Races transformadas

Metabolito Gnero vegetal AplicacinAtropina Hyoscyamus AnticolinrgicoBerberina Hydratis

canadensis Antihemorrgicouterino

Esteres debornilo

Valeriana Sedante

Ginsensidos Panax ginseng Tnico,estimulante

Rotenona Derris elliptica InsecticidaVincristina,vinblastina

Catharantusroseus

Antileucmico

Quinina,quinidina

Cinchona Antimalrico,antirreumtico

Reserpina Rauwolfia Antihipertensivo

Algunos metabolitos secundarios sintetizados en races

Metabolitos acumulados en cultivos de races NO transformadas

Agrobacterium rhizogenes .

Bacteria del suelo gram negativacausa la enfermedad de las races en cabellera

Agrobacterium tumefaciens

La infeccin de muchas especies in-vitro con el microorganismo patgeno Agrobacterium rhizogenespermite obtener clones de races estables y en condiciones axnicas

Mayoritariamente, los clones preservan la capacidad biosinttica de las races de las plantas que les dieron origen

Las races neoplsicas producidas por A. rhizogenes se caracterizan por :

su alto ndice de crecimiento y su estabilidad gentica

Estos cultivos producen niveles de metabolitos secundarios comparables a las plantas intactas

Biologa de la interacin Agrobacterium-planta

El nico ejemplo conocido de transferencia natural de AND inter-

reino

Genes Rol A, B, C y D

catabolismo de opinas

AuxinasOpinas

Regin Vir

Origen de Replicacin

TLTR

El T-ADN es el sector del plsmido que se transfiere a las clulas husped

Esta flanqueado por las secuencias bordes de aproximadamente 25 pb esencialespara la transferencia

En el T-ADN existen dos regiones, la derecha (TR) y la izquierda (TL)

Ambas codifican para funciones rizognicas una vez integradas a la clulahusped

La regin TR especifica la sntesis de agropinas y auxinas

Regin TL porta cuatro loci que contienen los genes rol (A,B,C y D) implicadosen el desarrollo morfolgico de las races mediante la sensibilizacin de las clulasal efecto auxnico

El gen rol D induce la formacin de tejido de callos mientras que los genes rol A,B y C regulan el tamao, grado de ramificacin, alteraciones de tropismo y demscaractersticas de las races en cabellera

Hairy roots are fast growing and plagiotropic

They require no external supply of growth hormones

The plagiotropic characteristic is advantageous as it increases the aeration in liquid mediumand roots grown in air have an elevated accumulation of biomass.

Una vez establecidos los cultivos de races transformadas se puedendesarrollar a partir de pequeos inculos y obtener buenos ndices decrecimiento.

El principal problema es el cambio de escala a niveles industriales yaque la agitacin mecnica causa injurias que conducen a la formacinde callos.

Debido a las ramificaciones las races forman una matriz queofrece resistencia al flujo, siendo el principal problemanuevamente el suministro de oxgeno.

En los medios lquidos se forman esferas de races con las raicillas jvenes en crecimiento sobre la periferia y un corazn de tejido viejo en el interior

La restriccin nutricional que soporta esta parte interna, principalmente en lo referido al oxgeno da origen a un bolsillo de tejido senescente

Produccin de metabolitos en cultivos de races TRANSFORMADAS

Las principales ventajas de utilizar cultivos de races transformadas, encabellera o hairy roots para producir metabolitos secundarios en lugar decultivos dediferenciados son:

Con estos sistemas no son necesarios medios suplementados confitorreguladores para desarrollar biomasa

Las races transformadas crecen rpidamente, son robustas y vigorosas

Sintetizan metabolitos secundarios caractersticos de las races de las plantasde las cuales provienen

La sntesis de estos metabolitos se realiza a niveles reproducibles puesto que,a diferencia de los cultivos de clulas indiferenciadas, son genticamenteestables por perodos prolongados de cultivo

El cultivo masivo de races transformadas es sencillo y tiene potencialidadpara desarrollarse en biorreactores, ampliando la posibilidad de aplicacinindustrial de estos procedimientos