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Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biológicas - Vol. XXXI Números 1 y 2: 33-49, octubre 2010

Estandarización de la metodología para el conteocromosómico en especies del género Polylepis

en el EcuadorQuija-Lamina, P1., Segovia-Salcedo, C1, 2., Jadán, M.1 & Proaño K.1

1Departamento de Ciencias de la Vida, Carrera de Ing. en Biotecnología, ESPE, Sangolquí, [email protected]

2Universidad de Florida, Departamento de Biología, Florida Museum of Natural History(FLMNH), Gainesville, USA

Recibido: 2010-05-21, aprobado: 2010-08-30

RESUMEN.- El género Polylepis incluye 26 especies de árboles y arbustos quehabitan desde Venezuela hasta la parte central de Argentina. Los bosques de Poly-lepis constituyen en su mayor parte la vegetación natural de los Andes con unafauna y flora sumamente especializada y de gran importancia ecológica. En las últi-mas décadas, varios intentos de clarificar su filogenia a través de técnicas molecu-lares no han tenido éxito. Debido posiblemente a la frecuente hibridización; otrashipótesis se centran en la poliploidía, la cual no ha sido analizada con éxito, debi-do a la falta de protocolos en el área de citogenética. Esta investigación presentapor primera vez una metodología estandarizada para la visualización y conteo decromosomas, así como para la obtención de fases celulares en las especies delgénero Polylepis. Se utilizaron meristemos radiculares y botones florales paraestandarizar la metodología. Adicionalmente, fueron llevados a cabo estudios delciclo celular para determinar la hora apropiada de recolección de las muestras. Lasplacas preparadas permitieron obtener los números cromosómicos de las especiesde Polylepis presentes en el Ecuador, los cuales revelan por primera vez la presen-cia de poliplodía dentro del género, proceso muy importante dentro de la diversifi-cación de las especies.

PALABRAS CLAVE: Ciclo celular, conservación, cromosomas, índice mitótico,Polylepis

ABSTRACT.- The genus Polylepis include 26 species of trees and shrubs distrib-uted from Venezuela to central Argentina. Polylepis forests are mostly natural veg-etation of the Andes with a highly specialized fauna and flora and they have greatecological importance. In recent decades, several attempts to clarify their phyloge-

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ny through molecular techniques have not been successful. One of the possible rea-sons could be the frequent hybridization, other hypotheses focus on the presence ofpolyploidy, phenomenon that has not been tested with success, due to lack of pro-tocols for conducting cytogenetic studies. This research has developed for the firsttime a standardized methodology for visualization and chromosome counting ofgenus Polylepis as well as data about the cellular phases. Root tips and flower budswere used to standardize the methodology. Additionally cell cycle studies were car-ried out to determine the proper time of collection of samples. The plates preparedallowed to obtain the chromosome numbers of Polylepis species present inEcuador, which revealed for the first time, the presence of polyploidism in thisgenus, a very important condition in the diversification of the species.

KEYWORDS: Cell cycle, conservation, chromosomes, mitotic index, Polylepis

INTRODUCCIÓN.- El géneroPolylepis incluye 26 especies de árbo-les y arbustos que habitan desde losAndes Venezolanos hasta la parte cen-tral de Argentina (1). En el Ecuadorencontramos ocho especies que perte-necen a los diferentes complejos evolu-tivos desde el grupo basal Sericea hastael más derivado: el complejo Incana(2). Los bosques de Polylepis formanparte de la vegetación natural de losAndes con una fauna sumamente espe-cializada. Sin embargo, la distribuciónactual de éstos ha sido disminuida demanera alarmante por procesos antro-pogénicos como agricultura, pastoreo,tala, quema e introducción de especiesexóticas (2).

En las últimas décadas varios inten-tos de aclarar su filogenia a través de téc-nicas moleculares se han visto truncadospor la falta de resolución en los análisis

a nivel de especies (3). Una de las posi-bles razones de esta falta de claridadevolutiva se puede centrar en la frecuen-te hibridización entre las especies de estegénero, por razones naturales (polen quepuede viajar largas distancias) y por reu-bicación de poblaciones debido a activi-dades humanas (reforestación no tecnifi-cada; 4, 5, 6). Otras hipótesis se enfocanen la existencia de poliplodía en el géne-ro, la cual no ha podido ser analizadacon éxito (7).

Los estudios cromosómicos son unaherramienta importante y básica para elanálisis intra e inter-poblacional, evolu-tivo y sistemático, permitiendo diferen-ciar especies morfológicamente simila-res o con un estatus taxonómico incier-to. Los conteos cromosómicos mitóti-cos y meióticos son usados comúnmen-te para determinar hibridización, rela-ciones entre especies, análisis de cario-

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tipos y translocaciones (8), ademásconstituyen la vía más directa para esta-blecer niveles de ploidía (9, 10).

De igual manera, el análisis delciclo celular presenta varias aplicacio-nes como eliminar el factor del azar yutilizar criterios objetivos para la tomade las muestras vegetales y esclarecerlas causas que determinan el rol de lapoliploidía (11, 12). Además, permitedeterminar la mejor hora del día para laprefijación, en función del número decélulas en división y de los componen-tes del índice mitótico (11). Estos datosconstituyen las herramientas principa-les para aumentar la efectividad de losmétodos químicos y físicos para lavisualización de cromosomas en espe-cies vegetales (13).

En el caso del género Polylepis, losestudios cromosómicos son relevantespara aclarar las hipótesis sobre poliploi-día, así como supuestos de hibridiza-ción y apomixis (3). Sin embargo,dichos estudios no se han podido reali-zar debido a la falta de una metodologíaestandarizada que permita la visualiza-ción de cromosomas metafásicos.

Simpson (16) menciona, en su estu-dio sistemático, que los ensayos no die-ron resultados específicos, y Kessler(15) observó números cromosómicosde 80 en muestras de raíces meristemá-ticas en tres especies de Polylepis, peroel conteo exacto no fue posible debidoal tamaño reducido de los cromosomasque fácilmente se pueden confundir con

partículas del colorante y suciedades(3). Posteriormente, Schmidt-Lebuhn etal., aseguran que debido al tamaño delos cromosomas y a la dificultad dedeterminar metafases en este género, esvirtualmente imposible obtener conteoscromosómicos (14).

La presente investigación presentauna metodología estandarizada que per-mite la visualización de fases celularesy cromosomas metafásicos en las espe-cies del género Polylepis, presentes enel Ecuador. Método que nos permitiráobtener por primera vez los númeroscromosómicos para el género Polylepis,datos sumamente importantes y básicospara aclarar las hipótesis sobre su ori-gen y evolución.

Además, los estudios del ciclo celu-lar en P. pauta y P. incana permitiránrealizar análisis genéticos comparativospara la determinación de mecanismoscitológicos como la duplicación somá-tica y la no reducción de los gametosque inducen poliploidía en plantas (17).

MATERIALES Y MÉTODOSMuestras de meristemo radicular y

botón floral de las especies del géneroPolylepis fueron obtenidas para estan-darizar la metodología para la obten-ción de cromosomas metafásicos, asícomo células en diferentes fases delciclo celular. Diferentes variaciones enlos procesos de pretratamiento, fija-ción, hidrólisis, tinción y preparaciónde placas, en base a las características

Estandarización de la metodología para el conteo cromosómico en especies del géneroPolylepis en el Ecuador

de los cromosomas observados en ensa-yos previos fueron utilizadas para laestandarización de la metodología.

Recolección de las muestrasvegetalesSe utilizaron muestras de meriste-

mos radiculares (1-2 cm de longitud)y ovarios de botones florales de lasespecies de género Polylepis las cua-les fueron colectadas durante losmeses de junio y julio del 2008, endiferentes localidades de los páramosecuatorianos.

Se tomaron datos de localizacióngeográfica, localidad, especie y tipo demuestras de cada una de las poblaciones.Se colectaron plántulas de 5–10 cm ymuestras de botones florales (Tabla 1).Las plántulas fueron transportadas con

bloques de tierra hasta los invernaderosdel laboratorio de la Carrera de Ingenie-ría en Biotecnología de la Escuela Poli-

técnica del Ejército, en donde fuerontransferidas a macetas con un sustratoapropiado para su enraizamiento con lafinalidad de obtener muestras de meris-temo radicular en forma regular y encantidades adecuadas para la estandari-zación de la metodología.

Los botones florales encontradosfueron pretratados en el sitio de colec-ción y transportados en un contenedorque permitía mantenerlos a temperatu-ras bajas. En el laboratorio, después delproceso de fijación y lavado, las mues-tras se almacenaron a -20 °C en etanolal 70% hasta su posterior uso.

Estudio del ciclo celularLos estudios del ciclo celular fueron

realizados en muestras de meristemoradicular en dos especies del género

Polylepis: P. pauta de la localidad dePapallacta, Páramo de Guamaní y P.incana de los Illinizas. El cálculo del



Especie Localidad Puntos GPS Muestra

P. incana Illinizas S 00 º12' 8.56''W 68 º40' 24.65'' Plántulas,Botón floral

Papallacta S 00 º19' 01.0'' W 78 º13' 28.6'' Plántulas,Botón floral

El Ángel, Potrerillos N 00 º48' 31.6'' W 77 º58' 31.9'' PlántulasMojanda N 00 º08' 18.9'' W 78 º5' 17.4'' Plántulas,

Botón floralP. pauta Papallacta S 00 º20' 41.5'' W 78 º12' 2.0'' Plántulas,

Botón floralMojanda N 00 º08' 07.4'' W 78 º15' 22.5'' Plántulas,

Botón floral

Tabla 1. Muestras de las especies del género Polylepis con sus detalles de localidad, puntos de localizacióngeográfica (GPS) y tipo de muestra colectada.

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tamaño la muestra “n” o número decélulas en mitosis a analizar por cadahora de colección, fue determinadomediante la fórmula del tamaño mues-tral para la estimación de la proporciónpoblacional (18).

Donde la expresión correspon-de al percentil de la ley normal estándarcuyo valor es de 1.96 para un 95% deconfianza en el estudio, S2 es la varian-za de la proporción, su valor es de 0,25,ya que la varianza se maximiza con unaproporción poblacional estimada de0,5, debido a la ausencia de estudiosprevios en el género y E2 es el errormáximo permitido del 5%.

Para calcular el tamaño muestraltotal a analizar que incluye células eninterfase, se realizó una prueba pilotoen P. incana con un total de 3.751 célu-las de las cuales 1.332 eran mitóticas,esto nos indica que por cada 2,82 célu-las una se encuentra en mitosis. En con-secuencia, se debe multiplicar 2,82 porel tamaño muestral mitótico (385),determinado mediante la ecuación paraobtener el número de células totales quese deben contabilizar por cada hora decolección para obtener resultados conel 95% de confianza, el resultado es de1.085 células. Los datos tomados de laprueba piloto demuestran que se puedeencontrar en promedio 6,76 células en

mitosis por cada imagen proyectada,por lo que para lograr obtener las 385células mitóticas y por ende las 1.085células totales, 60 imágenes diferentesfueron analizadas.

Preparación de las placas. Para elestudio del ciclo celular se colectaronde tres a cuatro raíces meristemáticasde 1 a 2 cm de longitud directamente enel fijador Carnoy (etanol:ácido acético1:3; 19), cada 30 minutos, desde las7:30h hasta las 18:00 h. Después dehidrolizar con HCl (ácido clorhídrico)1N durante 25 minutos a 60 °C y teñircon aceto-carmín al 1% durante almenos tres horas a temperatura ambien-te, se prepararon las placas para suobservación.

Recopilación de datos. Fueron pre-paradas al menos tres placas, para exa-minar un total de 60 imágenes (20 porcada placa). Se anotaron las frecuenciasde interfases, profases, metafases, ana-fases y telofases encontradas en cadaimagen y se capturaron aquellas dondese observaron las mejores células encada fase. Las microfotografías fuerontomadas con una cámara fotográficadigital de 20 MPX adaptada al micros-copio invertido marca LOMO con unaumento de 1.040 X.

Análisis de los datos. Los cálculosdel índice mitótico (IM) y los índices defases (IF), parciales y totales se llevaron

S2a/2n=

Z

E

2

2

2

2a/2Z




a cabo mediante las ecuaciones utiliza-das por Matos & Molina (1997) (22) entrabajos realizados con Aloe vera.

PretratamientoMeristemo radicular. Una vez

conocida la o las horas apropiadas parala recolección de las muestras, se colec-taron meristemos radiculares limpiosde 1 - 2 cm de longitud en microtubosque contenían los diferentes agentesantimitóticos, permitiéndonos variartanto la concentración, como la tempe-ratura y el tiempo de aplicación para laestandarización del proceso (Tabla 2).

También fueron probadas temperaturasbajas durante 4 horas antes de usar losagentes químicos.

Botones florales. Las muestrasfueron pretratadas a diferentes horasdel día en los sitios de colección en 8hidroxiquinolina 2mM y agua heladadurante 24 horas a 4 °C (20, 19),razón por la cual no se determinó lahora de colección.

FijaciónMeristemo radicular. Se usaron

diferentes soluciones de fijación: ácidoacético, etanol (1:3; 26) ácido acético,cloroformo, etanol (1:3:6; 19) y meta-nol, ácido propiónico, cloroformo(6:3:2; 21). Los meristemos radicularesdespués de varios lavados con agua

IM= x100

x100

No. células en mitosis

No. células totales

IF=No. células en fase

No. total de células en mitosis

Tabla 2. Agentes inhibidores de la mitosis, con sus detalles de variación en la concentración, tiempo y tem-peratura utilizados para estandarizar el proceso de pretratamiento en muestras de meristemo radicular.

Agente Tratamiento

Concentración Periodo Temperatura

Agua helada 24 horas 4 ˚C48 horas 0 ˚C4 horas

8-hidroxiquinolina 2mM 3 horas 4 ˚C

4 horas RT*

5 horas24 horas

1 hora RT más 24 h a 4 ˚C

Colchicina 0,2 % 1 hora RT0,5 % 2 horas

3 horas

*RT, Temperatura ambiente (16 – 18 °C).

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destilada fueron fijadas en dichas solu-ciones ensayándose diferentes tiempos:4, 21, 22, 23, 24 y 48 horas, a diferen-tes temperaturas: 4 ºC y a temperaturaambiente. En caso de no usarlas inme-diatamente, luego de la fijación se repi-ten los lavados y se preservan en alco-hol al 70% a -20 ºC, hasta su posterioruso.

Botones florales. Las muestras pre-tratadas en el lugar de colección, fueronfijadas en una solución de etanol, ácidoacético (3:1; 19) durante 24, 48 y 72horas a 4°C. Posteriormente fueronlavadas para ser preservadas en etanolal 70% a -20 °C, hasta su posterior uso.

HidrólisisMeristemo radicular. Después de

lavar la muestra se utilizó una hidrólisiscon HCl 1N a 60 °C (11), ensayandodiferentes tiempos (5, 10, 15, 20, 25,30, 40 y 60 minutos).

Botones florales. Fueron retiradosdel etanol al 70% y disectados para obte-ner los ovarios y estambres (Figura 1),los cuales fueron lavados para someterlosal proceso de hidrólisis en HCl 1N a 60°C (11), ensayando diferentes tiempos (5,10, 15, 20 y 25 minutos).

Tinción y preparación de placas.Fueron probados diferentes colorantes:aceto-carmín/orceína 1%, aceto-car-mín/orceína 2%, propiónico car-

mín/orceína 1%, lacto-propiónico orce-ína 2% (26, 27) y Reargent Shiff (10).Después de hidrolizar y lavar la mues-tra, se colocó el colorante en el micro-tubo, durante diferentes periodos detiempo: 1, 2, 3 y 24 horas, a temperatu-ra ambiente y 60 °C. Una vez teñidaslas muestras, se prepararon las placascon la técnica convencional del aplasta-do o squash (11).

RESULTADOS Y DISCUSIÓNEstudio del ciclo celular. El estu-

dio microscópico de las células mitóti-cas e interfásicas en meristemos radica-les permitió conocer cuantitativamenteel proceso de división mitótica en lasdos especies del género Polylepis: P.incana y P. pauta cuyos resultados yanálisis son presentados por primeravez para estas especies.

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Figura 1. Botón floral de P. incana disectado paraobtener el ovario y los estambres (2.5X).


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La determinación del ciclo celular yde la hora mitótica constituyen lasherramientas principales para aumentarla efectividad de los métodos químicosy físicos usados en la preparación yvisualización de los cromosomas enespecies vegetales, así como la elimina-ción del azar, utilizando criterios objeti-vos para la toma de las muestras. Deigual manera permiten determinar lapresencia de poliploidía como un pro-ceso de diversificación de las especiespropias de zonas montañosas (13, 11).La información obtenida en esta inves-tigación en relación al ciclo celularofrece la oportunidad de investigar pro-cesos de poliplodía en este género, nosolamente en las especies ecuatorianassi no a nivel regional.

Para la estimación del ciclo mitóti-co en las dos especies del géneroPolylepis, P. incana y P. pauta, fueron

analizadas un total de 55 200 células,discriminadas en células en interfase ycélulas en mitosis. En base a la eva-luación de un período de 12 horas delos índices de fase (IF) e índice mitó-tico (IM) parciales y totales, se esta-bleció que la mejor hora para la prefi-jación de las muestras de meristemoradicular en P. incana, está compren-dida entre las 08:00h y 08:30h(IM=57,50 %). Durante las demáshoras los IM fueron bajos, fluctuandoentre el 9 % (14H30) y 28 % (11H00)de la población celular (Figura 2). Esposible observar que el porcentaje deprofases ocupa la mayor parte de lapoblación celular en división, espe-cialmente entre las 08:00h y 08:30h.Durante las otras horas, las fases res-tantes (metafases, anafases y telofa-ses) se presentan en pequeña propor-ción, en forma irregular (Figura 3).

Quija-Lamina, P., Segovia-Salcedo, C. Jadán, M. & Proaño K.

Figura 2. Secuencia del ciclo celular en P. incana de los Illinizas en un periodo de recolección de12 horas

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La mejor hora para la prefijación delas muestras de meristemo radicular en P.pauta, está comprendida entre las 8:00hy 9:30h (IM = 43,08 – 49,00 %), obser-vando un pico mayor a las 8:30h (IM =53,92%). Durante las demás horas los IMfueron bajos, fluctuando entre el 14 %(17:00 h) y 37 % (10:00 h) (Figura 4).

De igual manera, es posible observarque el porcentaje de profases ocupa lamayor parte de la población celular endivisión, especialmente entre las 08:00hy 10:00h. Durante las demás horas, senota una acumulación leve de telofases.Las fases restantes (metafases y anafa-ses) se presentan en pequeña proporción,en forma irregular (Figura 5).

Figura 3. Secuencia de los índices de fase en P. incana de los Illinizas en un periodo de recolección de12 horas.

Figura 4. Secuencia del ciclo celular en P. pauta del Páramo de Guamaní - Papallacta, en un periodo de reco-lección de 12 horas.


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Las horas de colección obtenidaspara las dos especies son consistentescon otras investigaciones donde el mayornúmero de células en mitosis se observanen las primeras horas de la mañana hastaaproximadamente las 11:00h. Sin embar-go, es importante tomar en cuenta que elmomento del día en el cual las células semultiplican con mayor rapidez varía deuna especie a otra (22).

La curva de la Figura 2 nos permiteasumir un valor medio de 2 horas paraun ciclo de división celular completo enP. incana, por lo que la duración delciclo mitótico en base a la evaluaciónde los índices de fase (IF) e índicesmitóticos (IM) totales es de 29 minutos,de los cuales 18 minutos son ocupadospor la profase; cuatro minutos por lametafase, tres minutos por la anafase ycuatro minutos por la telofase. En P.pauta la Figura 4 nos permite asumir unvalor medio de tres horas para un ciclo

de división celular completo, por lo quela duración del ciclo mitótico en base ala evaluación de los IF e IM totales, esde 53 minutos, de los cuales 35 minutosson ocupados por la profase; seis minu-tos por la metafase, cuatro minutos porla anafase y siete minutos por la telofa-se. En las Figuras 6 y 7 se muestranfotografías de fases mitóticas observa-das en las especies evaluadas.

Se destaca un mayor tiempo para lascélulas en interfase, aunque una vez ini-ciada la actividad mitótica, las célulaspermanecen más tiempo en profase, laanafase dura un lapso más corto, lo queconcuerda con Raven, Evert & Curtis(1976) (23) quienes señalan que lasfases de la mitosis son variables en lon-gitud siendo la profase la más larga y laanafase la más corta. En este sentido,las frecuencias de las fases mitóticaspermanecen dentro de los rangos nor-males reportados (23, 24).

Figura 5 Secuencia de los índices de fase en P. pauta del Páramo de Guamaní-Papallacta, en un periodo derecolección de12 horas.

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La variación presentada tanto en lahora de colección como en la duracióndel ciclo mitótico y sus distintas fasesen P. incana y P. pauta, se debe posible-mente a la propiedades celulares decada especie y a su distinta reacciónante la acción de factores ambientales(11), probablemente se obtendrán resul-tados diferentes en las mismas especiesbajo diferentes condiciones.

En las dos especies se registra cier-ta irregularidad en el curso del ciclocelular, caracterizado por un mayorporcentaje de profases dentro de lapoblación celular en división y a unaacumulación de telofases en P. pauta,indicándonos la presencia ciclos irregu-lares. La alternancia de interfases nor-males con mitosis irregulares en otrasespecies analizadas como oca y olluco,constituyen uno de los probables meca-nismos de poliploidización (11).

Estandarización de la metodolo-gía. La metodología que se logró estan-darizar para el conteo cromosómico uti-lizando muestras de meristemo radicu-lar y botón floral, para las especies delgénero Polylepis, no se basó en un pro-tocolo específico, sino sobre la base delas características de los cromosomasdescritos por Kessler (1995) (28) entres especies de Polylepis: P. neglecta,P. triacontandra, P. tarapacana, quienobservó numerosos cromosomas (2n =82) de tamaños sumamente pequeños,los que se confundían con las partículasde colorante (3).

Pretratamiento de las muestras.Otro factor crítico, a más de la determi-nación de la hora de colección apropiada,para mejorar los resultados del procesode pretratamiento, es el tipo de agenteinhibidor de la mitosis que se utiliza (25).

Figura 6. Algunas de las fases mitóticas observadasen P. incana de los Illinizas. (a) Interfase, (b) Profase,(c) Metafase, (d) Anafase, (e) Telofase. Barra repre-senta 5 µm.

Figura 7. Algunas de las fases mitóticas observadasen P. pauta del Páramo de Guamaní. (a) Interfase, (b)Profase, (c) Metafase, (d) Anafase y (e) Telofase.Barra representa 5 µm


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En los pretratamientos con agentes quí-micos no se obtuvo buena condensacióny dispersión de los cromosomas como seobservó al utilizar temperaturas bajaspositivas de 4 °C (Figura 8). La utiliza-ción de frío o calor, previo al tratamientocon sustancias químicas, ayuda a deses-tabilizar los microtúbulos. Además, eltratamiento previo de meristemos radicu-lares con frío induce la acumulación decélulas en metafase (26) condición dese-able para la realización de pretratamien-tos con agentes químicos. Sin embargo,en este caso la utilización de frío noayudó a mejorar la acción de la 8-hidro-xiquinolina. Por lo que se sugiere utilizarcomo pretratamiento, agua destilada a 4°C durante 24 horas, la cual se recomien-da cuando las especies a estudiar poseennumerosos cromosomas (19), como es elcaso del género Polylepis.

Se deben usar períodos de al menos24 horas y no más de 26 horas en aguadestilada a 4 °C, ya que la longitud delos cromosomas se acorta considerable-mente (19) y las células se destruyen.Los periodos cortos (cuatro horas) tam-poco arrojan buenos resultados, no seobserva destrucción celular pero tam-poco cromosomas claros e individuales.Con la utilización de la temperatura decongelación, se destruyen las células ysus componentes. Para las muestra debotones florales funcionan bien los pre-tratamientos utilizados en meristemoradicular.

Fijación de las muestras. Las tresmezclas de fijación, ensayadas durante24 horas a 4 °C proporcionaron buenosresultados en la interrupción de los pro-cesos vitales de la célula sin dañar suestructura (4). Se prefirió usar Carnoy(ácido acético:etanol 1:3; 19) ya que lasotras mezclas contenían cloroformo, elcual es un químico nocivo para la saludy el medio ambiente.

Hidrólisis de las muestras. El pro-ceso de hidrólisis con HCl 1N a 60 °Cfue estandarizado para las muestras demeristemo radicular, ovario y estambre,obteniéndose diferentes períodos detiempo, los cuales dependen de la natu-raleza del tejido (20). En las muestrasde ovario y estambre se obtuvo unabuena separación de las células sin des-trucción de las mismas con cinco y diez


Figura 8. Cromosomas metafásicos en muestras demeristemo radicular de P. microphylla de la localidadde Achupallas. Barra representa 5 µm.

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minutos respectivamente, tiempomenor al utilizado con raíces meriste-mos radiculares (25–30 minutos), debi-do probablemente a que tanto el tejidodel ovario como el del estambre sonblandos y están protegidos por las otrasestructuras florales externas a diferen-cia de la raíz que está expuesta directa-mente al suelo.

Tinción de las muestras. Lasuperposición, la pobre coloración yel tamaño extremadamente pequeñode los cromosomas son factores quehan limitado los estudios citogenéti-cos (27). Sin embargo, el uso deaceto-carmín o aceto-orceína ha faci-litado la obtención de buenos resulta-dos (28) en las especies donde se hanobservado dichos factores como es elcaso de las del género Polylepis (3).En el presente estudio, de todos loscolorantes probados, sólo el uso delaceto-carmín al 1% permitió obteneruna tinción adecuada de los cromoso-mas, fases celulares y citoplasmasclaros en las muestras de meristemoradicular y ovario.

La partículas del colorante quepueden confundirse con los cromoso-mas han impedido también obtenerconteos exactos en ensayos anterio-res en algunas especies de Polylepis(15, 16), ésta dificultad fue superadausando el colorante en baja concen-tración (1%) y filtrándolo, cada vezantes de utilizarlo, aunque esto impli-

caba un mayor tiempo de tinción, elcual se reduce calentando las mues-tras en el colorante. Cabe recalcarque concentraciones mayores delcolorante destruyen el tejido. Unavez teñidas las muestras pueden per-manecer en el colorante, debido a queel ácido acético del mismo actúa tam-bién como fijador (20), pero se debenevitar dejarlas durante largos perio-dos de tiempo ya que las partículasdel colorante tienden a sedimentaracumulándose en el tejido. Se reco-mienda mantener las muestras enrefrigeración para evitar la prolifera-ción de bacterias.

Números Cromosómicos. Los cro-mosomas son reconocidos por suimportancia en los estudios taxonómi-cos y evolutivos. El número cromosó-mico, teniendo en cuenta dos variables:el número básico y el nivel de ploidía,constituyen datos relevantes para laresolución de problemas taxonómicos yla comprensión de las tendencias evolu-tivas (29, 11). A pesar de esta importan-cia, los estudios cromosómicos comple-tos en las especies del género Polylepisno han sido realizados, se han intentadoconteos cromosómicos desde 1979 sinresultados específicos (3).

En el presente trabajo, se presentanpor primera vez los números cromosó-micos (2n) de la especies del GéneroPolylepis presentes en el Ecuador(Tabla 3), iniciando de esta manera el


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Especie Muestra Localidad No No. Cromosomas 2ncélulas

P. incana Meristemo El Ángel 2 38(1), 40(1) 38-40radicular Illinizas 23 38(11), 39(5), 40(4), 41(1), 42(2) 38-42

Papallacta 25 39(2), 40(7), 41(9), 42(7) 39-42

Ovario Papallacta 15 40(7), 41(3), 42(5) 40-42

P. pauta Meristemo Papallacta 1 71(1) 71RadicularOvario Papallacta 25 67(9), 68(2), 72(2) 73(2), 67 - 83

74(1) 75(1), 76(3), 77(1),78(1), 80(1), 81(1), 83(1)

Mojanda 12 70(6), 71(1), 72(1), 73(1), 70 - 8475(1), 78(1), 84(1)

P. sericea Ovario El Ángel 8 37(5), 39(2), 40(1) 37 - 40Fierrourco 25 39(10), 40(6), 41(7), 42(2) 39 - 42Yanacocha 9 59(2), 64(1), 66(1), 10(1), 59 - 77

71(1), 74(1), 76(1), 77(1)

P. microphylla Meristemo Achupallas 25 70(3), 71(1), 72(1), 73(2), 70 - 82radicular 74(4), 75(2), 76(1), 77(5),

78(2), 79(2), 82(2)

P. weberbauri Meristemo Zhud 10 37(9), 42(1) 37 - 42Radicular

Ovario Zhud 16 37(7), 38(1), 39(4), 40(2), 37- 4241(1), 42(1)

P. lanuginosa Meristemo Zhud 25 38(2), 39(8), 40(5), 41(5), 38 - 42radicular 42(5)

P. reticulata Meristemo Oyacachi 15 87(2), 94(1), 96(1), 104(3), 87 - 118radicular 108(2), 109(2), 111(1), 114(1), 118(2)

Ovario Soldados 11 36(5), 38(1), 39(1), 40(2), 36 - 4241(1), 42(1)

P. racemosa Meristemo Oyacachi 25 69(9), 70(4), 71(3), 72(2), 69 - 80Radicular 74(3), 76(2), 78(1), 80(1)

Ovario Oyacachi 2 72(1), 77(1) 72 - 77

Tabla 3. Números cromosómicos somáticos de las especies del género Polylepis con detalles de muestra uti-lizada, localidad y número de células metafísicas analizadas.

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conocimiento cromosómico de estegénero y contribuyendo a su delimita-ción taxonómica. La variación presen-tada en los números cromosómicosdentro de las especies y entre poblacio-nes de la misma especie nos confirma,por primera vez, la presencia de poli-ploidía en el género en poblacionesnaturales, lo cual estaría indicando laimportancia de los cambios cromosó-micos numéricos en la diversificaciónde las especies de este género, posible-mente debido a causas, entre ellasmedioambientales, que aún no estánmuy claras.

Teniendo esta diversidad denúmeros cromosómicos y niveles deploidía, es obvio que tanto la aneu-ploidía como la poliploidía han juga-do un rol importante en la evolucióndel género Polylepis, así como enotros, lo cual lo convierte también enun género atractivo para el análisis dedichos eventos (25 ). En el futuro,sería interesante estudiar los cromo-somas de un mayor número de pobla-ciones, establecer las relaciones entrelos niveles de ploidía y su localiza-ción geográfica, hábitat, etc. Además,sugerir modelos evolutivos para lasespecies de este género cuyo rol eco-lógico es fundamental para el ecosis-tema en donde habita. En la Figura 8se presenta una fotografía de cromo-somas metafísicos de P. microphylla,resultado de la utilización de la meto-dología antes descrita.

AGRADECIMIENTOS

Este estudio se realizó gracias alapoyo económico del Proyecto Pára-mo Andino, Tropical Developmentand Conservation Program y la Escue-la Politécnica del Ejército con su pro-grama de iniciación científica ESPE2008.

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