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B REGLAMENTO (CEE) N o 256891 DE LA COMISIOacuteN

de 11 de julio de 1991

relativo a las caracteriacutesticas de los aceites de oliva y de los aceites de orujo de oliva y sobre sus meacutetodos de anaacutelisis

(DO L 248 de 591991 p 1)

Modificado por

Diario Oficial

n o paacutegina fecha

M1 Reglamento (CEE) n o 368291 de la Comisioacuten de 17 de diciembre de 1991

L 349 36 18121991

M2 Reglamento (CEE) n o 142992 de la Comisioacuten de 26 de mayo de 1992 L 150 17 261992 M3 Reglamento (CEE) n o 168392 de la Comisioacuten de 29 de junio de 1992 L 176 27 3061992 M4 Reglamento (CEE) n o 199692 de la Comisioacuten de 15 de julio de 1992 L 199 18 1871992 M5 Reglamento (CEE) n o 328892 de la Comisioacuten de 12 de noviembre de

1992 L 327 28 13111992

M6 Reglamento (CEE) n o 18393 de la Comisioacuten de 29 de enero de 1993 L 22 58 3011993 M7 modificado por el Reglamento (CEE) n o 82693 de la Comisioacuten de 6

de abril de 1993 L 87 6 741993

M8 Reglamento (CEE) n o 62093 de la Comisioacuten de 17 de marzo de 1993 L 66 29 1831993 M9 Reglamento (CE) n o 17794 de la Comisioacuten de 28 de enero de 1994 L 24 33 2911994 M10 Reglamento (CE) n o 263294 de la Comisioacuten de 28 de octubre de 1994 L 280 43 29101994 M11 Reglamento (CE) n o 65695 de la Comisioacuten de 28 de marzo de 1995 L 69 1 2931995 M12 Reglamento (CE) n o 252795 de la Comisioacuten de 27 de octubre de 1995 L 258 49 28101995 M13 Reglamento (CE) n o 247297 de la Comisioacuten de 11 de diciembre de

1997 L 341 25 12121997

M14 Reglamento (CE) n o 28298 de la Comisioacuten de 3 de febrero de 1998 L 28 5 421998 M15 Reglamento (CE) n o 224898 de la Comisioacuten de 19 de octubre de 1998 L 282 55 20101998 M16 Reglamento (CE) n o 3791999 de la Comisioacuten de 19 de febrero de

1999 L 46 15 2021999

M17 Reglamento (CE) n o 4552001 de la Comisioacuten de 6 de marzo de 2001 L 65 9 732001 M18 Reglamento (CE) n o 20422001 de la Comisioacuten de 18 de octubre de

2001 L 276 8 19102001

M19 Reglamento (CE) n o 7962002 de la Comisioacuten de 6 de mayo de 2002 L 128 8 1552002 M20 Reglamento (CE) n o 19892003 de la Comisioacuten de 6 de noviembre de

2003 L 295 57 13112003

M21 Reglamento (CE) n o 7022007 de la Comisioacuten de 21 de junio de 2007 L 161 11 2262007 M22 Reglamento (CE) n o 6402008 de la Comisioacuten de 4 de julio de 2008 L 178 11 572008 M23 Reglamento (UE) n o 612011 de la Comisioacuten de 24 de enero de 2011 L 23 1 2712011 M24 Reglamento de Ejecucioacuten (UE) n o 6612012 de la Comisioacuten de 19 de

julio de 2012 L 192 3 2072012

01991R2568 mdash ES mdash 20102019 mdash 032001 mdash 1

M25 Reglamento de Ejecucioacuten (UE) n o 2992013 de la Comisioacuten de 26 de marzo de 2013

L 90 52 2832013

M26 Reglamento de Ejecucioacuten (UE) n o 13482013 de la Comisioacuten de 16 de diciembre de 2013

L 338 31 17122013

M27 Reglamento Delegado (UE) 20151830 de la Comisioacuten de 8 de julio de 2015

L 266 9 13102015

M28 Reglamento de Ejecucioacuten (UE) 20151833 de la Comisioacuten de 12 de octubre de 2015

L 266 29 13102015

M29 Reglamento de Ejecucioacuten (UE) 20161227 de la Comisioacuten de 27 de julio de 2016

L 202 7 2872016

M30 Reglamento de Ejecucioacuten (UE) 20161784 de la Comisioacuten de 30 de septiembre de 2016

L 273 5 8102016

M31 Reglamento Delegado (UE) 20162095 de la Comisioacuten de 26 de sepshy tiembre de 2016

L 326 1 1122016


L 250 14 3092019

Rectificado por

C1 Rectificacioacuten DO L 347 de 28111992 p 69 (256891) C2 Rectificacioacuten DO L 176 de 2071993 p 30 (18393) C3 Rectificacioacuten DO L 63 de 431998 p 34 (247297) C4 Rectificacioacuten DO L 67 de 532004 p 34 (19892003) C5 Rectificacioacuten DO L 78 de 2432011 p 69 (612011) C6 Rectificacioacuten DO L 196 de 372014 p 45 (13482013) C7 Rectificacioacuten DO L 183 de 1472017 p 11 (20161227) C8 Rectificacioacuten DO L 211 de 1782017 p 58 (20162095)


REGLAMENTO (CEE) N o 256891 DE LA COMISIOacuteN



M20

Artiacuteculo 1

1 Se consideraraacuten aceites de oliva viacutergenes con arreglo a las letras a) y b) del punto 1 del anexo del Reglamento n o 13666CEE los aceites cuyas caracteriacutesticas se ajusten a las indicadas respectivamente en los puntos 1 y 2 del anexo I del presente Reglamento

2 Se consideraraacute aceite de oliva lampante con arreglo a la letra c) del punto 1 del anexo del Reglamento n o 13666CEE el aceite cuyas caracteriacutesticas se ajusten a las indicadas en el punto 3 del anexo I del presente Reglamento

3 Se consideraraacute aceite de oliva refinado con arreglo al punto 2 del anexo del Reglamento n o 13666CEE el aceite cuyas caracteriacutesticas se ajusten a las indicadas en el punto 4 del anexo I del presente Reglashymento

C4 4 Se consideraraacute aceite de oliva que contiene exclusivamente aceites de oliva refinados y aceites de oliva viacutergenes con arreglo al punto 3 del anexo del Reglamento n o 13666CEE el aceite cuyas caracteriacutesticas se ajusten a las indicadas en el punto 5 del anexo I del presente Reglashymento

M20 5 Se consideraraacute aceite de orujo de oliva crudo con arreglo al punto 4 del anexo del Reglamento n o 13666CEE el aceite cuyas caracteriacutesshyticas se ajusten a las indicadas en el punto 6 del anexo I del presente Reglamento

6 Se consideraraacute aceite de orujo de oliva refinado con arreglo al punto 5 del anexo del Reglamento n o 13666CEE el aceite cuyas caracteriacutesticas se ajusten a las indicadas en el punto 7 del anexo I del presente Reglamento

7 Se consideraraacute aceite de orujo de oliva con arreglo al punto 6 del anexo del Reglamento n o 13666CEE el aceite cuyas caracteriacutesticas se ajusten a las indicadas en el punto 8 del anexo I del presente Reglashymento

B


Artiacuteculo 2

1 Las caracteriacutesticas de los aceites previstas en el anexo I se deshyterminaraacuten empleando los meacutetodos de anaacutelisis siguientes

a) para determinar los aacutecidos grasos libres expresados en porcentaje de aacutecido oleico el meacutetodo recogido en el anexo II

b) para determinar el iacutendice de peroacutexidos el meacutetodo recogido en el anexo III

c) para determinar el contenido de ceras el meacutetodo recogido en el anexo IV

d) para determinar la composicioacuten y el contenido de esteroles y dialshycoholes triterpeacutenicos mediante cromatografiacutea de gases con columna capilar el meacutetodo recogido en el anexo V

e) para determinar el porcentaje de monopalmitato de 2-glicerilo el meacutetodo recogido en el anexo VII

f) para el anaacutelisis espectrofotomeacutetrico el meacutetodo recogido en el anexo IX

M28 g) para determinar la composicioacuten de aacutecidos grasos el meacutetodo recoshy

gido en el anexo X

M26 h) para determinar los disolventes halogenados volaacutetiles el meacutetodo

recogido en el anexo XI

i) para la valoracioacuten de las caracteriacutesticas organoleacutepticas de los aceites de oliva viacutergenes el meacutetodo recogido en el anexo XII

j) para determinar los estigmastadienos el meacutetodo recogido en el anexo XVII

k) para determinar el contenido de trigliceacuteridos con ECN42 el meacutetodo que figura en el anexo XVIII

M32 l) para determinar la composicioacuten y el contenido de esteroles y para

determinar los compuestos alcohoacutelicos mediante cromatografiacutea de gases con columna capilar el meacutetodo recogido en el anexo XIX

M26 m) para determinar el contenido en ceras y en eacutesteres metiacutelicos y etiacuteshy

licos de los aacutecidos grasos el meacutetodo previsto en el anexo XX

M28 __________

M26 2 La comprobacioacuten de las caracteriacutesticas organoleacutepticas de los aceishytes de oliva viacutergenes por parte de las autoridades nacionales o sus representantes correraacute a cargo de paneles de catadores autorizados por los Estados miembros

M26


Las caracteriacutesticas organoleacutepticas del aceite de oliva mencionado en el apartado 1 se consideraraacuten conformes a la categoriacutea declarada si un panel de catadores autorizado por el Estado miembro interesado conshyfirma dicha clasificacioacuten

M32 En caso de que el panel autorizado no confirme tal declaracioacuten en lo que respecta a las caracteriacutesticas organoleacutepticas las autoridades nacioshynales o sus representantes ordenaraacuten que se proceda a peticioacuten del interesado a realizar sin dilacioacuten dos anaacutelisis contradictorios por otros paneles autorizados Al menos uno de ellos deberaacute ser un panel de cata autorizado por el Estado miembro productor Las caracteriacutesticas en cuestioacuten se consideraraacuten conformes a las declaradas si ambos anaacutelisis contradictorios confirman la clasificacioacuten declarada En caso contrario independientemente del tipo de defectos determinados durante los anaacuteshylisis contradictorios la clasificacioacuten se declararaacute no coherente con las caracteriacutesticas y los gastos generados por los anaacutelisis contradictorios correraacuten por cuenta del interesado

M26 3 En lo tocante a la comprobacioacuten por las autoridades nacionales o sus representantes de las caracteriacutesticas de los aceites previstas en el apartado 1 la toma de muestras se efectuaraacute de acuerdo con las normas internacionales EN ISO 661 y EN ISO 5555 relativas a la preparacioacuten de las muestras y al muestreo respectivamente Ahora bien no obstante lo dispuesto en el punto 68 de la norma EN ISO 5555 respecto de los lotes de esos aceites presentados en envases inmediatos la toma de muestras se realizaraacute de acuerdo con el anexo I bis del presente Reshyglamento En el caso de los aceites a granel para los que la toma de muestras no se pueda efectuar conforme a EN ISO 5555 dicha toma de muestras se realizaraacute de conformidad con las instrucciones proporcionashydas por la autoridad competente del Estado miembro

Sin perjuicio de lo dispuesto en la norma EN ISO 5555 y en el capiacutetulo 6 de la norma EN ISO 661 las muestras deberaacuten guardarse lo antes posible en un lugar protegido de la luz y de las elevadas temperaturas y enviarse al laboratorio para la realizacioacuten de los anaacutelisis a maacutes tardar el quinto diacutea haacutebil siguiente al de la toma de las muestras de lo contrario estas se deberaacuten guardar de tal modo que no resulten deterioradas o dantildeadas durante el transporte o el almacenaje antes de ser enviadas al laboratorio

4 Para la comprobacioacuten prevista en el apartado 3 los anaacutelisis a que se refieren los anexos II III IX XII y XX asiacute como en su caso los anaacutelisis contradictorios previstos por las legislaciones nacionales se efectuaraacuten antes de la fecha de caducidad miacutenima en el caso de los productos envasados En el caso de la toma de muestras de aceites a granel los anaacutelisis deberaacuten llevarse a cabo a maacutes tardar seis meses despueacutes del mes en que se tomoacute la muestra

No se aplicaraacute ninguacuten plazo a los demaacutes anaacutelisis previstos por el preshysente Reglamento

Excepto si la toma de muestras se ha efectuado menos de dos meses antes de la fecha de caducidad miacutenima en caso de que los resultados de los anaacutelisis no se ajusten a las caracteriacutesticas de la categoriacutea de aceite de oliva o de orujo de oliva declarada se notificaraacute este extremo al inteshyresado como muy tarde un mes antes de que finalice el plazo mencioshynado en el paacuterrafo primero

M26


5 Con vistas a la determinacioacuten de las caracteriacutesticas de los aceites de oliva efectuada con arreglo a los meacutetodos contemplados en el aparshytado 1 paacuterrafo primero los resultados de los anaacutelisis se compararaacuten directamente con los liacutemites fijados en el presente Reglamento

M25

Artiacuteculo 2 bis

1 A efectos del presente artiacuteculo por laquoaceite de oliva comercializashydoraquo se entenderaacute la cantidad total de aceite de oliva y aceite de orujo de oliva de un determinado Estado miembro que se consuma en dicho Estado miembro o se exporte fuera del mismo

2 Los Estados miembros se cercioraraacuten de que los controles de conformidad se lleven a cabo de forma selectiva sobre la base de un anaacutelisis de riesgos y con la frecuencia apropiada con el fin de garanshytizar que el aceite de oliva comercializado se ajusta a la categoriacutea declarada

3 Los criterios para evaluar el riesgo podraacuten incluir

a) la categoriacutea de aceite el periacuteodo de produccioacuten el precio de los aceites en relacioacuten con otros aceites vegetales la mezcla y las opeshyraciones de embalaje las instalaciones y condiciones de almacenashymiento el paiacutes de origen el paiacutes de destino los medios de transporte o el volumen del lote

b) la posicioacuten de los agentes econoacutemicos en la cadena de comercialishyzacioacuten el volumen o el valor comercializado por los mismos la gama de categoriacuteas de aceite que comercializan el tipo de operacioshynes llevadas a cabo tales como molturacioacuten almacenamiento refishynado mezcla embalaje o venta al por menor

c) los resultados obtenidos en controles anteriores como nuacutemero y tipo de defectos encontrados calidad habitual de los aceites comercialishyzados y rendimiento del equipo teacutecnico utilizado

d) la fiabilidad de los sistemas de control de calidad o de autocontrol de los agentes econoacutemicos relativos a la conformidad con las normas de comercializacioacuten

e) el lugar donde se realiza el control sobre todo si se trata del punto de primera entrada en la Unioacuten del uacuteltimo punto de salida de la Unioacuten o del lugar donde se producen envasan cargan o venden al consumidor final

f) cualquier otra informacioacuten que pudiera indicar un riesgo de incumshyplimiento

4 Los Estados miembros estableceraacuten previamente

a) los criterios de evaluacioacuten del riesgo de no conformidad de los lotes

b) sobre la base de un anaacutelisis de riesgos con respecto a cada categoriacutea de riesgo el nuacutemero miacutenimo de agentes econoacutemicos o de lotes yo cantidades que deberaacuten someterse a un control de conformidad

M26


Se efectuaraacute anualmente al menos un control de conformidad por cada mil toneladas de aceite de oliva comercializado en el Estado miembro

5 Los Estados miembros verificaraacuten el cumplimiento

a) efectuando en cualquier orden los anaacutelisis contemplados en el anexo I o

M32 b) seguacuten el orden establecido en el anexo I ter del diagrama de flujos

hasta la adopcioacuten de una de las decisiones mencionadas en dicho diagrama

M19 __________

M25

Artiacuteculo 3

En caso de que se compruebe que un aceite no corresponde a la desshycripcioacuten de su categoriacutea el Estado miembro de que se trate aplicaraacute sin perjuicio de cualesquiera otras sanciones sanciones efectivas proporshycionadas y disuasorias que se determinaraacuten en funcioacuten de la gravedad de la irregularidad detectada

En caso de que en los controles se detecten irregularidades importantes los Estados miembros aumentaraacuten la frecuencia de los controles en relacioacuten con la etapa de comercializacioacuten categoriacutea de aceite origen u otros criterios

M5

Artiacuteculo 4

M19 1 Para la apreciacioacuten y el control de las caracteriacutesticas organoleacuteptishycas por parte de las autoridades nacionales o sus representantes los Estados miembros podraacuten constituir paneles de catadores autorizados

Las condiciones de autorizacioacuten seraacuten establecidas por los Estados miembros con los objetivos siguientes

mdash cumplir las condiciones del punto 4 del anexo XII

mdash asegurar que la formacioacuten del jefe del panel de catadores se efectuacutea en un establecimiento y en condiciones reconocidos a tal efecto por el Estado miembro

mdash someter la validez de la autorizacioacuten a los resultados obtenidos en el sistema de control anual implantado por el Estado miembro

Todos los Estados miembros comunicaraacuten a la Comisioacuten la lista de los paneles de catadores autorizados asiacute como las demaacutes medidas adoptashydas de conformidad con el presente apartado

M5 2 En caso de que un Estado miembro tenga dificultades para crear un panel de catadores en su territorio podraacute recurrir a un panel de degustadores autorizado de otro Estado miembro

3 Cada Estado miembro elaboraraacute la lista de los paneles de catadores creados por organizaciones profesionales o interprofesionales en las condiciones fijadas en el apartado 1 y velaraacute por el cumplimiento de esas condiciones

M19 __________

B

Artiacuteculo 6

1 El contenido en aceite de orujo de aceituna y demaacutes residuos de la extraccioacuten del aceite de oliva (coacutedigos NC 2306 90 11 y 2306 90 19) se determinaraacute con arreglo al meacutetodo recogido en el Anexo XV

M25


2 El contenido de aceite mencionado en el apartado 1 se expresaraacute como porcentaje del extracto seco en peso

M20

Artiacuteculo 7

Seraacuten aplicables las disposiciones comunitarias sobre la presencia de contaminantes

En lo que respecta al contenido de disolventes halogenados los liacutemites para todas las categoriacuteas de aceites de oliva son los siguientes

mdash Contenido maacuteximo de cada disolvente halogenado detectado 01 mgkg

mdash Contenido maacuteximo de la suma de los disolventes halogenados deshytectados 02 mgkg

M25

Artiacuteculo 7 bis

Las personas fiacutesicas o juriacutedicas y las agrupaciones de personas que posean aceite de oliva y aceite de orujo de oliva desde la extraccioacuten en la almazara hasta la fase de embotellado inclusive para cualesquiera fines profesionales o comerciales deberaacuten disponer de registros de enshytradas y salidas para cada categoriacutea de estos aceites

Los Estados miembros se cercioraraacuten de que la obligacioacuten prevista en el paacuterrafo primero se respeta debidamente

Artiacuteculo 8

1 Los Estados miembros comunicaraacuten a la Comisioacuten las medidas adoptadas en aplicacioacuten del presente Reglamento Informaraacuten a la Coshymisioacuten de cualquier modificacioacuten posterior

2 A maacutes tardar el 31 de mayo de cada antildeo los Estados miembros transmitiraacuten a la Comisioacuten un informe sobre la aplicacioacuten del presente Reglamento durante el antildeo civil anterior El informe contendraacute como miacutenimo los resultados de los controles de conformidad efectuados sobre los aceites de oliva y se ajustaraacuten a los modelos que figuran en el anexo XXI

3 Las notificaciones contempladas en el presente Reglamento se realizaraacuten de conformidad con el Reglamento (CE) n o 7922009 de la Comisioacuten ( 1 )

B

Artiacuteculo 9

Queda derogado el Reglamento (CEE) n o 105877

Artiacuteculo 10

1 El presente Reglamento entraraacute en vigor el tercer diacutea siguiente al de su publicacioacuten en el Diario Oficial de las Comunidades Europeas

No obstante el meacutetodo que figura en el Anexo XII se aplicaraacute a partir del M1 1 de noviembre de 1992 excepto en lo que se refiere a las operaciones relacionadas con la intervencioacuten

B


( 1 ) DO L 228 de 192009 p 3

Dicho meacutetodo no se aplicaraacute a los aceites de oliva viacutergenes envasados antes del 1 de noviembre de 1992

B El presente Reglamento no se aplicaraacute a los aceites de oliva y de orujo de oliva envasados antes de la fecha de entrada en vigor del presente Reglamento y comercializados hasta el 31 de octubre de 1992

El presente Reglamento seraacute obligatorio en todos sus elementos y dishyrectamente aplicable en cada Estado miembro

M5


ANEXOS

IacuteNDICE

Anexo I Caracteriacutesticas de los aceites de oliva

Anexo I bis Muestreo de aceite de oliva o aceite de orujo de oliva distrishy buido en envases inmediatos

Anexo I ter Diagrama de flujos para la comprobacioacuten de la conformidad de una muestra de aceite de oliva con la categoriacutea declarada

Anexo II Determinacioacuten de los aacutecidos grasos libres meacutetodo en friacuteo

Anexo III Determinacioacuten del iacutendice de peroacutexidos

Anexo IV Determinacioacuten del contenido de ceras mediante cromatografiacutea de gases con columna capilar

Anexo VII Determinacioacuten del porcentaje de monopalmitato de 2-glicerilo

Anexo IX Prueba espectrofotomeacutetrica en el ultravioleta

Anexo X Determinacioacuten de eacutesteres metiacutelicos de aacutecidos grasos mediante cromatografiacutea de gases

Anexo XI Determinacioacuten del contenido en disolventes halogenados volaacuteshy tiles en el aceite de oliva

Anexo XII Meacutetodo del Consejo Oleiacutecola Internacional para la evaluacioacuten organoleacuteptica de los aceites de oliva viacutergenes

Anexo XV Contenido de aceite de los orujos de aceituna

Anexo XVI Determinacioacuten del iacutendice de yodo

Anexo XVII Meacutetodo para la determinacioacuten de estigmastadienos en los aceishy tes vegetales

Anexo XVIII Determinacioacuten de la diferencia entre el contenido real y el contenido teoacuterico de trigliceacuteridos con ECN 42

Anexo XIX Determinacioacuten de la composicioacuten y contenido de los esteroles y compuestos alcohoacutelicos mediante cromatografiacutea de gases con columna capilar

Anexo XX Meacutetodo para la determinacioacuten del contenido en ceras y en eacutesteres metiacutelicos y etiacutelicos de los aacutecidos grasos mediante croshy matografiacutea de gases con columna capilar

Anexo XXI Resultados de los controles de conformidad realizados en los aceites de oliva a que se refiere el artiacuteculo 8 apartado 2

M32


01991R2568 mdash

ES mdash 20102019 mdash

032001 mdash 11

M32

ANEXO I

CARACTERIacuteSTICAS DE LOS ACEITES DE OLIVA

Caracteriacutesticas de calidad

Categoriacutea Acidez () ()

Iacutendice de peroacutexidos (mEq O 2 kg) K 232 K 268 o K 270 Delta-K

Evaluacioacuten organoleacuteptica Eacutesteres etiacutelicos de los

aacutecidos grasos (mgkg) Mediana del defecto

(Md) () Mediana del frutado

(Mf)

1 Aceite de oliva virgen extra le 080 le 200 le 250 le 022 le 001 Md = 00 Mf gt 00 le 35

2 Aceite de oliva virgen le 20 le 200 le 260 le 025 le 001 Md le 35 Mf gt 00 mdash

3 Aceite de oliva lampante gt 20 mdash mdash mdash mdash Md gt 35 ( 1 ) mdash mdash

4 Aceite de oliva refinado le 030 le 50 mdash le 125 le 016 mdash mdash

5 Aceite de oliva compuesto de aceite de oliva refinado y aceites de oliva viacutergenes

le 100 le 150 mdash le 115 le 015 mdash mdash

6 Aceite de orujo de oliva crudo mdash mdash mdash mdash mdash mdash mdash

7 Aceite de orujo de oliva refinado le 030 le 50 mdash le 200 le 020 mdash mdash

8 Aceite de orujo de oliva le 100 le 150 mdash le 170 le 018 mdash mdash

( 1 ) La mediana de los defectos puede ser inferior o igual a 35 cuando la mediana del frutado es igual a 00

01991R2568 mdash


032001 mdash 12

M32

Caracteriacutesticas de pureza

Categoriacutea

Composicioacuten de aacutecidos grasos ( 1 )

Sumas de los isoacutemeros

transoleicos ()

Sumas de los isoacutemeros translinoshyleicos +

translinoshyleacutenicos

()

Estigmastashydienos

(mgkg) ( 2 )

Diferencia ECN 42 (HPLC) y

ECN 42 (caacutelculo teoacuterico)

Monopalmitato de 2-glicerilo () Miriacutestico

() Linoleacutenico

() Araquiacutedico

() Eicosenoico

() Beheacutenico

() Lignoceacuterico

()

1 Aceite de oliva virgen extra

le 003 le 100 le 060 le 050 le 020 le 020 le 005 le 005 le 005 le |020| le 09 si el total de aacutecido palmiacutetico le 1400

le 10 si el total de aacutecido palmiacutetico gt 14

2 Aceite de oliva virgen le 003 le 100 le 060 le 050 le 020 le 020 le 005 le 005 le 005 le |020| le 09 si el total de aacutecido palmiacutetico le 1400


3 Aceite de oliva lampante


le 11 si el total de aacutecido palmiacutetico es gt 1400

4 Aceite de oliva refinado

le 003 le 100 le 060 le 050 le 020 le 020 le 020 le 030 mdash le |030| le 09 si el total de aacutecido palmiacutetico le 1400





01991R2568 mdash


032001 mdash 13

M32

Categoriacutea



transoleicos ()



()

Estigmastashydienos

(mgkg) ( 2 )




() Linoleacutenico

() Araquiacutedico

() Eicosenoico

() Beheacutenico

() Lignoceacuterico

()

6 Aceite de orujo de oliva crudo

le 003 le 100 le 060 le 050 le 030 le 020 le 020 le 010 mdash le |060| le 14

7 Aceite de orujo de oliva refinado


8 Aceite de orujo de oliva


( 1 ) Contenido de otros aacutecidos grasos () palmiacutetico 750-2000 palmitoleico 030-350 heptadecanoico le 040 heptadececenoico le 060 esteaacuterico 050-500 oleico 5500- 8300 linoleico 250-2100 ( 2 ) Total de isoacutemeros que han podido (o no han podido) separarse con columna capilar

Categoriacutea

Composicioacuten de los esteroles

Esteroles totales (mgkg)

Eritrodiol y uvaol

() ()

Ceras (mgkg) () Colesterol

() Brasicasterol

() Campesterol ( 1 )

() Estigmasterol

()

β-sitosterol aparente ( 2 )

()

Delta-7- estigshymastenol ( 1 )

()

1 Aceite de oliva virgen extra le 05 le 01 le 40 lt Camp ge 930 le 05 ge 1 000 le 45 C 42 + C 44 + C 46 le 150

2 Aceite de oliva virgen le 05 le 01 le 40 lt Camp ge 930 le 05 ge 1 000 le 45 C 42 + C 44 + C 46 le 150

3 Aceite de oliva lampante le 05 le 01 le 40 mdash ge 930 le 05 ge 1 000 le 45 ( 3 ) C 40 + C 42 + C 44 + C 46 le 300 ( 3 )

4 Aceite de oliva refinado le 05 le 01 le 40 lt Camp ge 930 le 05 ge 1 000 le 45 C 40 + C 42 + C 44 + C 46 le 350

01991R2568 mdash


032001 mdash 14

M32

Categoriacutea



Eritrodiol y uvaol

() ()


() Brasicasterol


() Estigmasterol

()


()


()


le 05 le 01 le 40 lt Camp ge 930 le 05 ge 1 000 le 45 C 40 + C 42 + C 44 + C 46 le 350

6 Aceite de orujo de oliva crudo le 05 le 02 le 40 mdash ge 930 le 05 ge 2 500 gt 45 ( 4 ) C 40 + C 42 + C 44 + C 46 gt 350 ( 4 )

7 Aceite de orujo de oliva refinado le 05 le 02 le 40 lt Camp ge 930 le 05 ge 1 800 gt 45 C 40 + C 42 + C 44 + C 46 gt 350

8 Aceite de orujo de oliva le 05 le 02 le 40 lt Camp ge 930 le 05 ge 1 600 gt 45 C 40 + C 42 + C 44 + C 46 gt 350

( 1 ) Veacutease el apeacutendice del presente anexo ( 2 ) β-sitosterol aparente delta-523-estigmastadienol + clerosterol + beta-sitosterol + sitostanol + delta-5-avenasterol + delta-524-estigmastadienol ( 3 ) Se considera que los aceites con un contenido de ceras entre 300 mgkg y 350 mgkg son aceites de oliva lampantes si el contenido total de alcoholes alifaacuteticos es inferior o igual a 350 mgkg o si el contenido de eritrodiol y

uvaol es inferior o igual al 35 ( 4 ) Los aceites con un contenido de ceras comprendido entre 300 mgkg y 350 mgkg se consideran aceite de orujo de oliva crudo si el contenido de alcoholes alifaacuteticos totales es superior a 350 mgkg y si el contenido de

eritrodiol y uvaol es superior al 35

Notas

a) Los resultados de los anaacutelisis deben expresarse indicando el mismo nuacutemero de decimales que el previsto para cada caracteriacutestica La uacuteltima cifra expresada debe redondearse hacia arriba si la cifra siguiente es superior a 4

b) Es suficiente con que una sola de las caracteriacutesticas no se ajuste a los valores indicados para que el aceite cambie de categoriacutea o se declare no conforme a efectos del presente Reglamento

c) En el caso del aceite de oliva lampante las caracteriacutesticas cualitativas marcadas con un asterisco () pueden diferir al mismo tiempo de los liacutemites establecidos para esa categoriacutea

d) Las caracteriacutesticas indicadas con dos asteriscos () implican que en el caso del aceite de orujo de oliva crudo pueden no respetarse simultaacuteneamente los liacutemites correspondientes En el caso del aceite de orujo de oliva y el aceite de orujo de oliva refinado uno de los liacutemites pertinentes puede ser distinto de los valores declarados

Apeacutendice

Aacuterboles de decisioacuten

Aacuterbol de decisioacuten del campesterol para los aceites de oliva virgen y virgen extra

Los restantes paraacutemetros deberaacuten cumplir los liacutemites que establece el presente Reglamento

Aacuterbol de decisioacuten del delta-7-estigmastenol para

mdash Aceites de oliva viacutergenes extra y viacutergenes

Los restantes paraacutemetros se adaptaraacuten a los liacutemites que establece el presente Reglamento

mdash Aceites de orujo de oliva (crudo y refinado)


M32


ANEXO I BIS

C6 MUESTREO DE ACEITE DE OLIVA O ACEITE DE ORUJO DE OLIVA

DISTRIBUIDO EN ENVASES INMEDIATOS

M26 Este meacutetodo de muestreo se aplica a lotes de aceite de oliva o aceite de orujo de oliva que se presenten en envases inmediatos Se aplicaraacuten distintos meacutetodos de muestreo en funcioacuten de si los envases inmediatos superan o no los 5 litros

Se entenderaacute por laquoloteraquo un conjunto de unidades de venta que se hayan producido fabricado y envasado en circunstancias tales que el aceite contenido en cada una de dichas unidades de venta se considere homogeacuteneo en lo que se refiere a sus caracteriacutesticas analiacuteticas La individualizacioacuten de un lote debe hacerse de conformidad con la Directiva 201191UE del Parlamento Europeo y del Consejo ( 1 )

Se entenderaacute por laquoporcioacutenraquo la cantidad de aceite que contiene un envase inmediato tomada aleatoriamente del lote

1 CONTENIDO DE UNA MUESTRA ELEMENTAL

11 Envases inmediatos de 5 litros como maacuteximo

Se entenderaacute por laquomuestra elementalraquo para los envases inmediatos de 5 litros como maacuteximo el nuacutemero de porciones tomadas de un lote y de acuerdo con el cuadro 1

Cuadro 1

El tamantildeo miacutenimo de las muestras elementales consistiraacute en lo siguiente

En caso de que los envases inmediatos tengan una capacidad

La muestra elemental debe extraerse del aceite de

a) superior o igual a 1 litro a) un envase inmediato

b) inferior a 1 litro b) el nuacutemero miacutenimo de envases cuya capacidad total sea de al menos 10 litro

Cada Estado miembro podraacute incrementar el nuacutemero de envases a los que se hace referencia en el cuadro 1 que constituyan una muestra elemental en funcioacuten de sus necesidades especiacuteficas (por ejemplo en caso de valoracioacuten organoleacuteptica por parte de un laboratorio distinto del que llevoacute a cabo los anaacutelisis quiacutemicos anaacutelisis contradictorios etc)

12 Envases inmediatos de maacutes de 5 litros

Se entenderaacute por laquomuestra elementalraquo para los envases inmediatos de maacutes de 5 litros una parte representativa del total de porciones obtenida mediante un proceso de reduccioacuten y de acuerdo con el cuadro 2 C6 La muestra elemental debe estar constituida por varios ejemplares

C6 Se entenderaacute por laquoejemplarraquo cada uno de los envases que componen la muestra elemental

M26 Cuadro 2

Nuacutemero miacutenimo de porciones que elegir

Nuacutemero de envases de que consta el lote Nuacutemero miacutenimo de porciones que elegir

Hasta 10 1

De 11 a 150 2

M26


( 1 ) Directiva 201191UE del Parlamento Europeo y del Consejo de 13 de diciembre de 2011 relativa a las menciones o marcas que permitan identificar el lote al que pertenece un producto alimenticio (DO L 334 de 16122011 p 1)


De 151 a 500 3

De 501 a 1 500 4

De 1 501 a 2 500 5

gt 2 500 por cada 1 000 envases 1 porcioacuten maacutes

Con objeto de reducir el volumen del muestreo de envases inmediatos el contenido de las porciones de muestreo es homogeneizado para preparar la muestra elemental Las partes de las distintas porciones se pasan a un recipiente comuacuten para ser homogeneizadas mediante agitacioacuten con el fin de evitar al maacuteximo el contacto con el aire

C6 El contenido de la muestra elemental se pasaraacute a una serie de envases con una capacidad miacutenima de 10 litro cada una de las cuales constituye un ejemplar de la muestra elemental

M26 Cada Estado miembro puede incrementar el nuacutemero de muestras elementales en funcioacuten de sus necesidades especiacuteficas (por ejemplo la valoracioacuten organoleacuteptica por parte de un laboratorio distinto del que llevoacute a cabo los anaacutelisis quiacutemicos anaacutelisis contradictorios etc)

Cada uno de los envases debe rellenarse de forma que se minimice la capa de aire superior para posteriormente ser cerrado y sellado de forma que garantice que el producto es inalterable

C6 Estos ejemplares deben estar etiquetados para garantizar su correcta idenshytificacioacuten

M26 2 ANAacuteLISIS Y RESULTADOS

M32 21 Cada muestra elemental debe subdividirse en muestras de laboratorio con

arreglo al punto 25 de la norma EN ISO 5555 y analizarse seguacuten el orden que se indica en el diagrama de flujos recogido en el anexo I ter o cualquier otro orden aleatorio

M26 22 En caso de que todos los resultados de los anaacutelisis se ajusten a las caractershy

iacutesticas de la categoriacutea de aceite declarada todo el lote se declararaacute conforme

Si un solo resultado de los anaacutelisis no se ajusta a las caracteriacutesticas de la categoriacutea de aceite declarada todo el lote se declararaacute no conforme

3 VERIFICACIOacuteN DE LA CATEGORIacuteA DE LOTE

31 Con objeto de verificar la categoriacutea del lote las autoridades competentes podraacuten aumentar el nuacutemero de muestras elementales tomadas en distintos puntos del lote con arreglo al siguiente cuadro

Cuadro 3

Nuacutemero de muestras elementales en funcioacuten del tamantildeo del lote

Tamantildeo del lote (litros) Nuacutemero de muestras elementales

Inferior a 7 500 2

Entre 7 500 e inferior a 25 000 3



Igual y superior a 125 000 6 + 1 por cada 50 000 litros adicionales

M26


Cada porcioacuten que constituya una muestra elemental deberaacute tomarse en un lugar continuo del lote es necesario tomar nota de la ubicacioacuten de cada muestra elemental e identificarla de forma inequiacutevoca

Cada muestra elemental debe formarse con arreglo a los procedimientos mencionados en los puntos 11 y 12

Posteriormente cada una de las muestras elementales es sometida a los anaacutelisis que se mencionan en el artiacuteculo 2 apartado 1

32 Cuando uno de los resultados de los anaacutelisis a los que se hace referencia en el artiacuteculo 2 apartado 1 de al menos una de las muestras elementales no se ajuste a las caracteriacutesticas de la categoriacutea de aceite declarada todo el lote muestreado se declararaacute no conforme

M26


ANEXO I ter

DIAGRAMA DE FLUJOS PARA LA COMPROBACIOacuteN DE LA CONFORMIDAD DE UNA MUESTRA DE ACEITE DE OLIVA CON

LA CATEGORIacuteA DECLARADA

Cuadro general

M32


Cuadro 1 mdash Aceite de oliva virgen extra mdash Criterios de calidad

M32


Cuadro 2 mdash Aceite de oliva virgenmdash Criterios de calidad

M32


Cuadro 3 mdash Aceite de oliva virgen extra y aceite de oliva virgen mdash Criterios de pureza

M32


Cuadro 4 mdash Aceite de oliva lampante mdash Criterios de pureza

M32


Cuadro 5 mdash Aceite de oliva refinado mdash Criterios de calidad

Cuadro 6 mdash Aceite de oliva (compuesto de aceite de oliva refinado y aceites de oliva viacutergenes) mdash Criterios de calidad

M32


Cuadro 7 mdash Aceite de oliva refinado y aceite de oliva compuesto de aceite de oliva refinado y aceites de oliva viacutergenes mdash Criterios de pureza

M32


Cuadro 8 mdash Aceite de orujo de oliva crudo mdash Criterios de pureza

M32


Cuadro 9 mdash Aceite de orujo de oliva refinado mdash Criterios de calidad

Cuadro 10 mdash Aceite de orujo de olivamdash Criterios de calidad

M32


Cuadro 11 mdash Aceite de orujo de oliva refinado y aceite de orujo de oliva mdash Criterios de pureza

M32


ANEXO II

DETERMINACIOacuteN DE LOS AacuteCIDOS GRASOS LIBRES MEacuteTODO EN FRIacuteO

1 OBJETO Y AacuteMBITO DE APLICACIOacuteN

El presente meacutetodo describe la determinacioacuten de los aacutecidos grasos libres en los aceites de oliva y en los aceites de orujo de oliva El contenido en aacutecidos grasos libres se expresa mediante la acidez calculada como el porcentaje de aacutecido oleico

2 PRINCIPIO

Disolucioacuten de la muestra en una mezcla de disolventes y valoracioacuten de los aacutecidos grasos libres mediante una solucioacuten de hidroacutexido potaacutesico o hidroacutexido soacutedico

3 REACTIVOS

Todos los reactivos deben ser de calidad analiacutetica reconocida y el agua utilizada debe ser agua destilada o de una pureza equivalente

31 Mezcla de eacuteter dietiacutelico y etanol de 95 (VV) en proporcioacuten de volumen 11

Debe neutralizarse exactamente en el momento de su utilizacioacuten con la solucioacuten de hidroacutexido potaacutesico (32) en presencia de 03 ml de la solucioacuten de fenolftaleiacutena (33) por cada 100 ml de mezcla

Nota 1 El eacuteter dietiacutelico es muy inflamable y puede formar peroacutexidos explosivos Debe utilizarse tomando especiales precauciones

Nota 2 Si no es posible utilizar eacuteter dietiacutelico puede sustituirse por una mezcla de disolventes formada por etanol y tolueno Si fuera necesario el etanol podriacutea sustituirse a su vez por 2-propanol

32 Solucioacuten etanoacutelica o acuosa valorada de hidroacutexido potaacutesico o hidroacutexido soacutedico c(KOH) [o c(NaOH)] aproximadamente 01 M o en caso neceshysario c(KOH) [o c(NaOH)] aproximadamente 05 M Pueden emplearse soluciones disponibles en los comercios

Debe conocerse y comprobarse antes de su utilizacioacuten la concentracioacuten exacta de la solucioacuten de hidroacutexido potaacutesico (o de la solucioacuten de hidroacutexido soacutedico) Debe utilizarse una solucioacuten que haya sido preparada por lo menos cinco diacuteas antes y decantada en un frasco de vidrio marroacuten cerrado con tapoacuten de goma La solucioacuten debe ser incolora o de color amarillo paja

Si se observa una separacioacuten de fases al utilizar la solucioacuten acuosa de hidroacutexido potaacutesico (o de hidroacutexido soacutedico) sustituir la solucioacuten acuosa por una solucioacuten etanoacutelica

Nota 3 Se puede preparar una solucioacuten incolora y estable de hidroacutexido potaacutesico (o de hidroacutexido soacutedico) de la manera siguiente Llevar a ebullicioacuten y mantener esta a reflujo durante una hora 1 000 ml de etanol o agua con 8 g de hidroacutexido potaacutesico (o de hidroacutexido soacutedico) y 05 g de virutas de aluminio Destilar inmediatamente Disolver en el destilado la cantidad requerida de hidroacutexido potaacutesico (o de hidroacutexido soacutedico) Dejar reposar durante varios diacuteas y decantar el liacutequido claro sobrenadante separaacutendolo del precipitado de carbonato potaacutesico (o de carbonato soacutedico)

La solucioacuten tambieacuten puede prepararse de la manera siguiente sin efectuar la destilacioacuten antildeadir 4 ml de butilato de aluminio a 1 000 ml de etanol (o de agua) y dejar reposar la mezcla durante algunos diacuteas Decantar el liacutequido sobrenadante y disolver en eacutel la cantidad necesaria de hidroacutexido potaacutesico (o de hidroacutexido soacutedico) La solucioacuten estaacute lista para ser utilizada

M29


33 Solucioacuten de 10 gl de fenolftaleiacutena en etanol de 95-96 (VV) o azul aacutelcali 6B o solucioacuten de 20 gl de timolftaleiacutena en etanol de 95-96 (VV) En caso de aceites muy coloreados se utilizaraacute azul aacutelcali o timolftaleiacutena

4 MATERIAL

Material habitual de laboratorio y en particular

41 Balanza analiacutetica

42 Matraz Erlenmeyer de 250 ml de capacidad

43 Bureta de 10 ml de capacidad clase A con graduacioacuten de 005 ml o bureta automaacutetica equivalente

5 PROCEDIMIENTO

51 Preparacioacuten de la muestra de ensayo

En caso de que la muestra esteacute turbia debe filtrarse

52 Tamantildeo de la muestra

Tomar una muestra en funcioacuten de la acidez prevista de acuerdo con el cuadro siguiente

Acidez prevista (acidez oleica en g100g) Peso de la muestra (en g) Precisioacuten de la pesada de

la muestra (en g)

0 a 2 10 002

gt 2 a 75 25 001

gt 75 05 0001

Pesar la muestra en el matraz Erlenmeyer (42)

53 Determinacioacuten

Disolver la muestra (52) en 50 a 100 ml de la mezcla de eacuteter dietiacutelico y etanol (31) previamente neutralizada

Valorar agitando con la solucioacuten de hidroacutexido potaacutesico (o de hidroacutexido soacutedico) de 01 M (32) (veacutease nota 4) hasta el viraje del indicador (la coloracioacuten del indicador coloreado debe permanecer al menos durante 10 segundos)

Nota 4 Si la cantidad necesaria de la solucioacuten de hidroacutexido potaacutesico (o de hidroacutexido soacutedico) de 01 M supera los 10 ml debe utilizarse una solucioacuten de 05 M o cambiar la masa de la muestra en funcioacuten de la acidez libre prevista y del cuadro propuesto

Nota 5 Si la solucioacuten se enturbia durante la valoracioacuten antildeadir una cantidad suficiente de disolventes (31) para que la solucioacuten se aclare

Efectuar una segunda determinacioacuten uacutenicamente si el primer resultado es superior al liacutemite especificado para la categoriacutea del aceite

M29


6 EXPRESIOacuteN DE LOS RESULTADOS

La acidez expresada en porcentaje de aacutecido oleico en peso es igual a

V Uuml c Uuml M

1 000 Uuml 100 m frac14

V Uuml c Uuml M 10 Uuml m

siendo

V = volumen en ml de la solucioacuten valorada de hidroacutexido potaacutesico (o de hidroacutexido soacutedico) utilizada

c = concentracioacuten exacta en moles por litro de la solucioacuten de hidroacutexido potaacutesico (o de hidroacutexido soacutedico) utilizada

M = 282 gmol la masa molar en gramos por mol de aacutecido oleico

m = la masa de la muestra en gramos

El aacutecido oleico se declara como sigue

a) con dos decimales para valores comprendidos entre 0 y 1 inclusive

b) con un decimal para valores comprendidos entre 1 y 100 inclusive

M29


ANEXO III

DETERMINACIOacuteN DEL IacuteNDICE DE PEROacuteXIDOS

1 Aacutembito de aplicacioacuten

El presente anexo describe un meacutetodo para la determinacioacuten del iacutendice de peroacutexidos de los aceites y grasas animales y vegetales

2 Definicioacuten

El iacutendice de peroacutexidos es la cantidad (expresada en miliequivalentes de oxiacutegeno activo por kg) de peroacutexidos en la muestra que ocasionan la oxidacioacuten del yoduro potaacutesico en las condiciones de trabajo descritas

3 Principio

La muestra problema disuelta en aacutecido aceacutetico y cloroformo se trata con solucioacuten de yoduro potaacutesico El yodo liberado se valora con solucioacuten valorada de tiosulfato soacutedico

4 Aparatos

Todo el material utilizado deberaacute estar exento de sustancias reductoras u oxidantes

Nota 1 No engrasar las superficies esmeriladas

41 Navecilla de vidrio de 3 ml

42 Matraces con cuello y tapoacuten esmerilados de 250 ml de capacidad aproximadamente previamente secados y llenos de gas inerte puro y seco (nitroacutegeno o preferiblemente dioacutexido de carbono)

43 Bureta de 5 ml 10 ml o 25 ml de capacidad con graduacioacuten miacutenima en 005 ml de preferencia con ajuste automaacutetico del cero o una bureta automaacutetica equivalente


5 Reactivos

51 Cloroformo para anaacutelisis exento de oxiacutegeno por borboteo de una corriente de gas inerte puro y seco

52 Aacutecido aceacutetico glacial para anaacutelisis exento de oxiacutegeno por borboteo de una corriente de gas inerte puro y seco

53 Solucioacuten acuosa saturada de yoduro potaacutesico recieacuten preparada exenta de yodo y yodatos Disolver alrededor de 14 g de yoduro potaacutesico en aproximadamente 10 ml de agua a temperatura ambiente

54 Solucioacuten acuosa de tiosulfato soacutedico 001 moll (equivalente a 001 N) valorada exactamente la valoracioacuten se efectuaraacute inmediatamente antes del uso

Preparar diariamente de nuevo la solucioacuten de tiosulfato soacutedico 001 moll a partir de una solucioacuten patroacuten de tiosulfato soacutedico 01 moll antes del uso o determinar la molaridad exacta Como demuestra la experiencia la estabilidad es limitada y depende del valor del pH y del contenido de dioacutexido de carbono libre Utilizar uacutenicamente agua recieacuten hervida para la dilucioacuten si es posible purgada con nitroacutegeno

Se recomienda el procedimiento siguiente para determinar la molaridad exacta de la solucioacuten de tiosulfato soacutedico

M30


Pesar con una precisioacuten de 0001 g entre 027 g y 033 g de yodato potaacutesico (m KIO3 ) en un matraz aforado (250 ml o 500 ml) enrasar con agua recieacuten hervida (V 2 ) que se habraacute dejado enfriar a temperatura ambiente Con una pipeta verter 5 ml o 10 ml de esta solucioacuten de yodato potaacutesico (V 1 ) en un matraz Erlenmeyer de 250 ml Antildeadir 60 ml de agua recieacuten hervida 5 ml de aacutecido clorhiacutedrico 4 moll y entre 25 mg y 50 mg de yoduro potaacutesico o 05 ml de la solucioacuten saturada de yoduro potaacutesico Valorar esta solucioacuten con la solucioacuten de tiosulfato soacutedico (V 3 ) para determinar la molaridad exacta de la solucioacuten de tiosulfato soacutedico

T frac14 m KIO3 Uuml V 1 Uuml 6 Uuml 10 Uuml w KIO3

M KIO3 Uuml V 2 Uuml V 3

Siendo

m KIO3 la masa de yodato potaacutesico en gramos

V 1 el volumen de la solucioacuten de yodato potaacutesico en mililitros (5 ml o 10 ml)

V 2 el volumen total de la solucioacuten de yodato potaacutesico en mililitros (250 ml o 500 ml)

V 3 el volumen de la solucioacuten de tiosulfato soacutedico en mililitros

w KIO3 la pureza del yodato potaacutesico en g100 g

M KIO3 la masa molecular del yodato potaacutesico (214 gmol)

T la molaridad exacta de la solucioacuten de tiosulfato soacutedico (moll)

55 Solucioacuten de almidoacuten dispersioacuten acuosa de 10 gl recieacuten preparada con almidoacuten natural soluble Tambieacuten pueden utilizarse reactivos equivalentes

6 Muestra

La muestra se tomaraacute y almacenaraacute al abrigo de la luz y se mantendraacute refrigerada dentro de envases de vidrio totalmente llenos y hermeacuteticamente cerrados con tapones de vidrio esmerilado o de corcho

7 Procedimiento

El ensayo deberaacute realizarse con luz natural difusa o con luz artificial Pesar con una precisioacuten de 0001 g en una navecilla de vidrio (41) o en su defecto en un matraz (42) una cantidad de muestra en funcioacuten del iacutendice de peroacutexidos previsto con arreglo al cuadro siguiente

Iacutendice de peroacutexidos previsto (meq)

Peso de la muestra problema (g)

0 a 12 50 a 20

12 a 20 20 a 12

20 a 30 12 a 08

30 a 50 08 a 05

50 a 90 05 a 03

Abrir un matraz (42) e introducir la navecilla de vidrio que contenga la muestra problema Antildeadir 10 ml de cloroformo (51) Disolver raacutepidamente la muestra problema utilizando un agitador Antildeadir 15 ml de aacutecido aceacutetico (52) y a continuacioacuten 1 ml de solucioacuten de yoduro potaacutesico (53) Cerrar raacutepidamente el matraz sacudir durante 1 minuto y mantenerlo en la oscuridad durante 5 minutos exactamente a una temperatura comprendida entre 15 y 25 degC

M30


Antildeadir 75 ml aproximadamente de agua destilada Valorar el yodo liberado con la solucioacuten de tiosulfato soacutedico (54) sacudiendo eneacutergicamente con el uso de la solucioacuten de almidoacuten (55) como indicador

Efectuar dos determinaciones de la misma muestra problema

Realizar simultaacuteneamente un ensayo en blanco Si el resultado del ensayo en blanco sobrepasa 005 ml de la solucioacuten de tiosulfato soacutedico 001 N (54) sustituir los reactivos impuros

8 Expresioacuten de los resultados

El iacutendice de peroacutexidos (IP) expresado en miliequivalentes de oxiacutegeno activo por kilogramo se obtiene mediante la foacutermula

PV frac14 V Uuml T Uuml 1 000

m

Siendo

V = ml de la solucioacuten valorada de tiosulfato soacutedico (54) empleada en el ensayo convenientemente corregidos para tener en cuenta el ensayo en blanco

T = molaridad exacta de la solucioacuten de tiosulfato soacutedico (54) empleada en moll

m = peso en gramos de la muestra problema

El resultado seraacute la media aritmeacutetica de las dos determinaciones efectuadas

Comunicar el resultado de la determinacioacuten con una sola cifra decimal

M30


ANEXO IV

DETERMINACIOacuteN DEL CONTENIDO DE CERAS MEDIANTE CROMATOGRAFIacuteA DE GASES CON COLUMNA CAPILAR

1 OBJETO

El presente meacutetodo describe un procedimiento para la determinacioacuten del contenido de ceras en los aceites de oliva Las ceras se separan en funcioacuten del nuacutemero de aacutetomos de carbono El meacutetodo puede utilizarse en particular para distinguir el aceite de oliva obtenido por presioacuten del obtenido mediante extraccioacuten (aceite de orujo de oliva)

2 PRINCIPIO

La materia grasa a la que se habraacute antildeadido un patroacuten interno adecuado se fracciona mediante cromatografiacutea en columna de gel de siacutelice hidratado se recupera la fraccioacuten eluida en primer lugar en las condiciones de ensayo (cuya polaridad es inferior a la de los trigliceacuteridos) y a continuacioacuten se analiza directamente mediante cromatografiacutea de gases en columna capilar

3 MATERIAL

31 Matraz Erlenmeyer de 25 ml

32 Columna de vidrio para cromatografiacutea de gases de 150 mm de diaacutemetro interior entre 30 y 40 cm de longitud y provista de una llave

33 Cromatoacutegrafo de gases adecuado para utilizarse con columna capilar dotado de un sistema de introduccioacuten directa en la columna que incluya los siguientes elementos

331 Recinto termostaacutetico para las columnas provisto de un programador de temperatura

332 Inyector en friacuteo para introduccioacuten directa en la columna

333 Detector de ionizacioacuten de llama y convertidor-amplificador

334 Registrador-integrador que pueda funcionar con el convertidor- amplificador (333) con un tiempo de respuesta inferior o igual a un segundo y velocidad variable del papel (Tambieacuten se pueden utilizar sistemas informatizados que contemplen la obtencioacuten de los datos de cromatografiacutea de gases mediante un ordenador)

335 Columna capilar de vidrio o siacutelice fundida de 8 a 12 m de longitud y de 025 a 032 mm de diaacutemetro interior recubierta interiormente de fase estacionaria con un espesor uniforme que oscile entre 010 y 030 μm (Se encuentran en el comercio fases estacionarias adecuadas listas para su empleo del tipo de la SE-52 o SE-54)

34 Microjeringa para introduccioacuten directa en columna de 10 μl de capacidad provista de una aguja cementada

35 Vibrador eleacutectrico

36 Rotavapor

37 Horno de mufla

38 Balanza analiacutetica con una precisioacuten de plusmn 01 mg

39 Material de vidrio normal de laboratorio

4 REACTIVOS

41 Gel de siacutelice de una granulometriacutea comprendida entre 60 y 200 μm

El gel de siacutelice debe mantenerse durante un miacutenimo de 4 horas en el horno a 500 degC Tras su enfriamiento se antildeade un 2 de agua respecto a la cantidad de gel de siacutelice tomada Se agita bien para homogeneizar la masa Se mantiene al abrigo de la luz durante al menos 12 horas antes de su uso

M21


42 n-hexano de calidad para cromatografiacutea

43 Eacuteter etiacutelico de calidad para cromatografiacutea

44 n-heptano de calidad para cromatografiacutea

45 Solucioacuten patroacuten de araquidato de laurilo al 01 (mv) en hexano (patroacuten interno) (Tambieacuten puede utilizarse palmitato de palmitilo o estearato de miristilo)

451 Sudaacuten 1 (1-fenil-azo-2-naftol)

46 Gas portador hidroacutegeno o helio puro de calidad para cromatografiacutea de gases

47 Gases auxiliares

mdash hidroacutegeno puro de calidad para cromatografiacutea de gases

mdash aire puro de calidad para cromatografiacutea de gases

5 PROCEDIMIENTO

51 Preparacioacuten de la columna cromatograacutefica

Suspender 15 g de gel de siacutelice (41) en n-hexano (42) e introducirlo en la columna (32) Completar la sedimentacioacuten espontaacutenea con ayuda de un vibrador eleacutectrico (35) a fin de obtener una capa cromatograacutefica maacutes homogeacutenea Hacer pasar 30 ml de n-hexano para eliminar las posibles impurezas Pesar exactamente con ayuda de la balanza (38) 500 mg de la muestra en el matraz Erlenmeyer de 25 ml (31) y antildeadir la cantidad adecuada del patroacuten interno (45) en funcioacuten del contenido previsto de ceras por ejemplo antildeadir 01 mg de araquidato de laurilo si se trata de aceite de oliva y de 025 a 050 mg si se trata de aceite de orujo Transferir la muestra asiacute preparada a la columna cromatograacutefica con ayuda de dos porciones cada una de 2 ml de n-hexano (42)

Dejar fluir el disolvente hasta que se situacutee a 1 mm por encima del nivel superior del absorbente y a continuacioacuten hacer pasar 70 ml maacutes de n- hexano para eliminar los n-alcanos presentes de forma natural Comenzar entonces la elucioacuten cromatograacutefica recogiendo 180 ml de la mezcla de n- hexanoeacuteter etiacutelico en la proporcioacuten 991 manteniendo un flujo aproximado de 15 gotas cada 10 segundos La elucioacuten de la muestra debe efectuarse a una temperatura ambiente de 22 degC plusmn 4 degC

Notas mdash La mezcla n-hexanoeacuteter etiacutelico (991) debe prepararse cada diacutea

mdash Para controlar visualmente la elucioacuten correcta de las ceras es posible antildeadir a la muestra en solucioacuten 100 μl de Sudaacuten al 1 en la mezcla de elucioacuten Como el colorante tiene una retencioacuten intermedia entre las ceras y los trigliceacuteridos cuando la coloracioacuten llega al fondo de la columna cromatoshygraacutefica hay que suspender la elucioacuten por haberse eluido ya todas las ceras

Secar la fraccioacuten resultante en el rotavapor (36) hasta que se haya eliminado praacutecticamente todo el disolvente Eliminar los dos uacuteltimos mililitros del disolvente con ayuda de una deacutebil corriente de nitroacutegeno antildeadir a continuacioacuten de 2 a 4 ml de n-heptano

52 Cromatografiacutea de gases

521 Operaciones preliminares

Instalar la columna en el cromatoacutegrafo de gases (33) conectando el terminal de entrada al sistema en columna y el terminal de salida al detector Efectuar los controles generales del cromatoacutegrafo de gases (funshycionamiento de los circuitos de gas eficacia del detector y del regisshytrador etc)

M21


Si la columna se utiliza por vez primera es conveniente acondicionarla Hacer pasar a traveacutes de la columna una corriente ligera de gas y a continuacioacuten encender el cromatoacutegrafo de gases Calentar gradualmente hasta alcanzar al cabo de unas 4 horas la temperatura de 350 degC Mantener esta temperatura durante al menos 2 horas y a continuacioacuten ajustar el aparato a las condiciones de trabajo [regulacioacuten del flujo del gas encendido de la llama conexioacuten con el registrador electroacutenico (334) regulacioacuten de la temperatura del recinto para la columna regushylacioacuten del detector etc] y registrar la sentildeal con una sensibilidad al menos dos veces superior a la prevista para efectuar el anaacutelisis La liacutenea de base deberaacute ser lineal sin picos de ninguacuten tipo ni deriva

Una deriva rectiliacutenea negativa indica que las conexiones de la columna no son correctas una deriva positiva indica que la columna no ha sido acondicionada adecuadamente

522 Eleccioacuten de las condiciones de trabajo

En general las condiciones de trabajo deben ser las siguientes

mdash temperatura de la columna

20 degC minuto

5 degC minuto

20 degC minuto

al inicio 80 degC

(1prime)

rarr 240 degC rarr 325 degC (6prime)

rarr 340 degC (10prime)

mdash temperatura del detector 350 degC

mdash cantidad inyectada 1 μl de la solucioacuten (2-4 ml) de n-heptano

mdash gas portador helio o hidroacutegeno a la velocidad lineal oacuteptima para el gas seleccionado (veacutease el apeacutendice)

mdash sensibilidad del instrumento capaz de responder a las condiciones siguientes

Estas condiciones pueden modificarse en funcioacuten de las caracteriacutesticas de la columna y del cromatoacutegrafo de gases de modo que se obtenga la separacioacuten de todas las ceras una resolucioacuten satisfactoria de los picos (veacutease la figura) y un tiempo de retencioacuten del patroacuten interno C 32 de 18 plusmn 3 minutos El pico maacutes representativo de las ceras debe haber medido al menos el 60 del fondo de la escala

Determinar los paraacutemetros de integracioacuten de los picos de manera que se obtenga una evaluacioacuten correcta de las aacutereas de los picos considerados

Nota Ante lo elevado de la temperatura final se admite una deriva positiva que no debe ser superior al 10 del fondo de la escala

53 Realizacioacuten del anaacutelisis

Tomar 1 μl de la solucioacuten con la microjeringa de 10 μl sacar el eacutembolo de la jeringa hasta que la aguja esteacute vaciacutea Introducir la aguja en el sistema de inyeccioacuten e inyectar raacutepidamente despueacutes de 1 o 2 segundos dejar pasar unos 5 segundos y extraer lentamente la aguja

Llevar a cabo el registro hasta que las ceras se hayan eluido completashymente

M21


La liacutenea de base debe satisfacer siempre las condiciones exigidas

54 Identificacioacuten de los picos

Identificar los distintos picos sobre la base de los tiempos de retencioacuten comparaacutendolos con mezclas de ceras analizadas en las mismas condiciones y cuyos tiempos de retencioacuten sean conocidos

La figura presenta un cromatograma de las ceras de un aceite de oliva virgen

55 Determinacioacuten cuantitativa

Calcular con ayuda del integrador las aacutereas de los picos correspondientes al patroacuten interno y a los eacutesteres alifaacuteticos de C 40 a C 46

Determinar el contenido en ceras de cada uno de los eacutesteres en mgkg de materia grasa aplicando la siguiente foacutermula

eacutester mg=kg frac14 A x Uuml m s Uuml 1000

A s Uuml m

siendo

A x = el aacuterea del pico de cada eacutester en miliacutemetros cuadrados

A s = el aacuterea del pico del patroacuten interno en miliacutemetros cuadrados

m s = la masa del patroacuten interno que se ha antildeadido en miligramos

m = la masa de la muestra tomada para la determinacioacuten en gramos


Indicar la suma de los contenidos de las distintas ceras de C 40 a C 46 en mgkg de materia grasa (ppm)

Nota Los componentes que se deben cuantificar hacen referencia a los picos con un nuacutemero par de carbonos comprendidos entre los eacutesteres C 40 y C 46 seguacuten el ejemplo del cromatograma de las ceras del aceite de oliva indicado en la figura siguiente Si el eacutester C 46 aparece dos veces para identificarlo conviene analizar la fraccioacuten de las ceras de un aceite de orujo de oliva en que el pico C 46 sea faacutecil de identificar por ser claramente mayoritario

Los resultados deben expresarse con una cifra decimal

M21


Figura

Cromatograma de las ceras de un aceite de oliva ( 1 )

Leyenda

IS = araquidato de laurilo

1 = eacutesteres diterpeacutenicos

2 + 2prime = eacutesteres C 40



5 = eacutesteres C 46

6 = eacutesteres de esteroles y alcoholes triterpeacutenicos

M21


( 1 ) Tras la elucioacuten de los eacutesteres de esteroles el trazado cromatograacutefico no debe presentar picos significativos (trigliceacuteridos)

Apeacutendice

Determinacioacuten de la velocidad lineal del gas

Inyectar de 1 a 3 μl de metano (o propano) en el cromatoacutegrafo de gases despueacutes de haberlo ajustado a las condiciones de trabajo normales Cronometrar el tiempo que tarda el gas en recorrer la columna desde el momento de su inyeccioacuten hasta la aparicioacuten del pico (t M )

La velocidad lineal en cms viene dada por la foacutermula Lt M siendo L la longitud de la columna expresada en cm y t M el tiempo cronometrado en segundos

M32 __________

M26 __________

M21


ANEXO VII

DETERMINACIOacuteN DEL PORCENTAJE DE MONOPALMITATO DE 2-GLICERILO


El presente meacutetodo describe el procedimiento analiacutetico para la detershyminacioacuten del porcentaje de aacutecido palmiacutetico en posicioacuten 2 de los trigshyliceacuteridos mediante la evaluacioacuten del monopalmitato de 2-glicerilo

Este meacutetodo es aplicable a los aceites vegetales liacutequidos a temperatura ambiente (20 degC)

2 PRINCIPIO

Tras la preparacioacuten la muestra de aceite se somete a la accioacuten de la lipasa pancreaacutetica la hidroacutelisis parcial y especiacutefica en las posiciones 1 y 3 de las moleacuteculas de trigliceacuteridos implica la aparicioacuten de monogliceacuteridos en posicioacuten 2 Se determina el porcentaje de monopalmitato de 2- glicerilo en la fraccioacuten monogliceriacutedica previa sililacioacuten mediante cromatografiacutea de gases en columna capilar

3 EQUIPO Y MATERIAL HABITUAL


32 Vasos de precipitados de 100 250 y 300 ml

33 Columna de vidrio para cromatografiacutea con un diaacutemetro interior de entre 21 y 23 mm una longitud de 400 mm una placa de vidrio fritado y una llave

34 Probetas graduadas de 10 50 100 y 200 ml

35 Matraces redondos de 100 y 250 ml

36 Rotavapor

37 Tubos de centriacutefuga de fondo coacutenico de 10 ml con tapoacuten esmerilado

38 Centriacutefuga para tubos de 10 y 100 ml

39 Termostato capaz de mantener la temperatura a 40 degC plusmn 05 degC

310 Pipetas graduadas de 1 y 2 ml

311 Jeringa hipodeacutermica de 1 ml

312 Microjeringa de 100 μl

313 Embudo de 1 000 ml

314 Cromatoacutegrafo de gases para columna capilar provisto de un dispositivo de inyeccioacuten en columna en friacuteo para la introduccioacuten directa de la muestra en la columna y de un recinto capaz de mantener la temperatura seleccionada con una variacioacuten maacutexima de 1 degC

315 Inyector en columna en friacuteo para la introduccioacuten directa de la muestra en la columna

316 Detector de ionizacioacuten de llama y electroacutemetro

317 Registrador-integrador adaptado al electroacutemetro con un tiempo de respuesta inferior o igual a un segundo y velocidad variable de despliegue del papel

318 Columna capilar de vidrio o siacutelice fundida de 8 a 12 m de longitud y de 025 a 032 mm de diaacutemetro interior recubierta interiormente de metilshypolisiloxano o de fenilmetilpolisiloxano al 5 con un espesor de entre 010 y 030 μm que pueda utilizarse a 370 degC

M21


319 Microjeringa de 10 μl provista de una aguja cementada de al menos 75 cm de longitud para inyeccioacuten directa en columna

4 REACTIVOS

41 Gel de siacutelice de una granulometriacutea comprendida entre 0063 y 0200 mm (70280 mallas) preparado de la forma siguiente se pone el gel de siacutelice en una caacutepsula de porcelana se seca en estufa a 160 degC durante 4 horas y despueacutes se deja enfriar a temperatura ambiente en un desecador Se antildeade un volumen de agua equivalente al 5 del peso del gel de siacutelice de la manera siguiente en un matraz Erlenmeyer se pesan 152 g de gel de siacutelice y se antildeaden 8 g de agua destilada se tapa y se agita suavemente para obtener un reparto uniforme del agua Se deja reposar al menos durante 12 horas antes del empleo

M32 42 n-hexano (grado cromatograacutefico) El hexano podraacute ser sustituido por

isooctano (224-trimetilpentano en grado cromatograacutefico) siempre que se alcancen valores de precisioacuten comparables

M21 43 Isopropanol

44 Isopropanol solucioacuten acuosa 11 (VV)

45 Lipasa pancreaacutetica Debe tener una actividad comprendida entre 20 y 10 unidades de lipasa por mg (En el comercio se encuentran lipasas pancreshyaacuteticas con una actividad comprendida entre 2 y 10 unidades por mg de enzima)

46 Solucioacuten amortiguadora de tris-hidroxi-metilaminometano solucioacuten acuosa 1 M llevada a pH 8 (control potenciomeacutetrico) con HCl concentrado (11 VV)

47 Colato de sodio calidad enzimaacutetica solucioacuten acuosa al 01 (esta solucioacuten debe utilizarse en el plazo de 15 diacuteas a partir de su preparashycioacuten)

48 Cloruro de calcio solucioacuten acuosa al 22

49 Eacuteter dietiacutelico para cromatografiacutea

410 Disolvente de desarrollo mezcla n-hexanoeacuteter dietiacutelico (8713) (VV)

411 Hidroacutexido de sodio solucioacuten al 12 en peso

412 Fenolftaleiacutena solucioacuten al 1 en etanol

413 Gas portador hidroacutegeno o helio puro para cromatografiacutea de gases

414 Gases auxiliares hidroacutegeno como miacutenimo al 99 exento de humedad y de sustancias orgaacutenicas y aire para cromatografiacutea de gases de la misma pureza

415 Reactivo de sililacioacuten mezcla piridinahexametildisilazano trimetilcloroshysilano 931 (VVV) (En el comercio se encuentran soluciones listas para su empleo Pueden emplearse otros reactivos de sililacioacuten como la bis-trimetilsilil-trifluoroacetamida + 1 trimetilclorosilano diluidos con un volumen ideacutentico de piridina anhidra)

416 Muestras de referencia monogliceacuteridos puros o mezclas de monoshygliceacuteridos cuya composicioacuten porcentual se conoce y es similar a la de la muestra

5 PROCEDIMIENTO

51 Preparacioacuten de la muestra

511 Los aceites con una acidez libre inferior al 3 no tienen que neutralshyizarse antes de la cromatografiacutea en columna de gel de siacutelice Los aceites con una acidez libre superior al 3 deberaacuten someterse a la neutralshyizacioacuten como se indica en el punto 5111

M21


5111 En el embudo de 1 000 ml (313) poner 50 g de aceite y 200 ml de n- hexano Antildeadir 100 ml de isopropanol y una cantidad de la solucioacuten de hidroacutexido de sodio al 12 (411) correspondiente a la acidez libre del aceite maacutes el 5 Agitar eneacutergicamente durante un minuto Antildeadir 100 ml de agua destilada agitar de nuevo y dejar en reposo

Decantar y despueacutes eliminar la capa inferior que contiene los jabones Eliminar las eventuales capas intermedias (muciacutelago y sustancias insolshyubles) Lavar la solucioacuten hexaacutenica de aceite neutralizado con porciones sucesivas de 50 o 60 ml de la solucioacuten de isopropanolagua 11 (VV) (44) hasta que desparezca el color rosado de la fenolftaleiacutena

Eliminar la mayor parte del hexano por destilacioacuten en vaciacuteo (utilizar por ejemplo un rotavapor) y pasar el aceite a un matraz redondo de 100 ml (35) Secar el aceite en vaciacuteo hasta la eliminacioacuten total del disolvente

Al final de esta operacioacuten la acidez del aceite debe ser inferior al 05

512 Introducir 10 g de aceite preparado como se indica maacutes arriba en un Erlenmeyer de 25 ml (31) y disolver en 10 ml de mezcla de desarrollo (410) Dejar reposar la solucioacuten durante al menos 15 minutos antes de efectuar la cromatografiacutea en columna de gel de siacutelice

Si la solucioacuten estaacute turbia centrifugarla a fin de garantizar condiciones oacuteptimas de cromatografiacutea (Pueden utilizarse cartuchos de gel de siacutelice SPE de 500 mg listos para su empleo)


Poner en la columna (33) unos 30 ml de disolvente de desarrollo (410) introducir un trozo de algodoacuten en la parte inferior de la columna con ayuda de una varilla de vidrio apretar para eliminar el aire

En un vaso de precipitados preparar una suspensioacuten de 25 g de gel de siacutelice (41) en unos 80 ml de disolvente de desarrollo y pasarla a la columna con ayuda de un embudo

Verificar que todo el gel de siacutelice se ha introducido en la columna lavar con el disolvente de desarrollo (410) abrir la llave y dejar que el nivel del liacutequido llegue a unos 2 mm por encima del nivel superior del gel de siacutelice

514 Cromatografiacutea en columna

En un Erlenmeyer de 25 ml (31) pesar exactamente 10 g de muestra preparada con arreglo al punto 51

Disolver la muestra en 10 ml de disolvente de desarrollo (410) Poner la solucioacuten en la columna cromatograacutefica preparada con arreglo al punto 513 Evitar remover la superficie de la columna

Abrir la llave y dejar que salga la solucioacuten de la muestra hasta que llegue al nivel del gel de siacutelice Desarrollar con 150 ml de disolvente de desarrollo Ajustar el flujo a 2 mlmin (de forma que pasen a la columna 150 ml en unos 60 o 70 minutos)

Recuperar el eluido en un matraz redondo de 250 ml tarado previashymente Evaporar el disolvente en vaciacuteo y retirar las uacuteltimas trazas de este en corriente de nitroacutegeno

Pesar el matraz y calcular el extracto recuperado

M21


[En caso de utilizacioacuten de cartuchos SPE de siacutelice listos para el empleo proceder de la manera siguiente introducir 1 ml de solucioacuten (512) en los cartuchos previamente preparados con 3 ml de n-hexano

Despueacutes de filtrar la solucioacuten desarrollar con 4 ml de n-hexanoeacuteter dietiacutelico 91 (VV)

Recuperar el eluido en un tubo de 10 ml y someterlo a evaporacioacuten en corriente de nitroacutegeno hasta sequedad

Someter el residuo seco a la accioacuten de la lipasa pancreaacutetica (52) Es fundamental verificar la composicioacuten en aacutecidos grasos antes y despueacutes del paso por el cartucho SPE]

52 Hidroacutelisis con lipasa pancreaacutetica

521 En el tubo de la centriacutefuga pesar 01 g de aceite preparado con arreglo al punto 51 Antildeadir 2 ml de solucioacuten amortiguadora (46) 05 ml de la solucioacuten de colato de sodio (47) y 02 ml de la solucioacuten de cloruro de calcio agitando bien tras cada adicioacuten Cerrar el tubo con el tapoacuten esmerilado y colocarlo en el termostato a 40 degC plusmn 05 degC

522 Antildeadir 20 mg de lipasa agitar cuidadosamente (evitando mojar el tapoacuten) y poner el tubo en el termostato durante 2 minutos exactos retirarlo despueacutes agitarlo eneacutergicamente durante un 1 minuto exacto y dejar enfriar

523 Antildeadir 1 ml de eacuteter dietiacutelico taponar y agitar eneacutergicamente despueacutes centrifugar y pasar la solucioacuten de eacuteter a un tubo limpio y seco con ayuda de una microjeringa

53 Preparacioacuten de los derivados sililados y de la cromatografiacutea de gases

531 Mediante una microjeringa introducir 100 μl de solucioacuten (523) en un tubo de fondo coacutenico de 10 ml

532 Eliminar el disolvente en corriente ligera de nitroacutegeno antildeadir 200 μl de reactivo de sililacioacuten (415) taponar el tubo y dejar reposar durante 20 minutos

533 Tras 20 minutos antildeadir entre 1 y 5 ml de n-hexano (en funcioacuten de las condiciones cromatograacuteficas) la solucioacuten resultante estaacute lista para la cromatografiacutea de gases


Las condiciones de trabajo son las siguientes

mdash temperatura del inyector (inyector en columna) inferior a la temperatura de ebullicioacuten del disolvente (68 degC)


mdash temperatura de la columna programacioacuten de la temperatura del horno 60 degC durante 1 minuto subir 15 degC por minuto hasta 180 degC despueacutes 5 degC por minuto hasta 340 degC y despueacutes 340 degC durante 13 minutos

mdash gas portador hidroacutegeno o helio regulado a la velocidad lineal adecuada para obtener la resolucioacuten reflejada en la figura 1 El tiempo de retencioacuten del trigliceacuterido C 54 debe ser de 40 plusmn 5 minutos (veacutease la figura 2) (Las condiciones de trabajo que se recogen aquiacute se proponen a tiacutetulo indicativo Cada operador deberaacute optimizarlas para alcanzar la resolucioacuten deseada La altura del pico correspondiente al monopalmitato de 2-glicerilo debe tener una altura miacutenima igual al 10 de la escala del registrador)

M21


mdash cantidad de sustancia inyectada 05-1 μl de la solucioacuten (5 ml) de n- hexano (533)


Los distintos monogliceacuteridos se identifican en funcioacuten de sus tiempos de retencioacuten obtenidos comparaacutendolos con los correspondientes a las mezclas patroacuten de monogliceacuteridos analizadas en las mismas condiciones


El aacuterea de cada pico se calcula mediante un integrador electroacutenico


El porcentaje de monopalmitato de glicerilo se calcula a partir de la relacioacuten entre el aacuterea del pico correspondiente y la suma de las aacutereas de los picos de todos los monogliceacuteridos (veacutease la figura 2) seguacuten la foacutermula siguiente

Monopalmitato de glicerilo () A x P

A Uuml 100

siendo

A x = el aacuterea del pico correspondiente al monopalmitato de glicerilo

sumA = la suma de las aacutereas de todos los picos de los monogliceacuteridos

El resultado debe expresarse con una cifra decimal

7 INFORME DEL ANAacuteLISIS

El informe del anaacutelisis deberaacute especificar

mdash la referencia al presente meacutetodo

mdash toda la informacioacuten necesaria para la completa identificacioacuten de la muestra

mdash el resultado del anaacutelisis

mdash las eventuales desviaciones respecto al presente meacutetodo tanto si se trata de una decisioacuten de los interesados como si se debe a cualquier otra razoacuten

mdash los datos de identidad del laboratorio la fecha del anaacutelisis y la firma de los responsables del mismo

M21


Figura 1

Cromatograma de los productos de la reaccioacuten de sililacioacuten obtenidos por accioacuten de la lipasa en un aceite de oliva refinado con la adicioacuten de un 20 de aceite esterificado (100 )

Leyenda laquoacides gras libresraquo = Aacutecidos grasos libres laquoHuile drsquoolive raffineacutee + 20 huile esteacuterifieacuteeraquo = Aceite de oliva refinado + 20 aceite de oliva esterificado laquo1-2 monopalmitoleacuteineraquo = 1-2 monopalmitina laquo1-2 mono C 18 insatraquo = 12-mono C 18 insat laquoSqualeneraquo = Escualeno laquo1-2 monopalmitoleacuteineraquo = 12-monopalmitoleiacutena laquoScanraquo = Lectura

M21


Figura 2

Cromatograma de

A) aceite de oliva no esterificado previo tratamiento con lipasa y sililacioacuten en estas condiciones (columna capilar de 8 a 12 m) la fraccioacuten de ceras se eluye al mismo tiempo que la fraccioacuten de digliceacuteridos o poco despueacutes

Tras el tratamiento con lipasa el contenido en trigliceacuteridos no deberiacutea superar el 15

Leyenda

1 = Aacutecidos grasos libres

2 = Monogliceacuteridos

3 = Digliceacuteridos

4 = Trigliceacuteridos

= 2-monopalmitina

= Trigliceacuterido C 54

M21


Cromatograma de

B) aceite esterificado previo tratamiento con lipasa y sililacioacuten en estas condiciones (columna capilar de 8 a 12 m) la fraccioacuten de ceras se eluye al mismo tiempo que la fraccioacuten de digliceacuteridos o poco despueacutes


Leyenda





= 2-monopalmitina


M21


8 NOTAS

Nota 1 PREPARACIOacuteN DE LA LIPASA

En el comercio se encuentran lipasas con una actividad satisfacshytoria Tambieacuten es posible prepararlas en el laboratorio de la forma siguiente

Enfriar a 0 degC 5 kg de paacutencreas fresco de cerdo Retirar la grasa soacutelida y el tejido conjuntivo que lo rodea y triturarlo en un molino de cuchillas hasta obtener una pasta fluida Agitar dicha pasta durante 4-6 horas con 25 l de acetona anhidra y despueacutes centrifugar Extraer el residuo tres veces maacutes con el mismo volumen de acetona anhidra despueacutes dos veces con una mezcla de acetonaeacuteter dietiacutelico 11 (VV) y otras dos veces con eacuteter dietiacutelico

Secar el residuo durante 48 horas en vaciacuteo para obtener un polvo estable que deberaacute conservarse en el refrigerador y al abrigo de la humedad

Nota 2 CONTROL DE LA ACTIVIDAD LIPAacuteSICA

Preparar una emulsioacuten de aceite de oliva de la forma siguiente

Agitar en un mezclador durante 10 minutos una mezcla constituida por 165 ml de una solucioacuten de goma araacutebiga de 100 gl 15 gramos de hielo picado y 20 ml de un aceite de oliva previamente neutralshyizado

Poner en un vaso de precipitados de 50 ml sucesivamente 10 ml de la emulsioacuten anterior 03 ml de una solucioacuten de colato de sodio de 02 gml y 20 ml de agua destilada

Colocar el vaso en un termostato regulado a 37 degC introducir en el vaso los electrodos del pH-metro y el agitador de heacutelice

Por medio de una bureta antildeadir gota a gota una solucioacuten de hidroacutexido de sodio 01 N hasta la obtencioacuten de un pH de 83

Antildeadir un volumen de suspensioacuten de polvo de lipasa en agua (01 gml de lipasa) Desde el momento en que el pH-metro indique un pH de 83 poner en marcha el cronoacutemetro y antildeadir la solucioacuten de hidroacutexido de sodio gota a gota al ritmo necesario para mantener el pH en el valor de 83 Anotar cada minuto el volumen de solucioacuten consumido

Llevar los datos obtenidos a un sistema de coordenadas poniendo en abscisas los tiempos y en ordenadas los mililitros de solucioacuten alcalina 01 N consumidos para mantener el pH constante Debe obtenerse un graacutefico lineal

La actividad de la lipasa medida en unidades de lipasa por mg viene dada por la foacutermula siguiente

A frac14 V Uuml N Uuml 100

m

siendo

A la actividad en unidades de lipasamg

V el nuacutemero de mililitros de solucioacuten de hidroacutexido de sodio 01 N por minuto (calculado a partir del graacutefico)

N la normalidad de la solucioacuten de hidroacutexido de sodio

m la masa en miligramos de la lipasa correspondiente

La unidad de lipasa se define como la cantidad de enzima que libera 10 micro-equivalentes de aacutecido por minuto

M20 __________

M21


ANEXO IX

PRUEBA ESPECTROFOTOMEacuteTRICA EN EL ULTRAVIOLETA

INTRODUCCIOacuteN

El examen espectrofotomeacutetrico en el ultravioleta puede proporcionar indicaciones sobre la calidad de una materia grasa su estado de conservacioacuten y las modifishycaciones inducidas en ella por los procesos tecnoloacutegicos Las absorciones en las longitudes de onda indicadas en el meacutetodo se deben a la presencia de sistemas dieacutenicos y trieacutenicos conjugados que resultan de los procesos de oxidacioacuten yo de las praacutecticas de refineriacutea Los valores de estas absorciones se expresan en extinshyciones especiacuteficas E

1 1 cm (extincioacuten de una solucioacuten de la materia grasa al 1 en

el disolvente determinado en un espesor de 10 mm) que se expresaraacute convenshycionalmente como K (tambieacuten denominado laquocoeficiente de extincioacutenraquo)

1 AacuteMBITO DE APLICACIOacuteN

Este anexo describe el procedimiento de ejecucioacuten de una prueba especshytrofotomeacutetrica del aceite de oliva en la regioacuten ultravioleta

2 PRINCIPIO DEL MEacuteTODO

Se disuelve una muestra en el disolvente requerido y se determina la absorcioacuten de la solucioacuten a las longitudes de onda prescritas respecto al disolvente puro

Las extinciones especiacuteficas a 232 nm y 268 nm en isooctano o a 232 nm y 270 nm en ciclohexano se calculan para una concentracioacuten del 1 pv en una cubeta de 10 mm

3 EQUIPO

31 Un espectrofotoacutemetro para medidas en longitudes de onda ultravioleta (de 220 nm a 360 nm) con capacidad de lectura para cada unidad nanoshymeacutetrica Se recomienda realizar una comprobacioacuten perioacutedica de la precisioacuten y la reproducibilidad de la absorbencia y de las escalas de longitud de onda asiacute como de la luz paraacutesita

311 Escala de onda puede comprobarse mediante un material de referencia que consta de un filtro de vidrio oacuteptico que contiene oacutexido de holmio o una solucioacuten de oacutexido de holmio (sellado o no) con distintas bandas de absorcioacuten El material de referencia estaacute concebido para la verificacioacuten y calibracioacuten de las escalas de longitud de onda de espectrofotoacutemetros de luz visible y ultravioleta con anchos nominales de banda espectral de 5 nm o menos Las mediciones se efectuacutean con respecto a un blanco de aire en el rango de longitud de onda de 640 a 240 nm de acuerdo con las instrucciones que se incluyen en los materiales de referencia La correccioacuten de la liacutenea de base se realiza con un recorrido del haz vaciacuteo en cada alteracioacuten del ancho de ranura Las longitudes de onda de la norma se enumeran en el certificado del material de referencia

312 Escala de absorbencia puede comprobarse con materiales de referencia sellados comercialmente disponibles que constan de soluciones aacutecidas de dicromato potaacutesico en determinadas concentraciones y valores de absorshybencia certificados en su λmax (de cuatro soluciones de dicromato potaacutesico en aacutecido percloacuterico selladas en cuatro cubetas de cuarzo para UV para medir la linealidad y precisioacuten fotomeacutetrica en el UV) Las solushyciones de dicromato potaacutesico se miden con respecto a un blanco del aacutecido utilizado tras corregir la liacutenea de base de acuerdo con las instrucciones que se incluyen con el material de referencia Los valores de absorbencia se enumeran en el certificado del material de referencia

Otra posibilidad para controlar la respuesta de la ceacutelula fotoeleacutectrica y del fotomultiplicador es proceder como sigue se pesan 02 g de cromato potaacutesico de calidad para espectrofotometriacutea se disuelven en un matraz aforado de 1 000 ml en una solucioacuten de hidroacutexido potaacutesico 005 N y se completa hasta el enrase De la solucioacuten obtenida se toman exactamente 25 ml se transvasan a un matraz aforado de 500 ml y se completa hasta el enrase con la misma solucioacuten de hidroacutexido potaacutesico

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Se mide la extincioacuten a 275 nm de la solucioacuten asiacute obtenida utilizando la solucioacuten de hidroacutexido potaacutesico como referencia La extincioacuten medida en cubeta de 1 cm deberaacute ser de 0200 plusmn 0005

32 Cubetas de cuarzo con tapadera para medidas en longitudes de onda ultravioleta (de 220 a 360 nm) con paso oacuteptico de 10 mm Las cubetas llenas de agua o de otro disolvente adecuado no deben presentar entre ellas diferencias superiores a 001 unidades de extincioacuten

33 Un matraz aforado con capacidad de 25 ml de clase A

34 Balanza analiacutetica capaz de leer con una precisioacuten de 00001 g

4 REACTIVOS

Durante el anaacutelisis a menos que se indique lo contrario deben utilizarse uacutenicamente reactivos de calidad analiacutetica reconocida y agua destilada desmineralizada o de una pureza equivalente

Disolvente iso-octano (224-trimetilpentano) para la medicioacuten a 232 nm y 268 nm o ciclohexano para la medicioacuten a 232 nm y 270 nm con una absorbencia inferior a 012 a 232 nm e inferior a 005 a 270 nm frente a agua destilada medida en una cubeta de 10 mm

5 PROCEDIMIENTO

51 La muestra debe ser perfectamente homogeacutenea y estar exenta de impurezas en suspensioacuten De no ser asiacute debe ser filtrada con papel a una temperatura de aproximadamente 30 degC

52 Pesar en un matraz aforado de 25 ml unos 025 g (con precisioacuten de 1 mg) de la muestra asiacute preparada enrasar con el disolvente especificado y homogeneizar La solucioacuten resultante debe estar perfectamente clara Si presenta opalescencia o turbidez filtrar raacutepidamente con papel de filtro

NOTA por lo general basta con una masa de 025-030 g para las medidas de absorbencia de aceites de oliva virgen y virgen extra a 268 nm y 270 nm Para mediciones a 232 nm se requieren normalmente 005 g de muestra de modo que por lo general se preparan dos soluciones distintas En el caso de medidas de absorbencia de los aceites de orujo de oliva los aceites de oliva refinados y los aceites de oliva adulterados por lo general se necesita una porcioacuten menor de muestra por ejemplo 01 g debido a su mayor absorbencia

53 En caso necesario corregir la liacutenea de base (220-290 nm) con el disolvente en cubetas de cuarzo (muestra y referencia) a continuacioacuten rellenar la cubeta de cuarzo de muestra con la solucioacuten de prueba y medir la extinciones a 232 268 o 270 nm con respecto al disolvente utilizado como referencia

Los valores de extincioacuten obtenidos deben estar comprendidos en el intervalo entre 01 y 08 o dentro del rango de linealidad del espectrofoshytoacutemetro que debe verificarse De lo contrario es necesario repetir la medicioacuten utilizando soluciones maacutes concentradas o maacutes diluidas seguacuten el caso

54 Despueacutes de medir la absorbencia a 268 o 270 nm medir la absorbencia a λmax λmax + 4 y λmax ndash 4 Estos valores de absorbencia se utilizan para determinar la variacioacuten en la extincioacuten especiacutefica (ΔΚ)

NOTA λmax se considera que es igual a 268 nm cuando se utiliza isooctano como disolvente y 270 nm cuando se utiliza ciclohexano

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61 Se registran las extinciones especiacuteficas o coeficientes de extincioacuten a las diversas longitudes de onda calculadas como sigue

Kλ frac14 Eλ

c Uuml s

donde

Kλ = extincioacuten especiacutefica a la longitud de onda λ

Eλ = extincioacuten medida a la longitud de onda λ

c = concentracioacuten de la solucioacuten en g100 ml

s = longitud del paso de la cubeta de cuarzo en cm

expresado con dos decimales

62 Variacioacuten de la extincioacuten especiacutefica (ΔΚ)

La variacioacuten del valor absoluto de la extincioacuten (ΔΚ) se define como

ΔK frac14 jK m Auml Iacute Kλm Auml 4 thorn Kλm thorn 4

2 Icirc j

donde Km es la extincioacuten especiacutefica a la longitud de onda de maacutexima absorcioacuten a 270 nm y 268 nm en funcioacuten del disolvente utilizado

El resultado ha de venir expresado con dos decimales

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ANEXO X

DETERMINACIOacuteN DE EacuteSTERES METIacuteLICOS DE AacuteCIDOS GRASOS MEDIANTE CROMATOGRAFIacuteA DE GASES


Este anexo ofrece orientacioacuten sobre la determinacioacuten de aacutecidos grasos libres y unidos mediante cromatografiacutea de gases en las grasas y aceites vegetales tras su conversioacuten en eacutesteres metiacutelicos de aacutecidos grasos

Los aacutecidos grasos unidos de los trigliceacuteridos y en funcioacuten del meacutetodo de esterificacioacuten los aacutecidos grasos libres se convierten en eacutesteres metiacutelicos de aacutecidos grasos que se determinan mediante cromatografiacutea de gases con columna capilar

El meacutetodo descrito en el presente anexo permite determinar los eacutesteres metiacutelicos de aacutecidos grasos de C 12 a C 24 incluidos los eacutesteres metiacutelicos de aacutecidos grasos saturados cis y trans monoinsaturados y cis y trans poliinsaturados

2 PRINCIPIO

La cromatografiacutea de gases (CG) se utiliza para el anaacutelisis cuantitativo de los eacutesteres metiacutelicos de aacutecidos grasos Los eacutesteres metiacutelicos de aacutecidos grasos se preparan con arreglo a la Parte A A continuacioacuten se inyectan y evaporan dentro del inyector La separacioacuten de los eacutesteres metiacutelicos de aacutecidos grasos se lleva a cabo en columnas analiacuteticas de polaridad y longitud especiacuteficas Para detectar los eacutesteres metiacutelicos de aacutecidos grasos se utiliza un detector de ionizacioacuten de llama (DIL) Las condiciones del anaacutelisis figuran en la Parte B

Podraacute utilizarse hidroacutegeno o helio como gas portador (fase moacutevil) en la cromatografiacutea de gases de eacutesteres metiacutelicos de aacutecidos grasos con el DIL El hidroacutegeno acelera la separacioacuten y produce picos maacutes fuertes La fase estacionaria es una capa microscoacutepica de una fina peliacutecula liacutequida en una superficie soacutelida inerte de siacutelice fundida

A medida que pasan a traveacutes de la columna capilar los compuestos volatilshyizados que se analizan interactuacutean con la fase estacionaria recubriendo la superficie interior de la columna Debido a la distinta interaccioacuten de los compuestos estos se eluyen en momentos diferentes lo que se conoce como tiempo de retencioacuten del compuesto para un conjunto determinado de paraacutemetros de anaacutelisis La comparacioacuten de los tiempos de retencioacuten se utiliza para identificar los diferentes compuestos

PARTE A

PREPARACIOacuteN DE LOS EacuteSTERES METIacuteLICOS DE LOS AacuteCIDOS GRASOS DEL ACEITE DE OLIVA Y DEL ACEITE DE ORUJO DE

OLIVA


Esta parte especifica la preparacioacuten de los eacutesteres metiacutelicos de los aacutecidos grasos Incluye los meacutetodos para preparar eacutesteres metiacutelicos de los aacutecidos grasos de los aceites de oliva y de los aceites de orujo de oliva

2 CAMPO DE APLICACIOacuteN

La preparacioacuten de los eacutesteres metiacutelicos de aacutecidos grasos de los aceites de oliva y de los aceites de orujo de oliva se lleva a cabo por transesteshyrificacioacuten con solucioacuten metanoacutelica de hidroacutexido de potasio a temperatura ambiente La necesidad de purificacioacuten de la muestra antes de la transshyesterificacioacuten depende del contenido de aacutecidos grasos libres de la muestra y del paraacutemetro analiacutetico que se vaya a determinar puede elegirse en funcioacuten de la tabla siguiente

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Categoriacutea del aceite Meacutetodo

Aceite de oliva virgen con acidez le 20

1 Aacutecidos grasos

2 Aacutecidos grasos trans

3 ΔECN42 (despueacutes de la purifishycacioacuten con gel de siacutelice SPE)

Aceite de oliva refinado

Aceite de oliva compuesto de aceite de oliva refinado y aceites de oliva viacutergenes

Aceite de orujo de oliva refinado

Aceite de orujo de oliva

Aceite de oliva virgen con acidez gt 20 Aceite de orujo de oliva crudo

1 Aacutecidos grasos (despueacutes de la purificacioacuten con gel de siacutelice SPE)

2 Aacutecidos grasos trans (despueacutes de la purificacioacuten con gel de siacutelice SPE)


3 METODOLOGIacuteA

31 Transesterificacioacuten con solucioacuten metanoacutelica de hidroacutexido de potasio a temperatura ambiente

311 Principio

Los eacutesteres metiacutelicos se forman por transesterificacioacuten con una solucioacuten metanoacutelica de hidroacutexido potaacutesico como etapa intermedia antes de que se produzca la saponificacioacuten

312 Reactivos

3121 Metanol con un contenido en agua igual o inferior al 05 (mm)

3122 Hexano para cromatografiacutea

3123 Heptano para cromatografiacutea

3124 Eacuteter dietiacutelico estabilizado para su anaacutelisis

3125 Acetona para cromatografiacutea

3126 Disolvente de elucioacuten para purificar el aceite mediante cromatografiacutea en columnaSPE mezcla de eacuteter de hexanoeacuteter dietiacutelico 8713 (vv)

3127 Hidroacutexido de potasio solucioacuten metanoacutelica de aproximadamente 2 M disolver 112 g de hidroacutexido potaacutesico en 100 ml de metanol

3128 Cartuchos de gel de siacutelice 1 g (6 ml) para extraccioacuten en fase soacutelida

313 Equipo

3131 Tubos de rosca (5 ml de volumen) con tapoacuten provisto de junta de PTFE

3132 Pipetas aforadas o automaacuteticas de 2 ml y 02 ml

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314 Purificacioacuten de las muestras de aceite

Cuando sea necesario las muestras se purificaraacuten pasando el aceite a traveacutes de un cartucho de gel de siacutelice para extraccioacuten en fase soacutelida Se coloca un cartucho de gel de siacutelice (3128) en un aparato de elucioacuten en vaciacuteo y se lava con 6 ml de hexano (3122) el lavado se realiza sin vaciacuteo A continuacioacuten se introduce en la columna una solucioacuten de aceite (012 g aproximadamente) en 05 ml de hexano (3122) Despueacutes se eluye con 10 ml de hexanoeacuteter dietiacutelico (8713 vv) (3126) Se homogeneiza la totalidad de los eluidos y se divide en dos aliacutecuotas similares Una aliacutecuota se evapora hasta sequedad en un evaporador rotatorio a presioacuten reducida y a temperatura ambiente El residuo se disuelve en 1 ml de heptano y la solucioacuten queda lista para el anaacutelisis de aacutecidos grasos por CG La segunda aliacutecuota se evapora y el residuo se disuelve en 1 ml de acetona para el anaacutelisis de los trigliceacuteridos mediante HPLC si es necesario

315 Procedimiento

En un tubo de rosca de 5 ml (3131) pesar aproximadamente 01 g de la muestra de aceite Antildeadir 2 ml de heptano (3122) y agitar Antildeadir 02 ml de la solucioacuten metanoacutelica de hidroacutexido potaacutesico (3127) poner el tapoacuten provisto de junta de PTFE cerrar bien y agitar eneacutergicamente durante 30 segundos Dejar reposar hasta que la parte superior de la solucioacuten quede clara Decantar la capa superior que es la que contiene los eacutesteres metiacutelicos La solucioacuten de heptano estaacute lista para inyectarse en el cromatoacutegrafo Es aconsejable mantener la solucioacuten en el frigoriacutefico hasta el momento de realizar el anaacutelisis cromatograacutefico No se recoshymienda guardar la solucioacuten durante maacutes de 12 horas

PARTE B

ANAacuteLISIS DE EacuteSTERES METIacuteLICOS DE AacuteCIDOS GRASOS MEDIANTE CROMATOGRAFIacuteA DE GASES


Esta parte proporciona orientaciones generales para utilizar la cromatoshygrafiacutea de gases en columna capilar para determinar la composicioacuten cualitativa y cuantitativa de una mezcla de eacutesteres metiacutelicos de aacutecidos grasos obtenidos con arreglo al meacutetodo especificado en la Parte A

El meacutetodo no es aplicable a los aacutecidos grasos polimerizados

2 REACTIVOS

21 Gas portador

Gas inerte (helio o hidroacutegeno) perfectamente desecado y que contenga menos de 10 mgkg de oxiacutegeno

Nota 1 El hidroacutegeno puede duplicar la velocidad de anaacutelisis pero es peligroso Existen dispositivos de seguridad

22 Gases auxiliares

221 Hidroacutegeno (pureza ge 999 ) exento de impurezas orgaacutenicas

222 Aire u oxiacutegeno exento de impurezas orgaacutenicas

223 Nitroacutegeno (pureza gt 99 )

23 Patroacuten de referencia

Una mezcla de eacutesteres metiacutelicos de aacutecidos grasos puros o los eacutesteres metiacutelicos de una grasa de composicioacuten conocida y preferentemente similar a la de la materia grasa objeto de anaacutelisis Los isoacutemeros cis y trans de eacutesteres metiacutelicos octadecenoicos octadecadienoicos y octadecshyatrienoicos son uacutetiles para la identificacioacuten de isoacutemeros trans de aacutecidos insaturados

Deberaacute evitarse la oxidacioacuten de los aacutecidos grasos poliinsaturados

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3 INSTRUMENTAL

Las normas que figuran a continuacioacuten se refieren al equipo ordinario para cromatografiacutea de gases utilizando columnas capilares y un detector de ionizacioacuten de llama

31 Cromatoacutegrafo de gases

El cromatoacutegrafo de gases constaraacute de los siguientes elementos

311 Sistema de inyeccioacuten

Utilizar un sistema de inyeccioacuten con columnas capilares en este caso el sistema de inyeccioacuten deberaacute estar especialmente disentildeado para poder operar con esa clase de columnas Podraacute utilizarse un inyector con divisioacuten de flujo o un inyector en columna sin fraccionamiento

312 Horno

El horno podraacute calentar la columna capilar a 260 degC como miacutenimo y mantener dicha temperatura con una oscilacioacuten maacutexima de 01 degC Este uacuteltimo requisito es especialmente importante si se utiliza una columna de siacutelice fundida

Se recomienda emplear en todos los casos un sistema de calentamiento programado sobre todo en el caso de aacutecidos grasos con menos de 16 aacutetomos de carbono

313 Columna capilar

3131 Tubo de un material inerte a las sustancias que vayan a analizarse (generalmente vidrio o siacutelice fundida) El diaacutemetro interior seraacute de entre 020 y 032 miliacutemetros La superficie interior se someteraacute a un tratamiento adecuado (por ejemplo preparacioacuten de la superficie inactishyvacioacuten) antes de recibir el recubrimiento de fase estacionaria Para los aacutecidos grasos y los isoacutemeros cis y trans de los aacutecidos grasos basta con una longitud de 60 m

3132 En la fase estacionaria son apropiadas las columnas de polisiloxano polar (cianopropilsilicona) de fase quiacutemicamente ligada

Nota 2 Existe el riesgo de que los polisiloxanos polares dificulten la identificacioacuten y separacioacuten del aacutecido linoleacutenico y de los aacutecidos C 20

El espesor de la fase estaraacute comprendido entre 01 y 02 μm

3133 Montaje y acondicionamiento de la columna

Observar las precauciones normales de montaje de columnas capilares (es decir instalacioacuten de la columna en el horno eleccioacuten y montaje de las juntas (estanqueidad) conexioacuten de los extremos de la columna al inyector y al detector (reduccioacuten de los espacios muertos) Colocar la columna bajo un flujo de gas portador [por ejemplo 03 bar (30 kPa) para una columna de 25 m de longitud y 03 mm de diaacutemetro interior]

Acondicionar la columna programando el gradiente de temperatura del horno a 3 degCmin a partir de la temperatura ambiente hasta alcanzar una temperatura 10 degC inferior al liacutemite de descomposicioacuten de la fase estashycionaria Mantener el horno a esa temperatura durante 1 hora hasta que se estabilice la liacutenea de base Restablecer la temperatura de 180 degC para trabajar en condiciones isoteacutermicas

Nota 3 En el comercio pueden obtenerse columnas adecuadas previamente acondicionadas


32 Jeringa

Tendraacute una capacidad maacutexima de 10 μl y estaraacute graduada en 01 μl

33 Sistema de recopilacioacuten de datos

Sistema de recopilacioacuten de datos conectado en liacutenea con los detectores y con un programa de software adecuado para la integracioacuten y normalshyizacioacuten de los picos

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4 PROCEDIMIENTO

Las operaciones descritas en los puntos 41 a 43 solo son vaacutelidas si se emplea un detector de ionizacioacuten de llama

41 Condiciones de ensayo

411 Seleccioacuten de las condiciones de funcionamiento oacuteptimas para las columnas capilares

Debido a la eficacia y permeabilidad de las columnas capilares la separacioacuten de los constituyentes y la duracioacuten del anaacutelisis dependen considerablemente del flujo del gas portador en la columna Por lo tanto seraacute necesario optimizar las condiciones de funcionamiento mediante el ajuste de este paraacutemetro (o la simple peacuterdida de carga de la columna) dependiendo de si el objetivo es mejorar la separacioacuten o la velocidad de anaacutelisis

Las siguientes condiciones han demostrado ser adecuadas para la separacioacuten de los eacutesteres metiacutelicos de aacutecidos grasos (C 4 a C 26 ) En el apeacutendice B se muestran ejemplos de cromatogramas

Temperatura del inyector 250 degC

Temperatura del detector 250 degC

Temperatura del horno de 165 degC (8 min) a 210 degC a 2 degCmin

Gas portador hidroacutegeno presioacuten en la cabeza de la columna 179 kPa

Flujo total 1540 mlmin

Relacioacuten de fraccionamiento 1100

Volumen de inyeccioacuten 1 μl

412 Determinacioacuten de la resolucioacuten (veacutease el apeacutendice A)

Calcular la resolucioacuten R de dos picos vecinos I y II utilizando la foacutermula

R = 2 times ((d r(II) ndash d r(I) )(ω (I) + ω (II) )) o R = 2 times ((t r(II) ndash t r(I) )(ω (I) + ω (II) )) (USP) (Farmacopea de los Estados Unidos)

O

R = 118 times ((t r(II) ndash t r(I) )(ω 05(I) + ω 05(II)) )) (EP BP JP DAB) (JP (Farmacopea japonesa) EP (Farmacopea europea) BP (Farmacopea

britaacutenica))

donde

d r(I) es la distancia de retencioacuten del pico I

d r(II) es la distancia de retencioacuten del pico II

t r(I) es el tiempo de retencioacuten del pico I

t r(II) es el tiempo de retencioacuten del pico II

ω (I) es la anchura de la base del pico I

ω( II) es la anchura de la base del pico II

ω 05 es la anchura del compuesto especificado a media altura del pico

Si ω (I) asymp ω (II) calcular R empleando las foacutermulas siguientes

R = (d r(II) ndash d r(I) )ω = (d r(II) ndash d r(I) )4σ

donde

σ es la desviacioacuten estaacutendar (consulte el apeacutendice A Figura 1)

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Si la distancia dr entre los dos picos d r(II) - d r(I) es igual a 4σ el factor de resolucioacuten es R = 1

Si dos picos no estaacuten completamente separados las tangentes a los puntos de inflexioacuten de los dos picos se intersecan en el punto C Para separar completamente los dos picos la distancia entre los dos debe ser igual a

d r(II) - d r(I) = 6 σ siendo R = 15 (veacutease el apeacutendice A figura 3)


51 Anaacutelisis cualitativo

Identificar los picos de eacutesteres metiacutelicos de la muestra a partir del cromatograma del apeacutendice B figura 1 si es necesario por interpolacioacuten o por comparacioacuten con los de las mezclas de eacutesteres metiacutelicos de referencia (tal como se indica en el punto 23)

52 Anaacutelisis cuantitativo

521 Determinacioacuten de la composicioacuten

Calcular el porcentaje en peso w i de cada eacutester metiacutelico de aacutecidos grasos expresado como un porcentaje en peso de los eacutesteres metiacutelicos de la siguiente manera

522 Meacutetodo de caacutelculo

5221 Caso general

Calcular el contenido de un componente dado (i) (expresado como porcentaje en masa de eacutesteres metiacutelicos) mediante la determinacioacuten del porcentaje que representa el aacuterea de su pico en relacioacuten con la suma de las aacutereas de todos los picos aplicando la foacutermula siguiente

w i = (A i ΣA) times 100

donde

A i es la superficie debajo del pico de cada eacutester metiacutelico de aacutecido graso i

ΣA es la suma de las superficies de todos los picos de todos los eacutesteres metiacutelicos de aacutecidos grasos

Los resultados se expresan con dos cifras decimales

Nota 4 Para las grasas y aceites la fraccioacuten de masa de los eacutesteres metiacutelicos de aacutecidos grasos es igual a la fraccioacuten de masa de los trigliceacuteridos en gramos por cada 100 g Para los casos en que no es vaacutelida esta consideracioacuten veacutease el punto 5222

5222 Utilizacioacuten de factores de correccioacuten

En determinados casos por ejemplo en presencia de aacutecidos grasos con menos de ocho aacutetomos de carbono o de aacutecidos con grupos secundarios las superficies se corregiraacuten con factores de correccioacuten especiacuteficos (Fci) Estos factores se determinaraacuten para cada uno de los instrumentos Para ello se utilizaraacuten materiales de referencia adecuados con composicioacuten de aacutecidos grasos certificada en el rango correspondiente

Nota 5 Estos factores de correccioacuten no son ideacutenticos a los factores de correccioacuten teoacutericos DIL que se indican en el apeacutendice A ya que estos tambieacuten incluyen el funcionamiento del sistema de inyeccioacuten etc Sin embargo en el caso de que haya diferencias mayores debe revisarse el funcionamiento de todo el sistema

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La foacutermula que se aplicaraacute a la mezcla de referencia para obtener el porcentaje en peso de los eacutesteres metiacutelicos de aacutecidos grasos i es la siguiente

w i = (m i Σm) times 100

donde

m i es el peso de los eacutesteres metiacutelicos de aacutecidos grasos i en la mezcla de referencia

Σm es la suma de los pesos de los diversos componentes como los eacutesteres metiacutelicos de aacutecidos grasos de la mezcla de referencia

A partir del cromatograma de la mezcla de referencia calcular el porcentaje en superficie de los eacutesteres metiacutelicos de aacutecidos grasos i del siguiente modo


donde

A i es la superficie de los eacutesteres metiacutelicos de aacutecidos grasos i en la mezcla de referencia

ΣA es la suma de todas las superficies de todos los eacutesteres metiacutelicos de aacutecidos grasos de la mezcla de referencia

El factor de correccioacuten F c es entonces

F c = (m i times ΣA)(A i Σm)

En el caso de la muestra el porcentaje en peso de cada eacutester metiacutelico de aacutecidos grasos i es

w i = (F i times A i )Σ (F i times A i )


Nota 6 El valor calculado se corresponde con el porcentaje en peso de cada aacutecido graso calculado como trigliceacuterido por cada 100 g de materia grasa

5223 Utilizacioacuten de patroacuten interno

En algunos anaacutelisis (por ejemplo cuando no se cuantifican todos los aacutecidos grasos por estar presentes simultaacuteneamente aacutecidos de 4 y 6 aacutetomos de carbono y aacutecidos de 16 y 18 aacutetomos de carbono o cuando es necesario determinar la cantidad absoluta de un aacutecido graso en la muestra) es preciso utilizar un patroacuten interno Se emplean con frecuencia aacutecidos grasos de 5 15 o 17 aacutetomos de carbono Debe detershyminarse si es necesario el factor de correccioacuten del patroacuten interno

El porcentaje en peso del componente i expresado como eacutesteres metiacutelicos se calcula mediante esta foacutermula

w i = (m IS times F i x A i )(m times F IS times A IS )

donde

A i es la superficie de los eacutesteres metiacutelicos de aacutecidos grasos i

A IS es la superficie del patroacuten interno

F i es el factor de correccioacuten del aacutecido graso i expresado como eacutester metiacutelico de aacutecidos grasos

F IS es el factor de correccioacuten del patroacuten interno

m es el peso de la porcioacuten analiacutetica en miligramos

m IS es el peso del patroacuten interno en miligramos


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6 INFORME DEL ENSAYO

En el informe del anaacutelisis se expondraacuten los meacutetodos utilizados para la preparacioacuten de los eacutesteres metiacutelicos y para la realizacioacuten del anaacutelisis mediante cromatografiacutea de gases Se mencionaraacuten asimismo cualesshyquiera procedimientos de trabajo que no se especifiquen en el presente meacutetodo estaacutendar o que se consideren facultativos asiacute como toda circshyunstancia que pueda haber influido en los resultados

El informe del anaacutelisis incluiraacute todos los datos necesarios para la completa identificacioacuten de la muestra

7 PRECISIOacuteN

71 Resultados de la prueba interlaboratorios

Los datos de la prueba interlaboratorios con respecto a la precisioacuten del meacutetodo figura en el anexo C a la norma COIT 20Doc N o 33 Los valores derivados de esta prueba interlaboratorios pueden no ser aplishycables a matrices y gamas de concentracioacuten distintas de las indicadas aquiacute

72 Repetibilidad

La diferencia absoluta entre dos resultados independientes y uacutenicos de una prueba obtenidos utilizando el mismo meacutetodo con el mismo material de prueba en el mismo laboratorio por el mismo operario con el mismo equipo dentro de un breve plazo no superaraacute en maacutes del 5 de los casos el valor r que figura en las tablas 1 a 14 del anexo C a la norma COIT 20Doc N o 33

73 Reproducibilidad

La diferencia absoluta entre dos resultados particulares de una prueba obtenidos utilizando el mismo meacutetodo con el mismo material de prueba en distintos laboratorios por distintos operarios con distintos equipos en maacutes del 5 de los casos no seraacute mayor que el valor R que figura en las tablas 1 a 14 del anexo C a la norma COIT 20Doc N o 33

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Apeacutendice A

Figura 1

con anchura ω 05 a media altura del triaacutengulo (ABC) y anchura b a media altura del triaacutengulo (NPM)

Figura 2 Figura 3

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Apeacutendice B

Figura 1

Perfil cromatograacutefico de un aceite de orujo de oliva obtenido con el meacutetodo de metilacioacuten en friacuteo

Los picos cromatograacuteficos corresponden a los eacutesteres metiacutelicos excepto aquellos en que se indica otra cosa

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ANEXO XI

DETERMINACIOacuteN DEL CONTENIDO EN C1 DISOLVENTES HALOGENADOS VOLAacuteTILES EN EL ACEITE DE OLIVA


Anaacutelisis por cromatografiacutea en fase gaseosa seguacuten la teacutecnica del espacio de cabeza (head space)

2 EQUIPO

21 Cromatografiacutea de gases con detector de captura de electrones (ECD)

22 Equipo para espacio de cabeza (head space)

23 Columna de cromatografiacutea en fase gaseosa de vidrio de 2 metros de largo y 2 mm de diaacutemetro fase estacionaria

OV 101 al 10 impregnado en cromosorb W-AW-DMCS (tierra de diatomeas calcinada lavada con aacutecido y silanizado (80mdash100 Mesh)

24 Gas portador y gas auxiliar nitroacutegeno para cromatografiacutea de gases de pureza adecuada para la deteccioacuten por captura de electrones

25 Frascos de cristal de 10 a 15 ml provistos de septum de tefloacuten y con una caacutepsula de aluminio con un orificio para toma de muestras con jeringa

26 Pinzas capsuladora para cerrar hermeacuteticamente

27 Jeringa para gases de 05 y 2 ml

3 REACTIVOS

C1 Disolventes halogenados con una pureza apropiada para su uso en cromatografiacutea en la fase gaseosa

4 PROCEDIMIENTO DE ANAacuteLISIS

41 Pesar con exactitud unos 3 g de aceite en un frasco de cristal (no reutilizshyable) tapar el frasco de manera que quede cerrado hermeacuteticamente Introducir el frasco en un bantildeo con termostato a 70 degC durante 1 hora Extraer con precisioacuten por medio de una jeringa un volumen de 02 a 05 ml del espacio de cabeza Inyectarlo en la columna del cromatoacutegrafo de gases con las siguientes condiciones

temperatura inyector 150 degC

temperatura columna 70mdash80 degC

temperatura detector 200mdash250 degC

Podraacuten utilizarse otras temperaturas siempre que los resultados sean equivshyalentes

La inyeccioacuten se puede realizar con el equipo para espacio de cabeza

42 Soluciones de referencia Preparar soluciones patroacuten utilizando aceite de oliva refinado sin trazas de C1 disolventes con concentraciones en hidrocarburos halogenados de 005 a 1 ppm (mgkg) seguacuten el contenido supuesto de la muestra Para preparar la solucioacuten de referencia si es necesario diluir previamente el hidrocarburo halogenado patroacuten puede utilshyizarse pentano

43 Cuantificacioacuten Se efectuacutea por caacutelculo mediante la relacioacuten de aacutereas o alturas del pico de la muestra y de la solucioacuten patroacuten cuya concentracioacuten sea la maacutes proacutexima a la de la muestra Si la desviacioacuten es superior al 10 seraacute necesario volver a hacer el anaacutelisis comparaacutendolo con una nueva solucioacuten patroacuten de concentracioacuten tal que se ajuste a la desviacioacuten relativa antes mencionada El contenido se estableceraacute efectuando la media de varias inyecciones

44 Expresioacuten de los resultados Los resultados se expresaraacuten en ppm (mgkg) El liacutemite de deteccioacuten del meacutetodo es de 001 mgkg

B


ANEXO XII

MEacuteTODO DEL CONSEJO OLEIacuteCOLA INTERNACIONAL PARA LA VALORACIOacuteN ORGANOLEacutePTICA DE LOS ACEITES DE OLIVA

VIacuteRGENES

M28


Este meacutetodo internacional tiene por finalidad establecer el procedimiento para evaluar las caracteriacutesticas organoleacutepticas de los aceites de oliva viacutergenes seguacuten se define en el punto 1 de la Parte VIII del anexo VII del Reglamento (UE) n o 13082013 del Parlamento Europeo y del Consejo ( 1 ) y describir el meacutetodo para su clasificacioacuten en funcioacuten de dichas caracteriacutesticas El meacutetodo incluye asimismo indicaciones para un etiquetado optativo

El meacutetodo descrito solo es aplicable a los aceites de oliva viacutergenes y a su clasificacioacuten o su etiquetado en funcioacuten de la intensidad de los defectos detectados y del atributo frutado determinados por un grupo de catadores seleccionados entrenados y evaluados constituidos en panel

Las normas del COI que se mencionan en este anexo deben usarse en la versioacuten maacutes reciente disponible

M26

2 ANAacuteLISIS SENSORIAL VOCABULARIO GENERAL BAacuteSICO

Remiacutetase a la norma COIT20Doc N o 4 laquoAnaacutelisis sensorial vocabulario general baacutesicoraquo

3 VOCABULARIO ESPECIacuteFICO

31 Atributos negativos

Atrojadoborras Flavor caracteriacutestico del aceite obtenido de aceitunas amontonadas o almacenadas en condiciones tales que han sufrido un avanzado grado de fermentacioacuten anaerobia o del aceite que ha permashynecido en contacto con los lodos de decantacioacuten que tambieacuten han sufrido un proceso de fermentacioacuten anaerobia en trujales y depoacutesitos

Moho-humedad Flavor caracteriacutestico del aceite obtenido de frutos en las que se han desarrollado abundantes hongos y levaduras a causa de haber permanecido amontonadas con humedad varios diacuteas o aceite obtenido de las aceitunas que han sido recogidas con tierra o barro y que no han sido lavadas

Avinado-avinagradoAacutecido-agrio Flavor caracteriacutestico de algunos aceites que recuerda al vino o vinagre Es debido fundamentalmente a un proceso fermentativo aerobio de las aceitunas o de los restos de pasta de aceitunas en capachos que no han sido limpiados adecuadamente que da lugar a la formacioacuten de aacutecido aceacutetico acetato de etilo y etanol

Rancio Flavor de los aceites que han sufrido un proceso oxidativo intenso

C6 Aceitunas heladas (madera huacutemeda) Flavor caracteriacutestico de aceites que han sido extraiacutedos de aceitunas que han sufrido un proceso de congelacioacuten en el aacuterbol

M26


( 1 ) Reglamento (UE) n o 13082013 del Parlamento Europeo y del Consejo de 17 de diciembre de 2013 por el que se crea la organizacioacuten comuacuten de mercados de los productos agrarios y por el que se derogan los Reglamentos (CEE) n o 92272 (CEE) n o 23479 (CE) n o 10372001 y (CE) n o 12342007 (DO L 347 de 20122013 p 671)

311 Otros atributos negativos

Cocido o quemado

Flavor caracteriacutestico del aceite originado por un excesivo yo prolongado calentamiento durante el procesado muy particularmente durante el termo-batido de la pasta si este se realiza en condiciones teacutermicas inadecuadas

Heno-madera Flavor caracteriacutestico de algunos aceites procedentes de aceitunas secas

Basto Sensacioacuten buco-taacutectil densa y pastosa producida por algunos aceites viejos

Lubricante Flavor del aceite que recuerda al gasoacuteleo a la grasa de lubricar o al aceite mineral

Alpechiacuten Flavor adquirido por el aceite a causa de un contacto prolongado con alpechiacuten que han sufrido procesos fermentativos

Salmuera Flavor del aceite extraiacutedo de aceitunas conservadas en salmuera

Metaacutelico Flavor que recuerda a los metales Es caracteriacutestico del aceite que ha permanecido en contacto durante tiempo prolongado con superficies metaacutelicas durante los procesos de molienda batido prensado o almacenamiento

Esparto Flavor caracteriacutestico del aceite obtenido de aceitunas prensadas en capachos nuevos de esparto El flavor puede ser diferente si el capacho estaacute fabricado con esparto verde o si lo estaacute con esparto seco

Gusano Flavor caracteriacutestico del aceite obtenido de aceitunas fuertemente atacadas por larvas de mosca del olivo (Bactrocera oleae)

Pepino Flavor que se produce en el aceite cuando se mantiene en un envase hermeacutetico durante un tiempo excesivo particularmente en hojalata que se atribuye a la formacioacuten de 26-nonadienal

32 Atributos positivos

Frutado Conjunto de sensaciones olfativas caracteriacutesticas del aceite dependientes de la variedad de las aceitunas procedentes de frutos sanos y frescos verdes o maduros y percibidas por viacutea directa yo retronasal

Amargo Sabor elemental caracteriacutestico del aceite obtenido de aceitunas verdes o en envero Se percibe en las papilas circunvaladas de la uve lingual

Picante Sensacioacuten taacutectil de picor caracteriacutestica de los aceites obtenidos al comienzo de la campantildea principalmente de aceitunas todaviacutea verdes Puede ser percibido en toda la cavidad bucal especialmente en la garganta

M32 33 Terminologiacutea opcional para el etiquetado

A peticioacuten expresa el jefe de panel puede certificar que los aceites evaluados cumplen las definiciones e intervalos correspondientes uacutenicamente a los teacuterminos siguientes en funcioacuten de la intensidad y de la percepcioacuten de los atributos

M28


Atributos positivos (frutado amargo y picante) En funcioacuten de la intensidad de la percepcioacuten

mdash Robusto cuando la mediana del atributo sea superior a 60

mdash Medio cuando la mediana del atributo sea superior a 30 e inferior o igual a 60

mdash Delicado cuando la mediana del atributo sea inferior o igual a 30

Frutado Conjunto de sensaciones olfativas caracteriacutesticas del aceite dependientes de la variedad de las aceitunas procedentes de frutos sanos y frescos en las que no predomina el sabor del fruto verde ni el del fruto maduro que se perciben por viacutea directa yo retronasal

Frutado verde Conjunto de sensaciones olfativas caracteriacutesticas del aceite que recuerdan a los frutos verdes dependen de la variedad de las aceitunas proceden de frutos verdes sanos y frescos y se perciben por viacutea directa yo retronasal

Frutado maduro Conjunto de sensaciones olfativas caracteriacutesticas del aceite que recuerdan a los frutos verdes dependen de la variedad de las aceitunas proceden de frutos sanos y frescos y se perciben por viacutea directa yo retronasal

Equilibrado Aceite que no presenta desequilibrio entendieacutendose por tal la sensacioacuten olfato-gustativa y taacutectil del aceite en el que la mediana del atributo amargo y la mediana del atributo picante son como maacuteximo superiores en 20 puntos a la mediana del atributo frutado

Aceite dulce Aceite en el que la mediana del atributo amargo y del atributo picante son inferiores o iguales a 20

Lista de teacuterminos en funcioacuten de la intensidad de la percepcioacuten

Teacuterminos sujetos a la presenshytacioacuten de un certificado de

ensayo organoleacuteptico Mediana del atributo

Frutado mdash

Frutado maduro mdash

Frutado verde mdash

Frutado delicado le 30

Frutado medio 30 lt Me le 60

Frutado robusto gt 60

Frutado maduro delicado le 30

Frutado maduro medio 30 lt Me le 60

Frutado maduro robusto gt 60

Frutado verde delicado le 30

Frutado verde medio 30 lt Me le 60

M32




Frutado verde robusto gt 60

Amargo delicado le 30

Amargo medio 30 lt Me le 60

Amargo robusto gt 60

Picante delicado le 30

Picante medio 30 lt Me le 60

Picante robusto gt 60

Aceite equilibrado La mediana del atributo amargo y la mediana del atributo picante son como maacuteximo superiores en 20 puntos a la mediana del atributo frutado

Aceite dulce La mediana del atributo amargo y la mediana del atributo picante son iguales o inferiores a 20

M26

4 COPA PARA DEGUSTACIOacuteN DE ACEITES

Remiacutetase a la norma COIT20Doc N o 5 laquoCopa para la degustacioacuten de aceitesraquo

5 SALA DE CATA

Remiacutetase a la norma COIT20Doc N o 6 laquoGuiacutea para la instalacioacuten de una sala de cataraquo

6 ACCESORIOS

En cada cabina y a disposicioacuten del catador deben estar los utensilios necesarios para que eacuteste pueda ejercer adecuadamente su cometido Estos son

mdash copas (normalizadas) que contengan las muestras codificadas y recushybiertas de un cristal de reloj y mantenidas a 28 degC plusmn 2 degC

mdash ficha de cata (veacutease figura 1) en papel o en formato electroacutenico que cumplan con los requisitos de la hoja de perfil que se completaraacute si fuera preciso con las instrucciones de empleo

mdash boliacutegrafo o tinta indeleble

mdash bandejitas con rodajas de manzana yo agua con o sin gas yo tostadas

mdash vaso de agua a temperatura ambiente

mdash documento con las normas generales mencionadas en las secciones 84 y 911

mdash escupideras

M32


7 JEFE DE PANEL Y CATADORES

71 El jefe del panel

El jefe del panel deberaacute tener una soacutelida formacioacuten y ser un conocedor experto de todos los tipos de aceite con los que habraacute de tratar en el desempentildeo de su trabajo Es la figura clave del panel y el responsable de la organizacioacuten y del funcionamiento del mismo

Su trabajo requiere la pertinente formacioacuten en anaacutelisis sensorial y las herramientas correspondientes ademaacutes de meticulosidad en la preparacioacuten de los ensayos y la organizacioacuten y ejecucioacuten de estos asiacute como destreza y paciencia para planificar y efectuar los ensayos de forma cientiacutefica

Tambieacuten es de su exclusiva competencia proceder a la seleccioacuten el entrenamiento y el control de los catadores para asegurarse de su nivel de aptitud siendo por tanto responsable de la cualificacioacuten de estos Dicha cualificacioacuten deberaacute ser en todo momento objetiva por lo que deberaacute disentildear procedimientos especiacuteficos basados en ensayos y en criterios de aceptacioacuten y rechazo soacutelidamente fundamentados Veacutease la norma COIT20Doc n o 14 laquoGuiacutea para la seleccioacuten el entrenamiento y el control de los catadores cualificados de aceite de oliva virgenraquo

C6 Es asimismo responsable del desempentildeo del panel y por consiguiente de su evaluacioacuten que deberaacute acreditar de forma fiel y objetiva Deberaacute poder demostrar en todo momento que el meacutetodo y los catadores estaacuten bajo control Se recomienda llevar a cabo una calibracioacuten perioacutedica del panel (COIT20Doc N o 14 sect 5)

Es el maacutes alto responsable de los registros del panel y de la custodia de los mismos Dichos registros deberaacuten poder rastrearse en todo momento y ajustarse a los requisitos en materia de garantiacutea de la calidad establecidos en las normas internacionales relativas al anaacutelisis sensorial ademaacutes de garantizar el anonimato de las muestras

Es el responsable de los utensilios y del material necesario para el cumplishymiento de las especificaciones del presente meacutetodo asiacute como del inventario y de la perfecta limpieza y conservacioacuten de los mismos Redactaraacute un informe sobre todo cuanto antecede y sobre el cumplimiento de las condiciones del ensayo

Es el responsable de la recepcioacuten y la conservacioacuten de las muestras desde su llegada al laboratorio hasta el anaacutelisis garantizando en todo momento el anonimato de las mismas y su adecuada conservacioacuten A tal efecto deberaacute redactar procedimientos sobre todo cuanto antecede con vistas a garantizar la trazabilidad y la calidad de todo el proceso

Tambieacuten es responsable de la preparacioacuten codificacioacuten y presentacioacuten de las muestras a los catadores seguacuten el disentildeo experimental adecuado de acuerdo con el protocolo previamente establecido de la recopilacioacuten de los datos de los catadores y del tratamiento estadiacutestico de estos

Es responsable de establecer y redactar todos los demaacutes procedimientos que pudieran precisarse para completar la presente norma o para el adecuado funcionamiento del panel

Deberaacute buscar la manera de comparar los resultados del panel con los de otros paneles de cata de aceite de oliva virgen para asegurarse de que el funcionamiento de su panel es el correcto

M26


Es misioacuten del jefe de panel motivar a los componentes del grupo fomentando entre ellos el intereacutes la curiosidad y el espiacuteritu competitivo Por este motivo se recomienda garantizar el intercambio fluido de informacioacuten con los miembros del grupo implicaacutendolos en todas las tareas que realicen asiacute como en los resultados obtenidos Debe evitar que su opinioacuten sea conocida e impedir que los criterios de posibles liacutederes se impongan sobre los restantes catadores

Convocaraacute con tiempo suficiente a los catadores y responderaacute a cualquier consulta en cuanto a la realizacioacuten de los ensayos aunque se abstendraacute de sugerirles ninguacuten tipo de opinioacuten sobre la muestra

M28 711 Jefe en funciones del grupo

El jefe del grupo podraacute por razones justificadas ser reemplazado por un jefe en funciones que le sustituiraacute en el ejercicio de sus deberes en relacioacuten con la realizacioacuten de los anaacutelisis Este sustituto deberaacute tener todos los conocimientos especializados necesarios para el puesto de jefe de grupo

72 Catadores

Las personas que intervengan en calidad de catadores en los ensayos organoleacutepticos de aceites de oliva deberaacuten hacerlo de forma voluntaria Por este motivo se recomienda exigir a los candidatos una peticioacuten por escrito Los candidatos deberaacuten ser seleccionados formados y evaluados por el presidente de la comisioacuten de acuerdo con su habilidad para distinguir entre muestras similares debieacutendose tener en cuenta que la precisioacuten se mejoraraacute con la praacutectica

El catador deberaacute comportarse como un auteacutentico observador sensorial dejando a un lado sus gustos personales para dar cuenta uacutenicamente de las sensaciones que percibe Por ello deberaacute realizar su trabajo en silencio estar relajado y no tener prisa Deberaacute prestar la maacutexima atencioacuten posible a la muestra que estaacute catando

Para la prueba se exige un nuacutemero de 8 a 12 catadores siendo conveniente disponer de algunos maacutes en reserva para cubrir posibles ausencias

M26

8 CONDICIONES DE ENSAYO

81 Presentacioacuten de la muestra

La muestra de aceite que se vaya a analizar se presentaraacute en las copas de degustacioacuten normalizadas con arreglo a la Norma COIT20Doc N o 5 laquoCopa para la degustacioacuten de aceitesraquo

La copa deberaacute contener 14-16 ml de aceite o bien entre 128 y 146 g si las muestras se pesan y estar tapada con un vidrio de reloj

Cada copa deberaacute estar marcada con un coacutedigo numeacuterico o alfanumeacuterico aleatorio El coacutedigo se aplicaraacute mediante un sistema inodoro

82 Temperatura de la muestra y durante el ensayo

La muestra de aceite que se vaya a analizar deberaacute mantenerse en la copa a una temperatura de 28 degC plusmn 2 degC durante todo el ensayo Se ha elegido esta temperatura porque permite detectar con mayor facilidad que a temperatura ambiente las diferencias organoleacutepticas Ademaacutes a temperaturas maacutes bajas se produce una escasa volatilizacioacuten de los componentes aromaacuteticos propios de estos aceites y a temperaturas maacutes altas se forman componentes volaacutetiles propios de los aceites calentados Veacutease la norma COIT20Doc N o 5 laquoCopa para la degustacioacuten de aceitesraquo para consultar el sistema de calentamiento de las muestras que se ha de utilizar una vez que la muestra se haya introducido en la copa

M26


La sala de cata debe estar a una temperatura comprendida entre los 20deg y los 25deg C (veacutease COIT20Doc N o 6)

83 Horario del ensayo

Para la cata de aceites las horas de trabajo oacuteptimas son las de la mantildeana Estaacute demostrado que durante el diacutea existen periacuteodos de oacuteptima percepcioacuten para el gusto y el olfato Las comidas son precedidas de un periacuteodo de incremento de la sensibilidad olfato-gustativa seguidas de un decrecishymiento de la misma

Sin embargo este criterio no debe ser llevado al extremo hasta el punto de que el hambre pueda distraer a los catadores haciendo descender en ellos su capacidad de discriminacioacuten Por consiguiente se recomienda que las sesiones de cata se realicen entre las 10 y las 12 de la mantildeana

84 Normas generales de comportamiento para catadores

Las siguientes recomendaciones se refieren al comportamiento de los catadores durante su trabajo

Al recibir la comunicacioacuten del jefe del panel para intervenir en un ensayo organoleacuteptico los catadores deberaacuten estar en condiciones de realizarlo a la hora previamente sentildealada atenieacutendose a las siguientes normas

mdash Se abstendraacuten de fumar o de beber cafeacute al menos 30 minutos antes de la hora fijada

mdash No deberaacuten haberse aplicado ninguacuten perfume cosmeacutetico o jaboacuten cuya fragancia persista hasta el momento del ensayo Para el lavado de las manos deberaacuten utilizar un jaboacuten no perfumado procediendo a enjuagarse las manos y a secaacuterselas tantas veces como sean necesarias para eliminar cualquier olor

mdash No deberaacuten haber tomado ninguacuten alimento al menos una hora antes de realizar la cata

mdash Si se encontrasen en condiciones de inferioridad fisioloacutegica particushylarmente si tienen afectado el sentido del olfato o del gusto o bajo alguacuten efecto psicoloacutegico que les impida concentrarse en su trabajo deberaacuten abstenerse de participar en la cata e informaraacuten oporshytunamente al jefe del panel

mdash Una vez que los catadores hayan cumplido las normas precedentes procederaacuten a ocupar su lugar en la cabina que les corresponda en silencio y de forma ordenada

mdash Leeraacuten detenidamente las instrucciones que detalle la ficha de cata y no comenzaraacuten el examen de la muestra hasta estar totalmente preparados para el trabajo que deben realizar (relajados y sin prisas) En caso de duda deben consultar privadamente al jefe del panel

mdash Deberaacuten permanecer en silencio mientras realizan su trabajo

mdash Deberaacuten mantener el moacutevil apagado en todo momento para proteger la concentracioacuten y el trabajo de sus colegas

9 PROCEDIMIENTO PARA LA EVALUACIOacuteN ORGANOLEacutePTICA Y LA CLASIFICACIOacuteN DE ACEITES DE OLIVA VIacuteRGENES

91 Teacutecnica de cata

M29 911 Los catadores procederaacuten a tomar la copa mantenieacutendola cubierta con su

vidrio de reloj la inclinaraacuten ligeramente y en esta posicioacuten le daraacuten un giro total a fin de mojar lo maacutes posible la superficie interior Hecha esta operacioacuten separaraacuten el vidrio de reloj y procederaacuten a oler la muestra haciendo inspiraciones lentas e intensas para evaluar el aceite El periacuteodo de olfaccioacuten no deberiacutea superar los 30 segundos Si en este periacuteodo no se ha llegado a ninguna conclusioacuten deberaacuten tomarse un pequentildeo descanso antes de proceder a un nuevo intento

M26


Una vez realizado el ensayo olfativo los catadores procederaacuten a valorar las sensaciones bucales (conjunto de las sensaciones olfato-gustativas por viacutea retronasal y taacutectiles) Para ello tomaraacuten un pequentildeo sorbo de aceite de unos 3 ml aproximadamente Es muy importante distribuir el aceite por toda la cavidad bucal desde la parte anterior de la boca y la lengua por los laterales y la parte posterior hasta los pilares del paladar y la garganta ya que como se sabe la percepcioacuten de los sabores y las sensaciones taacutectiles se hace con distinta intensidad seguacuten las zonas de la lengua el paladar y la garganta

Debe insistirse en la necesidad de que el aceite se extienda en cantidad suficiente y muy lentamente por la parte posterior de la lengua hacia los pilares del paladar y la garganta concentrando la atencioacuten en el orden de aparicioacuten de los estiacutemulos amargo y picante Si no se procede asiacute en algunos aceites ambos estiacutemulos pueden pasar inadvertidos o el amargo quedar oculto por el picante

Las aspiraciones cortas y sucesivas introduciendo aire por la boca permiten ademaacutes de extender la muestra ampliamente por la cavidad bucal percibir por viacutea retronasal los componentes volaacutetiles aromaacuteticos al forzarse el uso de esta viacutea

Nota cuando los catadores no perciban el frutado en una muestra y la intensidad del atributo negativo de clasificacioacuten sea igual o inferior a 35 el jefe de panel puede decidir que los catadores analicen la muestra de nuevo a temperatura ambiente (COIT20Doc n o 6Rev 1 septiembre de 2007 seccioacuten 3-Especificaciones generales de la instalacioacuten de una sala de cata) especificando el contexto y el concepto de temperatura ambiente Cuando la muestra alcance la temperatura ambiente los catadores deberaacuten volver a evaluarla para verificar uacutenicamente si se percibe el frutado Si es asiacute deben anotar la intensidad en la escala

La sensacioacuten taacutectil de picante debe tenerse en consideracioacuten A tal fin es aconsejable tragar el aceite

M26 912 C6 En la valoracioacuten organoleacuteptica del aceite de oliva virgen se recoshy

mienda efectuar el anaacutelisis de un maacuteximo de CUATRO MUESTRAS por sesioacuten con un maacuteximo de tres sesiones diarias al objeto de evitar el efecto de contraste que podriacutea provocar la degustacioacuten inmediata de otros aceites

Puesto que las catas sucesivas producen fatiga o peacuterdida de sensibilidad causadas por las muestras precedentes es preciso utilizar un producto capaz de eliminar de la boca los restos de aceite de la cata anterior

Se recomienda el uso de un pequentildeo trozo de manzana el cual despueacutes de masticado puede ser vertido al escupidor procediendo seguidamente a enjuagarse con un poco de agua a temperatura ambiente Entre la sesioacuten finalizada y la siguiente deben transcurrir al menos 15 minutos

92 Utilizacioacuten de la ficha de cata por los catadores

La ficha de cata que deben utilizar los catadores se recoge en la figura 1 del presente anexo

Cada uno de los catadores que componen el panel oleraacute y degustaraacute ( 1 ) el aceite sometido a examen Deben consignar en las escalas de 10 cm de la ficha de cata que se pondraacute a su disposicioacuten la intensidad con la que perciben cada uno de los atributos negativos y positivos

M29


( 1 ) Pueden abstenerse de catar un aceite cuando aprecien por viacutea olfativa directa alguacuten atributo negativo sumamente intenso en cuyo caso deberaacuten registrar en la ficha de cata esta circunstancia excepcional

En caso de que los catadores perciban atributos negativos no indicados en la seccioacuten 4 deberaacuten consignarse en el apartado laquootrosraquo empleando el teacutermino o teacuterminos que los describan con mayor precisioacuten

M28 93 Utilizacioacuten de los datos por los jefes de panel

El jefe del panel deberaacute recoger las fichas de cata cumplimentadas por cada uno de los catadores y revisar las intensidades asignadas a los diferentes atributos De constatarse alguna anomaliacutea pediraacute al catador que revise su ficha de cata y si fuera necesario que repita la prueba

El jefe del grupo deberaacute introducir los datos de la valoracioacuten de cada miembro en un programa informaacutetico como el que se recoge en la norma COIT20Doc N o 15 con miras al caacutelculo estadiacutestico de los resultados del anaacutelisis basados en el caacutelculo de la mediana Veacutease el punto 94 y el apeacutendice del presente anexo La introduccioacuten de los datos corresponshydientes a cada muestra se realizaraacute con ayuda de una matriz compuesta de nueve columnas que corresponden a los nueve atributos sensoriales y n liacuteneas que corresponden a los n miembros del panel utilizados

En caso de que en el apartado laquootrosraquo figure un defecto percibido y sentildealado por al menos el 50 del panel el jefe del panel calcularaacute la mediana de dicho defecto y lo clasificaraacute en consecuencia

El valor del coeficiente de variacioacuten robusto que define la clasificacioacuten (defecto con la mayor intensidad y el mayor atributo frutado) deberaacute ser inferior o igual al 20

Cuando no sea asiacute el jefe del panel deberaacute repetir la evaluacioacuten de la muestra especiacutefica en otra sesioacuten de cata

Si esta situacioacuten se produce con frecuencia se recomienda al jefe del grupo que imparta formacioacuten especiacutefica adicional (COIT20Doc N o 14 sect 5) y utilice el iacutendice de repetibilidad y el iacutendice de desviacioacuten para controlar el rendimiento del catador (COIT20Doc No 14 sect 6)

M32 94 Clasificacioacuten del aceite

El aceite se clasifica en las categoriacuteas que se indican maacutes adelante en funcioacuten de la mediana de los defectos y de la mediana del atributo frutado Por mediana de los defectos se entiende la mediana del defecto percibido con mayor intensidad La mediana de los defectos y la mediana del atributo frutado se expresaraacuten con una sola cifra decimal

La clasificacioacuten del aceite se hace comparando el valor de la mediana de los defectos y de la mediana del atributo frutado con los intervalos de referencia expuestos a continuacioacuten Los liacutemites de estos intervalos han sido establecidos teniendo en cuenta el error del meacutetodo por lo que son considerados como absolutos Los programas informaacuteticos permiten visualizar la clasificacioacuten en un cuadro de datos estadiacutesticos o graacuteficashymente

a) Aceite de oliva virgen extra la mediana de los defectos es igual a 00 y la del atributo frutado es superior a 00

b) Aceite de oliva virgen la mediana de los defectos es superior a 00 pero inferior o igual a 35 y la del atributo frutado es superior a 00

c) Aceite de oliva virgen lampante la mediana de los defectos es superior a 35 o bien la mediana de los defectos es inferior o igual a 35 y la del atributo frutado es igual a 00

M26


Nota 1 Cuando las medianas del atributo amargo yo del atributo picante sean superiores a 50 el jefe de panel lo sentildealaraacute en el certificado de anaacutelisis del aceite

En el caso de los anaacutelisis efectuados en el marco de controles de conforshymidad se realizaraacute un ensayo En el caso de anaacutelisis contradictorios el anaacutelisis debe efectuarse por duplicado en diferentes sesiones de cata En el caso de anaacutelisis contradictorios el anaacutelisis debe efectuarse por duplicado en diferentes sesiones de cata Los resultados de los anaacutelisis por duplicado deben ser estadiacutesticamente homogeacuteneos (veacutease el punto 95) En caso contrario la muestra debe ser analizada de nuevo dos veces El valor final de la mediana de los atributos de clasificacioacuten se calcularaacute utilizando la media de ambas medianas

M29 95 Criterios de aceptacioacuten y de rechazo de duplicados

Para determinar si los dos resultados de un anaacutelisis duplicado son homogeacuteneos o estadiacutesticamente aceptables se utilizaraacute el error normalizado definido a continuacioacuten

E n frac14 jMe 1 Auml Me 2 j

2 ffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi U 2 1 thorn U 2

2 p

siendo Me 1 y Me 2 las medianas de los dos duplicados (respectivamente primer y segundo anaacutelisis) y U 1 y U 2 las incertidumbres expandidas obtenidas para los dos valores calculadas como sigue seguacuten se especifica en el apeacutendice

U 1 = c times s y s auml frac14 ethCV r Uuml Me 1 THORN 100

Para la incertidumbre expandida c = 196 por consiguiente

U 1 = 00196 times CV r times M e1

siendo CV r el coeficiente de variacioacuten robusto

Para poder afirmar que los dos valores obtenidos no son estadiacutesticamente diferentes E n debe ser igual o inferior a 10

M32


Figura 1

FICHA DE CATA DEL ACEITE DE OLIVA VIRGEN

Intensidad de percepcioacuten de los defectos

Atrojadoborras

Mohosohuacutemedoterroso

Avinadoavinagrado

aacutecidoagrio

Aceitunas congeladas

(madera huacutemeda)

Rancio

Otros atributos negativos

Descriptor Metaacutelico Heno seco Gusano Basto

Salmuera Cocido o quemado Alpechiacuten

Esparto Pepino Lubricante

Intensidad de las percepciones de los atributos positivos

Frutado

Color verde Maduro

Amargas

Picante

Nombre del catador Coacutedigo del catador

Coacutedigo de la muestra Firma

Fecha

Comentarios

M28


Apeacutendice

Meacutetodo de caacutelculo de la mediana y de los intervalos de confianza

Mediana

Me frac14 frac12p ethX lt x m THORN Iuml frac12 ^ p ethX Iuml x m THORN ge frac12 acirc

La mediana se define como el nuacutemero real X m caracterizado por el hecho de que la probabilidad (p) de que los valores de la distribucioacuten (X) sean inferiores a ese nuacutemero (X m ) es inferior o igual a 05 y de que simultaacuteneamente la probabilidad (p) de que los valores de la distribucioacuten (X) sean inferiores o iguales a X m es superior o igual a 05 Otra definicioacuten maacutes praacutectica es que la mediana es el percentil 50 de una distribucioacuten de nuacutemeros ordenados de modo creciente Dicho de otro modo representa el valor central de una serie ordenada impar o la media de los dos valores centrales de una serie ordenada par

Desviacioacuten tiacutepica robusta

Para obtener una estimacioacuten fiable de la variabilidad que se produce en torno a la mediana es necesario referirse a la estimacioacuten de la desviacioacuten tiacutepica robusta seguacuten Stuart y Kendall (4) La foacutermula indica la desviacioacuten tiacutepica asintoacutetica robusta es decir la estimacioacuten robusta de la variabilidad de los datos considerados en la que N es el nuacutemero de observaciones e IQR el intervalo intercuartil el cual abarca exactamente el 50 de los casos de una distribucioacuten de probabilidad cualquiera

s auml frac14 1 25 Uuml IQR 1 35 Uuml ffiffiffiffi N

p

El caacutelculo del intervalo intercuartil se efectuacutea calculando la magnitud de la diferencia entre el percentil 75 y el 25

IQR frac14 percentil 75 Auml percentil 25

Siendo el percentil el valor X pc caracterizado por el hecho de que la probabilidad (p) de que los valores de la distribucioacuten sean inferiores a X pc es inferior e igual a una centeacutesima determinada y de que simultaacuteneamente la probabilidad (p) de que los valores de la distribucioacuten sean inferiores o iguales a X pc es superior e igual a dicha centeacutesima La centeacutesima indica la fraccioacuten de distribucioacuten elegida En el caso de la mediana esta es igual a 50100

Percentil frac14 frac12p ethX lt x pc THORN Iuml n

100 ^ p ethX Iuml x pc THORN ETH

n 100 acirc

En la praacutectica el percentil es el valor de distribucioacuten que corresponde a un aacuterea determinada trazada a partir de la curva de distribucioacuten o de densidad Por ejemplo el percentil 25 representa el valor de distribucioacuten correspondiente a un aacuterea igual a 025 o 25100

En este meacutetodo los percentiles se computan basaacutendose en los valores reales que figuran en la matriz de datos (procedimiento de coacutemputo de percentiles)

Coeficiente de variacioacuten robusto (en )

El CVr representa un nuacutemero puro que indica el porcentaje de variabilidad de la serie de nuacutemeros analizada Por esta razoacuten este coeficiente resulta muy uacutetil para comprobar la fiabilidad de los miembros del panel

CV r frac14 s auml

Me Uuml 100

M26


Intervalos de confianza al 95 sobre la mediana

Los intervalos de confianza al 95 (valor del error de primer tipo igual a 005 o 5) representan el intervalo en el que el valor de la mediana podriacutea variar si fuese posible repetir infinitas veces un experimento En la praacutectica indica el intervalo de variabilidad de la prueba en las condiciones operativas adoptadas partiendo de la hipoacutetesis de que es posible repetirlo varias veces El intervalo ayuda a evaluar como en el caso del CVr la fiabilidad de la prueba

IC sup frac14 Me thorn ethc Uuml s auml THORN

IC inf frac14 Me Auml ethc Uuml s auml THORN

donde C = 196 en el caso del intervalo de confianza al 95

Puede encontrarse un ejemplo de la hoja de caacutelculo en el anexo I de la norma COIT20Doc N o 15

Bibliografiacutea

(1) Wilkinson L 1990 Systat The system for statistics Evanston ILSYSTAT Inc

(2) Cicchitelli G 1984 Probabilitagrave e Statistica Maggioli Editore Rimini

(3) Massart DL Vandeginste BGM Deming Y Michotte L 1988 Chemometrics A textbook Elsevier Amsterdam

(4) Kendall MG Stuart A 1967 The advanced theory of statistics Vol 1 Hafner Publishing Co

(5) McGill R Tukey JW Larsen WA 1978 Variation of Box Plots The American Statistician 32 (2) 12-16

(6) COIT28Doc N o 1 Septiembre de 2007 Directrices para la acreditacioacuten de los laboratorios de anaacutelisis sensorial de aceite de oliva virgen en particular seguacuten la norma ISOIEC 170252005

(7) COIT20Doc N o 14


(9) ISOIEC 1702505

M20 __________

M19 __________

M26


ANEXO XV

1 CONTENIDO EN ACEITE DE LOS ORUJOS DE ACEITUNA

11 Material

mdash aparato de extraccioacuten apropiado tipo C1 soxhlet provisto de un matraz de 200 a 250 ml

mdash bantildeo por calefaccioacuten eleacutectrica (bantildeo de arena bantildeo de agua etc) o placa calefactora

mdash balanza analiacutetica

mdash estufa regulada a 80 degC como maacuteximo

mdash estufa de calefaccioacuten eleacutectrica provista de un dispositivo de termorregushylacioacuten regulada a 103 degC plusmn 2 degC y que permita realizar una insuflacioacuten de aire o una presioacuten reducida

mdash triturador mecaacutenico faacutecil de limpiar y que permita el triturado del orujo sin calentamiento y sin disminucioacuten sensible de su contenido en agua y en aceite

mdash cartucho de extraccioacuten y algodoacuten hidroacutefilo o papel filtro exentos de productos extraiacutebles por el hexano

mdash desecador

mdash criba con agujeros de 1 mm de diaacutemetro

mdash piedra poacutemez en pequentildeos granos previamente secada

12 Reactivo

n-hexano teacutecnico cuyo residuo en evaporacioacuten completa deberaacute ser inferior a 0002 g para 100 ml

2 MODO DE OPERAR

21 Preparacioacuten de la muestra para ensayo

Triturar la muestra para laboratorio si fuera necesario en el triturador mecaacutenico previamente bien limpio para reducirla a partiacuteculas que puedan atravesar completamente la criba

Utilizar aproximadamente una vigeacutesima parte de la muestra para completar la limpieza del triturador tirar dicha mezcla triturar el resto recogerlo mezclarlo con cuidado y analizarlo sin demora

22 Toma de muestra

Pesar inmediatamente despueacutes del triturado alrededor de 10 g de la muestra para ensayo con una aproximacioacuten de 001 g

23 Preparacioacuten del cartucho de extraccioacuten

C1 colocar la muestra en el cartucho y taparla con el tapoacuten de algodoacuten hidroacutefilo En caso de haber utilizado papel de filtro envolver la muestra molida en dicho papel

24 Presecado

Cuando el orujo esteacute muy huacutemedo (contenido en agua y en materias volaacutetiles superior al 10 ) efectuar un presecado colocando durante un tiempo conveniente el cartucho lleno (o el papel de filtro) en la estufa calentada a 80 degC como maacuteximo para llevar el contenido en agua y en materias volaacutetiles por debajo del 10

B


25 Preparacioacuten del matraz

Pesar con aproximacioacuten de 1 g el matraz que contenga 1 a 2 granos de piedra poacutemez previamente secado en la estufa a 103 degC plusmn 2 degC y despueacutes enfriado durante al menos una hora en el desecador

26 Primera extraccioacuten

Colocar en el aparato de extraccioacuten el cartucho (o el papel de filtro) que contenga la muestra Verter en el matraz la cantidad necesaria de hexano C1 Adaptar el matraz al aparato de extraccioacuten y colocarlo todo sobre la placa calefactora Llevar la calefaccioacuten a tal estado que el caudal de reflujo sea al menos de tres gotas por segundo (ebullicioacuten moderada no tumultuosa)

Despueacutes de cuatro horas de extraccioacuten dejar enfriar Quitar el cartucho del aparato de extraccioacuten y colocarlo en una corriente de aire para eliminar la mayor parte del disolvente que lo impregna

27 Segunda extraccioacuten

Vaciar el cartucho en el microtriturador y triturar tan finamente como sea posible Colocar de nuevo cuantitativamente la mezcla en el cartucho y eacutesta en el aparato de extraccioacuten

Empezar de nuevo la extraccioacuten durante dos horas maacutes utilizando el mismo matraz conteniendo la primera extraccioacuten

La solucioacuten obtenida en el matraz de extraccioacuten deberaacute ser liacutempida Si no fuere asiacute filtrarla sobre un papel de filtro lavando varias veces el primer matraz y el papel de filtro con hexano Recoger el filtrado y el disolvente en un segundo matraz previamente secado y tarado aproximadshyamente a 1 mg

28 Eliminacioacuten del disolvente y pesada del extracto

Eliminar en el equipo de extraccioacuten la mayor parte del disolvente Eliminar los uacuteltimos restos de eacuteste calentando el matraz en la estufa a 103 degC plusmn 2 degC durante 20 minutos Facilitar dicha eliminacioacuten ya sea insuflando aire de vez en cuando o preferiblemente un gas inerte o actuando bajo una presioacuten reducida

Dejar enfriar el matraz en un desecador durante al menos una hora y pesarlo con una precisioacuten de 1 mg aproximadamente

Calentar de nuevo 10 minutos en las mismas condiciones dejar enfriar en el desecador y pesar

La diferencia entre los resultados de estas dos pesadas deberaacute ser inferior o igual a 10 mg si no calentar de nuevo durante periacuteodos de diez minutos seguidos de enfriamento y pesada hasta que la diferencia de peso sea a lo sumo de 10 mg Seleccionar la uacuteltima pesada del matraz

Efectuar dos determinaciones


31 Modo de caacutelculo y foacutermula

a) El extracto expresado en peso del producto tal cual seraacute igual a

S frac14 m 1 Uuml 100 m 0

B


donde S es el porcentaje en peso del extracto del producto tal cual

m 0 es el peso en gramos de la muestra

m 1 es el peso en gramos del extracto seco

Tomar como resultado la media aritmeacutetica de las dos determinaciones si las condiciones de repetitividad se cumplen

Expresar el resultado con un solo decimal

b) El extracto se relacionaraacute con la materia seca utilizando la siguiente foacutermula

S Uuml 100

100 Auml U frac14 grasa sobre extracto seco

donde S es el procentaje en peso de extracto del producto tal cual ver a)

U es su contenido en agua y en materias volaacutetiles

32 Repetitividad

La diferencia entre los resultados de las dos determinaciones efectuadas simultaacuteneamente o raacutepidamente la una a continuacioacuten de la otra mediante el mismo anaacutelisis no deberaacute ser superior a 02 g de extracto de hexano por cada 100 g de muestra

En caso contrario repetir sobre otras dos tomas de muestra Si esta vez la diferencia es de nuevo superior a 02 g tomar como resultado la media aritmeacutetica de las cuatro determinaciones efectuadas

B


ANEXO XVI

DETERMINACIOacuteN DEL IacuteNDICE DE YODO

1 OBJETO

La presente norma internacional especifica un meacutetodo para la detershyminacioacuten del iacutendice de yodo de las grasas y aceites animales y vegetales en lo sucesivo denominados grasas

2 DEFINICIOacuteN

A los fines de la presente norma internacional se aplicaraacute la definicioacuten siguiente

21 Iacutendice de yodo el peso de yodo absorbido por la muestra en las condiciones de trabajo que se especifican en la presente norma intershynacional

El iacutendice de yodo se expresa en gramos de yodo por 100 gr de muestra

3 PRINCIPIO

Disolucioacuten de la muestra problema y adicioacuten de reactivo de Wijs Una vez transcurrido el tiempo que se especifica adicioacuten de solucioacuten acuosa de yoduro potaacutesico y valoracioacuten del yodo liberado con solucioacuten de tiosulfato soacutedico

4 REACTIVOS

Todos los reactivos seraacuten de calidad analiacutetica reconocida

41 Yoduro potaacutesico solucioacuten de 100 gl exento de yodatos o de yodo libre

42 Engrudo de almidoacuten

Mezclar 5 g de almidoacuten soluble con 30 ml de agua antildeadir esta mezcla a 1 000 ml de agua en ebullicioacuten hervir durante 3 minutos y dejar enfriar

43 Solucioacuten volumeacutetrica patroacuten de tiosulfato soacutedico

c (Na 2 S 2 O 3 5H 2 O) = 01 moll valorada como maacuteximo 7 diacuteas antes de su uso

44 Disolvente preparado mezclando voluacutemenes iguales de ciclohexano y aacutecido aceacutetico

45 Reactivo de Wijs que contenga monocloruro de yodo en aacutecido aceacutetico Se utilizaraacute reactivo de Wijs comercializado

Nota El reactivo contiene 9 g de ICl 3 + 9 g de I en aacutecido aceacutetico

5 MATERIAL

Material ordinario de laboratorio y en particular lo siguiente

51 Navecillas de vidrio apropiadas para la muestra problema y que puedan introducirse en los matraces (52)

52 Matraces erlenmeyer de 500 ml de capacidad con boca esmerilada provistos de sus correspondientes tapones de vidrio y perfectamente secos

6 PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA C1 PROBLEMA

C1 La muestra homogeneizada se seca sobre sulfato soacutedico y se filtra

7 PROCEDIMIENTO


El peso de la muestra variacutea en funcioacuten del iacutendice de yodo previsto como se indica en el cuadro 1

B


Cuadro 1

Iacutendice de yodo previsto Peso de la muestra problema

menos de 5 300 g

5mdash 20 100 g

21mdash 50 040 g

51mdash100 020 g

101mdash150 013 g

151mdash200 010 g

Pesar la muestra problema con precisioacuten de 01 mg en una C1 navecilla de vidrio 51


Introducir la muestra problema en un matraz de 500 ml (52) Antildeadir 20 ml del disolvente (44) para disolver la grasa Agregar exactamente 25 ml del reactivo de Wijs (45) tapar el matraz agitar el contenido y colocar el matraz al abrigo de la luz No deberaacute utilizarse la boca para pipetear el reactivo de Wijs

Preparar del mismo modo un ensayo en blanco con el disolvente y el reactivo pero sin la muestra problema

Para las muestras con un iacutendice de yodo inferior a 150 mantener los matraces en la oscuridad durante 1 hora para las muestras con un iacutendice de yodo superior a 150 asiacute como en el caso de productos polimerizados o considerablemente oxidados mantener en la oscuridad durante 2 horas

Una vez transcurrido el tiempo correspondiente agregar a cada uno de los matraces 20 ml de solucioacuten de yoduro potaacutesico (41) y 150 ml de agua

Valorar con la disolucion de tiosulfato soacutedico (43) hasta que haya desashyparecido casi totalmente el color amarillo producido por el yodo Antildeadir unas gotas de engrudo de almidoacuten (42) y continuar la valoracioacuten hasta el momento preciso en que desaparezca el color azul despueacutes de una agitacioacuten muy intensa

Nota Se permite la determinacioacuten potenciomeacutetrica del punto final

73 Nuacutemero de determinaciones

Efectuar 2 determinaciones de la muestra problema


El iacutendice de yodo se expresa del siguiente modo

12 69 c ethV 1 Auml V 2 THORN p

siendo

c valor numeacuterico de la concentracioacuten exacta expresada en moles por litro de la solucioacuten volumeacutetrica patroacuten de tiosulfato soacutedico (43) utilshyizada

V 1 valor numeacuterico del volumen expresado en mililitros de la solucioacuten de tiosulfato soacutedico (43) utilizada para el ensayo en blanco

B


V 2 valor numeacuterico del volumen expresado en mililitros de la solucioacuten de tiosulfato soacutedico (43) utilizada para la determinacioacuten

p valor numeacuterico del peso expresado en gramos de la muestra problema (71)

Se tomaraacute como resultado la media aritmeacutetica de las dos determinaciones siempre que se cumpla el requisito establecido con respecto a la repetishybilidad

B


ANEXO XVII

MEacuteTODO PARA LA DETERMINACIOacuteN DE ESTIGMASTADIENOS EN LOS ACEITES VEGETALES

1 OBJETIVOS

Determinacioacuten de estigmastadienos en los aceites vegetales que presentan bajas concentraciones de dichos hidrocarburos particularmente en el aceite de oliva virgen y en el aceite de orujo de oliva sin refinar

2 APLICACIOacuteN

Se trata de una norma aplicable a cualquier aceite de origen vegetal teniendo en cuenta que uacutenicamente se obtendraacuten medidas fiables cuando el contenido de estos hidrocarburos se halle incluido en un margen de 001 a 40 mgkg El meacutetodo resulta especialmente adecuado para detectar la presencia de aceites vegetales refinados (aceites de oliva orujo de oliva girasol palma etc) en el aceite de oliva virgen dado que los aceites refinados contienen estigmastadienos y los aceites viacutergenes no

3 FUNDAMENTO

Aislamiento de la materia insaponificable Separacioacuten de la fraccioacuten de hidrocarburos esteroideos mediante cromatografia en columna de gel de siacutelice y anaacutelisis mediante cromatografiacutea de gases en columna capilar

4 INSTRUMENTAL

41 Matraces de 250 ml aptos para colocarles un refrigerante de reflujo

42 Embudos de decantacioacuten con capacidad para 500 ml

43 Matraces de fondo redondo de 100 ml

44 Rotavapor

45 Columna de vidrio para cromatografiacutea (15-20 cm de diaacutemetro interno por 50 cm de longitud) provista de una llave de tefloacuten y con una torunda de lana de vidrio o un disco de vidrio unterizado en el fondo Para preparar la columna de gel de siacutelice se vierte hexano en la columna de cromatografiacutea hasta que alcance una altura de aproximadamente 5 cm llenaacutendose a continuacioacuten con una papilla de gel de siacutelice en hexano (15 g en 40 ml) mediante la ayuda de varias porciones de hexano Se deja sedishymentar la mezcla en reposo completaacutendose la sedimentacioacuten aplicando una ligera vibracioacuten Antildeadir sulfato soacutedico anhidro hasta una altura de aproximadamente 05 cm y finalmente eluir el exceso de hexano

46 Cromatoacutegrafo de gases equipado con detector de ionizacioacuten de llama inyector con divisioacuten de flujo u laquocold on -columnraquo y horno programable con precisioacuten de plusmn 1 degC

47 Columna capilar de siacutelice fundida (025 o 032 mm de diaacutemetro interno times 25 m de longitud) recubierta con una peliacutecula de 025 μm de espesor de la fase 5 -fenilmetilsilicona

Nota 1

Pueden utilizarse otras columnas con polaridades similares o inferiores

48 Integrador-registrador con capacidad para modo de integracioacuten valle-valle

49 Microjeringa de 5-10 μl para cromatografiacutea de gases con aguja fija

410 Calentador de tipo manta o placa eleacutectrica

M11


5 REACTIVOS

Salvo indicacioacuten en sentido contrario uacutenicamente se utilizaraacuten reactivos de calidad para anaacutelisis Debe emplearse agua destilada o de pureza al menos equivalente

M32 51 Hexano o una mezcla de alcanos con un intervalo de ebullicioacuten de 65-

70 degC destilados en columna rectificadora El hexano podraacute ser sustituido por isooctano (224-trimetil pentano en grado cromatograacutefico) siempre que se alcancen valores de precisioacuten comparables El residuo tras la evapshyoracioacuten de 100 ml de disolvente podraacute ser controlado Los disolventes con un punto de ebullicioacuten superior al del n-hexano tardan en evaporarse No obstante son preferibles debido a la toxicidad del hexano

M11 52 Etanol de 96 vv

53 Sulfato soacutedico anhidro

54 Solucioacuten alcohoacutelica de hidroacutexido potaacutesico al 10 Antildeadir 10 ml de agua a 50 g de hidroacutexido potaacutesico agitar y diluir seguidamente la mezcla en etanol hasta un volumen de 500 ml

Nota 3

La potasa alcohoacutelica toma color marroacuten con el tiempo Debe prepararse diariamente y se almacenaraacute en botellas de vidrio oscuro cerradas hermeacutetishycamente

55 Gel de siacutelice 60 para columna de cromatografia de 70-230 mallas (refshyerencia 7734 de Merck o similar)

Nota 4

Por lo general el gel de siacutelice puede utilizarse directamente a partir del envase sin necesidad de tratamiento Sin embargo algunos lotes de siacutelice pueden presentar baja actividad produciendo separaciones cromatograacuteficas inadecuadas Cuando ello ocurra debe tratarse el gel de siacutelice de la siguiente manera activar el gel calentaacutendolo a 550 degC durante un miacutenimo de cuatro horas Tras el calentamiento poner el gel de siacutelice a enfriar en un desecador y trasvasarlo a continuacioacuten a un matraz con cierre hermeacutetico Se antildeade seguidamente un 2 de agua agitando hasta que dejen de verse grumos y el polvo fluya libremente

Si alguacuten lote de gel de siacutelice origina cromatogramas con picos que intershyfieran dicho gel seraacute sometido al tratamiento anteriormente mencionado Puede considerarse como alternativa la utilizacioacuten de gel de siacutelice 60 extrapuro (referencia 7754 de Merck)

56 Solucioacuten madre (200 ppm) de colesta-35-dieno (Sigma 99 de pureza) en hexano (10 mg en 50 ml)

57 Solucioacuten patroacuten de colesta-35-dieno en hexano con una concentracioacuten de 20 ppm que se obtiene diluyendo la solucioacuten anterior

Nota 5

Si se mantiene la temperatura por debajo de 4 degC las soluciones 56 y 57 permaneceraacuten inalteradas durante un miacutenimo de 4 meses

58 Solucioacuten de n-nonacosano en hexano con una concentracioacuten aproximada de 100 ppm

59 Gas portador para cromatografia helio o hidroacutegeno de 999990 de pureza

510 Gases auxiliares para el detector de ionizacioacuten de llama aire purificado e hidroacutegeno de 999990 de pureza

M11


6 METODOLOGIacuteA

61 Preparacioacuten de la materia insaponificable

611 Pesar 20 plusmn 01 g de aceite en un matraz de 250 ml (41) antildeadir 1 ml de solucioacuten patroacuten de colesta-35-dieno (20μg) y 75 ml de potasa alcohoacutelica al 10 colocar un refrigerante de reflujo y calentar a ebullicioacuten suave durante 30 minutos Retirar de la fuente de calor el matraz con la muestra y dejar enfriar ligeramente la solucioacuten (el enfriamiento no debe ser total para evitar la decantacioacuten de la muestra) Antildeadir 100 ml de agua y pasar la solucioacuten a un embudo de decantacioacuten (42) con ayuda de 100 ml de hexano Agitar eneacutergicamente durante 30 segundos y dejar decantar

Nota 6

Si se produce emulsioacuten que no desaparece raacutepidamente antildeadir pequentildeas cantidades de etanol

612 Pasar la fase acuosa inferior a un segundo embudo de decantacioacuten y someterla nuevamente a extraccioacuten con 100 ml de hexano Separar nuevamente la fase inferior y lavar los extractos de hexano (mezclaacutendolos en otro embudo de decantacioacuten) con tres porciones de 100 ml cada una de una mezcla de agua y etanol (1 1) hasta obtener un pH neutro

613 Pasar la solucioacuten de hexano a traveacutes de sulfato soacutedico anhidro (50 g) lavar con 20 ml de hexano y evaporar a 30 degC y presioacuten reducida en un rotavapor hasta sequedad

62 Separacioacuten de la fraccioacuten de hidrocarburos esteroideos

621 Introducir el residuo en la columna de fraccionamiento con ayuda de dos porciones de 1 ml de hexano distribuir la muestra en la columna dejando que el nivel de solucioacuten descienda hasta la parte superior del sulfato de sodio y comenzar la elucioacuten cromatograacutefica con hexano a un flujo aproximado de 1 mlmin Desechar los primeros 25-30 ml de eluido y recoger la fraccioacuten siguiente de 40 ml Despueacutes pasar esta fraccioacuten a un matraz de fondo redondo de 100 ml (43)

Nota 7

La primera fraccioacuten contiene los hidrocarburos saturados (cf Figura 1a) y la segunda fraccioacuten los esteroideos Al proseguir con la elucioacuten se obtiene escualeno y otros compuestos relacionados Para poder obtener una buena separacioacuten entre los hidrocarburos saturados y los esteroideos es necesario optimizar los voluacutemenes de las fracciones A tal efecto se debe ajustar el volumen de la primera fraccioacuten de tal manera que cuando se analice la segunda los picos correspondientes a los hidrocshyarburos saturados sean bajos (cf Figura 1c) cuando estos no aparezcan pero la intensidad del pico correspondiente al patroacuten sea reducida debe disminuirse el volumen De todas formas puesto que no se produce solapamiento de los picos durante la cromatografiacutea de gases no es precisa una separacioacuten completa entre los componentes de la primera y segunda fracciones siempre que las condiciones de la CG esteacuten ajustadas como se indica en 631 Por lo general no es necesario optimizar el volumen de la segunda fraccioacuten puesto que existe una buena separacioacuten con los componentes que eluyen posteriormente Sin embargo la presencia de un pico importante a 15 min aproximadamente por debajo del tiempo de retencioacuten del patroacuten se debe al escualeno y revela una mala separacioacuten

622 Evaporar la segunda fraccioacuten en rotavapor a 30 degC y presioacuten reducida hasta sequedad Disolver inmediatamente el residuo en 02 ml de hexano y mantener la solucioacuten en el refrigerador hasta el momento de su anaacutelisis

Nota 8

Los residuos 613 y 622 no deben mantenerse en seco a temperatura ambiente Una vez obtenidos es necesario antildeadirles disolvente y almashycenarlos en un refrigerador

M11



631 Condiciones de trabajo para inyeccioacuten con divisioacuten de flujo

mdash temperatura del inyector 300 degC


mdash integrador-registrador los paraacutemetros de integracioacuten deben ser fijados de tal forma que la evaluacioacuten de las aacutereas sea correcta La modalidad de integracioacuten valle-valle es la maacutes recomendable

mdash sensibilidad aproximadamente 16 veces la atenuacioacuten miacutenima

mdash cantidad de disolucioacuten inyectada 1μl

mdash programacioacuten de la temperatura del horno temperatura inicial constante de 235 degC durante 6 minutos seguida de un aumento gradual de 2 degCmin hasta alcanzar 285 degC

mdash inyeccioacuten con una divisioacuten de flujo de 1 15

mdash gas portador helio o hidroacutegeno a 120 kPa de presioacuten

Dichas condiciones pueden modificarse en funcioacuten de las caracteriacutesticas del cromatoacutegrafo y de la columna con objeto de obtener cromatogramas que respondan a los siguientes requisitos Pico del patroacuten interno situado con una aproximacioacuten de 5 minutos en torno al tiempo citado en 632 el pico del patroacuten interno alcanzaraacute como miacutenimo un 80 de la escala total

El sistema de cromatografiacutea de gases deberaacute comprobarse inyectando una mezcla de la solucioacuten madre de colestadieno (56) y de n-nonacosano (58) El pico del colesta-35-dieno deberaacute aparecer antes que el del n- nonacosano (veacutease figura 1c) si esto no ocurre pueden adoptarse dos soluciones reducir la temperatura inicial del horno o sustituir la columna de cromatografiacutea de gases por otra de polaridad inferior

632 Identificacioacuten de picos

El pico del patroacuten interno aparece a un tiempo de retencioacuten de aproxishymadamente 19 minutos y el del estigmasta-35-dieno lo hace a un tiempo de retencioacuten relativo de aproximadamente 129 (veacutease figura 1b) El estigshymasta-35-dieno suele ir acompantildeado de pequentildeas cantidades de un isoacutemero y por lo general ambos originan un solo pico cromatograacutefico No obstante si la columna es demasiado polar o tiene un gran poder de resolucioacuten el isoacutemero puede aparecer en forma de un pequentildeo pico justo antes y cerca del estigmasta-35-dieno (veacutease figura 2) En estos casos es preciso sumar las aacutereas de los dos picos Con el fin de estar seguro que los estigmastadienos eluyen como un solo pico se recomienda instituir la columna por otra de menor polaridad o de mayor diaacutemetro interior

Nota 9

Para obtener una referencia de los estigmastadienos puede utilizarse el anaacutelisis de cualquier aceite vegetal refinado empleando menor cantidad de muestra (de 1 a 2 g) Los estigmastadienos dan lugar a un pico importante de faacutecil identificacioacuten


El contenido de los estigmastadienos se determina aplicando la foacutermula

mg=kg de estigmastadienos frac14 A s Uuml M c A c Uuml M o

M11


en la cual A b = aacuterea del pico de estigmastadienos (si el pico se halla dividido en dos picos suacutemese el aacuterea de los dos picos)

A c = aacuterea del pico del patroacuten interno (colestadieno)

M c = peso de patroacuten antildeadido en microgramos

M o = peso de aceite empleado en gramos

Liacutemite de deteccioacuten aproximadamente 001 mgkg

M32 Nota 10

En caso de que aparezcan los estigmastadienos en concentraciones superiores a 4 mgkg si se requiere la cuantificacioacuten deberaacute aplicarse el meacutetodo del Consejo Oleiacutecola Internacional para determinar los esterenos en los aceites vegetales refinados

M11


Figura 1

Cromatogramas procedentes del anaacutelisis de muestras de aceite de oliva en columna capilar de siacutelice fundida (025 mm de diaacutemetro interno times 25 m) recushybierta con una peliacutecula de 025 μm de grosor de 5 -fenilmetilsilicona

M11


a) Primera fraccioacuten (30 ml) de un aceite virgen marcado con el patroacuten

b) Segunda fraccioacuten (40 ml) de un aceite de oliva que contiene 010 mgkg de estigmastadienos

c) Segunda fraccioacuten (40 ml) que incluye una pequentildea proporcioacuten de la primera

Figura 2

Cromatograma procedente del anaacutelisis de una muestra de aceite de oliva refinado en una columna DB-5 en el que se aprecia el isoacutemero del estigmasta-35-dieno

M11


ANEXO XVIII

DETERMINACIOacuteN DE LA DIFERENCIA ENTRE EL CONTENIDO REAL Y EL CONTENIDO TEOacuteRICO DE TRIGLICEacuteRIDOS CON

ECN 42

1 OBJETO

Determinacioacuten de la diferencia absoluta entre los valores experimentales de trigliceacuteridos (TG) con un nuacutemero equivalente de carbonos igual a 42 (ECN 42 HPLC ) obtenidos mediante determinacioacuten en el aceite por cromashytografiacutea de liacutequidos de alta resolucioacuten y el valor teoacuterico de TG con un nuacutemero equivalente de carbonos igual a 42 (ECN 42 teoacuterico ) calculado a partir de la composicioacuten de los aacutecidos grasos


El presente meacutetodo es aplicable a los aceites de oliva Puede utilizarse para detectar la presencia de pequentildeas cantidades de aceites de semillas (ricos en aacutecido linoleico) en todos los tipos de aceites de oliva

3 PRINCIPIO

El contenido de trigliceacuteridos con ECN 42 determinado por anaacutelisis con HPLC y el contenido teoacuterico de trigliceacuteridos con ECN 42 (calculado sobre la base de la determinacioacuten de la composicioacuten de aacutecidos grasos mediante GLC) se corresponden dentro de ciertos liacutemites en el caso de los aceites de oliva auteacutenticos Una diferencia superior a los valores adoptados para cada tipo de aceite seriacutea indicativa de que el aceite contiene aceites de semillas

4 MEacuteTODO

El meacutetodo para el caacutelculo del contenido teoacuterico de trigliceacuteridos con ECN 42 y de la diferencia con respecto a los datos obtenidos con HPLC consiste esencialmente en la coordinacioacuten de los datos analiacuteticos obtenidos por medio de otros meacutetodos Pueden distinguirse tres fases determinacioacuten de la composicioacuten de aacutecidos grasos mediante cromatoshygrafiacutea de gases con columna capilar caacutelculo de la composicioacuten teoacuterica de trigliceacuteridos con ENC 42 determinacioacuten mediante HPLC de los trigliceacuteridos con ECN 42

41 Instrumental


412 Vasos de precipitados de 100 ml

413 Columna de cromatografiacutea de vidrio de 21 mm de diaacutemetro interior y 450 mm de longitud con llave y cono (hembra) normalizado en el extremo superior

414 Ampollas de decantacioacuten de 250 ml con cono (macho) normalizado en el extremo inferior adecuadas para conectarse al extremo superior de la columna

415 Varilla de vidrio de 600 mm de longitud

416 Embudo de vidrio de 80 mm de diaacutemetro

417 Matraces aforados de 50 ml


419 Rotavapor

4110 Cromatoacutegrafo de liacutequidos de alta resolucioacuten con control termostaacutetico de la temperatura de la columna

4111 Sistema de inyeccioacuten de voluacutemenes de 10 μl

4112 Detector refractoacutemetro diferencial La sensibilidad en toda la escala deberaacute ser como miacutenimo de 10 ndash4 unidades de iacutendice de refraccioacuten

M25


4113 Columna tubo de acero inoxidable de 250 mm de longitud times 45 mm de diaacutemetro interior rellena de partiacuteculas de siacutelice de 5 μm de diaacutemetro con un 22-23 de carbono en forma de octadecilsilano

4114 Programas de tratamiento de datos

4115 Frascos de aproximadamente 2 ml de volumen con membranas revestidas de tefloacuten y tapones de rosca

42 Reactivos

Los reactivos deberaacuten ser de calidad para anaacutelisis Los disolventes de elucioacuten deberaacuten desgasificarse y podraacuten reciclarse varias veces sin que ello afecte a las separaciones

M32 421 Eacuteter de petroacuteleo 40-60 degC de pureza de grado cromatograacutefico o

hexano El hexano podraacute ser sustituido por isooctano (224-trimetil pentano en grado cromatograacutefico) siempre que se alcancen valores de precisioacuten comparables Los disolventes con un punto de ebullicioacuten superior al del n-hexano tardan en evaporarse No obstante son preferibles debido a la toxicidad del hexano

M25 422 Eacuteter etiacutelico libre de peroacutexidos recieacuten destilado

423 Disolvente de elucioacuten para purificar el aceite mediante cromatografiacutea en columna mezcla de eacuteter de petroacuteleoeacuteter etiacutelico 8713 (vv)

424 Gel de siacutelice 70-230 mallas tipo Merck 7734 con contenido de agua normalizado al 5 (pp)

425 Lana de vidrio

426 Acetona para HPLC

427 Acetonitrilo o propionitrilo para HPLC

428 Disolvente de elucioacuten para HPLC acetonitrilo + acetona (las proporshyciones se ajustaraacuten para obtener la separacioacuten deseada comenzar con una mezcla 5050) o propionitrilo

429 Disolvente de solubilizacioacuten acetona

4210 Trigliceacuteridos de referencia es posible utilizar trigliceacuteridos comerciales (tripalmitina trioleiacutena etc) y los tiempos de retencioacuten se representan entonces graacuteficamente frente al nuacutemero equivalente de carbonos o bien cromatogramas de referencia obtenidos de aceite de soja de una mezcla 3070 de aceite de soja y aceite de oliva y de aceite de oliva puro (veacuteanse las notas 1 y 2 y las figuras 1 a 4)

4211 Columna de extraccioacuten en fase soacutelida con 1 g de fase de siacutelice en 6 ml

M32 4212 Heptano calidad cromatograacutefica El heptano podraacute ser sustituido por

isooctano (224-trimetil pentano en grado cromatograacutefico)

M25 43 Preparacioacuten de la muestra

Como hay una serie de sustancias interferentes que puede dar lugar a falsos resultados positivos la muestra debe purificarse siempre seguacuten el meacutetodo IUPAC 2507 utilizado para la determinacioacuten de compuestos polares en grasas para freiacuter


Llenar la columna (413) con aproximadamente 30 ml de disolvente de elucioacuten (423) introducir a continuacioacuten en la columna un poco de lana de vidrio (425) y empujarla hasta el fondo de la columna ayudaacutendose con la varilla de vidrio (415)

Preparar en un vaso de precipitados de 100 ml una suspensioacuten de 25 g de gel de siacutelice (424) en 80 ml de la mezcla de elucioacuten (423) y transferirla a la columna con ayuda de un embudo de vidrio (416)

Para asegurarse de la transferencia total del gel de siacutelice a la columna lavar el vaso de precipitados con la mezcla de elucioacuten y pasar tambieacuten los liacutequidos de lavado a la columna

Abrir la llave de la columna y dejar que salga el disolvente hasta que su nivel se situacutee aproximadamente 1 cm por encima del gel de siacutelice

M25



Pesar con precisioacuten de 0001 g 25 plusmn 01 g de aceite previamente filtrado homogeneizado y en caso necesario deshidratado en un matraz aforado de 50 ml (417)

Disolverlos en 20 ml aproximadamente del disolvente de elucioacuten (423) En caso necesario calentar ligeramente para facilitar la disolucioacuten Enfriar a temperatura ambiente y enrasar con el disolvente de elucioacuten

Introducir con una pipeta aforada 20 ml de solucioacuten en la columna preparada como se indica en 431 abrir la llave y dejar eluir el disolvente hasta el nivel de la capa de gel de siacutelice

Eluir a continuacioacuten con 150 ml de disolvente de elucioacuten (423) regulando el flujo de disolvente a 2 mlminuto aproximadamente (de modo que pasen a traveacutes de la columna 150 ml en unos 60-70 minutos)

Recoger el eluido en un matraz redondo de 250 ml (411) previamente tarado en estufa y pesarlo exactamente Eliminar el disolvente a presioacuten reducida en un rotavapor (419) y pesar el residuo con el cual se prepararaacute la solucioacuten para el anaacutelisis por HPLC y para la obtencioacuten de los eacutesteres metiacutelicos

Tras pasar por la columna debe recuperarse como miacutenimo un 90 de la muestra en el caso de las categoriacuteas virgen extra virgen corriente refinado y aceite de oliva mientras que en el de los aceites lampantes y de orujo de oliva los porcentajes de recuperacioacuten no pueden ser inferiores al 80

433 Purificacioacuten por extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)

La columna de siacutelice de SPE se activa haciendo pasar 6 ml de hexano (423) en vaciacuteo evitando la desecacioacuten

Pesar con una precisioacuten de 0001 g 012 g en un frasco de 2 ml (4115) y disolver con 05 ml de hexano (423)

Cargar la columna de SPE con la solucioacuten y eluir con 10 ml de mezcla hexanoeacuteter dietiacutelico (8713 vv) (423) al vaciacuteo

La fraccioacuten recogida se evapora hasta su desecacioacuten en un rotavapor (419) a presioacuten reducida y a temperatura ambiente El residuo se disuelve en 2 ml de acetona (426) para realizar el anaacutelisis de trigliceacuteridos (TG)

44 Anaacutelisis por HPLC

441 Preparacioacuten de las muestras para anaacutelisis cromatograacutefico

Preparar del siguiente modo una solucioacuten al 5 de la muestra que vaya a analizarse pesar 05 plusmn 0001 g de la muestra en un matraz aforado de 10 ml y enrasar con el disolvente de solubilizacioacuten (429)

442 Procedimiento

Instalar el sistema cromatograacutefico Bombear el disolvente de elucioacuten (428) a un flujo de 15 mlmin para purgar todo el sistema Esperar hasta que se obtenga una liacutenea de base estable

Inyectar 10 μl de la muestra preparada como se indica en el punto 43

443 Caacutelculo y expresioacuten de los resultados

Utilizar el meacutetodo de normalizacioacuten de aacutereas es decir considerar que la suma de las superficies de los picos correspondientes a los trigliceacuteridos de ECN entre 42 y 52 es igual al 100

Calcular el porcentaje relativo de cada trigliceacuterido mediante la foacutermula siguiente

del trigliceacuterido = superficie del pico times 100suma de las superficies de los picos

Los resultados deben expresarse como miacutenimo con dos decimales

Veacuteanse las notas 1 a 4

M25


45 Caacutelculo de la composicioacuten de trigliceacuteridos (porcentaje de moles) a partir de los datos de composicioacuten de los aacutecidos grasos (porcentaje de superficie)

451 Determinacioacuten de composicioacuten de aacutecidos grasos

La composicioacuten de aacutecidos grasos se determina seguacuten la norma ISO 5508 por medio de una columna capilar Los eacutesteres metiacutelicos se preparan seguacuten el COIT20Doc no 24

452 Aacutecidos grasos para el caacutelculo

Los gliceacuteridos se agrupan en funcioacuten de su nuacutemero equivalente de carbonos (ECN) teniendo en cuenta las equivalencias que figuran a continuacioacuten entre ECN y aacutecidos grasos Solo se han considerado los aacutecidos grasos con 16 y 18 aacutetomos de carbono ya que son los uacutenicos importantes para el aceite de oliva Los aacutecidos grasos deben normalshyizarse al 100

Aacutecido graso (AG) Abreviatura Peso molecular (PM) ECN

Aacutecido palmiacutetico P 2564 16

Aacutecido palmitoleico Po 2544 14

Aacutecido esteaacuterico S 2845 18

Aacutecido oleico O 2825 16

Aacutecido linoleico L 2804 14

Aacutecido linoleacutenico Ln 2784 12

453 Conversioacuten de los de superficie en moles respecto a todos los aacutecidos grasos (1)

moles P frac14 sup P

PM P moles S frac14

sup S PM S

moles Po frac14 sup Po

PM Po

moles O frac14 sup O

PM O moles L frac14

sup L PM L

moles Ln frac14 sup Ln

PM Ln

454 Normalizacioacuten de los moles de los aacutecidos grasos al 100 (2)

moles P eth123THORN frac14 moles P auml 100

moles ethP thorn S thorn Po thorn O thorn L thorn LnTHORN

moles S eth123THORN frac14 moles S auml 100


moles Po eth123THORN frac14 moles Po auml 100


moles O eth123THORN frac14 moles O auml 100


moles L eth123THORN frac14 moles L auml 100


moles Ln eth123THORN frac14 moles Ln auml 100


El resultado proporciona el porcentaje de cada aacutecido graso en porcentaje de moles en todas las posiciones (1 2 y 3) de los TG A continuacioacuten se calculan las sumas de los aacutecidos grasos saturados (AGS) P y S y de los aacutecidos grasos insaturados (AGI) Po O L y Ln (3) moles AGS frac14 moles P thorn moles S moles AGI frac14 100 Auml moles AGS

M25


455 Caacutelculo de la composicioacuten de aacutecidos grasos en la posicioacuten 2 y en las posiciones 1 y 3 de los TG

Los aacutecidos grasos se distribuyen en tres grupos del siguiente modo uno para la posicioacuten 2 y dos ideacutenticos para las posiciones 1 y 3 con coefishycientes diferentes para los aacutecidos saturados (P y S) y los insaturados (Po O L y Ln)

4551 Aacutecidos grasos saturados en la posicioacuten 2 [P(2) y S(2)] (4)

moles Peth2THORN frac14 moles P eth123THORN auml 006

moles Seth2THORN frac14 moles S eth123THORN auml 006

4552 Aacutecidos grasos insaturados en la posicioacuten 2 [Po(2) O(2) L(2) y Ln(2)] (5)

moles Poeth2THORN frac14 moles Poeth123THORN

moles AGI auml eth100 ndash moles Peth2THORN ndash moles Seth2THORNTHORN

moles Oeth2THORN frac14 moles Oeth123THORN


moles Leth2THORN frac14 moles Leth123THORN


moles Lneth2THORN frac14 moles Lneth123THORN


4553 Aacutecidos grasos en las posiciones 1 y 3 [P(13) S(13) Po(13) O(13) L(13) y Ln(13)] (6)

moles Peth13THORN frac14 moles Peth123THORN ndash moles Peth2THORN

2 thorn moles Peth123THORN

moles Seth13THORN frac14 moles Seth123THORN ndash moles Seth2THORN

2 thorn moles Seth123THORN

moles Poeth13THORN frac14 moles Poeth123THORN ndash moles Poeth2THORN

2 thorn moles Poeth123THORN

moles Oeth13THORN frac14 moles Oeth123THORN ndash moles Oeth2THORN

2 thorn moles Oeth123THORN

moles Leth13THORN frac14 moles Leth123THORN ndash moles Leth2THORN

2 thorn moles Leth123THORN

moles Lneth13THORN frac14 moles Lneth123THORN ndash moles Lneth2THORN

2 thorn moles Lneth123THORN

456 Caacutelculo de trigliceacuteridos

4561 TG con un solo aacutecido graso (AAA aquiacute LLL PoPoPo) (7)

moles AAA frac14 moles Aeth13THORN auml moles Aeth2THORN auml moles Aeth13THORN

10 000

4562 TG con dos aacutecidos grasos (AAB aquiacute PoPoL PoLL) (8)

moles AAB frac14 moles Aeth13THORN auml moles Aeth2THORN auml moles Beth13THORN auml 2

10 000

moles ABA frac14 moles Aeth13THORN auml moles Beth2THORN auml moles Aeth13THORN

10 000

M25


4563 TG con tres aacutecidos grasos diferentes (ABC en este caso OLLn PLLn PoOLn PPoLn) (9)

moles ABC frac14 moles Aeth13THORN auml moles Beth2THORN auml moles Ceth13THORN auml 2

10 000

moles BCA frac14 moles Beth13THORN auml moles Ceth2THORN auml moles Aeth13THORN auml 2

10 000

moles CAB frac14 moles Ceth13THORN auml moles Aeth2THORN auml moles Beth13THORN auml 2

10 000

4564 Trigliceacuteridos con ECN 42

Los trigliceacuteridos con ECN 42 se calculan de acuerdo con las ecuaciones 7 8 y 9 y se indican por orden de elucioacuten prevista en HPLC (normshyalmente solo tres picos)

LLL

PoLL y el isoacutemero de posicioacuten LPoL

OLLn y los isoacutemeros de posicioacuten OLnL y LnOL

PoPoL y el isoacutemero de posicioacuten PoLPo

PoOLn y los isoacutemeros de posicioacuten OPoLn y OLnPo

PLLn y los isoacutemeros de posicioacuten LLnP y LnPL

PoPoPo

SLnLn y el isoacutemero de posicioacuten LnSLn

PPoLn y los isoacutemeros de posicioacuten PLnPo y PoPLn

Los trigliceacuteridos con ECN 42 se obtienen mediante la suma de los nueve trigliceacuteridos incluidos sus isoacutemeros de posicioacuten Los resultados deben expresarse como miacutenimo con dos decimales

5 EVALUACIOacuteN DE LOS RESULTADOS

Se comparan el contenido teoacuterico calculado y el determinado por HPLC Si la diferencia en valor absoluto entre los datos de HPLC y los datos teoacutericos es superior a los valores indicados para la categoriacutea adecuada de aceite en la norma se concluye que la muestra contiene aceite de semillas

Los resultados se expresan con dos decimales

6 EJEMPLO (LOS NUacuteMEROS SE REFIEREN A LAS SECCIONES DEL TEXTO DEL MEacuteTODO)

mdash 451 Caacutelculo del porcentaje de moles de aacutecidos grasos a partir de datos de GLC (porcentaje de superficie normalizada)

Los datos siguientes de la composicioacuten de aacutecidos grasos se obtienen mediante GLC

FA P S Po O L Ln

PM 2564 2845 2544 2825 2804 2784

Porcentaje de superficie

100 30 10 750 100 10

M25


mdash 453 Conversioacuten en moles de los porcentajes de superficie respecto a todos los aacutecidos grasos [veacutease la foacutermula (1)]

moles P = 10

2564 frac14 003900 moles P

moles S = 3

2845 frac14 001054 moles S

moles Po = 1

2544 frac14 000393 moles Po

moles O = 75

2825 frac14 026549 moles O

moles L = 10

2804 frac14 003566 moles L

moles Ln = 1

2784 frac14 000359 moles Ln

total = 035821 moles TG

mdash 454 Normalizacioacuten de los moles de aacutecidos grasos al 100 [veacutease la foacutermula (2)]

moles P(123) = 003900 moles P auml 100

035821 moles frac14 10887

moles S(123) = 001054 moles S auml 100

035821 moles frac14 2942

moles Po(123) = 000393 moles Po auml 100

035821 moles frac14 1097

moles O(123) = 026549 moles O auml 100

035821 moles frac14 74116

moles L(123) = 003566 moles L auml 100

035821 moles frac14 9955

moles Ln(123) = 000359 moles Ln auml 100

035821 moles frac14 1002

total moles = 100

Suma de los aacutecidos grasos saturados e insaturados en las posiciones 1 2 y 3 de los TG [veacutease la foacutermula (3)]

moles AGS frac14 10887 thorn 2942 frac14 13829

moles AGI frac14 100000 Auml 13829 frac14 86171

mdash 455 Caacutelculo de la composicioacuten de aacutecidos grasos en la posicioacuten 2 y en las posiciones 1 y 3 de los TG

mdash 4551 Aacutecidos grasos saturados en la posicioacuten 2 [P(2) y S(2)] [veacutease la foacutermula (4)]

moles Peth2THORN frac14 10887 auml 006 frac14 0653 moles

moles Seth2THORN frac14 2942 auml 006 frac14 0177 moles

mdash 4552 Aacutecidos grasos insaturados en la posicioacuten 2 [Po(13) O(13) L(13) y Ln(13)] [veacutease la foacutermula (5)]

moles Poeth2THORN frac14 1097

86171 auml eth100 ndash 0653 ndash 0177THORN frac14 1262 moles

moles Oeth2THORN frac14 74116 86171 auml eth100 ndash 0653 ndash 0177THORN frac14 85296 moles

moles Leth2THORN frac14 9955 86171 auml eth100 ndash 0653 ndash 0177THORN frac14 11457 moles

moles Lneth2THORN frac14 1002


M25


mdash 4553 Aacutecidos grasos en las posiciones 1 y 3 [P(13) S(13) Po(13) O(13) L(13) y Ln(13)] [(veacutease la foacutermula (6)]

moles Peth13THORN frac14 10887 ndash 0653

2 thorn 10887 frac14 16004 moles

moles Seth13THORN frac14 2942 ndash 0177


moles Poeth13THORN frac14 1097 ndash 1262


moles Oeth13THORN frac14 74116 ndash 85296


moles Leth13THORN frac14 9955 ndash 11457


moles Lneth13THORN frac14 1002 ndash 1153


mdash 456 Caacutelculo de trigliceacuteridos

A partir de la composicioacuten calculada de aacutecidos grasos en las posiciones 2 y 13

AG en Posiciones 1 y 3 Posicioacuten 2

P 16004 0653

S 4325 0177

Po 1015 1262

O 68526 85296

L 9204 11457

Ln 0927 1153

Suma 1000 1000

se calculan los trigliceacuteridos siguientes

LLL

PoPoPo

PoLL con un isoacutemero de posicioacuten

SLnLn con un isoacutemero de posicioacuten

PoPoL con un isoacutemero de posicioacuten

PPoLn con dos isoacutemeros de posicioacuten

OLLn con dos isoacutemeros de posicioacuten

PLLn con dos isoacutemeros de posicioacuten

PoOLn con dos isoacutemeros de posicioacuten

mdash 4561 TG con un solo aacutecido graso (LLL PoPoPo) [veacutease la foacutermula (7)]

mol LLL frac14 9204 auml 11457 auml 9204

10 000 frac14 0 09706 mol LLL

mol PoPoPo frac14 1015 auml 1262 auml 1015

10 000 frac14 000013 mol PoPoPo

M25


mdash 4562 TG con dos aacutecidos grasos (PoLL SLnLn PoPoL) [veacutease la foacutermula (8)]

mol PoLL thorn LLPo frac14 1015 auml 11457 auml 9204 auml 2

10 000 frac14 002141

mol LPoL frac14 9204 auml 1262 auml 9204

10 000 frac14 001069

003210 mol PoLL

mol SLnLn thorn LnLnS frac14 4325 auml 1153 auml 0927 auml 2

10 000 frac14 000092

mol LnSLn frac14 0927 auml 0177 auml 0927

10 000 frac14 000002

000094 mol SLnLn

mol PoPoL thorn LPoPo frac14 1015 auml 1262 auml 9204 auml 2

10000 frac14 000236

mol PoLPo frac14 1015 auml 11457 auml 1015

10 000 frac14 000118

000354 mol PoPoL

mdash 4563 TG con tres aacutecidos grasos diferentes (PoPLn OLLn PLLn PoOLn) [veacutease la foacutermula (9)]

mol PPoLn frac14 16004 auml 1262 auml 0927 auml 2

10 000 frac14 000374

mol LnPPo frac14 0927 auml 0653 auml 1015 auml 2

10 000 frac14 000012

mol PoLnP frac14 1015 auml 1153 auml 16004 auml 2

10 000 frac14 000375

000761 mol PPoLn

mol OLLn frac14 68526 auml 11457 auml 0927 auml 2

10 000 frac14 014556

mol LnOL frac14 0927 auml 85296 auml 9204 auml 2

10 000 frac14 014555

mol LLnO frac14 9204 auml 1153 auml 68526 auml 2

10 000 frac14 014544

043655 mol OLLn

mol PLLn frac14 16004 auml 11457 auml 0927 auml 2

10 000 frac14 003399

mol LnPL frac14 0927 auml 0653 auml 9204 auml 2

10000 frac14 000111

mol LLnP frac14 9204 auml 1153 auml 16004 auml 2

10 000 frac14 003397

006907 mol PLLn

M25


mol PoOLn frac14 1015 auml 85296 auml 0927 auml 2

10 000 frac14 001605

mol LnPoO frac14 0927 auml 1262 auml 68526 auml 2

10 000 frac14 001603

mol OLnPo frac14 68526 auml 1153 auml 1015 auml 2

10 000 frac14 001604

004812 mol PoOLn

ECN 42 = 069512 mol TG

Nota 1 El orden de elucioacuten puede determinarse calculando los nuacutemeros equivshyalentes de carbono a menudo definidos por la relacioacuten ECN frac14 CN ndash 2n donde CN es el nuacutemero de carbonos y n es el nuacutemero de dobles enlaces pueden calcularse con mayor precisioacuten teniendo en cuenta el origen del doble enlace Si n o n l y n ln son los nuacutemeros de enlaces dobles atribuidos a los aacutecidos oleico linoleico y linoleacutenico respectivamente el nuacutemero equivalente de carbonos puede calcularse mediante la foacutermula siguiente

ECN frac14 CN ndash d o n o ndash d l n l ndash d ln n ln

donde los coeficientes d o d l y d ln pueden calcularse mediante los trigliceacuteridos de referencia En las condiciones que se especifican en el presente meacutetodo la foacutermula obtenida seraacute similar a la siguiente

ECN frac14 CN ndash eth260 n o THORN ndash eth235 n l THORN ndash eth217 n ln THORN

Nota 2 Con varios trigliceacuteridos de referencia tambieacuten es posible calcular la resolucioacuten con respecto a la trioleiacutena

α frac14 TR 1=TR trioleiacutena

utilizando el tiempo de retencioacuten reducido TR 1 frac14 TR Auml TR disolvente

La representacioacuten graacutefica del log α frente a f (nuacutemero de dobles enlaces) permite determinar los valores de retencioacuten de todos los trigliceacuteridos de los aacutecidos grasos contenidos en los trigliceacuteridos de referencia (veacutease la figura 1)

Nota 3 La resolucioacuten de la columna ha de permitir separar claramente el pico de la trilinoleiacutena de los picos de los trigliceacuteridos con un tiempo de retencioacuten proacuteximo La elucioacuten se prosigue hasta el pico de ECN 52

Nota 4 Para poder medir correctamente las superficies de todos los picos de intereacutes en la presente determinacioacuten es necesario que el segundo pico corresponshydiente a ECN 50 equivalga al 50 de la escala completa del registrador

M25


Figura 1

Representacioacuten graacutefica del log α frente a f (nuacutemero de dobles enlaces)

Nuacutemero de dobles enlaces

La aacutecido laacuteurico My aacutecido miriacutestico P aacutecido palmiacutetico S aacutecido esteaacuterico O aacutecido oleico L aacutecido linoleico Ln aacutecido linoleacutenico

M25


Figura 2

Aceite de oliva con bajo contenido en linoleico

a

Con disolvente acetonaacetonitrilo

PERFIL a Principales componentes de los picos cromatograacuteficos ECN 42 (1) LLL + PoLL (2) OLLn + PoOLn (3) PLLn ECN 44 (4) OLL + PoOL (5) OOLn + PLL (6) POLn + PPoPo (7) OOL + PoOO ECN 46 (8) OOL + LnPP (9) PoOO (10) SLL + PLO (11) PoOP + SPoL + SOLn + SPoPo (12) PLP ECN 48 (13) OOO + PoPP (14 + 15) SOL + POO (16) POP ECN 50 (17) SOO (18) POS + SLS

b

Con disolvente propionitrilo

PERFIL b Principales componentes de los picos cromatograacuteficos ECN 42 (1) LLL (2) OLLn + PoLL (3) PLLn ECN 44 (4) OLL (5) OOLn + PoOL (6) PLL + PoPoO (7) POLn + PPoPo + PPoL ECN 46 (8) OOL + LnPP (9) PoOO (10) SLL + PLO (11) PoOP + SPoL + SOLn + SPoPo (12) PLP ECN 48 (13) OOO + PoPP (14) SOL (15) POO (16) POP ECN 50 (17) SOO (18) POS + SLS

M25


Figura 3

Aceite de oliva con alto contenido en linoleico

(a)

Con disolvente acetonaacetonitrilo (50 50)

Perfil a Principales componentes de los picos cromatograacuteficos ECN 42 (1rsquo) LLL + PoLL (2rsquo) OLLn + PoOLn (3rsquo) PLLn ECN 44 (4rsquo) OLL + PoOL (5rsquo) OOLn + PLL (6rsquo) POLn + PPoPo ECN 46 (7rsquo) OOL + PoOO (8rsquo) PLO + SLL + PoOP (9rsquo) PLP + PoPP ECN 48 (10rsquo) OOO (11rsquo) POO + SLL + PPoO (12rsquo) POP + PLS ECN 50 (13rsquo) SOO (14rsquo) POS + SLS

(b)


Perfil b Principales componentes de los picos cromatograacuteficos ECN 42 (1) LLL (2 + 2rsquo) OLLn + PoLL (3) PLLn ECN 44 (4) OLL (5) OOLn + PoOL (6) PLL + PoPoO (7) POLn + PPoPo + PPoL ECN 46 (8) OOL + LnPP (9) PoOO (10) SLL + PLO (11) PoOP + SPoL + SOLn + SPoPo ECN 48 (12) PLP (13) OOO + PoPP (14) SOL (15) POO (16) POP ECN 50 (17) SOO (18) POS + SLS ECN 52 (19) AOO

M25


ANEXO XIX

DETERMINACIOacuteN DE LA COMPOSICIOacuteN Y CONTENIDO DE LOS ESTEROLES Y COMPUESTOS ALCOHOacuteLICOS MEDIANTE

CROMATOGRAFIacuteA DE GASES CON COLUMNA CAPILAR


El meacutetodo describe un procedimiento para determinar el contenido alcoshyhoacutelico volumeacutetrico total e individual de los aceites de oliva y de los aceites de orujo de oliva asiacute como de las mezclas de estos dos aceites

Los compuestos alcohoacutelicos de los aceites de oliva y los aceites de orujo de oliva comprenden alcoholes alifaacuteticos esteroles y dialcoholes tritershypeacutenicos

2 PRINCIPIO

Los aceites con α-colestanol y 1-eicosanol antildeadidos como patrones internos se saponifican con hidroacutexido potaacutesico en solucioacuten etanoacutelica y la materia insaponificable se extrae a continuacioacuten con eacuteter de etilo

Las diferentes fracciones de compuestos alcohoacutelicos se separan de la materia insaponificable ya sea mediante cromatografiacutea en capa fina sobre una placa de gel de siacutelice baacutesica (meacutetodo de referencia) o mediante HPLC con columna de gel de siacutelice La fraccioacuten recuperada de la separacioacuten del gel de siacutelice se transforma en eacuteteres de trimetilsililo y se analizan a continuacioacuten mediante cromatografiacutea de gases con columna capilar

PARTE 1

PREPARACIOacuteN DEL INSAPONIFICABLE


Esta parte describe la preparacioacuten y extraccioacuten del insaponificable Incluye la preparacioacuten y extraccioacuten del insaponificable a partir de los aceites de oliva y de los aceites de orujo de oliva

2 PRINCIPIO

Una porcioacuten de prueba se saponifica llevaacutendola a ebullicioacuten por reflujo con una solucioacuten etanoacutelica de hidroacutexido de potasio El insaponificable se extrae mediante eacuteter dietiacutelico

3 INSTRUMENTAL

El equipo de laboratorio habitual y en particular lo siguiente

31 Matraz de fondo redondo de 250 ml provisto de refrigerante de reflujo con juntas esmeriladas

32 Embudo de decantacioacuten de 500 ml

33 Matraces de 250 ml

34 Microjeringas de100 μl y 500 μl

35 Embudo ciliacutendrico filtrante con filtro poroso G3 (porosidad 15-40 μm) con un diaacutemetro aproximado de 2 cm y una profundidad de 5 cm apropiado para filtraciones al vaciacuteo con junta esmerilada macho

36 Matraz coacutenico de 50 ml con junta esmerilada hembra acoplable al embudo filtrante (punto 35)

37 Tubo de ensayo de 10 ml con fondo coacutenico y tapoacuten de vidrio de cierre hermeacutetico

38 Desecador de dicloruro de calcio

4 REACTIVOS

41 Hidroacutexido potaacutesico (pureza miacutenima del 85 )

M32


42 Hidroacutexido potaacutesico solucioacuten etanoacutelica 2 M aproximadamente

Disolver enfriando al mismo tiempo 130 g de hidroacutexido potaacutesico (41) en 200 ml de agua destilada y completar hasta un litro con etanol (47) Conservar la solucioacuten en botellas de vidrio oscuro bien cerradas y almashycenarla un maacuteximo de dos diacuteas

43 Eacuteter etiacutelico de calidad para anaacutelisis

44 Sulfato soacutedico anhidro de calidad para anaacutelisis

45 Acetona de calidad para cromatografiacutea


47 Etanol de calidad para anaacutelisis

48 Acetato de etilo de calidad para anaacutelisis

49 patroacuten interno α-Colestanol de pureza superior al 99 (hay que comprobar la pureza mediante cromatografiacutea de gases)

410 Solucioacuten de patroacuten interno de α-colestanol solucioacuten 02 (mV) en acetato de etilo (48)

411 Solucioacuten de fenolftaleiacutena 10 gl en etanol (47)

412 1-eicosanol solucioacuten al 01 (mv) en acetato de etilo (patroacuten interno)

5 PROCEDIMIENTO

Utilizando una microjeringa de 500 μl (34) introducir en el matraz de 250 ml (31) un volumen de solucioacuten de patroacuten interno de α-colestanol (410) y un volumen de 1-eicosanol (412) que contengan una cantidad de colestanol y de eicosanol correspondiente a aproximadamente el 10 del contenido de esteroles y alcohol de la muestra Por ejemplo para 5 g de aceite de oliva antildeadir 500 μl de la solucioacuten de α-colestanol (410) y 250 μl de la solucioacuten de 1-eicosanol (412) Para los aceites de orujo de oliva antildeadir 1 500 μl de la solucioacuten de α-colestanol (410) y 1 500 μl de la solucioacuten de 1-eicosanol (412) Se hace evaporar hasta secar mediante una ligera corriente de nitroacutegeno en un bantildeo de agua templada Despueacutes de enfriar el matraz en el mismo matraz pesar 500 g plusmn 001 g de la muestra filtrada seca

Nota 1 En el caso de aceites y grasas animales o vegetales con un alto contenido de colesterol puede producirse un pico cuyo tiempo de retencioacuten sea ideacutentico al del colestanol En tal caso el anaacutelisis de la fraccioacuten de esteroles debe realizarse dos veces con patroacuten interno y sin eacutel

Antildeadir 50 ml de solucioacuten etanoacutelica de hidroacutexido potaacutesico 2 M (42) y algo de piedra poacutemez ajustar el condensador de reflujo y calentar a ebullicioacuten suave hasta que tenga lugar la saponificacioacuten (la solucioacuten se vuelve incoshylora) Calentar durante 20 minutos maacutes y a continuacioacuten antildeadir 50 ml de agua destilada por la parte superior del condensador separar el condensador y enfriar el matraz a 30 degC aproximadamente

Pasar el contenido del matraz cuantitativamente a una ampolla de decantacioacuten de 500 ml (32) usando varias fracciones de agua destilada (50 ml) Antildeadir aproximadamente 80 ml de eacuteter etiacutelico (46) y agitar con fuerza aproximadamente durante 60 segundos con liberacioacuten perioacutedica de la presioacuten invirtiendo la ampolla de decantacioacuten y abriendo la llave Dejarla en reposo hasta que se produzca una completa separacioacuten en dos fases (nota 2) Retirar entonces la solucioacuten de jaboacuten lo maacutes exhaustishyvamente posible y pasar a una segunda ampolla de decantacioacuten Efectuar otras dos extracciones de la fase hidroalcohoacutelica por el mismo procedishymiento utilizando de 60 a 70 ml de eacuteter etiacutelico (46)

Nota 2 Las emulsiones pueden eliminarse antildeadiendo pequentildeas cantidades de etanol (47)

M32


Combinar las tres extracciones de eacuteter en una sola ampolla de decantacioacuten que contenga 50 ml de agua Continuar lavando con agua (50 ml) hasta que el agua de lavado no adquiera un color rosa al antildeadirle una gota de solucioacuten de fenolftaleiacutena (411) Una vez eliminada el agua de lavado filtrar con sulfato soacutedico anhidro (44) a un matraz de 250 ml previamente pesado lavando el embudo y el filtro con pequentildeas cantidades de eacuteter etiacutelico (46)

Evaporar el disolvente mediante su destilacioacuten en un rotavapor a 30 degC al vaciacuteo Antildeadir 5 ml de acetona (45) y eliminar totalmente el disolvente volaacutetil con una ligera corriente de aire Secar el residuo en el horno a 103 plusmn 2 degC durante 15 min Enfriar en desecador y pesar con precisioacuten de 01 mg

PARTE 2

SEPARACIOacuteN DE LAS FRACCIONES DE LOS COMPUESTOS ALCOHOacuteLICOS


El insaponificable preparado en la parte 1 estaacute fraccionado en compuestos alcohoacutelicos alcoholes alifaacuteticos esteroles y dialcoholes triterpeacutenicos (eritshyrodiol y uvaol)

2 PRINCIPIO

El insaponificable puede fraccionarse mediante cromatografiacutea de capa fina baacutesica (meacutetodo de referencia) y hacerse visible y las bandas corresponshydientes deben rasparse y extraerse Como meacutetodo alternativo la separacioacuten puede realizarse mediante HPLC utilizando una columna de gel de siacutelice y un detector por luz ultravioleta y las diferentes fracciones recogidas Los alcoholes alifaacuteticos y triterpeacutenicos asiacute como el esterol y los dialcoholes triterpeacutenicos se aiacuteslan juntos

3 INSTRUMENTAL


31 Aparato completo para anaacutelisis mediante cromatografiacutea en capa fina usando placas de vidrio de 20 times 20 cm

32 Laacutempara ultravioleta con longitud de onda de 366 o 254 nm






38 Sistema HPLC compuesto por

381 Bomba binaria

382 Inyector manual o automaacutetico equipado con un circuito de inyeccioacuten de 200 μl

383 Desgasificador en liacutenea

384 Detector de rayos UV-VIS o IR

39 Columna de HPLC (25 cm times 4 mm de diaacutemetro interior) con gel de siacutelice 60 (granulometriacutea de 5 μm)

310 Filtro de jeringa de 045 μm


M32


4 REACTIVOS



Disolver enfriando al mismo tiempo 130 g de hidroacutexido potaacutesico (punto 41) en 200 ml de agua destilada y completar hasta un litro con etanol (punto 49) Conservar la solucioacuten en botellas de vidrio oscuro bien cerradas y almacenarla un maacuteximo de dos diacuteas



Disolver 13 g de hidroacutexido potaacutesico (41) en 20 ml de agua destilada y completar hasta un litro con etanol (49)

45 Placas de vidrio de 20 times 20 cm recubiertas con gel de siacutelice sin indicador de fluorescencia de 025 mm de espesor (disponibles en el comercio y listas para su uso)


47 N-hexano de calidad para cromatografiacutea




411 Solucioacuten de referencia para cromatografiacutea en capa fina colesterol fitoesshyteroles alcoholes y solucioacuten de eritrodiol al 5 en acetato de etilo (410)

412 Solucioacuten de 27-diclorofluoresceiacutena al 02 en etanol Para hacerla ligershyamente baacutesica se antildeaden algunas gotas de solucioacuten alcohoacutelica 2 M de hidroacutexido potaacutesico (42)

413 Mezcla de n-hexano (47)eacuteter etiacutelico (48) 6535 (VV)

414 Fase moacutevil HPLC n-hexano (47)eacuteter etiacutelico (48) 11 (VV)

5 MEacuteTODO DE REFERENCIA SEPARACIOacuteN DE LOS COMPUESTOS ALCOHOacuteLICOS MEDIANTE PLACA DE CROMATOGRAFIacuteA EN CAPA FINA BAacuteSICA

Preparacioacuten de placas para cromatografiacutea en capa fina baacutesicas Sumergir las placas con gel de siacutelice (45) unos 4 cm en la solucioacuten etanoacutelica 02 M de hidroacutexido potaacutesico (44) durante 10 segundos dejar secar las placas en una campana durante dos horas y por uacuteltimo mantenerlas en un horno a 100 degC durante una hora

Sacarlas del horno y conservarlas en un desecador de cloruro de calcio (37) hasta el momento del uso (las placas sometidas a este tratamiento deben utilizarse en el plazo de quince diacuteas como maacuteximo)

Colocar la mezcla de hexano y eacuteter etiacutelico (413) (nota 3) en la cubeta de desarrollo con una profundidad aproximada de 1 cm Cerrar la cubeta con la tapa adecuada y dejarla asiacute durante al menos media hora en un lugar friacuteo de manera que se establezca el equilibrio liacutequido-vapor Se pueden colocar tiras de papel de filtro que se sumerjan en el eluyente en las caras interiores de la cubeta De esta manera el tiempo de desarrollo se reduce casi un tercio y se obtiene una elucioacuten maacutes uniforme y regular de los componentes

Nota 3 La mezcla de desarrollo debe sustituirse para cada ensayo a fin de alcanzar unas condiciones de elucioacuten perfectamente reproducibles Alternativamente se puede utilizar una mezcla de n-hexanoeacuteter etiacutelico 5050 (VV)

Preparar una solucioacuten del insaponificable preparado en la parte 1 al 5 aproximadamente en acetato de etilo (410) y utilizando una microjeringa de 100 μl depositar 03 ml de solucioacuten sobre una liacutenea fina e uniforme en el extremo inferior (2 cm) de la placa cromatograacutefica (45) Paralela a esta liacutenea colocar de 2 a 3 μl de la solucioacuten de referencia (411) de manera que puedan identificarse las bandas de esterol de dialcoholes triterpeacutenicos y de alcoholes despueacutes del desarrollo

M32


Colocar la placa en la caacutemara de desarrollo (31) Deberaacute mantenerse a una temperatura ambiente entre 15 y 20 degC (nota 4) Tapar inmedishyatamente la cubeta y dejar que se produzca la elucioacuten hasta que el frente del disolvente se situacutee a 1 cm aproximadamente del borde superior de la placa Sacar la placa de la cubeta y evaporar el disolvente en una corriente de aire caliente o dejando la placa bajo una campana unos minutos

Nota 4 Una temperatura maacutes alta podriacutea perjudicar la separacioacuten

Pulverizar sobre la placa de forma ligera y uniforme la solucioacuten de 27- diclorofluoresceiacutena (412) y dejar secar Al examinar la placa con ayuda de una laacutempara ultravioleta (32) pueden identificarse las bandas de esteshyroles dialcoholes triperpeacutenicos y alcoholes mediante comparacioacuten con las manchas obtenidas a partir de la solucioacuten de referencia (411) Marcar con laacutepiz negro los liacutemites de las bandas a lo largo de los maacutergenes de fluorshyescencia (veacutease la placa para cromatografiacutea de placa fina del graacutefico 1)

Rascar con una espaacutetula metaacutelica el gel de siacutelice contenido en el aacuterea delimitada Introducir el material obtenido finamente triturado en el embudo filtrante (34) antildeadir 10 ml de acetato de etilo caliente (410) mezclar cuidadosamente con la espaacutetula metaacutelica y filtrar (en vaciacuteo si es necesario) recogiendo el filtrado en el matraz coacutenico (35) acoplado al embudo filtrante

Lavar el residuo en el matraz tres veces con eacuteter etiacutelico (43) (empleando cada vez unos 10 ml) recogiendo el filtrado en el mismo matraz acoplado al embudo Evaporar el filtrado hasta obtener un volumen de 4 a 5 ml transvasar la solucioacuten residual al tubo de ensayo de 10 ml (36) previamente pesado evaporar hasta secar mediante calentamiento suave en corriente ligera de nitroacutegeno recubrir con algunas gotas de acetona (46) evaporar de nuevo hasta secar El residuo contenido en el tubo de ensayo se compone de los esteroles y dialcoholes triperpeacutenicos o los alcoholes y las fracciones de alcoholes triterpeacutenicos y triterpeacutenicos

6 SEPARACIOacuteN DE LA FRACCIOacuteN ALCOHOacuteLICA POR HPLC

Disolver el insaponificable de la parte 1 en 3 ml de la fase moacutevil (414) filtrar la solucioacuten con un filtro de jeringa (310) y reservar

Inyectar 200 μl de la solucioacuten filtrada insaponificable en el sistema HPLC (38)

Ejecutar la separacioacuten por HPLC a 08 mlmin desechar los primeros 5 minutos y recoger en matraces Erlenmeyer de 25 ml (311) entre los minutos 5 y 10 para los alcoholes alifaacuteticos y triterpeacutenicos y entre los minutos 11 y 25 para los esteroles y el eritrodiol y el uvaol (nota 5)

La separacioacuten puede controlarse con un detector por luz ultravioleta a la longitud de onda de 210 nm o un detector de iacutendice de refraccioacuten (veacutease el graacutefico7)

Las fracciones se evaporan hasta sequedad y se preparan para cromatoshygrafiacutea

Nota 5 Controlar cuidadosamente la presioacuten de la bomba de HPLC el eacuteter etiacutelico puede aumentar la presioacuten ajustar el flujo para mantener la presioacuten bajo control

PARTE 3

ANAacuteLISIS POR CROMATOGRAFIacuteA DE GASES DE LAS FRACCIONES DE COMPUESTOS ALCOHOacuteLICOS


Esta parte ofrece orientaciones generales para la aplicacioacuten de la cromashytografiacutea de gases con columna capilar para determinar la composicioacuten cualitativa y cuantitativa de los compuestos alcohoacutelicos aislados de acuerdo con el meacutetodo especificado en la parte 2 de este meacutetodo

M32


2 PRINCIPIO

Las fracciones que se recogen del insaponificable mediante cromatografiacutea de capa fina o cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten (HPLC) se transshyforman en eacuteteres de trimetilsililo y se analizan con cromatografiacutea de gases en columna capilar con inyector de fraccionamiento de flujo (split) y detector de ionizacioacuten de llama

3 INSTRUMENTAL



32 Cromatoacutegrafo de gases adecuado para su uso con columna capilar con inyector de fraccionamiento de flujo (split) formado por

321 Una caacutemara para columnas capaz de mantener la temperatura deseada con una precisioacuten de plusmn 1 degC

322 Inyector termorregulable con elemento vaporizador de vidrio persilanizado y divisor

323 Detector de ionizacioacuten de llama (FID por sus siglas en ingleacutes)

324 Sistema de captura de datos para uso con el detector FID (3103) capaz de integrarse manualmente

33 Columna capilar de siacutelice fundida de 20 a 30 m de longitud y de 025 a 032 mm de diaacutemetro interno recubierta con difenil (5 ) y dimetilpolishysiloxano (95 ) (fase estacionaria SE 52 o SE 54 o equivalente) con un espesor uniforme que oscile entre 010 y 030 μm

34 Microjeringa de 10 μl de capacidad para cromatografiacutea de gases con aguja fija apropiada para divisioacuten de flujo

4 REACTIVOS

41 Piridina anhidra para calidad de cromatografiacutea

42 Hexametildisilazano de calidad para anaacutelisis

43 Trimetilclorosilano de calidad para anaacutelisis

44 Solucioacuten patroacuten de los trimetilsilileacuteteres de esteroles Preparar en el momento del uso a partir de esteroles y eritrodiol obtenidos de aceites que los contengan

45 Solucioacuten patroacuten de trimetilsilileacuteteres de los alcoholes alifaacuteticos de C20 a C28 debe prepararse en el momento de utilizacioacuten a partir de mezclas de alcoholes puros

46 Gas portador hidroacutegeno o helio de calidad para cromatografiacutea de gases

47 Gases auxiliares hidroacutegeno helio nitroacutegeno y aire de calidad para cromatografiacutea de gases

48 Reactivo de sililacioacuten consiste en una mezcla 931 (VVV) de piridina hexametildisilazanotrimetilclorosilano

49 n-Hexano de calidad para cromatografiacutea

M32


5 PREPARACIOacuteN DE LOS EacuteTERES DE TRIMETILSILILO

Antildeadir al tubo (31) que contiene la fraccioacuten de compuesto alcohoacutelico el reactivo de sililacioacuten (48) (nota 6) a razoacuten de 50 μl por miligramo de compuesto alcohoacutelico evitando toda absorcioacuten de humedad (nota 7)

Nota 6 Existen soluciones comerciales listas para usar Ademaacutes tambieacuten existen otros reactivos de sililacioacuten como la bis- trimetilsililtrifluoroacetamida + trimetilclorosilano al 1 que se diluye en el mismo volumen de piridina anhidra La piridina se puede sustituir por la misma cantidad de acetonitrilo

Nota 7 La eventual formacioacuten de una ligera opalescencia es normal y no ocasiona ninguna anomaliacutea La formacioacuten de una floculacioacuten blanca o la aparicioacuten de una coloracioacuten rosa es indicativa de presencia de humedad o de deterioro del reactivo En este caso deberaacute repetirse la prueba (solo cuando se utilice hexametildisshyilazanotrimetilclorosilano)

Tapar el tubo (31) y agitar cuidadosamente (sin invertir) hasta la completa disolucioacuten de los compuestos Dejarlo en reposo durante al menos 15 minutos a temperatura ambiente y centrifugar durante algunos minutos La solucioacuten liacutempida estaacute lista para el anaacutelisis mediante cromatoshygrafiacutea de gases

6 ANAacuteLISIS DE CROMATOGRAFIacuteA DE GASES

61 Operaciones preliminares acondicionamiento de la columna capilar

Colocar la columna (33) en el cromatoacutegrafo de gases conectando el extremo de entrada al inyector de fraccionamiento y el extremo de salida al detector

Efectuar los controles generales del equipo para cromatografiacutea de gases (estanquidad de los circuitos de gases eficacia del detector eficacia del sistema de divisioacuten de flujo y del sistema de registro etc)

Si la columna se utiliza por vez primera es conveniente acondicionarla previamente hacer pasar un ligero flujo de gas a traveacutes de la columna encender el equipo de cromatografiacutea de gases e iniciar un calentamiento gradual hasta alcanzar una temperatura al menos 20 degC superior a la temperatura de trabajo (nota 8) Mantener dicha temperatura durante 2 horas como miacutenimo a continuacioacuten poner el equipo completo en condiciones de funcionamiento [regulacioacuten del flujo de gases y del fracshycionamiento (split) ignicioacuten de la llama conexioacuten con el sistema informaacutetico regulacioacuten de la temperatura de la columna del detector y del inyector etc] y registrar la sentildeal con una sensibilidad al menos dos veces superior a la prevista para el anaacutelisis El trazado de la liacutenea de base debe ser lineal exento de picos de cualquier tipo y no debe presentar deriva Una deriva rectiliacutenea negativa indica que las conexiones de la columna no son totalmente estancas una deriva positiva indica que el acondicionamiento de la columna es insuficiente

Nota 8 La temperatura de acondicionamiento deberaacute ser siempre como miacutenimo 20 degC inferior a la temperatura maacutexima especificada para la fase estacionaria utilizada

62 Condiciones de funcionamiento

Optimizar el programa de temperatura y el flujo del gas portador de tal manera que se obtengan los cromatogramas similares a los de los graacuteficos 3 a 6

Los siguientes paraacutemetros se sometieron a prueba y se consideraron uacutetiles

M32


621 Alcoholes alifaacuteticos

Programa del horno 180 degC (8 min) rarr 260 degC (a 5 degCmin) rarr 260 degC (15 min)



Velocidad lineal del gas portador

Helio (20 a 30 cms) hidroacutegeno (30 a 50 cms)

Relacioacuten de fraccionamiento de 150 a 1100

Volumen inyectado 05 a 1 μl de solucioacuten de TMSE

622 Esteroles y dialcoholes triterpeacutenicos

Programa del horno 260 plusmn 5 degC isoteacutermico

Temperatura del inyector 280 ndash 300 degC

Temperatura del detector 280 ndash 300 degC





Estas condiciones pueden modificarse en funcioacuten de las caracteriacutesticas de la columna y del cromatoacutegrafo de gases de modo que se obtengan cromashytogramas que cumplan los siguientes requisitos

mdash el tiempo de retencioacuten del alcohol C26 debe ser de 18 plusmn 5 minutos

mdash el pico del alcohol C22 debe ser 80 plusmn 20 de la escala de fondo en el caso del aceite de oliva y 40 plusmn 20 de la escala de fondo en el caso del aceite de orujo de oliva

mdash el tiempo de retencioacuten del pico del szlig-sitosterol debe ser de 20 plusmn 5 min

mdash el pico del campesterol debe ser para el aceite de oliva (contenido medio del 3 ) 20 plusmn 5 del fondo de escala

mdash se deben separar todos los esteroles presentes es necesario que los picos no solo se separen sino que se resuelvan completamente es decir que el trazo del pico llegue a la liacutenea de base antes de que se inicie el pico siguiente No obstante podraacute admitirse una resolucioacuten incompleta si el pico a TRR 102 (sitostanol) puede cuantificarse utilizando la perpendicular


Con la microjeringa de 10 μl (34) tomar 1 μl de hexano aspirar 05 μl de aire y a continuacioacuten entre 05 y 1 μl de la solucioacuten de muestra elevar el eacutembolo de la jeringa de modo que la aguja quede vaciacutea Introducir la aguja a traveacutes de la membrana del inyector y despueacutes de 1 o 2 segundos inyectar raacutepidamente transcurridos unos 5 segundos extraer la aguja lentamente Tambieacuten puede emplearse un inyector automaacutetico

M32


Realizar la grabacioacuten hasta la completa elucioacuten de los TMSE de los correspondientes compuestos alcohoacutelicos presentes La liacutenea de base debe seguir cumpliendo los requisitos de las condiciones de funcionshyamiento correspondientes (621 o 622)


Identificar los picos individuales sobre la base de los tiempos de retencioacuten y en comparacioacuten con la mezcla de alcoholes alifaacuteticos y triterpeacutenicos o de los esteroles y dialcoholes triperpeacutenicos TMSE analizados en las mismas condiciones En el graacutefico 3 se muestra un cromatograma de la fraccioacuten de alcoholes alifaacuteticos y triterpeacutenicos y en el graacutefico 2 los cromatogramas correspondientes de los esteroles y dialcoholes triterpeacutenicos

La elucioacuten de los alcoholes alifaacuteticos se efectuacutea en el orden siguiente C20-ol (IS) C22-ol C23-ol C24-ol C25-ol C26-ol C27-ol y C28-ol

La elucioacuten de los esteroles y dialcoholes triperpeacutenicos se efectuacutea en el orden siguiente colesterol brasicasterol ergosterol 24-metilencolesterol campesterol campestanol estigmasterol Δ-7-campesterol Δ-523-estigshymastadienol clerosterol szlig-sitosterol sitostanol Δ-5-avenasterol Δ-524- estigmastadienol Δ-7-estigmastenol Δ-7-avenasterol eritrodiol y uvaol


Calcular las aacutereas de los picos del 1-eicosanol y de los alcoholes alifaacuteticos C22 C24 C26 y C28 mediante un sistema apropiado El factor de respuesta para el 1-eicosanol debe considerarse igual a 1

Calcular las aacutereas de los picos del α-colestanol y de los esteroles y dialshycoholes triperpeacutenicos utilizando el sistema informaacutetico No se tomaraacuten en cuenta los picos de aquellos componentes que no figuren en el cuadro 1 (el ergosterol no debe calcularse) El factor de respuesta para el α- colestanol debe considerarse como 1

Calcular del modo siguiente el contenido de cada uno de compuestos alcohoacutelicos expresado en mgkg de materia grasa

Compuesto alcohuacutelico x frac14 A x Uuml m s A s Uuml m Uuml 1 000

donde

A x = aacuterea bajo el pico para el compuesto alcohoacutelico x en unidades de cuenta del sistema informaacutetico

A s = aacuterea bajo el pico del 1-eicosanolα-cholestanol en unidades de cuenta del sistema informaacutetico

m s = peso del 1-eicosanolα-colestanol antildeadido en miligramos

m = peso de la muestra tomada para la determinacioacuten en gramos


Indicar las concentraciones de alcoholes alifaacuteticos y triterpeacutenicos em mgkg de materia grasa y su suma como laquocontenido de alcoholes alifaacuteticos totalesraquo El contenido total es la suma de C22 C24 C26 y C28

La composicioacuten de cada uno de los compuestos alcohoacutelicos se expresaraacute con una precisioacuten decimal

La concentracioacuten de esteroles totales debe expresarse sin ninguacuten decimal

M32


El contenido porcentual de cada uno de los esteroles simples se calcula como la razoacuten entre el aacuterea bajo el pico correspondiente y la suma de las aacutereas bajo el pico de los esteroles

Esterol x frac14 A x ΣA Uuml 100

donde

A x = aacuterea bajo el pico para el esterol x

ΣΑ = suma de las aacutereas bajo el pico de los esteroles

β-sitosterol aparente Δ5-23-estigmastadienol+ clerosterol + β-sitosterol + sitostanol + Δ5-avenasterol + Δ5-24-estigmastadienol

Caacutelculo del porcentaje de eritrodiol y uvaol

Eritrodiol thorn Uvaol frac14 A Er thorn A Uv

ΣA T Uuml 100

donde

A Er = aacuterea del eritrodiol en unidades de cuenta del sistema informaacutetico

A Uv = aacuterea del uvaol en unidades de cuenta del sistema informaacutetico

ΣA T = suma de las aacutereas de esterol + eritrodiol + uvaol en unidades de cuenta del sistema informaacutetico

Ademaacutes del caacutelculo del porcentaje relativo de esteroles y dialcoholes triterpeacutenicos y de la concentracioacuten total de esteroles debe calcularse la concentracioacuten de eritrodiol y uvaol y su suma en mgkg de material graso con arreglo a las siguientes expresiones

Eritrodiol frac14 A Er Uuml m s A s Uuml m Uuml 1 000

Uvaol frac14 A Uv Uuml m s A s Uuml m Uuml 1 000

donde

A Er = aacuterea bajo el pico del eritrodiol en unidades de cuenta del sistema informaacutetico


A s = aacuterea bajo el pico del α-colestanol en unidades de cuenta del sistema informaacutetico

m s = peso del α-colestanol antildeadido en miligramos


M32


Apeacutendice

1 Hidrocarburos 2 α-Tocoferol 3 Prenoles 4 alcoholes triterpeacutenicos 5 Alcoholes alifaacuteticos 6 Metil-esteroles 7 Esteroles 8 Dialcoholes triterpeacutenicos

Graacutefico 1 mdash TLC de la fraccioacuten insaponificable del aceite de orujo de oliva eluido en dos ocasiones con hexanoeacuteter dietiacutelico (6535) desarrollada con SO 4 H 2 (50 ) y calentada Las bandas que deben rasparse son las que figuran dentro del rectaacutengulo laquo1raquo son las bandas para alcoholes alifaacuteticos y laquo2raquo las bandas para los esteroles y dialcoholes triterpeacutenicos

Cuadro I mdash Plazos de retencioacuten relativa de esteroles

Pico Identificacioacuten Tiempo de retencioacuten relativo

Columna SE 54 Columna SE 52

1 Colesterol Δ-5-Colesten-3szlig-ol 067 063

2 Colestanol 5α-Colestan-3szlig-ol 068 064

3 Brasicasterol [24S]-24-Metil-Δ-522-colestadien-3β-ol 073 071

Ergosterol [24S]-24-Metil-Δ-57-22 colestatrien-3β-ol 078 076

4 24-metilencolesterol 24-Metilen-Δ-524-colestadien-3szlig-ol 082 080

5 Campesterol (24R)-24-Metil-Δ-5-colesten-3szlig-ol 083 081

6 Campestanol (24R)-24-Metil-colestan-3szlig-ol 085 082

7 Estigmasterol [24S]-24-Etil-Δ-522-colestadien-3szlig-ol 088 087

8 Δ-7-campesterol (24R)-24-Metil-Δ-7-colesten-3szlig-ol 093 092

9 Δ-523-Estigmastashydienol

[24RS]-24-Etil-Δ-523-colestadien-3szlig-ol 095 095

10 Clerosterol [24S]-24-Etil-Δ-525-colestadien-3szlig-ol 096 096

M32




11 szlig-sitosterol (24R)-24-Etil-Δ-5-colesten-3szlig-ol 100 100

12 Sitostanol 24-Etil-colestan-3szlig-ol 102 102

13 Δ-5-avenasterol (24Z)-24-Etiliden-Δ-colesten-3szlig-ol 103 103


(24RS)-24-Etil-Δ-524-colestadien-3szlig-ol 108 108

15 Δ-7-Estigmastenol (24RS)-24-Etil-Δ-7-colesten-3szlig-ol 112 112

16 Δ-7-avenasterol (24Z)-24-Etiliden-Δ-7-colesten-3szlig-ol 116 116

17 Eritrodiol 5α-Olean-12-en-3β28-diol 141 141

18 Uvaol Δ12-Ursen-3β28-diol 152 152

Graacutefico 2 mdash Perfil cromatograacutefico GC-FID de los esteroles y de los dialcoholes triterpeacutenicos derivados del aceite de oliva refinado 1) colesterol 2) α-colestanol (IS) 3) 24-metilencolesterol 4) campesterol 5) campestanol 6) estigmasterol 7) Δ523-estigmastadienol 8) clerosterol 9) β- sitosterol 10) sitostanol 11) Δ5-avenasterol 12) Δ524-estigmastadienol 13) Δ7-estigmastenol 14) Δ7-avenastol 15) eritrodiol 16) uvaol

M32


Graacutefico 3 mdash Perfil cromatograacutefico GC-FID de los esteroles y de los dialcoholes triterpeacutenicos derivados de un aceite de oliva lampante 1) colesterol 2) α-colestanol 3) brasicasterol 4) 24- metilencolesterol 5) campesterol 6) campeestanol 7) estigmasterol 8) Δ7-campesterol 9) Δ523- estigmastadienol 10) clerosterol 11) β-sitosterol 12) sitostanol 13) Δ5-avenasterol 14) Δ524- estigmastadienol 15) Δ7-estigmastenol 16) Δ7-avenastol 17) eritrodiol 18) uvaol

Graacutefico 4 ndash Perfil cromatograacutefico GC-FID de los alcoholes alifaacuteticos y alcoholes triterpeacutenicos procedentes del aceite de oliva (IS) C20-ol 1) C22-ol 2) C24-ol 3) C26-ol 4) C28-ol 5) alcoholes triterpeacutenicos

M32


Graacutefico 5 ndash Perfil cromatograacutefico GC-FID de los alcoholes alifaacuteticos y alcoholes triterpeacutenicos procedentes de un aceite de oliva refinado y un aceite de oliva de segunda centrifugacioacuten (IS) C20-ol 1) C22-ol 2) C24-ol 3) C26-ol 4) C28-ol 5) alcoholes triterpeacutenicos

Graacutefico 6 mdash Chromatograma de HPLC de un aceite de oliva insaponificable separado por HPLC con un detector por luz ultravioleta 1) alcoholes alifaacuteticos y alcoholes triterpeacutenicos 2) esteroles y dialcoholes triperpeacutenicos

M32


ANEXO XX

Meacutetodo para la determinacioacuten del contenido en ceras y en eacutesteres metiacutelicos y etiacutelicos de los aacutecidos grasos mediante cromatografiacutea de gases con columna

capilar

1 OBJETO

El presente meacutetodo describe un procedimiento para la determinacioacuten del contenido en ceras y en eacutesteres metiacutelicos y etiacutelicos de los aacutecidos grasos de los aceites de oliva Las ceras y los eacutesteres de alquilo se separan en funcioacuten del nuacutemero de aacutetomos de carbono El meacutetodo se recomienda como herramienta para distinguir entre el aceite de oliva y el aceite de orujo de oliva y como paraacutemetro cualitativo para los aceites de oliva viacutergenes extra ya que permite detectar las mezclas fraudulentas de aceites de oliva viacutergenes extra con aceites de menor calidad ya sean viacutergenes lampantes o desodorizados

2 PRINCIPIO

La grasa a la que se habraacute antildeadido el adecuado patroacuten interno se fracciona mediante cromatografiacutea con columna de gel de siacutelice hidratado La fraccioacuten eluida en primer lugar en las condiciones de ensayo (con polaridad inferior a la de los trigliceacuteridos) se recupera y se analiza direcshytamente mediante cromatografiacutea de gases con columna capilar

3 APARATOS


32 Columna de vidrio para cromatografiacutea liacutequida de 15 mm de diaacutemetro interior y 30-40 cm de altura provista de una llave adecuada

33 Cromatoacutegrafo de gases apto para columna capilar provisto de un sistema de introduccioacuten directa en la columna constituido por

331 Caacutemara termostaacutetica con programador de temperatura



334 Registrador-integrador (nota 1) apto para funcionar con el convertidor-amplificador (333) con tiempo de respuesta inferior o igual a un segundo y velocidad del papel variable

Nota 1 Tambieacuten se pueden utilizar sistemas informatizados que prevean la obtencioacuten de los datos de la cromatografiacutea de gases mediante ordenador

335 Columna capilar de siacutelice fundida (para el anaacutelisis de las ceras y de los eacutesteres metiacutelicos y etiacutelicos) de 8 a 12 m de longitud y de 025 a 032 mm de diaacutemetro interior con recubrimiento interno de fase liacutequida (nota 2) de espesor uniforme comprendido entre 010 y 030 μm

Nota 2 Hay comercializadas fases liacutequidas listas para su uso como la SE-52 o la SE-54

34 Microjeringa para introduccioacuten directa en la columna de 10 μl provista de aguja cementada


36 Rotavapor

37 Horno de mufla

38 Balanza analiacutetica con una precisioacuten de + 01 mg

M23


39 Cristaleriacutea normal de laboratorio

4 REACTIVOS

41 Gel de siacutelice con granulometriacutea comprendida entre 60 y 200 μm El gel de siacutelice debe mantenerse un miacutenimo de 4 horas en el horno de mufla a 500 degC Tras su enfriamiento se antildeade un 2 de agua respecto a la cantidad de gel de siacutelice utilizada Se agita bien para homogeneizar la masa Se mantiene en el desecador durante al menos 12 horas antes de su uso

M32 42 n-hexano para cromatografiacutea o anaacutelisis de residuos El hexano podraacute ser

sustituido por isooctano (224-trimetilpentano en grado cromatograacutefico) siempre que se alcancen valores de precisioacuten comparables Los disolventes con un punto de ebullicioacuten maacutes elevado que el del n-hexano tardan maacutes en evaporarse No obstante son preferibles debido a la toxicidad del hexano El grado de pureza deberaacute comprobarse por ejemplo podraacute controlarse el residuo tras la evaporacioacuten de 100 ml de disolvente

ADVERTENCIA Riesgo de inflamacioacuten de los vapores Mantener lejos de fuentes de calor chispas y llamas desnudas Mantener en recipientes bien cerrados Utilizar con la ventilacioacuten adecuada Evitar la acumulacioacuten de vapores y eliminar toda posible causa de incendio como calentadores o aparatos eleacutectricos no fabricados con material antiinflamable Nocivo por inhalacioacuten puede dantildear las ceacutelulas del sistema nervioso Evitar respirar los vapores Utilizar si es preciso un aparato respirador adecuado Evitar el contacto con los ojos y la piel

El isooctano es un liacutequido inflamable que presenta un riesgo de incendio Su explosioacuten en el aire se situacutea entre los liacutemites del 11 y el 60 (fraccioacuten en volumen) Es toacutexico por ingestioacuten y por inhalacioacuten Utilizar una campana ventilada en buen estado para trabajar con este disolvente

M23 43 Eacuteter etiacutelico para cromatografiacutea

ADVERTENCIA Altamente inflamable y moderadamente toacutexico Irritante para la piel Nocivo por inhalacioacuten Puede dantildear los ojos Puede tener efectos retardados Riesgo de formacioacuten de peroacutexidos explosivos Riesgo de inflamacioacuten de los vapores Mantener alejado de fuentes de calor chispas y llamas desnudas Mantener en recipientes bien cerrados Utilizar con la ventilacioacuten adecuada Evitar la acumulacioacuten de vapores y eliminar toda posible causa de incendio como calentadores o aparatos eleacutectricos no fabricados con material antiinflamable No evaporar hasta sequedad total o cuasi total La adicioacuten de agua o de cualquier otro agente reductor adecuado puede reducir la formacioacuten de peroacutexidos No ingerir Evitar respirar los vapores Evitar el contacto prolongado o repetido con la piel

44 n-heptano para cromatografiacutea o isooctano

ADVERTENCIA Inflamable Nocivo por inhalacioacuten Mantener alejado de fuentes de calor chispas y llamas desnudas Mantener en recipientes bien cerrados Utilizar con la ventilacioacuten adecuada Evitar respirar los vapores Evitar el contacto prolongado o repetido con la piel

45 Solucioacuten patroacuten de araquidato de laurilo (nota 3) al 005 (mV) en heptano (patroacuten interno para ceras)

Nota 3 Tambieacuten puede utilizarse palmitato de palmitilo estearato de miristilo o laureato de araquidilo

46 Solucioacuten patroacuten de heptadecanoato metiacutelico al 002 (mV) en heptano (patroacuten interno para eacutesteres metiacutelicos y etiacutelicos)


M23



ADVERTENCIA

Hidroacutegeno altamente inflamable bajo presioacuten Mantener alejado de fuentes de calor chispas llamas desnudas o aparatos eleacutectricos no fabricados con material antiinflamable Asegurarse de que la vaacutelvula de la bombona esteacute bien cerrada cuando no esteacute en uso Utilizar exclusishyvamente con un reductor de presioacuten Destensar el muelle del reductor antes de abrir la vaacutelvula de la bombona Mantenerse alejado del orificio de salida del gas de la bombona al abrir la vaacutelvula Utilizar con la ventilacioacuten adecuada No transferir el hidroacutegeno de una bombona a otra No mezclar gases en la bombona Asegurarse de que las bombonas no puedan caerse Mantener las bombonas alejadas del sol o de fuentes de calor No almacenar en ambiente corrosivo No utilizar bombonas dantildeadas o sin etiquetar

Helio gas comprimido a alta presioacuten Reduce el oxiacutegeno disponible para la respiracioacuten Mantener cerrada la bombona Utilizar con la ventilacioacuten adecuada No entrar en los locales de almacenaje si no estaacuten bien ventishylados Utilizar exclusivamente con un reductor de presioacuten Destensar el muelle del reductor antes de abrir la vaacutelvula de la bombona No transferir el gas de una bombona a otra Asegurarse de que las bombonas no puedan caerse Mantenerse alejado del orificio de salida del gas de la bombona al abrir la vaacutelvula Mantener las bombonas alejadas del sol o de fuentes de calor No almacenar en ambiente corrosivo No utilizar bombonas dantildeadas o sin etiquetar No inhalar Utilizar exclusivamente para usos teacutecnicos

49 Gases auxiliares

mdash hidroacutegeno puro para cromatografiacutea de gases

mdash aire puro para cromatografiacutea de gases

ADVERTENCIA

Aire gas comprimido a alta presioacuten Utilizar con precaucioacuten en presencia de sustancias combustibles ya que la temperatura de autoignicioacuten de la mayoriacutea de los compuestos orgaacutenicos en el aire se reduce considershyablemente a alta presioacuten Asegurarse de que la vaacutelvula de la bombona esteacute bien cerrada cuando no esteacute en uso Utilizar exclusivamente con un reductor de presioacuten Destensar el muelle del reductor antes de abrir la vaacutelvula de la bombona Mantenerse alejado del orificio de salida del gas de la bombona al abrir la vaacutelvula No transferir el gas de una bombona a otra No mezclar gases en la bombona Asegurarse de que las bombonas no puedan caerse Mantener las bombonas alejadas del sol o de fuentes de calor No almacenar en ambiente corrosivo No utilizar bombonas dantildeadas o sin etiquetar No inhalar ni utilizar para aparatos respiradores el aire destinado a usos teacutecnicos

5 PROCEDIMIENTO


Proceder a la suspensioacuten de 15 g de gel de siacutelice (41) en el n-hexano (42) e introducirlo en la columna (32) Permitir la sedimentacioacuten espontaacutenea Completar la sedimentacioacuten con ayuda de un vibrador eleacutectrico (35) para obtener una capa cromatograacutefica maacutes homogeacutenea Hacer pasar 30 ml de n-hexano para eliminar posibles impurezas Pesar exactamente con la balanza de precisioacuten (38) 500 mg de la muestra con el matraz Erlenmeyer de 25 ml (31) Antildeadir la cantidad adecuada de patroacuten interno (45) en funcioacuten del contenido de ceras previsto Por ejemplo antildeadir 01 mg de araquidato de laurilo si se trata de aceite de oliva y entre 025 y 05 mg si se trata de aceite de orujo y 005 de heptadecanoato metiacutelico en el caso de los aceites de oliva (46)

M23


Transferir la muestra asiacute preparada a la columna cromatograacutefica con ayuda de dos porciones de 2 ml cada una de n-hexano (42)

Dejar fluir el disolvente hasta 1 mm por encima del nivel superior del absorbente Hacer pasar maacutes n-hexanoeacuteter etiacutelico en una proporcioacuten de 991 y recoger 220 ml manteniendo un flujo aproximado de 15 gotas cada 10 segundos (esta fraccioacuten contiene los eacutesteres metiacutelicos y etiacutelicos y las ceras) (notas 4 y 5)

Nota 4 La mezcla n-hexanoeacuteter etiacutelico (991) debe prepararse a diario

Nota 5 Para controlar visualmente la correcta elucioacuten de las ceras puede antildeadirse a la muestra de solucioacuten 100 μl de colorante Sudaacuten I al 1 en la mezcla de elucioacuten

El tiempo de retencioacuten del colorante se encuentra entre el de las ceras y el de los trigliceacuteridos Por tanto cuando la coloracioacuten llega al fondo de la columna cromatograacutefica hay que suspender la elucioacuten por haberse eluido ya todas las ceras

Evaporar las fracciones resultantes en el rotavapor (36) hasta eliminar praacutecticamente todo el disolvente Eliminar los 2 uacuteltimos ml del disolvente con ayuda de una corriente deacutebil de nitroacutegeno Tomar la fraccioacuten que contiene los eacutesteres metiacutelicos y etiacutelicos diluidos en 2 a 4 ml de n-heptano o isooctano

52 Anaacutelisis por cromatografiacutea de gases


Instalar la columna en el cromatoacutegrafo de gases (33) conectando el terminal de entrada al sistema de la columna y el terminal de salida al detector Efectuar los controles generales del cromatoacutegrafo de gases (funshycionamiento de los circuitos de gas eficacia del detector y del registrador etc)

Si la columna se utiliza por vez primera es conveniente acondicionarla Hacer pasar a traveacutes de la columna una corriente ligera de gas y a continuacioacuten encender el cromatoacutegrafo de gases Calentar gradualmente hasta alcanzar al cabo de unas cuatro horas una temperatura de 350 degC

Mantener esta temperatura durante al menos 2 horas a continuacioacuten ajustar el aparato a las condiciones de trabajo (regulacioacuten del flujo de gas encendido de la llama conexioacuten con el registrador electroacutenico [334] regulacioacuten de la temperatura de la caacutemara termostaacutetica para la columna regulacioacuten del detector etc) Registrar la sentildeal con una sensishybilidad al menos 2 veces superior a la prevista para efectuar el anaacutelisis El trazado de la liacutenea de base deberaacute ser lineal sin picos de ninguacuten tipo ni deriva


522 Eleccioacuten de las condiciones operativas para las ceras y los eacutesteres etiacutelicos y metiacutelicos (nota 6)

En teacuterminos generales las condiciones operativas seraacuten las siguientes


20 degCminuto 5 degCminuto

Al inicio 80 degC (1rsquo) 140 degC 335 degC (20)


mdash cantidad inyectada 1 μl de la solucioacuten de n-heptano (2-4 ml)

M23


mdash gas portador helio o hidroacutegeno a la velocidad lineal oacuteptima para el gas seleccionado (ver Apeacutendice A)

mdash sensibilidad del instrumento capaz de responder a las condiciones anteriores

Nota 6 Por lo elevado de la temperatura final se admite una deriva positiva que no debe ser superior al 10 del fondo de la escala

Estas condiciones pueden modificarse en funcioacuten de las caracteriacutesticas de la columna y del cromatoacutegrafo de gases al objeto de obtener la separacioacuten de todas las ceras y de los eacutesteres etiacutelicos y metiacutelicos de los aacutecidos grasos una resolucioacuten satisfactoria de los picos (ver figuras 2 3 y 4) y un tiempo de retencioacuten del patroacuten interno araquidato de laurilo de 18 plusmn 3 minutos El pico maacutes representativo de las ceras debe medir al menos un 60 del fondo de la escala mientras que el patroacuten interno heptadecshyanoato metiacutelico de los eacutesteres metiacutelicos y etiacutelicos debe alcanzar la totalidad del fondo de la escala

Los paraacutemetros de integracioacuten de los picos deben calcularse de modo que se logre una evaluacioacuten correcta de las aacutereas de los picos examinadas


Tomar 10 μl de la solucioacuten con ayuda de la microjeringa de 10 μl tirando del eacutembolo de la jeringa hasta que la aguja esteacute vaciacutea Introducir la aguja en el sistema de inyeccioacuten y despueacutes de 1-2 segundos inyectar raacutepidashymente al cabo de unos 5 segundos extraer lentamente la aguja

Llevar a cabo el registro hasta la total elucioacuten de las ceras o los estigshymastadienos seguacuten la fraccioacuten analizada



La identificacioacuten de los distintos picos debe efectuarse a partir de los tiempos de retencioacuten comparaacutendolos con mezclas de ceras analizadas en las mismas condiciones y cuyos tiempos de retencioacuten sean conocidos Los eacutesteres de alquilo se identifican a partir de mezclas de eacutesteres metiacutelicos y etiacutelicos de los principales aacutecidos grasos del aceite de oliva (palmiacutetico y oleico)

La figura 1 representa un cromatograma de las ceras de un aceite de oliva virgen Las figuras 2 y 3 representan los cromatogramas de dos aceites de oliva viacutergenes extra vendidos en el comercio uno con eacutesteres metiacutelicos y etiacutelicos y otro no La figura 4 representa los cromatogramas de un aceite de oliva virgen extra de calidad oacuteptima y del mismo aceite con un 20 de aceite desodorizado

55 Determinacioacuten cuantitativa de las ceras

Calcular con ayuda del integrador las aacutereas de los picos correspondientes al patroacuten interno araquidato de laurilo y a los eacutesteres alifaacuteticos de C 40 a C 46

Determinar el contenido total en ceras sumando las ceras de cada uno de los eacutesteres en mgkg de materia grasa aplicando la siguiente foacutermula

Ceras mg=kg frac14 ethΣA x THORNm s 1000 A s m

M23


siendo

A x = aacuterea del pico de cada eacutester en miliacutemetros cuadrados

A s = aacuterea del pico del patroacuten interno araquidato de laurilo en miliacuteshymetros cuadrados

m s = masa del patroacuten interno araquidato de laurilo que se ha antildeadido en miligramos

m = masa de la muestra tomada para la determinacioacuten en gramos

551 Determinacioacuten cuantitativa de los eacutesteres metiacutelicos y etiacutelicos

Calcular con ayuda del integrador las aacutereas de los picos correspondientes al patroacuten interno heptadecanoato metiacutelico y a los eacutesteres metiacutelicos y etiacutelicos de los aacutecidos grasos C 16 y C 18

Determinar el contenido en cada uno de los eacutesteres de alquilo en mgkg de materia grasa aplicando la siguiente foacutermula

Eacutesteres mg=kg frac14 A x m s 1000

A s m

siendo

A x = aacuterea del pico de cada eacutester C 16 y C 18 en miliacutemetros cuadrados

A s = aacuterea del pico del patroacuten interno heptadecanoato metiacutelico en miliacutemetros cuadrados

m s = masa del patroacuten interno heptadecanoato metiacutelico que se ha antildeadido en miligramos



Indicar la suma de los contenidos de las distintas ceras de C 40 a C 46 (nota 7) en mgkg de materia grasa

Indicar la suma de los contenidos de los eacutesteres metiacutelicos y etiacutelicos de C 16 a C 18 y el total de ambos

Los resultados deben redondearse al mgkg maacutes proacuteximo

Nota 7 Los componentes que se deben cuantificar hacen referencia a los picos con un nuacutemero par de carbonos comprendidos entre los eacutesteres C 40 y C 46 seguacuten el ejemplo del cromatograma de las ceras del aceite de oliva indicado en la figura siguiente Si el eacutester C 46 aparece dos veces para identificarlo conviene analizar la fraccioacuten de las ceras de un aceite de orujo de oliva en que el pico C 46 sea faacutecil de identificar por ser claramente predominante

Indicar la relacioacuten entre eacutesteres etiacutelicos y eacutesteres metiacutelicos

M23


Figura 1

Cromatograma de gas de las ceras de un aceite de oliva ( 1 )

picos de los eacutesteres metiacutelicos y etiacutelicos de los aacutecidos grasos con un tiempo de retencioacuten de entre 5 y 8 minutos

Leyenda

IS = Araquidato de laurilo

1 = Eacutesteres diterpeacutenicos

2+2prime = Eacutesteres C 40



5 = Eacutesteres C 46

6 = Eacutesteres de esteroles y alcoholes triterpeacutenicos

M23



Figura 2

Eacutesteres metiacutelicos eacutesteres etiacutelicos y ceras en un aceite de oliva virgen

Leyenda

1 ndash Metilo C 16

2 ndash Etilo C 16

3 ndash Heptadecanoato metiacutelico PI

4 ndash Metilo C 18

5 ndash Etilo C 18

6 ndash Escualeno

7 ndash Araquidato de laurilo PI

A ndash Eacutesteres diterpeacutenicos

B ndash Ceras

C ndash Eacutesteres esteroacutelicos y eacutesteres triterpeacutenicos

M23


Figura 3

Eacutesteres metiacutelicos eacutesteres etiacutelicos y ceras en un aceite de oliva virgen extra

Leyenda


2 ndash Metilo C 18

3 ndash Etilo C 18

4 ndash Escualeno



B ndash Ceras


M23


Figura 4

Parte de un cromatograma de un aceite de oliva virgen extra y del mismo aceite con aceite desodorizado

Leyenda

1 ndash Miristato metiacutelico P I

2 ndash Palmitato metiacutelico

3 ndash Palmitato etiacutelico


5 ndash Linoleato metiacutelico

6 ndash Oleato metiacutelico

7 ndash Estearato metiacutelico

8 ndash Linoleato etiacutelico

9 ndash Oleato etiacutelico

10 ndash Estearato etiacutelico

M23


Apeacutendice A


Inyectar de 1 a 3 μl de metano (o propano) en el cromatoacutegrafo de gases despueacutes de haberlo ajustado a las condiciones de trabajo normales Cronometrar el tiempo que tarda el gas en recorrer la columna desde el momento de su inyeccioacuten hasta la aparicioacuten del pico (tM)

La velocidad lineal en cms viene dada por la foacutermula LtM siendo L la longitud de la columna expresada en cm y tM el tiempo cronometrado en segundos

M28 __________

M23


01991R2568 mdash


032001 mdash 128

M25

ANEXO XXI

Resultados de los controles de conformidad realizados en los aceites de oliva a que se refiere el artiacuteculo 8 apartado 2

Etiquetado Paraacutemetros quiacutemicos Caracteriacutesticas organoleacutepticas ( 4 ) Conclusioacuten final

Muestra Categoriacutea Paiacutes de origen

Lugar de inspecshycioacuten ( 1 )

Denomishynacioacuten legal

Denomishynacioacuten de

origen

Condishyciones de almacenashy

miento

Informacishyoacuten

erroacutenea Legibilidad CNC ( 3 )

Paraacuteshymetros

fuera de liacutemite SN

En caso afirmativo

indique cuaacuteles ( 2 )

CNC ( 3 ) Mediana deldefecto

Mediana delfrutado CNC ( 3 ) Acciones

requeridas Sancioacuten

( 1 ) Mercado interior (almazara embotelladores fase de venta al por menor) exportacioacuten importacioacuten ( 2 ) Cada caracteriacutestica del aceite de oliva que figura en el anexo I tendraacute un coacutedigo ( 3 ) Conforme o no conforme ( 4 ) No requerido para aceite de oliva y aceite de orujo de oliva

Texto consolidado Reglamento(CEE) no 256891 de la Comisioacutende 11 de julio de 1991

Modificado por

Rectificado por

Reglamento (CEE) no256891 de la Comisioacuten

Artiacuteculo 1

Artiacuteculo 2

Artiacuteculo 2 bis

Artiacuteculo 3

Artiacuteculo 4

Artiacuteculo 6

Artiacuteculo 7

Artiacuteculo 7 bis

Artiacuteculo 8

Artiacuteculo 9

Artiacuteculo 10

ANEXOS IacuteNDICE

ANEXO I CARACTERIacuteSTICAS DE LOS ACEITES DE OLIVA

Apeacutendice Aacuterboles de decisioacuten

ANEXO I BIS MUESTREO DE ACEITE DE OLIVA O ACEITE DE ORUJO DE OLIVA DISTRIBUIDO EN ENVASES INMEDIATOS

ANEXO I ter DIAGRAMA DE FLUJOS PARA LA COMPROBACIOacuteN DE LA CONFORMIDAD DE UNA MUESTRA DE ACEITE DE OLIVA CON LA CATEGORIacuteA DECLARADA

ANEXO II DETERMINACIOacuteN DE LOS AacuteCIDOS GRASOS LIBRES MEacuteTODO EN FRIacuteO

ANEXO III DETERMINACIOacuteN DEL IacuteNDICE DE PEROacuteXIDOS

ANEXO IV DETERMINACIOacuteN DEL CONTENIDO DE CERAS MEDIANTE CROMATOGRAFIacuteA DE GASES CON COLUMNA CAPILAR

Apeacutendice Determinacioacuten de la velocidad lineal del gas

ANEXO VII DETERMINACIOacuteN DEL PORCENTAJE DE MONOPALMITATO DE 2-GLICERILO

ANEXO IX PRUEBA ESPECTROFOTOMEacuteTRICA EN EL ULTRAVIOLETA

ANEXO X DETERMINACIOacuteN DE EacuteSTERES METIacuteLICOS DE AacuteCIDOS GRASOS MEDIANTE CROMATOGRAFIacuteA DE GASES

Apeacutendice A

Apeacutendice B

ANEXO XI DETERMINACIOacuteN DEL CONTENIDO EN DISOLVENTES HALOGENADOS VOLAacuteTILES EN EL ACEITE DE OLIVA

ANEXO XII MEacuteTODO DEL CONSEJO OLEIacuteCOLA INTERNACIONAL PARA LA VALORACIOacuteN ORGANOLEacutePTICA DE LOS ACEITES DE OLIVA VIacuteRGENES

Apeacutendice Meacutetodo de caacutelculo de la mediana y de los intervalos de confianza

ANEXO XV

ANEXO XVI DETERMINACIOacuteN DEL IacuteNDICE DE YODO

ANEXO XVII MEacuteTODO PARA LA DETERMINACIOacuteN DE ESTIGMASTADIENOS EN LOS ACEITES VEGETALES

ANEXO XVIII DETERMINACIOacuteN DE LA DIFERENCIA ENTRE EL CONTENIDO REAL Y EL CONTENIDO TEOacuteRICO DE TRIGLICEacuteRIDOS CON ECN 42

ANEXO XIX DETERMINACIOacuteN DE LA COMPOSICIOacuteN Y CONTENIDO DE LOS ESTEROLES Y COMPUESTOS ALCOHOacuteLICOS MEDIANTE CROMATOGRAFIacuteA DE GASES CON COLUMNA CAPILAR

Apeacutendice

ANEXO XX Meacutetodo para la determinacioacuten del contenido en ceras y en eacutesteres metiacutelicos y etiacutelicos de los aacutecidos grasos mediante cromatografiacutea de gases con columna capilar

Apeacutendice A Determinacioacuten de la velocidad lineal del gas

ANEXO XXI

M25 Reglamento de Ejecucioacuten (UE) n o 2992013 de la Comisioacuten de 26 de marzo de 2013

L 90 52 2832013

M26 Reglamento de Ejecucioacuten (UE) n o 13482013 de la Comisioacuten de 16 de diciembre de 2013

L 338 31 17122013

M27 Reglamento Delegado (UE) 20151830 de la Comisioacuten de 8 de julio de 2015

L 266 9 13102015

M28 Reglamento de Ejecucioacuten (UE) 20151833 de la Comisioacuten de 12 de octubre de 2015

L 266 29 13102015

M29 Reglamento de Ejecucioacuten (UE) 20161227 de la Comisioacuten de 27 de julio de 2016

L 202 7 2872016


L 273 5 8102016

M31 Reglamento Delegado (UE) 20162095 de la Comisioacuten de 26 de sepshy tiembre de 2016

L 326 1 1122016


L 250 14 3092019

Rectificado por

C1 Rectificacioacuten DO L 347 de 28111992 p 69 (256891) C2 Rectificacioacuten DO L 176 de 2071993 p 30 (18393) C3 Rectificacioacuten DO L 63 de 431998 p 34 (247297) C4 Rectificacioacuten DO L 67 de 532004 p 34 (19892003) C5 Rectificacioacuten DO L 78 de 2432011 p 69 (612011) C6 Rectificacioacuten DO L 196 de 372014 p 45 (13482013) C7 Rectificacioacuten DO L 183 de 1472017 p 11 (20161227) C8 Rectificacioacuten DO L 211 de 1782017 p 58 (20162095)





M20

Artiacuteculo 1








B


Artiacuteculo 2









gido en el anexo X










M28 __________


M26









M26



M25

Artiacuteculo 2 bis













M26







M19 __________

M25

Artiacuteculo 3



M5

Artiacuteculo 4









M19 __________

B

Artiacuteculo 6


M25



M20

Artiacuteculo 7





M25

Artiacuteculo 7 bis



Artiacuteculo 8




B

Artiacuteculo 9


Artiacuteculo 10



B


( 1 ) DO L 228 de 192009 p 3




M5


ANEXOS

IacuteNDICE



















M32


01991R2568 mdash


032001 mdash 11

M32

ANEXO I








(Mf)











01991R2568 mdash


032001 mdash 12

M32


Categoriacutea



transoleicos ()



()

Estigmastashydienos

(mgkg) ( 2 )




() Linoleacutenico

() Araquiacutedico

() Eicosenoico

() Beheacutenico

() Lignoceacuterico

()















01991R2568 mdash


032001 mdash 13

M32

Categoriacutea



transoleicos ()



()

Estigmastashydienos

(mgkg) ( 2 )




() Linoleacutenico

() Araquiacutedico

() Eicosenoico

() Beheacutenico

() Lignoceacuterico

()








Categoriacutea



Eritrodiol y uvaol

() ()


() Brasicasterol


() Estigmasterol

()


()


()





01991R2568 mdash


032001 mdash 14

M32

Categoriacutea



Eritrodiol y uvaol

() ()


() Brasicasterol


() Estigmasterol

()


()


()









Notas





Apeacutendice









M32


ANEXO I BIS









Cuadro 1










M26 Cuadro 2



Hasta 10 1

De 11 a 150 2

M26




De 151 a 500 3

De 501 a 1 500 4

De 1 501 a 2 500 5















Cuadro 3



Inferior a 7 500 2





M26






M26


ANEXO I ter



Cuadro general

M32



M32



M32



M32



M32




M32



M32



M32




M32



M32


ANEXO II




2 PRINCIPIO


3 REACTIVOS











M29



4 MATERIAL





5 PROCEDIMIENTO






la muestra (en g)

0 a 2 10 002

gt 2 a 75 25 001

gt 75 05 0001








M29




V Uuml c Uuml M

1 000 Uuml 100 m frac14


siendo








M29


ANEXO III




2 Definicioacuten


3 Principio


4 Aparatos







5 Reactivos







M30





Siendo









6 Muestra


7 Procedimiento




0 a 12 50 a 20

12 a 20 20 a 12

20 a 30 12 a 08

30 a 50 08 a 05

50 a 90 05 a 03


M30








m

Siendo






M30


ANEXO IV


1 OBJETO


2 PRINCIPIO


3 MATERIAL











36 Rotavapor

37 Horno de mufla



4 REACTIVOS



M21








47 Gases auxiliares



5 PROCEDIMIENTO










M21







20 degC minuto

5 degC minuto

20 degC minuto

al inicio 80 degC

(1prime)













M21










A s Uuml m

siendo









M21


Figura


Leyenda








M21



Apeacutendice




M32 __________

M26 __________

M21


ANEXO VII





2 PRINCIPIO








36 Rotavapor













M21



4 REACTIVOS




M21 43 Isopropanol














5 PROCEDIMIENTO



M21


















M21




















M21










A Uuml 100

siendo











M21


Figura 1



M21


Figura 2

Cromatograma de



Leyenda





= 2-monopalmitina


M21


Cromatograma de



Leyenda





= 2-monopalmitina


M21


8 NOTAS















m

siendo






M20 __________

M21


ANEXO IX


INTRODUCCIOacuteN









3 EQUIPO





M28






4 REACTIVOS



5 PROCEDIMIENTO








M28




Kλ frac14 Eλ

c Uuml s

donde









2 Icirc j



M28


ANEXO X






2 PRINCIPIO




PARTE A


OLIVA





M28















3 METODOLOGIacuteA


311 Principio


312 Reactivos









313 Equipo



M28




315 Procedimiento


PARTE B





2 REACTIVOS

21 Gas portador



22 Gases auxiliares







M28


3 INSTRUMENTAL






312 Horno



313 Columna capilar










32 Jeringa




M28


4 PROCEDIMIENTO
















O


britaacutenica))

donde










donde


M28












5221 Caso general



donde








M28




donde





donde













donde








M28





7 PRECISIOacuteN



72 Repetibilidad


73 Reproducibilidad


M28


Apeacutendice A

Figura 1


Figura 2 Figura 3

M28


Apeacutendice B

Figura 1



M28


ANEXO XI




2 EQUIPO









3 REACTIVOS












B


ANEXO XII


VIacuteRGENES

M28





M26










M26




Cocido o quemado

















M28














Frutado mdash


Frutado verde mdash









M32













M26



5 SALA DE CATA


6 ACCESORIOS








mdash escupideras

M32














M26






72 Catadores




M26








M26





















M26














M29

















M26








2 p







M32


Figura 1



Atrojadoborras


Avinadoavinagrado

aacutecidoagrio



Rancio






Frutado

Color verde Maduro

Amargas

Picante



Fecha

Comentarios

M28


Apeacutendice


Mediana






p






n 100 acirc





CV r frac14 s auml

Me Uuml 100

M26








Bibliografiacutea









(9) ISOIEC 1702505

M20 __________

M19 __________

M26


ANEXO XV


11 Material








mdash desecador



12 Reactivo


2 MODO DE OPERAR




22 Toma de muestra




24 Presecado


B





















B








S Uuml 100




32 Repetitividad



B


ANEXO XVI


1 OBJETO


2 DEFINICIOacuteN




3 PRINCIPIO


4 REACTIVOS










5 MATERIAL






7 PROCEDIMIENTO



B


Cuadro 1


menos de 5 300 g

5mdash 20 100 g

21mdash 50 040 g

51mdash100 020 g

101mdash150 013 g

151mdash200 010 g














siendo



B





B


ANEXO XVII


1 OBJETIVOS


2 APLICACIOacuteN


3 FUNDAMENTO


4 INSTRUMENTAL




44 Rotavapor




Nota 1





M11


5 REACTIVOS







Nota 3



Nota 4





Nota 5





M11


6 METODOLOGIacuteA



Nota 6






Nota 7



Nota 8


M11
















Nota 9





M11







M32 Nota 10


M11


Figura 1


M11





Figura 2


M11


ANEXO XVIII


ECN 42

1 OBJETO




3 PRINCIPIO


4 MEacuteTODO


41 Instrumental









419 Rotavapor




M25





42 Reactivos







425 Lana de vidrio
















M25

















442 Procedimiento









M25
















PM P moles S frac14

sup S PM S


PM Po


PM O moles L frac14

sup L PM L


PM Ln















M25
































10 000



10 000


10 000

M25




10 000


10 000


10 000



LLL






PoPoPo










FA P S Po O L Ln

PM 2564 2845 2544 2825 2804 2784


100 30 10 750 100 10

M25



moles P = 10

2564 frac14 003900 moles P

moles S = 3

2845 frac14 001054 moles S

moles Po = 1


moles O = 75

2825 frac14 026549 moles O

moles L = 10

2804 frac14 003566 moles L

moles Ln = 1





035821 moles frac14 10887


035821 moles frac14 2942


035821 moles frac14 1097


035821 moles frac14 74116


035821 moles frac14 9955


035821 moles frac14 1002

total moles = 100















M25


















P 16004 0653

S 4325 0177

Po 1015 1262

O 68526 85296

L 9204 11457

Ln 0927 1153

Suma 1000 1000


LLL

PoPoPo










10 000 frac14 0 09706 mol LLL



M25




10 000 frac14 002141


10 000 frac14 001069

003210 mol PoLL


10 000 frac14 000092


10 000 frac14 000002

000094 mol SLnLn


10000 frac14 000236


10 000 frac14 000118

000354 mol PoPoL



10 000 frac14 000374


10 000 frac14 000012


10 000 frac14 000375

000761 mol PPoLn


10 000 frac14 014556


10 000 frac14 014555


10 000 frac14 014544

043655 mol OLLn


10 000 frac14 003399


10000 frac14 000111


10 000 frac14 003397

006907 mol PLLn

M25



10 000 frac14 001605


10 000 frac14 001603


10 000 frac14 001604

004812 mol PoOLn

ECN 42 = 069512 mol TG











M25


Figura 1




M25


Figura 2


a



b



M25


Figura 3


(a)



(b)



M25


ANEXO XIX






2 PRINCIPIO



PARTE 1




2 PRINCIPIO


3 INSTRUMENTAL










4 REACTIVOS


M32














5 PROCEDIMIENTO






M32




PARTE 2




2 PRINCIPIO


3 INSTRUMENTAL










381 Bomba binaria







M32


4 REACTIVOS























M32














PARTE 3




M32


2 PRINCIPIO


3 INSTRUMENTAL










4 REACTIVOS










M32
















M32


























M32












donde









M32




donde






ΣA T Uuml 100

donde







donde






M32


Apeacutendice


















M32














M32




M32




M32


ANEXO XX


capilar

1 OBJETO


2 PRINCIPIO


3 APARATOS













36 Rotavapor

37 Horno de mufla


M23



4 REACTIVOS














M23



ADVERTENCIA



49 Gases auxiliares



ADVERTENCIA


5 PROCEDIMIENTO



M23





















M23


















M23


siendo









A s m

siendo











M23


Figura 1



Leyenda








M23



Figura 2


Leyenda

1 ndash Metilo C 16

2 ndash Etilo C 16


4 ndash Metilo C 18

5 ndash Etilo C 18

6 ndash Escualeno



B ndash Ceras


M23


Figura 3


Leyenda


2 ndash Metilo C 18

3 ndash Etilo C 18

4 ndash Escualeno



B ndash Ceras


M23


Figura 4


Leyenda











M23


Apeacutendice A




M28 __________

M23


01991R2568 mdash


032001 mdash 128

M25

ANEXO XXI







origen


miento

Informacishyoacuten


Paraacuteshymetros


En caso afirmativo







Modificado por

Rectificado por


Artiacuteculo 1

Artiacuteculo 2

Artiacuteculo 2 bis

Artiacuteculo 3

Artiacuteculo 4

Artiacuteculo 6

Artiacuteculo 7

Artiacuteculo 7 bis

Artiacuteculo 8

Artiacuteculo 9

Artiacuteculo 10

ANEXOS IacuteNDICE












Apeacutendice A

Apeacutendice B




ANEXO XV





Apeacutendice



ANEXO XXI




M20

Artiacuteculo 1








B


Artiacuteculo 2









gido en el anexo X










M28 __________


M26









M26



M25

Artiacuteculo 2 bis













M26







M19 __________

M25

Artiacuteculo 3



M5

Artiacuteculo 4









M19 __________

B

Artiacuteculo 6


M25



M20

Artiacuteculo 7





M25

Artiacuteculo 7 bis



Artiacuteculo 8




B

Artiacuteculo 9


Artiacuteculo 10



B


( 1 ) DO L 228 de 192009 p 3




M5


ANEXOS

IacuteNDICE



















M32


01991R2568 mdash


032001 mdash 11

M32

ANEXO I








(Mf)











01991R2568 mdash


032001 mdash 12

M32


Categoriacutea



transoleicos ()



()

Estigmastashydienos

(mgkg) ( 2 )




() Linoleacutenico

() Araquiacutedico

() Eicosenoico

() Beheacutenico

() Lignoceacuterico

()















01991R2568 mdash


032001 mdash 13

M32

Categoriacutea



transoleicos ()



()

Estigmastashydienos

(mgkg) ( 2 )




() Linoleacutenico

() Araquiacutedico

() Eicosenoico

() Beheacutenico

() Lignoceacuterico

()








Categoriacutea



Eritrodiol y uvaol

() ()


() Brasicasterol


() Estigmasterol

()


()


()





01991R2568 mdash


032001 mdash 14

M32

Categoriacutea



Eritrodiol y uvaol

() ()


() Brasicasterol


() Estigmasterol

()


()


()









Notas





Apeacutendice









M32


ANEXO I BIS









Cuadro 1










M26 Cuadro 2



Hasta 10 1

De 11 a 150 2

M26




De 151 a 500 3

De 501 a 1 500 4

De 1 501 a 2 500 5















Cuadro 3



Inferior a 7 500 2





M26






M26


ANEXO I ter



Cuadro general

M32



M32



M32



M32



M32




M32



M32



M32




M32



M32


ANEXO II




2 PRINCIPIO


3 REACTIVOS











M29



4 MATERIAL





5 PROCEDIMIENTO






la muestra (en g)

0 a 2 10 002

gt 2 a 75 25 001

gt 75 05 0001








M29




V Uuml c Uuml M

1 000 Uuml 100 m frac14


siendo








M29


ANEXO III




2 Definicioacuten


3 Principio


4 Aparatos







5 Reactivos







M30





Siendo









6 Muestra


7 Procedimiento




0 a 12 50 a 20

12 a 20 20 a 12

20 a 30 12 a 08

30 a 50 08 a 05

50 a 90 05 a 03


M30








m

Siendo






M30


ANEXO IV


1 OBJETO


2 PRINCIPIO


3 MATERIAL











36 Rotavapor

37 Horno de mufla



4 REACTIVOS



M21








47 Gases auxiliares



5 PROCEDIMIENTO










M21







20 degC minuto

5 degC minuto

20 degC minuto

al inicio 80 degC

(1prime)













M21










A s Uuml m

siendo









M21


Figura


Leyenda








M21



Apeacutendice




M32 __________

M26 __________

M21


ANEXO VII





2 PRINCIPIO








36 Rotavapor













M21



4 REACTIVOS




M21 43 Isopropanol














5 PROCEDIMIENTO



M21


















M21




















M21










A Uuml 100

siendo











M21


Figura 1



M21


Figura 2

Cromatograma de



Leyenda





= 2-monopalmitina


M21


Cromatograma de



Leyenda





= 2-monopalmitina


M21


8 NOTAS















m

siendo






M20 __________

M21


ANEXO IX


INTRODUCCIOacuteN









3 EQUIPO





M28






4 REACTIVOS



5 PROCEDIMIENTO








M28




Kλ frac14 Eλ

c Uuml s

donde









2 Icirc j



M28


ANEXO X






2 PRINCIPIO




PARTE A


OLIVA





M28















3 METODOLOGIacuteA


311 Principio


312 Reactivos









313 Equipo



M28




315 Procedimiento


PARTE B





2 REACTIVOS

21 Gas portador



22 Gases auxiliares







M28


3 INSTRUMENTAL






312 Horno



313 Columna capilar










32 Jeringa




M28


4 PROCEDIMIENTO
















O


britaacutenica))

donde










donde


M28












5221 Caso general



donde








M28




donde





donde













donde








M28





7 PRECISIOacuteN



72 Repetibilidad


73 Reproducibilidad


M28


Apeacutendice A

Figura 1


Figura 2 Figura 3

M28


Apeacutendice B

Figura 1



M28


ANEXO XI




2 EQUIPO









3 REACTIVOS












B


ANEXO XII


VIacuteRGENES

M28





M26










M26




Cocido o quemado

















M28














Frutado mdash


Frutado verde mdash









M32













M26



5 SALA DE CATA


6 ACCESORIOS








mdash escupideras

M32














M26






72 Catadores




M26








M26





















M26














M29

















M26








2 p







M32


Figura 1



Atrojadoborras


Avinadoavinagrado

aacutecidoagrio



Rancio






Frutado

Color verde Maduro

Amargas

Picante



Fecha

Comentarios

M28


Apeacutendice


Mediana






p






n 100 acirc





CV r frac14 s auml

Me Uuml 100

M26








Bibliografiacutea









(9) ISOIEC 1702505

M20 __________

M19 __________

M26


ANEXO XV


11 Material








mdash desecador



12 Reactivo


2 MODO DE OPERAR




22 Toma de muestra




24 Presecado


B





















B








S Uuml 100




32 Repetitividad



B


ANEXO XVI


1 OBJETO


2 DEFINICIOacuteN




3 PRINCIPIO


4 REACTIVOS










5 MATERIAL






7 PROCEDIMIENTO



B


Cuadro 1


menos de 5 300 g

5mdash 20 100 g

21mdash 50 040 g

51mdash100 020 g

101mdash150 013 g

151mdash200 010 g














siendo



B





B


ANEXO XVII


1 OBJETIVOS


2 APLICACIOacuteN


3 FUNDAMENTO


4 INSTRUMENTAL




44 Rotavapor




Nota 1





M11


5 REACTIVOS







Nota 3



Nota 4





Nota 5





M11


6 METODOLOGIacuteA



Nota 6






Nota 7



Nota 8


M11
















Nota 9





M11







M32 Nota 10


M11


Figura 1


M11





Figura 2


M11


ANEXO XVIII


ECN 42

1 OBJETO




3 PRINCIPIO


4 MEacuteTODO


41 Instrumental









419 Rotavapor




M25





42 Reactivos







425 Lana de vidrio
















M25

















442 Procedimiento









M25
















PM P moles S frac14

sup S PM S


PM Po


PM O moles L frac14

sup L PM L


PM Ln















M25
































10 000



10 000


10 000

M25




10 000


10 000


10 000



LLL






PoPoPo










FA P S Po O L Ln

PM 2564 2845 2544 2825 2804 2784


100 30 10 750 100 10

M25



moles P = 10

2564 frac14 003900 moles P

moles S = 3

2845 frac14 001054 moles S

moles Po = 1


moles O = 75

2825 frac14 026549 moles O

moles L = 10

2804 frac14 003566 moles L

moles Ln = 1





035821 moles frac14 10887


035821 moles frac14 2942


035821 moles frac14 1097


035821 moles frac14 74116


035821 moles frac14 9955


035821 moles frac14 1002

total moles = 100















M25


















P 16004 0653

S 4325 0177

Po 1015 1262

O 68526 85296

L 9204 11457

Ln 0927 1153

Suma 1000 1000


LLL

PoPoPo










10 000 frac14 0 09706 mol LLL



M25




10 000 frac14 002141


10 000 frac14 001069

003210 mol PoLL


10 000 frac14 000092


10 000 frac14 000002

000094 mol SLnLn


10000 frac14 000236


10 000 frac14 000118

000354 mol PoPoL



10 000 frac14 000374


10 000 frac14 000012


10 000 frac14 000375

000761 mol PPoLn


10 000 frac14 014556


10 000 frac14 014555


10 000 frac14 014544

043655 mol OLLn


10 000 frac14 003399


10000 frac14 000111


10 000 frac14 003397

006907 mol PLLn

M25



10 000 frac14 001605


10 000 frac14 001603


10 000 frac14 001604

004812 mol PoOLn

ECN 42 = 069512 mol TG











M25


Figura 1




M25


Figura 2


a



b



M25


Figura 3


(a)



(b)



M25


ANEXO XIX






2 PRINCIPIO



PARTE 1




2 PRINCIPIO


3 INSTRUMENTAL










4 REACTIVOS


M32














5 PROCEDIMIENTO






M32




PARTE 2




2 PRINCIPIO


3 INSTRUMENTAL










381 Bomba binaria







M32


4 REACTIVOS























M32














PARTE 3




M32


2 PRINCIPIO


3 INSTRUMENTAL










4 REACTIVOS










M32
















M32


























M32












donde









M32




donde






ΣA T Uuml 100

donde







donde






M32


Apeacutendice


















M32














M32




M32




M32


ANEXO XX


capilar

1 OBJETO


2 PRINCIPIO


3 APARATOS













36 Rotavapor

37 Horno de mufla


M23



4 REACTIVOS














M23



ADVERTENCIA



49 Gases auxiliares



ADVERTENCIA


5 PROCEDIMIENTO



M23





















M23


















M23


siendo









A s m

siendo











M23


Figura 1



Leyenda








M23



Figura 2


Leyenda

1 ndash Metilo C 16

2 ndash Etilo C 16


4 ndash Metilo C 18

5 ndash Etilo C 18

6 ndash Escualeno



B ndash Ceras


M23


Figura 3


Leyenda


2 ndash Metilo C 18

3 ndash Etilo C 18

4 ndash Escualeno



B ndash Ceras


M23


Figura 4


Leyenda











M23


Apeacutendice A




M28 __________

M23


01991R2568 mdash


032001 mdash 128

M25

ANEXO XXI







origen


miento

Informacishyoacuten


Paraacuteshymetros


En caso afirmativo







Modificado por

Rectificado por


Artiacuteculo 1

Artiacuteculo 2

Artiacuteculo 2 bis

Artiacuteculo 3

Artiacuteculo 4

Artiacuteculo 6

Artiacuteculo 7

Artiacuteculo 7 bis

Artiacuteculo 8

Artiacuteculo 9

Artiacuteculo 10

ANEXOS IacuteNDICE












Apeacutendice A

Apeacutendice B




ANEXO XV





Apeacutendice



ANEXO XXI

Artiacuteculo 2









gido en el anexo X










M28 __________


M26









M26



M25

Artiacuteculo 2 bis













M26







M19 __________

M25

Artiacuteculo 3



M5

Artiacuteculo 4









M19 __________

B

Artiacuteculo 6


M25



M20

Artiacuteculo 7





M25

Artiacuteculo 7 bis



Artiacuteculo 8




B

Artiacuteculo 9


Artiacuteculo 10



B


( 1 ) DO L 228 de 192009 p 3




M5


ANEXOS

IacuteNDICE



















M32


01991R2568 mdash


032001 mdash 11

M32

ANEXO I








(Mf)











01991R2568 mdash


032001 mdash 12

M32


Categoriacutea



transoleicos ()



()

Estigmastashydienos

(mgkg) ( 2 )




() Linoleacutenico

() Araquiacutedico

() Eicosenoico

() Beheacutenico

() Lignoceacuterico

()















01991R2568 mdash


032001 mdash 13

M32

Categoriacutea



transoleicos ()



()

Estigmastashydienos

(mgkg) ( 2 )




() Linoleacutenico

() Araquiacutedico

() Eicosenoico

() Beheacutenico

() Lignoceacuterico

()








Categoriacutea



Eritrodiol y uvaol

() ()


() Brasicasterol


() Estigmasterol

()


()


()





01991R2568 mdash


032001 mdash 14

M32

Categoriacutea



Eritrodiol y uvaol

() ()


() Brasicasterol


() Estigmasterol

()


()


()









Notas





Apeacutendice









M32


ANEXO I BIS









Cuadro 1










M26 Cuadro 2



Hasta 10 1

De 11 a 150 2

M26




De 151 a 500 3

De 501 a 1 500 4

De 1 501 a 2 500 5















Cuadro 3



Inferior a 7 500 2





M26






M26


ANEXO I ter



Cuadro general

M32



M32



M32



M32



M32




M32



M32



M32




M32



M32


ANEXO II




2 PRINCIPIO


3 REACTIVOS











M29



4 MATERIAL





5 PROCEDIMIENTO






la muestra (en g)

0 a 2 10 002

gt 2 a 75 25 001

gt 75 05 0001








M29




V Uuml c Uuml M

1 000 Uuml 100 m frac14


siendo








M29


ANEXO III




2 Definicioacuten


3 Principio


4 Aparatos







5 Reactivos







M30





Siendo









6 Muestra


7 Procedimiento




0 a 12 50 a 20

12 a 20 20 a 12

20 a 30 12 a 08

30 a 50 08 a 05

50 a 90 05 a 03


M30








m

Siendo






M30


ANEXO IV


1 OBJETO


2 PRINCIPIO


3 MATERIAL











36 Rotavapor

37 Horno de mufla



4 REACTIVOS



M21








47 Gases auxiliares



5 PROCEDIMIENTO










M21







20 degC minuto

5 degC minuto

20 degC minuto

al inicio 80 degC

(1prime)













M21










A s Uuml m

siendo









M21


Figura


Leyenda








M21



Apeacutendice




M32 __________

M26 __________

M21


ANEXO VII





2 PRINCIPIO








36 Rotavapor













M21



4 REACTIVOS




M21 43 Isopropanol














5 PROCEDIMIENTO



M21


















M21




















M21










A Uuml 100

siendo











M21


Figura 1



M21


Figura 2

Cromatograma de



Leyenda





= 2-monopalmitina


M21


Cromatograma de



Leyenda





= 2-monopalmitina


M21


8 NOTAS















m

siendo






M20 __________

M21


ANEXO IX


INTRODUCCIOacuteN









3 EQUIPO





M28






4 REACTIVOS



5 PROCEDIMIENTO








M28




Kλ frac14 Eλ

c Uuml s

donde









2 Icirc j



M28


ANEXO X






2 PRINCIPIO




PARTE A


OLIVA





M28















3 METODOLOGIacuteA


311 Principio


312 Reactivos









313 Equipo



M28




315 Procedimiento


PARTE B





2 REACTIVOS

21 Gas portador



22 Gases auxiliares







M28


3 INSTRUMENTAL






312 Horno



313 Columna capilar










32 Jeringa




M28


4 PROCEDIMIENTO
















O


britaacutenica))

donde










donde


M28












5221 Caso general



donde








M28




donde





donde













donde








M28





7 PRECISIOacuteN



72 Repetibilidad


73 Reproducibilidad


M28


Apeacutendice A

Figura 1


Figura 2 Figura 3

M28


Apeacutendice B

Figura 1



M28


ANEXO XI




2 EQUIPO









3 REACTIVOS












B


ANEXO XII


VIacuteRGENES

M28





M26










M26




Cocido o quemado

















M28














Frutado mdash


Frutado verde mdash









M32













M26



5 SALA DE CATA


6 ACCESORIOS








mdash escupideras

M32














M26






72 Catadores




M26








M26





















M26














M29

















M26








2 p







M32


Figura 1



Atrojadoborras


Avinadoavinagrado

aacutecidoagrio



Rancio






Frutado

Color verde Maduro

Amargas

Picante



Fecha

Comentarios

M28


Apeacutendice


Mediana






p






n 100 acirc





CV r frac14 s auml

Me Uuml 100

M26








Bibliografiacutea









(9) ISOIEC 1702505

M20 __________

M19 __________

M26


ANEXO XV


11 Material








mdash desecador



12 Reactivo


2 MODO DE OPERAR




22 Toma de muestra




24 Presecado


B





















B








S Uuml 100




32 Repetitividad



B


ANEXO XVI


1 OBJETO


2 DEFINICIOacuteN




3 PRINCIPIO


4 REACTIVOS










5 MATERIAL






7 PROCEDIMIENTO



B


Cuadro 1


menos de 5 300 g

5mdash 20 100 g

21mdash 50 040 g

51mdash100 020 g

101mdash150 013 g

151mdash200 010 g














siendo



B





B


ANEXO XVII


1 OBJETIVOS


2 APLICACIOacuteN


3 FUNDAMENTO


4 INSTRUMENTAL




44 Rotavapor




Nota 1





M11


5 REACTIVOS







Nota 3



Nota 4





Nota 5





M11


6 METODOLOGIacuteA



Nota 6






Nota 7



Nota 8


M11
















Nota 9





M11







M32 Nota 10


M11


Figura 1


M11





Figura 2


M11


ANEXO XVIII


ECN 42

1 OBJETO




3 PRINCIPIO


4 MEacuteTODO


41 Instrumental









419 Rotavapor




M25





42 Reactivos







425 Lana de vidrio
















M25

















442 Procedimiento









M25
















PM P moles S frac14

sup S PM S


PM Po


PM O moles L frac14

sup L PM L


PM Ln















M25
































10 000



10 000


10 000

M25




10 000


10 000


10 000



LLL






PoPoPo










FA P S Po O L Ln

PM 2564 2845 2544 2825 2804 2784


100 30 10 750 100 10

M25



moles P = 10

2564 frac14 003900 moles P

moles S = 3

2845 frac14 001054 moles S

moles Po = 1


moles O = 75

2825 frac14 026549 moles O

moles L = 10

2804 frac14 003566 moles L

moles Ln = 1





035821 moles frac14 10887


035821 moles frac14 2942


035821 moles frac14 1097


035821 moles frac14 74116


035821 moles frac14 9955


035821 moles frac14 1002

total moles = 100















M25


















P 16004 0653

S 4325 0177

Po 1015 1262

O 68526 85296

L 9204 11457

Ln 0927 1153

Suma 1000 1000


LLL

PoPoPo










10 000 frac14 0 09706 mol LLL



M25




10 000 frac14 002141


10 000 frac14 001069

003210 mol PoLL


10 000 frac14 000092


10 000 frac14 000002

000094 mol SLnLn


10000 frac14 000236


10 000 frac14 000118

000354 mol PoPoL



10 000 frac14 000374


10 000 frac14 000012


10 000 frac14 000375

000761 mol PPoLn


10 000 frac14 014556


10 000 frac14 014555


10 000 frac14 014544

043655 mol OLLn


10 000 frac14 003399


10000 frac14 000111


10 000 frac14 003397

006907 mol PLLn

M25



10 000 frac14 001605


10 000 frac14 001603


10 000 frac14 001604

004812 mol PoOLn

ECN 42 = 069512 mol TG











M25


Figura 1




M25


Figura 2


a



b



M25


Figura 3


(a)



(b)



M25


ANEXO XIX






2 PRINCIPIO



PARTE 1




2 PRINCIPIO


3 INSTRUMENTAL










4 REACTIVOS


M32














5 PROCEDIMIENTO






M32




PARTE 2




2 PRINCIPIO


3 INSTRUMENTAL










381 Bomba binaria







M32


4 REACTIVOS























M32














PARTE 3




M32


2 PRINCIPIO


3 INSTRUMENTAL










4 REACTIVOS










M32
















M32


























M32












donde









M32




donde






ΣA T Uuml 100

donde







donde






M32


Apeacutendice


















M32














M32




M32




M32


ANEXO XX


capilar

1 OBJETO


2 PRINCIPIO


3 APARATOS













36 Rotavapor

37 Horno de mufla


M23



4 REACTIVOS














M23



ADVERTENCIA



49 Gases auxiliares



ADVERTENCIA


5 PROCEDIMIENTO



M23





















M23


















M23


siendo









A s m

siendo











M23


Figura 1



Leyenda








M23



Figura 2


Leyenda

1 ndash Metilo C 16

2 ndash Etilo C 16


4 ndash Metilo C 18

5 ndash Etilo C 18

6 ndash Escualeno



B ndash Ceras


M23


Figura 3


Leyenda


2 ndash Metilo C 18

3 ndash Etilo C 18

4 ndash Escualeno



B ndash Ceras


M23


Figura 4


Leyenda











M23


Apeacutendice A




M28 __________

M23


01991R2568 mdash


032001 mdash 128

M25

ANEXO XXI







origen


miento

Informacishyoacuten


Paraacuteshymetros


En caso afirmativo







Modificado por

Rectificado por


Artiacuteculo 1

Artiacuteculo 2

Artiacuteculo 2 bis

Artiacuteculo 3

Artiacuteculo 4

Artiacuteculo 6

Artiacuteculo 7

Artiacuteculo 7 bis

Artiacuteculo 8

Artiacuteculo 9

Artiacuteculo 10

ANEXOS IacuteNDICE












Apeacutendice A

Apeacutendice B




ANEXO XV





Apeacutendice



ANEXO XXI








M26



M25

Artiacuteculo 2 bis













M26







M19 __________

M25

Artiacuteculo 3



M5

Artiacuteculo 4









M19 __________

B

Artiacuteculo 6


M25



M20

Artiacuteculo 7





M25

Artiacuteculo 7 bis



Artiacuteculo 8




B

Artiacuteculo 9


Artiacuteculo 10



B


( 1 ) DO L 228 de 192009 p 3




M5


ANEXOS

IacuteNDICE



















M32


01991R2568 mdash


032001 mdash 11

M32

ANEXO I








(Mf)











01991R2568 mdash


032001 mdash 12

M32


Categoriacutea



transoleicos ()



()

Estigmastashydienos

(mgkg) ( 2 )




() Linoleacutenico

() Araquiacutedico

() Eicosenoico

() Beheacutenico

() Lignoceacuterico

()















01991R2568 mdash


032001 mdash 13

M32

Categoriacutea



transoleicos ()



()

Estigmastashydienos

(mgkg) ( 2 )




() Linoleacutenico

() Araquiacutedico

() Eicosenoico

() Beheacutenico

() Lignoceacuterico

()








Categoriacutea



Eritrodiol y uvaol

() ()


() Brasicasterol


() Estigmasterol

()


()


()





01991R2568 mdash


032001 mdash 14

M32

Categoriacutea



Eritrodiol y uvaol

() ()


() Brasicasterol


() Estigmasterol

()


()


()









Notas





Apeacutendice









M32


ANEXO I BIS









Cuadro 1










M26 Cuadro 2



Hasta 10 1

De 11 a 150 2

M26




De 151 a 500 3

De 501 a 1 500 4

De 1 501 a 2 500 5















Cuadro 3



Inferior a 7 500 2





M26






M26


ANEXO I ter



Cuadro general

M32



M32



M32



M32



M32




M32



M32



M32




M32



M32


ANEXO II




2 PRINCIPIO


3 REACTIVOS











M29



4 MATERIAL





5 PROCEDIMIENTO






la muestra (en g)

0 a 2 10 002

gt 2 a 75 25 001

gt 75 05 0001








M29




V Uuml c Uuml M

1 000 Uuml 100 m frac14


siendo








M29


ANEXO III




2 Definicioacuten


3 Principio


4 Aparatos







5 Reactivos







M30





Siendo









6 Muestra


7 Procedimiento




0 a 12 50 a 20

12 a 20 20 a 12

20 a 30 12 a 08

30 a 50 08 a 05

50 a 90 05 a 03


M30








m

Siendo






M30


ANEXO IV


1 OBJETO


2 PRINCIPIO


3 MATERIAL











36 Rotavapor

37 Horno de mufla



4 REACTIVOS



M21








47 Gases auxiliares



5 PROCEDIMIENTO










M21







20 degC minuto

5 degC minuto

20 degC minuto

al inicio 80 degC

(1prime)













M21










A s Uuml m

siendo









M21


Figura


Leyenda








M21



Apeacutendice




M32 __________

M26 __________

M21


ANEXO VII





2 PRINCIPIO








36 Rotavapor













M21



4 REACTIVOS




M21 43 Isopropanol














5 PROCEDIMIENTO



M21


















M21




















M21










A Uuml 100

siendo











M21


Figura 1



M21


Figura 2

Cromatograma de



Leyenda





= 2-monopalmitina


M21


Cromatograma de



Leyenda





= 2-monopalmitina


M21


8 NOTAS















m

siendo






M20 __________

M21


ANEXO IX


INTRODUCCIOacuteN









3 EQUIPO





M28






4 REACTIVOS



5 PROCEDIMIENTO








M28




Kλ frac14 Eλ

c Uuml s

donde









2 Icirc j



M28


ANEXO X






2 PRINCIPIO




PARTE A


OLIVA





M28















3 METODOLOGIacuteA


311 Principio


312 Reactivos









313 Equipo



M28




315 Procedimiento


PARTE B





2 REACTIVOS

21 Gas portador



22 Gases auxiliares







M28


3 INSTRUMENTAL






312 Horno



313 Columna capilar










32 Jeringa




M28


4 PROCEDIMIENTO
















O


britaacutenica))

donde










donde


M28












5221 Caso general



donde








M28




donde





donde













donde








M28





7 PRECISIOacuteN



72 Repetibilidad


73 Reproducibilidad


M28


Apeacutendice A

Figura 1


Figura 2 Figura 3

M28


Apeacutendice B

Figura 1



M28


ANEXO XI




2 EQUIPO









3 REACTIVOS












B


ANEXO XII


VIacuteRGENES

M28





M26










M26




Cocido o quemado

















M28














Frutado mdash


Frutado verde mdash









M32













M26



5 SALA DE CATA


6 ACCESORIOS








mdash escupideras

M32














M26






72 Catadores




M26








M26





















M26














M29

















M26








2 p







M32


Figura 1



Atrojadoborras


Avinadoavinagrado

aacutecidoagrio



Rancio






Frutado

Color verde Maduro

Amargas

Picante



Fecha

Comentarios

M28


Apeacutendice


Mediana






p






n 100 acirc





CV r frac14 s auml

Me Uuml 100

M26








Bibliografiacutea









(9) ISOIEC 1702505

M20 __________

M19 __________

M26


ANEXO XV


11 Material








mdash desecador



12 Reactivo


2 MODO DE OPERAR




22 Toma de muestra




24 Presecado


B





















B








S Uuml 100




32 Repetitividad



B


ANEXO XVI


1 OBJETO


2 DEFINICIOacuteN




3 PRINCIPIO


4 REACTIVOS










5 MATERIAL






7 PROCEDIMIENTO



B


Cuadro 1


menos de 5 300 g

5mdash 20 100 g

21mdash 50 040 g

51mdash100 020 g

101mdash150 013 g

151mdash200 010 g














siendo



B





B


ANEXO XVII


1 OBJETIVOS


2 APLICACIOacuteN


3 FUNDAMENTO


4 INSTRUMENTAL




44 Rotavapor




Nota 1





M11


5 REACTIVOS







Nota 3



Nota 4





Nota 5





M11


6 METODOLOGIacuteA



Nota 6






Nota 7



Nota 8


M11
















Nota 9





M11







M32 Nota 10


M11


Figura 1


M11





Figura 2


M11


ANEXO XVIII


ECN 42

1 OBJETO




3 PRINCIPIO


4 MEacuteTODO


41 Instrumental









419 Rotavapor




M25





42 Reactivos







425 Lana de vidrio
















M25

















442 Procedimiento









M25
















PM P moles S frac14

sup S PM S


PM Po


PM O moles L frac14

sup L PM L


PM Ln















M25
































10 000



10 000


10 000

M25




10 000


10 000


10 000



LLL






PoPoPo










FA P S Po O L Ln

PM 2564 2845 2544 2825 2804 2784


100 30 10 750 100 10

M25



moles P = 10

2564 frac14 003900 moles P

moles S = 3

2845 frac14 001054 moles S

moles Po = 1


moles O = 75

2825 frac14 026549 moles O

moles L = 10

2804 frac14 003566 moles L

moles Ln = 1





035821 moles frac14 10887


035821 moles frac14 2942


035821 moles frac14 1097


035821 moles frac14 74116


035821 moles frac14 9955


035821 moles frac14 1002

total moles = 100















M25


















P 16004 0653

S 4325 0177

Po 1015 1262

O 68526 85296

L 9204 11457

Ln 0927 1153

Suma 1000 1000


LLL

PoPoPo










10 000 frac14 0 09706 mol LLL



M25




10 000 frac14 002141


10 000 frac14 001069

003210 mol PoLL


10 000 frac14 000092


10 000 frac14 000002

000094 mol SLnLn


10000 frac14 000236


10 000 frac14 000118

000354 mol PoPoL



10 000 frac14 000374


10 000 frac14 000012


10 000 frac14 000375

000761 mol PPoLn


10 000 frac14 014556


10 000 frac14 014555


10 000 frac14 014544

043655 mol OLLn


10 000 frac14 003399


10000 frac14 000111


10 000 frac14 003397

006907 mol PLLn

M25



10 000 frac14 001605


10 000 frac14 001603


10 000 frac14 001604

004812 mol PoOLn

ECN 42 = 069512 mol TG











M25


Figura 1




M25


Figura 2


a



b



M25


Figura 3


(a)



(b)



M25


ANEXO XIX






2 PRINCIPIO



PARTE 1




2 PRINCIPIO


3 INSTRUMENTAL










4 REACTIVOS


M32














5 PROCEDIMIENTO






M32




PARTE 2




2 PRINCIPIO


3 INSTRUMENTAL










381 Bomba binaria







M32


4 REACTIVOS























M32














PARTE 3




M32


2 PRINCIPIO


3 INSTRUMENTAL










4 REACTIVOS










M32
















M32


























M32












donde









M32




donde






ΣA T Uuml 100

donde







donde






M32


Apeacutendice


















M32














M32




M32




M32


ANEXO XX


capilar

1 OBJETO


2 PRINCIPIO


3 APARATOS













36 Rotavapor

37 Horno de mufla


M23



4 REACTIVOS














M23



ADVERTENCIA



49 Gases auxiliares



ADVERTENCIA


5 PROCEDIMIENTO



M23





















M23


















M23


siendo









A s m

siendo











M23


Figura 1



Leyenda








M23



Figura 2


Leyenda

1 ndash Metilo C 16

2 ndash Etilo C 16


4 ndash Metilo C 18

5 ndash Etilo C 18

6 ndash Escualeno



B ndash Ceras


M23


Figura 3


Leyenda


2 ndash Metilo C 18

3 ndash Etilo C 18

4 ndash Escualeno



B ndash Ceras


M23


Figura 4


Leyenda











M23


Apeacutendice A




M28 __________

M23


01991R2568 mdash


032001 mdash 128

M25

ANEXO XXI







origen


miento

Informacishyoacuten


Paraacuteshymetros


En caso afirmativo







Modificado por

Rectificado por


Artiacuteculo 1

Artiacuteculo 2

Artiacuteculo 2 bis

Artiacuteculo 3

Artiacuteculo 4

Artiacuteculo 6

Artiacuteculo 7

Artiacuteculo 7 bis

Artiacuteculo 8

Artiacuteculo 9

Artiacuteculo 10

ANEXOS IacuteNDICE












Apeacutendice A

Apeacutendice B




ANEXO XV





Apeacutendice



ANEXO XXI


M25

Artiacuteculo 2 bis













M26







M19 __________

M25

Artiacuteculo 3



M5

Artiacuteculo 4









M19 __________

B

Artiacuteculo 6


M25



M20

Artiacuteculo 7





M25

Artiacuteculo 7 bis



Artiacuteculo 8




B

Artiacuteculo 9


Artiacuteculo 10



B


( 1 ) DO L 228 de 192009 p 3




M5


ANEXOS

IacuteNDICE



















M32


01991R2568 mdash


032001 mdash 11

M32

ANEXO I








(Mf)











01991R2568 mdash


032001 mdash 12

M32


Categoriacutea



transoleicos ()



()

Estigmastashydienos

(mgkg) ( 2 )




() Linoleacutenico

() Araquiacutedico

() Eicosenoico

() Beheacutenico

() Lignoceacuterico

()















01991R2568 mdash


032001 mdash 13

M32

Categoriacutea



transoleicos ()



()

Estigmastashydienos

(mgkg) ( 2 )




() Linoleacutenico

() Araquiacutedico

() Eicosenoico

() Beheacutenico

() Lignoceacuterico

()








Categoriacutea



Eritrodiol y uvaol

() ()


() Brasicasterol


() Estigmasterol

()


()


()





01991R2568 mdash


032001 mdash 14

M32

Categoriacutea



Eritrodiol y uvaol

() ()


() Brasicasterol


() Estigmasterol

()


()


()









Notas





Apeacutendice









M32


ANEXO I BIS









Cuadro 1










M26 Cuadro 2



Hasta 10 1

De 11 a 150 2

M26




De 151 a 500 3

De 501 a 1 500 4

De 1 501 a 2 500 5















Cuadro 3



Inferior a 7 500 2





M26






M26


ANEXO I ter



Cuadro general

M32



M32



M32



M32



M32




M32



M32



M32




M32



M32


ANEXO II




2 PRINCIPIO


3 REACTIVOS











M29



4 MATERIAL





5 PROCEDIMIENTO






la muestra (en g)

0 a 2 10 002

gt 2 a 75 25 001

gt 75 05 0001








M29




V Uuml c Uuml M

1 000 Uuml 100 m frac14


siendo








M29


ANEXO III




2 Definicioacuten


3 Principio


4 Aparatos







5 Reactivos







M30





Siendo









6 Muestra


7 Procedimiento




0 a 12 50 a 20

12 a 20 20 a 12

20 a 30 12 a 08

30 a 50 08 a 05

50 a 90 05 a 03


M30








m

Siendo






M30


ANEXO IV


1 OBJETO


2 PRINCIPIO


3 MATERIAL











36 Rotavapor

37 Horno de mufla



4 REACTIVOS



M21








47 Gases auxiliares



5 PROCEDIMIENTO










M21







20 degC minuto

5 degC minuto

20 degC minuto

al inicio 80 degC

(1prime)













M21










A s Uuml m

siendo









M21


Figura


Leyenda








M21



Apeacutendice




M32 __________

M26 __________

M21


ANEXO VII





2 PRINCIPIO








36 Rotavapor













M21



4 REACTIVOS




M21 43 Isopropanol














5 PROCEDIMIENTO



M21


















M21




















M21










A Uuml 100

siendo











M21


Figura 1



M21


Figura 2

Cromatograma de



Leyenda





= 2-monopalmitina


M21


Cromatograma de



Leyenda





= 2-monopalmitina


M21


8 NOTAS















m

siendo






M20 __________

M21


ANEXO IX


INTRODUCCIOacuteN









3 EQUIPO





M28






4 REACTIVOS



5 PROCEDIMIENTO








M28




Kλ frac14 Eλ

c Uuml s

donde









2 Icirc j



M28


ANEXO X






2 PRINCIPIO




PARTE A


OLIVA





M28















3 METODOLOGIacuteA


311 Principio


312 Reactivos









313 Equipo



M28




315 Procedimiento


PARTE B





2 REACTIVOS

21 Gas portador



22 Gases auxiliares







M28


3 INSTRUMENTAL






312 Horno



313 Columna capilar










32 Jeringa




M28


4 PROCEDIMIENTO
















O


britaacutenica))

donde










donde


M28












5221 Caso general



donde








M28




donde





donde













donde








M28





7 PRECISIOacuteN



72 Repetibilidad


73 Reproducibilidad


M28


Apeacutendice A

Figura 1


Figura 2 Figura 3

M28


Apeacutendice B

Figura 1



M28


ANEXO XI




2 EQUIPO









3 REACTIVOS












B


ANEXO XII


VIacuteRGENES

M28





M26










M26




Cocido o quemado

















M28














Frutado mdash


Frutado verde mdash









M32













M26



5 SALA DE CATA


6 ACCESORIOS








mdash escupideras

M32














M26






72 Catadores




M26








M26





















M26














M29

















M26








2 p







M32


Figura 1



Atrojadoborras


Avinadoavinagrado

aacutecidoagrio



Rancio






Frutado

Color verde Maduro

Amargas

Picante



Fecha

Comentarios

M28


Apeacutendice


Mediana






p






n 100 acirc





CV r frac14 s auml

Me Uuml 100

M26








Bibliografiacutea









(9) ISOIEC 1702505

M20 __________

M19 __________

M26


ANEXO XV


11 Material








mdash desecador



12 Reactivo


2 MODO DE OPERAR




22 Toma de muestra




24 Presecado


B





















B








S Uuml 100




32 Repetitividad



B


ANEXO XVI


1 OBJETO


2 DEFINICIOacuteN




3 PRINCIPIO


4 REACTIVOS










5 MATERIAL






7 PROCEDIMIENTO



B


Cuadro 1


menos de 5 300 g

5mdash 20 100 g

21mdash 50 040 g

51mdash100 020 g

101mdash150 013 g

151mdash200 010 g














siendo



B





B


ANEXO XVII


1 OBJETIVOS


2 APLICACIOacuteN


3 FUNDAMENTO


4 INSTRUMENTAL




44 Rotavapor




Nota 1





M11


5 REACTIVOS







Nota 3



Nota 4





Nota 5





M11


6 METODOLOGIacuteA



Nota 6






Nota 7



Nota 8


M11
















Nota 9





M11







M32 Nota 10


M11


Figura 1


M11





Figura 2


M11


ANEXO XVIII


ECN 42

1 OBJETO




3 PRINCIPIO


4 MEacuteTODO


41 Instrumental









419 Rotavapor




M25





42 Reactivos







425 Lana de vidrio
















M25

















442 Procedimiento









M25
















PM P moles S frac14

sup S PM S


PM Po


PM O moles L frac14

sup L PM L


PM Ln















M25
































10 000



10 000


10 000

M25




10 000


10 000


10 000



LLL






PoPoPo










FA P S Po O L Ln

PM 2564 2845 2544 2825 2804 2784


100 30 10 750 100 10

M25



moles P = 10

2564 frac14 003900 moles P

moles S = 3

2845 frac14 001054 moles S

moles Po = 1


moles O = 75

2825 frac14 026549 moles O

moles L = 10

2804 frac14 003566 moles L

moles Ln = 1





035821 moles frac14 10887


035821 moles frac14 2942


035821 moles frac14 1097


035821 moles frac14 74116


035821 moles frac14 9955


035821 moles frac14 1002

total moles = 100















M25


















P 16004 0653

S 4325 0177

Po 1015 1262

O 68526 85296

L 9204 11457

Ln 0927 1153

Suma 1000 1000


LLL

PoPoPo










10 000 frac14 0 09706 mol LLL



M25




10 000 frac14 002141


10 000 frac14 001069

003210 mol PoLL


10 000 frac14 000092


10 000 frac14 000002

000094 mol SLnLn


10000 frac14 000236


10 000 frac14 000118

000354 mol PoPoL



10 000 frac14 000374


10 000 frac14 000012


10 000 frac14 000375

000761 mol PPoLn


10 000 frac14 014556


10 000 frac14 014555


10 000 frac14 014544

043655 mol OLLn


10 000 frac14 003399


10000 frac14 000111


10 000 frac14 003397

006907 mol PLLn

M25



10 000 frac14 001605


10 000 frac14 001603


10 000 frac14 001604

004812 mol PoOLn

ECN 42 = 069512 mol TG











M25


Figura 1




M25


Figura 2


a



b



M25


Figura 3


(a)



(b)



M25


ANEXO XIX






2 PRINCIPIO



PARTE 1




2 PRINCIPIO


3 INSTRUMENTAL










4 REACTIVOS


M32














5 PROCEDIMIENTO






M32




PARTE 2




2 PRINCIPIO


3 INSTRUMENTAL










381 Bomba binaria







M32


4 REACTIVOS























M32














PARTE 3




M32


2 PRINCIPIO


3 INSTRUMENTAL










4 REACTIVOS










M32
















M32


























M32












donde









M32




donde






ΣA T Uuml 100

donde







donde






M32


Apeacutendice


















M32














M32




M32




M32


ANEXO XX


capilar

1 OBJETO


2 PRINCIPIO


3 APARATOS













36 Rotavapor

37 Horno de mufla


M23



4 REACTIVOS














M23



ADVERTENCIA



49 Gases auxiliares



ADVERTENCIA


5 PROCEDIMIENTO



M23





















M23


















M23


siendo









A s m

siendo











M23


Figura 1



Leyenda








M23



Figura 2


Leyenda

1 ndash Metilo C 16

2 ndash Etilo C 16


4 ndash Metilo C 18

5 ndash Etilo C 18

6 ndash Escualeno



B ndash Ceras


M23


Figura 3


Leyenda


2 ndash Metilo C 18

3 ndash Etilo C 18

4 ndash Escualeno



B ndash Ceras


M23


Figura 4


Leyenda











M23


Apeacutendice A




M28 __________

M23


01991R2568 mdash


032001 mdash 128

M25

ANEXO XXI







origen


miento

Informacishyoacuten


Paraacuteshymetros


En caso afirmativo







Modificado por

Rectificado por


Artiacuteculo 1

Artiacuteculo 2

Artiacuteculo 2 bis

Artiacuteculo 3

Artiacuteculo 4

Artiacuteculo 6

Artiacuteculo 7

Artiacuteculo 7 bis

Artiacuteculo 8

Artiacuteculo 9

Artiacuteculo 10

ANEXOS IacuteNDICE












Apeacutendice A

Apeacutendice B




ANEXO XV





Apeacutendice



ANEXO XXI






M19 __________

M25

Artiacuteculo 3



M5

Artiacuteculo 4









M19 __________

B

Artiacuteculo 6


M25



M20

Artiacuteculo 7





M25

Artiacuteculo 7 bis



Artiacuteculo 8




B

Artiacuteculo 9


Artiacuteculo 10



B


( 1 ) DO L 228 de 192009 p 3




M5


ANEXOS

IacuteNDICE



















M32


01991R2568 mdash


032001 mdash 11

M32

ANEXO I








(Mf)











01991R2568 mdash


032001 mdash 12

M32


Categoriacutea



transoleicos ()



()

Estigmastashydienos

(mgkg) ( 2 )




() Linoleacutenico

() Araquiacutedico

() Eicosenoico

() Beheacutenico

() Lignoceacuterico

()















01991R2568 mdash


032001 mdash 13

M32

Categoriacutea



transoleicos ()



()

Estigmastashydienos

(mgkg) ( 2 )




() Linoleacutenico

() Araquiacutedico

() Eicosenoico

() Beheacutenico

() Lignoceacuterico

()








Categoriacutea



Eritrodiol y uvaol

() ()


() Brasicasterol


() Estigmasterol

()


()


()





01991R2568 mdash


032001 mdash 14

M32

Categoriacutea



Eritrodiol y uvaol

() ()


() Brasicasterol


() Estigmasterol

()


()


()









Notas





Apeacutendice









M32


ANEXO I BIS









Cuadro 1










M26 Cuadro 2



Hasta 10 1

De 11 a 150 2

M26




De 151 a 500 3

De 501 a 1 500 4

De 1 501 a 2 500 5















Cuadro 3



Inferior a 7 500 2





M26






M26


ANEXO I ter



Cuadro general

M32



M32



M32



M32



M32




M32



M32



M32




M32



M32


ANEXO II




2 PRINCIPIO


3 REACTIVOS











M29



4 MATERIAL





5 PROCEDIMIENTO






la muestra (en g)

0 a 2 10 002

gt 2 a 75 25 001

gt 75 05 0001








M29




V Uuml c Uuml M

1 000 Uuml 100 m frac14


siendo








M29


ANEXO III




2 Definicioacuten


3 Principio


4 Aparatos







5 Reactivos







M30





Siendo









6 Muestra


7 Procedimiento




0 a 12 50 a 20

12 a 20 20 a 12

20 a 30 12 a 08

30 a 50 08 a 05

50 a 90 05 a 03


M30








m

Siendo






M30


ANEXO IV


1 OBJETO


2 PRINCIPIO


3 MATERIAL











36 Rotavapor

37 Horno de mufla



4 REACTIVOS



M21








47 Gases auxiliares



5 PROCEDIMIENTO










M21







20 degC minuto

5 degC minuto

20 degC minuto

al inicio 80 degC

(1prime)













M21










A s Uuml m

siendo









M21


Figura


Leyenda








M21



Apeacutendice




M32 __________

M26 __________

M21


ANEXO VII





2 PRINCIPIO








36 Rotavapor













M21



4 REACTIVOS




M21 43 Isopropanol














5 PROCEDIMIENTO



M21


















M21




















M21










A Uuml 100

siendo











M21


Figura 1



M21


Figura 2

Cromatograma de



Leyenda





= 2-monopalmitina


M21


Cromatograma de



Leyenda





= 2-monopalmitina


M21


8 NOTAS















m

siendo






M20 __________

M21


ANEXO IX


INTRODUCCIOacuteN









3 EQUIPO





M28






4 REACTIVOS



5 PROCEDIMIENTO








M28




Kλ frac14 Eλ

c Uuml s

donde









2 Icirc j



M28


ANEXO X






2 PRINCIPIO




PARTE A


OLIVA





M28















3 METODOLOGIacuteA


311 Principio


312 Reactivos









313 Equipo



M28




315 Procedimiento


PARTE B





2 REACTIVOS

21 Gas portador



22 Gases auxiliares







M28


3 INSTRUMENTAL






312 Horno



313 Columna capilar










32 Jeringa




M28


4 PROCEDIMIENTO
















O


britaacutenica))

donde










donde


M28












5221 Caso general



donde








M28




donde





donde













donde








M28





7 PRECISIOacuteN



72 Repetibilidad


73 Reproducibilidad


M28


Apeacutendice A

Figura 1


Figura 2 Figura 3

M28


Apeacutendice B

Figura 1



M28


ANEXO XI




2 EQUIPO









3 REACTIVOS












B


ANEXO XII


VIacuteRGENES

M28





M26










M26




Cocido o quemado

















M28














Frutado mdash


Frutado verde mdash









M32













M26



5 SALA DE CATA


6 ACCESORIOS








mdash escupideras

M32














M26






72 Catadores




M26








M26





















M26














M29

















M26








2 p







M32


Figura 1



Atrojadoborras


Avinadoavinagrado

aacutecidoagrio



Rancio






Frutado

Color verde Maduro

Amargas

Picante



Fecha

Comentarios

M28


Apeacutendice


Mediana






p






n 100 acirc





CV r frac14 s auml

Me Uuml 100

M26








Bibliografiacutea









(9) ISOIEC 1702505

M20 __________

M19 __________

M26


ANEXO XV


11 Material








mdash desecador



12 Reactivo


2 MODO DE OPERAR




22 Toma de muestra




24 Presecado


B





















B








S Uuml 100




32 Repetitividad



B


ANEXO XVI


1 OBJETO


2 DEFINICIOacuteN




3 PRINCIPIO


4 REACTIVOS










5 MATERIAL






7 PROCEDIMIENTO



B


Cuadro 1


menos de 5 300 g

5mdash 20 100 g

21mdash 50 040 g

51mdash100 020 g

101mdash150 013 g

151mdash200 010 g














siendo



B





B


ANEXO XVII


1 OBJETIVOS


2 APLICACIOacuteN


3 FUNDAMENTO


4 INSTRUMENTAL




44 Rotavapor




Nota 1





M11


5 REACTIVOS







Nota 3



Nota 4





Nota 5





M11


6 METODOLOGIacuteA



Nota 6






Nota 7



Nota 8


M11
















Nota 9





M11







M32 Nota 10


M11


Figura 1


M11





Figura 2


M11


ANEXO XVIII


ECN 42

1 OBJETO




3 PRINCIPIO


4 MEacuteTODO


41 Instrumental









419 Rotavapor




M25





42 Reactivos







425 Lana de vidrio
















M25

















442 Procedimiento









M25
















PM P moles S frac14

sup S PM S


PM Po


PM O moles L frac14

sup L PM L


PM Ln















M25
































10 000



10 000


10 000

M25




10 000


10 000


10 000



LLL






PoPoPo










FA P S Po O L Ln

PM 2564 2845 2544 2825 2804 2784


100 30 10 750 100 10

M25



moles P = 10

2564 frac14 003900 moles P

moles S = 3

2845 frac14 001054 moles S

moles Po = 1


moles O = 75

2825 frac14 026549 moles O

moles L = 10

2804 frac14 003566 moles L

moles Ln = 1





035821 moles frac14 10887


035821 moles frac14 2942


035821 moles frac14 1097


035821 moles frac14 74116


035821 moles frac14 9955


035821 moles frac14 1002

total moles = 100















M25


















P 16004 0653

S 4325 0177

Po 1015 1262

O 68526 85296

L 9204 11457

Ln 0927 1153

Suma 1000 1000


LLL

PoPoPo










10 000 frac14 0 09706 mol LLL



M25




10 000 frac14 002141


10 000 frac14 001069

003210 mol PoLL


10 000 frac14 000092


10 000 frac14 000002

000094 mol SLnLn


10000 frac14 000236


10 000 frac14 000118

000354 mol PoPoL



10 000 frac14 000374


10 000 frac14 000012


10 000 frac14 000375

000761 mol PPoLn


10 000 frac14 014556


10 000 frac14 014555


10 000 frac14 014544

043655 mol OLLn


10 000 frac14 003399


10000 frac14 000111


10 000 frac14 003397

006907 mol PLLn

M25



10 000 frac14 001605


10 000 frac14 001603


10 000 frac14 001604

004812 mol PoOLn

ECN 42 = 069512 mol TG











M25


Figura 1




M25


Figura 2


a



b



M25


Figura 3


(a)



(b)



M25


ANEXO XIX






2 PRINCIPIO



PARTE 1




2 PRINCIPIO


3 INSTRUMENTAL










4 REACTIVOS


M32














5 PROCEDIMIENTO






M32




PARTE 2




2 PRINCIPIO


3 INSTRUMENTAL










381 Bomba binaria







M32


4 REACTIVOS























M32














PARTE 3




M32


2 PRINCIPIO


3 INSTRUMENTAL










4 REACTIVOS










M32
















M32


























M32












donde









M32




donde






ΣA T Uuml 100

donde







donde






M32


Apeacutendice


















M32














M32




M32




M32


ANEXO XX


capilar

1 OBJETO


2 PRINCIPIO


3 APARATOS













36 Rotavapor

37 Horno de mufla


M23



4 REACTIVOS














M23



ADVERTENCIA



49 Gases auxiliares



ADVERTENCIA


5 PROCEDIMIENTO



M23





















M23


















M23


siendo









A s m

siendo











M23


Figura 1



Leyenda








M23



Figura 2


Leyenda

1 ndash Metilo C 16

2 ndash Etilo C 16


4 ndash Metilo C 18

5 ndash Etilo C 18

6 ndash Escualeno



B ndash Ceras


M23


Figura 3


Leyenda


2 ndash Metilo C 18

3 ndash Etilo C 18

4 ndash Escualeno



B ndash Ceras


M23


Figura 4


Leyenda











M23


Apeacutendice A




M28 __________

M23


01991R2568 mdash


032001 mdash 128

M25

ANEXO XXI







origen


miento

Informacishyoacuten


Paraacuteshymetros


En caso afirmativo







Modificado por

Rectificado por


Artiacuteculo 1

Artiacuteculo 2

Artiacuteculo 2 bis

Artiacuteculo 3

Artiacuteculo 4

Artiacuteculo 6

Artiacuteculo 7

Artiacuteculo 7 bis

Artiacuteculo 8

Artiacuteculo 9

Artiacuteculo 10

ANEXOS IacuteNDICE












Apeacutendice A

Apeacutendice B




ANEXO XV





Apeacutendice



ANEXO XXI


M20

Artiacuteculo 7





M25

Artiacuteculo 7 bis



Artiacuteculo 8




B

Artiacuteculo 9


Artiacuteculo 10



B


( 1 ) DO L 228 de 192009 p 3




M5


ANEXOS

IacuteNDICE



















M32


01991R2568 mdash


032001 mdash 11

M32

ANEXO I








(Mf)











01991R2568 mdash


032001 mdash 12

M32


Categoriacutea



transoleicos ()



()

Estigmastashydienos

(mgkg) ( 2 )




() Linoleacutenico

() Araquiacutedico

() Eicosenoico

() Beheacutenico

() Lignoceacuterico

()















01991R2568 mdash


032001 mdash 13

M32

Categoriacutea



transoleicos ()



()

Estigmastashydienos

(mgkg) ( 2 )




() Linoleacutenico

() Araquiacutedico

() Eicosenoico

() Beheacutenico

() Lignoceacuterico

()








Categoriacutea



Eritrodiol y uvaol

() ()


() Brasicasterol


() Estigmasterol

()


()


()





01991R2568 mdash


032001 mdash 14

M32

Categoriacutea



Eritrodiol y uvaol

() ()


() Brasicasterol


() Estigmasterol

()


()


()









Notas





Apeacutendice









M32


ANEXO I BIS









Cuadro 1










M26 Cuadro 2



Hasta 10 1

De 11 a 150 2

M26




De 151 a 500 3

De 501 a 1 500 4

De 1 501 a 2 500 5















Cuadro 3



Inferior a 7 500 2





M26






M26


ANEXO I ter



Cuadro general

M32



M32



M32



M32



M32




M32



M32



M32




M32



M32


ANEXO II




2 PRINCIPIO


3 REACTIVOS











M29



4 MATERIAL





5 PROCEDIMIENTO






la muestra (en g)

0 a 2 10 002

gt 2 a 75 25 001

gt 75 05 0001








M29




V Uuml c Uuml M

1 000 Uuml 100 m frac14


siendo








M29


ANEXO III




2 Definicioacuten


3 Principio


4 Aparatos







5 Reactivos







M30





Siendo









6 Muestra


7 Procedimiento




0 a 12 50 a 20

12 a 20 20 a 12

20 a 30 12 a 08

30 a 50 08 a 05

50 a 90 05 a 03


M30








m

Siendo






M30


ANEXO IV


1 OBJETO


2 PRINCIPIO


3 MATERIAL











36 Rotavapor

37 Horno de mufla



4 REACTIVOS



M21








47 Gases auxiliares



5 PROCEDIMIENTO










M21







20 degC minuto

5 degC minuto

20 degC minuto

al inicio 80 degC

(1prime)













M21










A s Uuml m

siendo









M21


Figura


Leyenda








M21



Apeacutendice




M32 __________

M26 __________

M21


ANEXO VII





2 PRINCIPIO








36 Rotavapor













M21



4 REACTIVOS




M21 43 Isopropanol














5 PROCEDIMIENTO



M21


















M21




















M21










A Uuml 100

siendo











M21


Figura 1



M21


Figura 2

Cromatograma de



Leyenda





= 2-monopalmitina


M21


Cromatograma de



Leyenda





= 2-monopalmitina


M21


8 NOTAS















m

siendo






M20 __________

M21


ANEXO IX


INTRODUCCIOacuteN









3 EQUIPO





M28






4 REACTIVOS



5 PROCEDIMIENTO








M28




Kλ frac14 Eλ

c Uuml s

donde









2 Icirc j



M28


ANEXO X






2 PRINCIPIO




PARTE A


OLIVA





M28















3 METODOLOGIacuteA


311 Principio


312 Reactivos









313 Equipo



M28




315 Procedimiento


PARTE B





2 REACTIVOS

21 Gas portador



22 Gases auxiliares







M28


3 INSTRUMENTAL






312 Horno



313 Columna capilar










32 Jeringa




M28


4 PROCEDIMIENTO
















O


britaacutenica))

donde










donde


M28












5221 Caso general



donde








M28




donde





donde













donde








M28





7 PRECISIOacuteN



72 Repetibilidad


73 Reproducibilidad


M28


Apeacutendice A

Figura 1


Figura 2 Figura 3

M28


Apeacutendice B

Figura 1



M28


ANEXO XI




2 EQUIPO









3 REACTIVOS












B


ANEXO XII


VIacuteRGENES

M28





M26










M26




Cocido o quemado

















M28














Frutado mdash


Frutado verde mdash









M32













M26



5 SALA DE CATA


6 ACCESORIOS








mdash escupideras

M32














M26






72 Catadores




M26








M26





















M26














M29

















M26








2 p







M32


Figura 1



Atrojadoborras


Avinadoavinagrado

aacutecidoagrio



Rancio






Frutado

Color verde Maduro

Amargas

Picante



Fecha

Comentarios

M28


Apeacutendice


Mediana






p






n 100 acirc





CV r frac14 s auml

Me Uuml 100

M26








Bibliografiacutea









(9) ISOIEC 1702505

M20 __________

M19 __________

M26


ANEXO XV


11 Material








mdash desecador



12 Reactivo


2 MODO DE OPERAR




22 Toma de muestra




24 Presecado


B





















B








S Uuml 100




32 Repetitividad



B


ANEXO XVI


1 OBJETO


2 DEFINICIOacuteN




3 PRINCIPIO


4 REACTIVOS










5 MATERIAL






7 PROCEDIMIENTO



B


Cuadro 1


menos de 5 300 g

5mdash 20 100 g

21mdash 50 040 g

51mdash100 020 g

101mdash150 013 g

151mdash200 010 g














siendo



B





B


ANEXO XVII


1 OBJETIVOS


2 APLICACIOacuteN


3 FUNDAMENTO


4 INSTRUMENTAL




44 Rotavapor




Nota 1





M11


5 REACTIVOS







Nota 3



Nota 4





Nota 5





M11


6 METODOLOGIacuteA



Nota 6






Nota 7



Nota 8


M11
















Nota 9





M11







M32 Nota 10


M11


Figura 1


M11





Figura 2


M11


ANEXO XVIII


ECN 42

1 OBJETO




3 PRINCIPIO


4 MEacuteTODO


41 Instrumental









419 Rotavapor




M25





42 Reactivos







425 Lana de vidrio
















M25

















442 Procedimiento









M25
















PM P moles S frac14

sup S PM S


PM Po


PM O moles L frac14

sup L PM L


PM Ln















M25
































10 000



10 000


10 000

M25




10 000


10 000


10 000



LLL






PoPoPo










FA P S Po O L Ln

PM 2564 2845 2544 2825 2804 2784


100 30 10 750 100 10

M25



moles P = 10

2564 frac14 003900 moles P

moles S = 3

2845 frac14 001054 moles S

moles Po = 1


moles O = 75

2825 frac14 026549 moles O

moles L = 10

2804 frac14 003566 moles L

moles Ln = 1





035821 moles frac14 10887


035821 moles frac14 2942


035821 moles frac14 1097


035821 moles frac14 74116


035821 moles frac14 9955


035821 moles frac14 1002

total moles = 100















M25


















P 16004 0653

S 4325 0177

Po 1015 1262

O 68526 85296

L 9204 11457

Ln 0927 1153

Suma 1000 1000


LLL

PoPoPo










10 000 frac14 0 09706 mol LLL



M25




10 000 frac14 002141


10 000 frac14 001069

003210 mol PoLL


10 000 frac14 000092


10 000 frac14 000002

000094 mol SLnLn


10000 frac14 000236


10 000 frac14 000118

000354 mol PoPoL



10 000 frac14 000374


10 000 frac14 000012


10 000 frac14 000375

000761 mol PPoLn


10 000 frac14 014556


10 000 frac14 014555


10 000 frac14 014544

043655 mol OLLn


10 000 frac14 003399


10000 frac14 000111


10 000 frac14 003397

006907 mol PLLn

M25



10 000 frac14 001605


10 000 frac14 001603


10 000 frac14 001604

004812 mol PoOLn

ECN 42 = 069512 mol TG











M25


Figura 1




M25


Figura 2


a



b



M25


Figura 3


(a)



(b)



M25


ANEXO XIX






2 PRINCIPIO



PARTE 1




2 PRINCIPIO


3 INSTRUMENTAL










4 REACTIVOS


M32














5 PROCEDIMIENTO






M32




PARTE 2




2 PRINCIPIO


3 INSTRUMENTAL










381 Bomba binaria







M32


4 REACTIVOS























M32














PARTE 3




M32


2 PRINCIPIO


3 INSTRUMENTAL










4 REACTIVOS










M32
















M32


























M32












donde









M32




donde






ΣA T Uuml 100

donde







donde






M32


Apeacutendice


















M32














M32




M32




M32


ANEXO XX


capilar

1 OBJETO


2 PRINCIPIO


3 APARATOS













36 Rotavapor

37 Horno de mufla


M23



4 REACTIVOS














M23



ADVERTENCIA



49 Gases auxiliares



ADVERTENCIA


5 PROCEDIMIENTO



M23





















M23


















M23


siendo









A s m

siendo











M23


Figura 1



Leyenda








M23



Figura 2


Leyenda

1 ndash Metilo C 16

2 ndash Etilo C 16


4 ndash Metilo C 18

5 ndash Etilo C 18

6 ndash Escualeno



B ndash Ceras


M23


Figura 3


Leyenda


2 ndash Metilo C 18

3 ndash Etilo C 18

4 ndash Escualeno



B ndash Ceras


M23


Figura 4


Leyenda











M23


Apeacutendice A




M28 __________

M23


01991R2568 mdash


032001 mdash 128

M25

ANEXO XXI







origen


miento

Informacishyoacuten


Paraacuteshymetros


En caso afirmativo







Modificado por

Rectificado por


Artiacuteculo 1

Artiacuteculo 2

Artiacuteculo 2 bis

Artiacuteculo 3

Artiacuteculo 4

Artiacuteculo 6

Artiacuteculo 7

Artiacuteculo 7 bis

Artiacuteculo 8

Artiacuteculo 9

Artiacuteculo 10

ANEXOS IacuteNDICE












Apeacutendice A

Apeacutendice B




ANEXO XV





Apeacutendice



ANEXO XXI

Este texto es exclusivamente un instrumento de ...

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