Establecimiento de mtodos de monitoreo para autofagia en arroz revela reciclamiento atufagico de cloroplastos y plastidos de raz durante limitacinLa autofagia es un proceso intracelular que conduce a la degradacin lisosmica vacuolar o componentes de citoplasma en eucariontes.Establecimiento de mtodos adecuados para controlar la autofagia es un paso clave para descubrir su funcin en los organismos, como la levadura (Saccharomyces cerevisiae), mamferos, y Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), en el que se han encontrado protenas kda podra ejercer para serreciclado por la autofagia. Cloroplasto reciclado se ha pronosticado en funcin de removilizacin de nutrientes cada vez ms rganos ollenado de grano en los cultivos de cereales. Aqu, a desarrollar nuestra comprensin de la autofagia en el sector de los cereales, hemos establecido mtodos de vigilancia parala autofagia cloroplasto de arroz (Oryza sativa). Hemos generado arroz transgnico de protena fluorescente (FP) OsAuTophaGy8 (OsATG8) como la autofagia los marcadores. FP-ATG8 seales fueron entregados en la vacuolar lumen en clulas vivas de races y hojasprincipalmente como vesculas autofgicas correspondiente a rganos. Este fenmeno no se observ en la adicin de-, un inhibidor de la autofagia, o en un dispositivo ATG7 mutante knock-out. Los marcadores de los cloroplastos estroma estroma, FP yFP-etiqueta Rubisco se entregaron por parte de un tipo de cuerpo llamado autofagia Rubisco de cuerpo (RCB) de la misma manera.RCB extirpado en produccin fue suprimida por hojas de sacarosa o de la luz. La liberacin de FP causado porla autofagia de ruptura depende de FP-etiqueta Rubisco fue inducida en senescencia aceleradadeja oscurecido de manera individual. En las races, es decir se realizaron ambos RCB plstidos de toda mediacin y organelos tipos de autofagia. Por lo tanto, nuestros nuevos mtodospara controlar la autofagia autofagia directamente mostr degradacin hoja de cloroplastos y raz plstidos en plantas de arroz ysu induccin en energa limitacin.Autofagia es la principal via que facilita la degradacion en mas de componentes intracelulares en eucariotas . macotofagia la cual de ahora en adelante llamaremos autofagia es un proceso bn caracterizado mediante el cual citoplasmas y organelas son secuestrados por una vesicula de doble membrana llamada autofagosoma y transportada a la vacuola en levaduras y plantas o a lisosomas en animales. la formacin del autofagosoma empieza con la generacin de un secuestramiento de membrana llamada fagoforo o membrana de aislamiento el cual se elonga o se alarga para englutir una porcin del citoplasma incluyendo organelas lo cual eventualmente forma al autofagosoma. La membrana externa del autofagosoma se funde con la membrana vacuolar/ lisossomica y la estructura en la membrana llamada el cuerpo atufagico es degradada por hidrolasas dentro de la vacuola/lisosoma. Los eventos moleculares durante la formacin del fagosoma han sido bn caracterizados en los brotes de levaduras atraves de la identificacin de genes de autofagia (ATG). Aislamiento y caracterizacin de la transferencia de ADN knock-out insercionales Y ARN de interferencia Los mutantes de Arabidopsis (Arabidopsis thaliana)ATG Ortlogos han revelado que los acontecimientos moleculares para AUTOFAGOSOMA Formacin en la levadura son en su mayora conservados en plantas .Anlisis de numerosos autofago deficientes Mutantes de Arabidopsis han demostrado la importancia dela autofagia para reciclaje de nutrientes en las plantas, similar a la de supapel en la levadura y los animales. Casi todos los mutantes atgmostraron sensibilidad a nitrgeno o carbono-condiciones limitadas:su supervivencia en medio libre de nitrgeno o en la oscuridadse ha reducido considerablemente en comparacin conlas plantas plantas de tipo salvaje o no alteradas no mutadas.Los cloroplastos son la principal fuente de reciclaje de carbono y de nitrgeno en plantas dado que la mayoria de nutrientes en las plantas estn distribuidos en los cloroplastos, tanto asi q las protenas cloroplasticas forman del 75 al 80% del total de nitrgeno en hojas. Rubisco que es la encima encargada de la fijacin de co2 en fotosntesis es particularmente predominante y da cuenta del 50% de la protena total soluble en hojas. Previamente hemos reportado que hay vas autofagicas para protenas cloroplasticas incluyendo rubisco. Durante la fase temprana de la natural envejecimiento de la hoja o durante limitacin de energa una porcin de las protenas del estroma es parcialmente transportada a la vacuola por un tipo de cuerpos autofagicos llamados rubisco llamados cuerpos que continen rubisco. En la fase final del envejeciemiento inducido a la hoja atraves de deplexion de azcar los cloroplastos en su totalidad o enteros son transportados dentro de la vacuola por un proceso autofagico llamado clorofagia. Esta via de autofagia de cloroplastos probablemente contribuye a la utilizacin de carbn y nitrgeno a travs de toda la planta en arabidopsis.La removilizacion de nutrientes q se inicia con la degradacin de protenas cloroplasticas es un factor determinante en la productividad de plantas de cultivo. En cereales como arroz y cebada las protenas cloroplasticas son degradadas durante el envejecimiento de la hoja y el nitrgeno liberado es removilizado a rganos en crecimientos y finalmente almacenados dentro de la semilla. Este nitrgeno removilizado da cuenta de 45% del nitrgeno total de hoas nuevas en arroz. La contribucin de nitrgeno removilizado para el crecimiento del grano ha sido estimado cerca del 50 al 90% en arroz trigo maz aunque es variable dependiendo de tcnicas de cultivo y condiciones de crecimiento particularmente cuando se usa fertilizacin con nitrgeno. A pesar de la importancia de la degradacin en esta removilizacion hasta la fecha no hay evidencia directa que involucre autofagia en la degradacin de protenas cloroplasticas en cereales. Adems, a diferencia atg7 mutantes el retrotasposon stou 17 es knokcut de arroz demuestra un fenotipo de esterelidad masculina indicando q hay algn tipo de diferencia en los roles de autofagia dependiendo de la especie de planta hasta la fecha la mayora de los estudios de autofagia en plantas diferentes de arabidopsis se han enfocado en anlisis transcrripcional o observacin morfolgica. Para demostrar la relevancia del reciclaje atofagico en cereales y para investigar cualquier rol potencial q difiera de aquellos en arabidopsis en monitoreo directo de la progresin de actividad de autofagia en clulas vivas o tejidos intactos es esencial. Un paso vital del estudio de autofagia en levaduras mamferos y arabidopsis fue el estableciemiento de mtodos basados en protenas fluorecentes para mionitorizacion de autofagia en las cuales protenas fucionadas que consisten de protenas fluorecentes y protenas de autofagia o protenas de localizacin especifica en organelas; todas estas fueron usadas no solo como marcadores visuales para autofagia bajo microspia de fluorecencia sino tambn como marcadores bioqumicos de autofagia como inmunoblotting.

Las protena de fusin fpatg8 son actualmente consideradas los marcadores de autfagia mas confiables en mamferos y arabidopsis. Para la autofagia de cloroplastos en arabidopsis protenas fluorecentes localizadas en el estroma de los cloroplastos o rubisco marcado con preoteinas fluorecentes son no solo marcadores visuales para cuerpos contenedores de rubisco sino tambn buenos indicadores de la progresin de autofagia durante el envejeciemiento de la hoja. A pesar de este progreso el monitoreo de autofagia basado en protenas fluorecentes ha sido limitado a arabidopsis o clulas cultivadas.En este estudio visualizamos autofagia de cloroplastos de hojas y plastidos de raz en clulas vivas de plantas de arroz usando FP-OsATG8 fusion protena, otra protena de fusin que tiene como blanco el estroma del cloroplasto y protena de rubisco marcadas con protena fluorecente y tambn n OsATG7 knockout mutant. Estos mtodos permitieron establecer la importancia del reciclaje autofagico de protenas de cloroplasto es conservado en hoas con limitaciones de energa en arroz y tambn revelo caractersticas unas de degradacin autofagica de plastidos.

ResultadosVisualizacin en Planta de la autofagia en ArrozGFP-AtATG8a fue previamente utilizado con xito para visualizarla progresin de la hambruna inducida por autofagia enclulas de cultivo arroz Aqu, nos propusimos desarrollaren planta la autofagia tcnicas de visualizacinpara arroz ,por produccin de arroz transgnico que expresa FP-OsATG8 protenas de fusin. Las bsquedas anteriores de arroz ADN genmico o ADN complementario Bases de datos: identificado varios posibles ortlogos De levadura y Arabidopsis genes ATG Entre los que se encontraban cinco o siete candidatos OsATG8s. Porque hubo cierta incertidumbre acerca de estos candidatos, Con algunos carecen de adnc correspondiente informacin o que se produzcan diferencias de adnc datos entre los dos informes anteriores, Comenzamos por minado de datos datos OsATG8 cDNA, la clonacin y secuenciacin directa. Se confirma la secuencias de OsATGa a OsATG8d.En visualizacin de plantar de autophagy enarroz. A, representacin Esquemtica del mRFPOsATG8ao construccin de la fusin de mRFP-OsATG8d. Fusinprotenas que consisten en mRFP y OsATG8a oOsATG8d se expresaron bajo el control delPromotor de 35 de CaMV. B, Visualizacin de autophagyen races de arroz. Races frescas de arroz que expresa mRFPOsATG8ao los mRFP-OsATG8d se extirparon yobservado inmediatamente (0 h) o despus de tratamiento por 6 hcon 1 mM concanamycin un sin (+concA) ocon 5 mM (+concA+wort) wortmannin. La reginaproximadamente 5 mm de puntas de la raz se observaron porLSCM. Imgenes de la fluorescencia de RFP e imgenes DICobtenido simultneamente se muestran. Barras = 10 mm.

Comparado con identidad alta desecuencias de aminocidos deducidas entre OsATG8a aOsATG8c, la secuencia de aminocidos deducida de OsATG8dera ms similar a ese de AtATG8i (Fig. SuplementalS1B). El C-terminal residuo de Gly en ATG8 se exponea travs de la hendidura por ATG4 proembroman durante el alargamientode la membrana autophagosomal. OsATG8d no haceposea una cola del aminocido suplementaria ro abajo de Gly.Generamos el arroz transgenic que expresa monomericprotena fluorescente roja (mRFP)-OsATG8a o mRFPOsATG8dfusiones bajo el control de la Coliflorvirus mosaico (CaMV) promotor de 35 (Fig. 1A). Cuandolas races de las plantas transgenic se extirparon e inmediatamenteobservado por exploracin del lser confocal microscopia(LSCM), la fluorescencia RFP se descubrien el cytoplasm y ncleo (Fig. 1B). Tratamiento conconcanamycin A, un inhibidor de vacuolar H +- ATPase,es usado para facilitar la observacin de cuerpos autophagicaumentando el pH interior en el lumen vacuolaras encontrado en AtATG8h y AtATG8i (SuplementalFig. S1B; Doelling et al., 2002; Hanaoka et al., 2002). Aconsidere las consecuencias de estas diferencias de la secuencia,elegimos OsATG8a y OsATG8d para producirlas construcciones de la fusin FP-OsATG8.Cuando extirpadolas races de las plantas transgenic se incubaroncon concanamycin un en solucin sin nutrientes para 6 hen la oscuridad, observamos mucha exposicin de vesculasRFP fuertes hacen seas y la extensin de la seal de RFP dbil enel rea central de las clulas de la raz (Fig. 1B). En visualizacin de plantar de autophagy enarroz. A, representacin Esquemtica del mRFPOsATG8ao construccin de la fusin de mRFP-OsATG8d. Fusinprotenas que consisten en mRFP y OsATG8a oOsATG8d se expresaron bajo el control delPromotor de 35 de CaMV. B, Visualizacin de autophagyen races de arroz. Races frescas de arroz que expresa mRFPOsATG8ao los mRFP-OsATG8d se extirparon yobservado inmediatamente (0 h) o despus de tratamiento por 6 hcon 1 mM concanamycin un sin (+concA) ocon 5 mM (+concA+wort) wortmannin. La reginaproximadamente 5 mm de puntas de la raz se observaron porLSCM. Imgenes de la fluorescencia de RFP e imgenes DICobtenido simultneamente se muestran. Barras = 10 mm.

Adems, las estructuras de la vescula eran visibles a imgenes de contraste de interferencia diferencial (DIC). Wortmannin es un inhibidor de phosphatidylinositol 3-kinases que puede inhibir autophagicprocesos en plantas de Arabidopsis. La adicin de wortmannin durante concanamycin Ael tratamiento suprimi la movilizacin de seales de RFP enel lumen vacuolar en arroz que expresa mRFP-OsATG8a omRFP-OsATG8d (Fig. 1B). Estos resultados indican estoFP-OsATG8 puede ser usado para visualizar la progresin deautophagy en clulas vivas de plantas de arroz.1. GEN KNOCKOUTDefiniciones web1. El bloqueo de genes, tambin llamado inactivacin gnica o desactivacin gnica es una tcnica gentica que consiste en suprimir la expresin de un gen especfico en un organismo, sustituyendo el gen original en su locus por una versin modificada del mismo.

- La movilizacin de la seal de mRFP-OsATG8 en el vacuole no esobservado en OsATG7 PLANTA CON GEN KNOCOUT. Races de KNOCOUT OsATG7(Osatg7-1) y tipo salvaje correspondiente (OsATG7 + / +) plantasla expresin mRFP-OsATG8d se extirp e incub para 6 h con1 mM concanamycin (+concA). Imgenes de la fluorescencia de RFP y DIClas imgenes obtenidas simultneamente se muestran. Barras = 10 mm.

La figura 3. Visualizacin de autophagy en mesfiloclulas que contienen chloroplasts en arroz. Primeras hojas deel arroz de mRFP-OsATG8d-expressing se extirp yobservado inmediatamente (0 h) o despus de incubacin para20 h en 1 mM concanamycin un sin (+concA) ocon 5 mM (+concA+wort) wortmannin. Fluorescencia de RFPparece verde, y clorofila auto -la fluorescencia aparece la magenta. Barras = 10 mm.

-Visualizacin de degradacin Autophagic de Chloroplastspor RUBISCO en arroz:

Movilizacin Autophagy-dependiente deprotenas de stromal en el vacuole por RCBs en arroz. A,Representacin esquemtica que ilustra la construccinpara expresin CT-sGFP. Protenas de la fusin que consistendel pptido de trnsito (TP) de OsRBCS2 y sGFPse expresaron bajo el control de los 35 de CaMVpromotor. B, Visualizacin de RCBs en hojas de arroz.La primera hoja de arroz CT-sGFP-expressing se extirpy observado inmediatamente (0 h) o despus de incubacinpara 20 h en la presencia de 1 mM concanamycin Asin (+concA) o con 5 mM (+concA+wort)wortmannin. C, la acumulacin de RCB no se observaen fbricas de golpe de gracia OsATG7. Primeras hojas de Osatg7-1 ola planta del tipo salvaje correspondiente (OsATG7 + / +) expresinCT-sGFP se extirparon e incubaron para 20 hen la presencia de 1 mM concanamycin (+concA).La fluorescencia de GFP parece verde, y clorofilala autofluorescencia aparece la magenta. A imgenes combinadas,las seales que se superponen parecen blancas. Barras = 10 mm.-Produccin de RCB en hojas de arroz extirpadas es una respuesta aLimitacin de la energa causada por oscuridad