Espectrofotometria

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

ESCUELA DE POST GRADO

MAESTRIA EN TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS

FACULTAD DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

CURSO INSTRUMENTACIÓN DE ANÁLISIS DE ALIMENTOS - TEORIA

ING. ALBERTO JUAN TORRES FLORESIng. Santos Jaimes Serkovic

LIMA 2006

http://tumi.lamolina.edu.pe/UNALM_PRINCIPIOS%20BIOACTIVOS/images/esc.jpg


Í N D I C E Página

ESPECTRO ELECTROMAGNÉTICO 3

RELACIONES ENTRE LA ABSORCIÓN DE LUZ Y COLOR 4

ABSORCIÓN DE ENERGIA 5

TIPOS DE LUZ 6

LEYES FUNDAMENTALES DE LA FOTOMETRÍA 8

LEY DE BERNARD 9

ESPECTROFOTOMETROS 10

ESQUEMA SIMPLE DE UN ESPECTROFOTOMETRO 11

SISTEMA DE MONTAJE EMPLEANDO PRISMAS 14

RED DE DEFRACCIÓN O EMPARALLADO 15

TIPOS DE ESPECTROFOTOMETROS 19

ESQUEMAS DE INSTALACIÓNa) ESPECTROFOTOMETRO DE EMISIÓN DE LLAMA 22

b) ESPECTROFOTOMETRO DE ABSORCIÓN ATÓMICA 23

ESPECTROFOTOMETRO DE LECTURA DIRECTA 24

ESPECTROFOTOMETRO DE DOBLE HAZ 25

CROMATOGRAFÍA 26

CLASES DE CROMATROGRAFÍA 32

I CROMATOGRAFÍA DE PAPEL 33

II CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA 35

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA 38

3.3 TÉCNICAS DE SEPARACIÓN 40

CROMATOGRAFÍA DE GASES 41

ESQUEMA DE INSTALACIÓN DE UN APARATO PARA CROMATOGRAFÍA DE GASES. 42

III SISTEMA HPLC 44

M. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 2


ESPECTRO ELECTROMAGNÉTICOREGIONES QUE LO FORMAN

RAYOS GAMMA



RELACIONES ENTRE LA ABSORCIÓN DE LUZ Y COLORREGIÓN DE LONGITUD ONDA.

La luz visible representa una parte muy pequeña del espectro electromagnético.Se extiende de 380 a 780 mu (milimitra)

La región ultravioleta se extiende de 185 m u hasta la visible.La longitud de onda mas cortas son consideradas como la región mas lejana (o de vacío) ultravioleta.

Unidades m u = 10-7 mm = mu 10

Aº = milimitron = 1 millón de m. 1000 (1 mil millonésimo de m)

La onda electromagnética varía entre cuatrilloncico de metro y 100, 000 km de longitud.



ABSORCIÓN DE ENERGIA

Cuando un haz de energía choca contra una sustancia le pueden suceder varias cosas.

- Ser absorbida- Ser reflejada- Ser transmitida- Ser dispersada- Ser refractada

La longitud del trayecto óptico es “b”

Efecto de Luz de haz sobre un objeto:

1. Puede pasar a través de la materia habiendo solo una pequeña absorción y por lo tanto poca perdida de energía se mide % de luz transmitida.

2. La dirección de la propagación del haz puede ser alterado por :o Reflexióno Refaccióno DifracciónO puede haber dispersión por la presencia de alguna materia particular suspendida.

3. La energía radiante puede ser total o parcialmente absorbida.La absorción implica una transparencia de energía al medio y esto esta relacionado a las características de las estructuras moleculares.

En la figura:

Po es el haz de luz incidente

Po es la energía no absorbida después de pasar por la muestra o recipiente (energía transmitida)

Transmitancia = P = T Po


P

b

P

DISPERSION


Definición:Viene a ser la relación entre el poder radiante transmitido por una muestra al poder radiante incidente.

El poder radiante transmitido se puede medir usando detectores (fotoceldas, fototubos)

Absorbancia.- Es el logaritmo a la base 10 del recipado de la transmitancia.

A = Log 10 1

T

A = Log 10 Po P

TIPOS DE LUZ

El campo de la luz visible se extiende desde 380 a 780 m u de longitud onda.

De acuerdo al tipo de luz se perciben los colores

1. Luz del día (luz indirecta) (fuente C)2. Luz del Sol (fuente B) 3. Luz de lámpara de tungsteno (artificial) (fuente A)

GraficandoSe aprecia que estas fuentes aportan diferentes longitudes onda y los colores dependen de la longitud / .

La función de la fuente de luz es de provocar la luz INCIDENTE de suficiente intensidad para la medición.



La fuente de luz mas usada es la lámpara de tungsteno.

El inconveniente es de que emite su principal porción de energía en la región cercana al infrarrojo del espectro solo el 15% cae dentro del espectro de luz visible.

Temperatura operacional 2854º K.

Se tiene espectroplometros de absorción UV – visible emplean 2 tipos de lámparas, las halógenas y de dentrecio las halógenas cubren el espectro de luz visible, las de denterio se emplea para medidas en la zona del ultravioleta.

Las lámparas no emiten luz monocromática, es decir radiación de una longitud onda única ya que la luz es policromática, se debe seleccionar la longitud onda en que interese trabajar el monocromador permite obtener una luz monocromática.

Un cuerpo es incoloro cuando transmite pero no refleja (no refleja ni absorbe Ejemplo Agua)

Un objeto negro absorbe todos los tipos de radiación

Un objeto blanco refleja todos las longitudes onda visible.

Cuando observamos una manzana, esta absorbe de determinadas longitudes onda y refleja las ondas mas grandes o sea del color rojo.

La onda reflejada es la que el ojo humano capta.

Se debe tomar en cuenta:



1. La composición de la fuente luminosa2. Características físicas y químicas del objeto3. sensibilidad del ojo.

LEYES FUNDAMENTALES DE LA FOTOMETRIA

2 LEYES1. La Ley de Bourguer o de Lambert (1760)2. La Ley de BERNARD (1852)

1. LEY DE BOURGUEREstablece que cuando un haz de luz monocromático previamente dispuesto en paralelo entra a un medio absorbente la velocidad de disminución de su poder radiante con respecto a la longitud de trayecto de luz a través de un medio absorbente b, es proporcional al poder radiante del haz. Esta proporción es geométrica.

La capa absorbe la 1 de la luz = H 2 2

Capa B absorbe la 1 con la 1 precedente = H 2 2 4

luego (derivada parcial)

Integrando y usando logaritmos de base 10 y haciendo

P = P0 cuando b = 0

Se obtiene :


(1/4)


Esto quiere decir que el poder radiante de una luz no absorbida decrece espontáneamente, conforme al espesor del medio absorbente aumente aritméticamente.

2. LEY DE BERNARD.-Establecer que el poder radiante de un haz de una radiación monocromática paralela decrece en una forma similar a como aumenta la concentración del constituyente absorbente de la luz.

2.303 Log. Po = K’C P

C = Concentración

Nota.- Esta ley deja de ser lineal a altas concentraciones, por lo que hay que diluir instrumentos colorimétricos comerciales.

Los instrumentos para fotometría de absorción se clasifica en :

a. COMPARADORES VISUALES.-

Usan como fuente de luz, la luz del día y pasa a través de un par de tubos conteniendo la muestra y el standard.

Se diluye la muestra hasta llegar al color del estándar y se ve la concentración.

Se usa los tubos de NESSIER (50 a 100 ml capa)

Otro método es hacer girar un disco con colores hasta igualar al de la muestra.

B. FOTÓMETRO DE FILTROColorímetro fotoeléctrico

ESPECTROFOTOMETROS


MUESTRA DETECTOR FILTRO

REOSTATO AL GALVANOMETRO

LAMPARA

FOTÓMETROS DE FILTRO (Fig. N°01)


INTRODUCCIÓN

Cada sustancia absorbe energía radiante de una determinada longitud de onda y esto es una característica de todas las sustancias.

Si la luz blanca atraviesa una solución que tiene un compuesto colorado, ciertas longitudes de onda serán absorbidas y otras serán transmitidas, de esta interacción nace el color.

ESPECTROMETRÍA, etimológicamente es la medida de la absorción o transición de la luz.

Cada sustancia (líquido) absorbe o transmite la luz de forma característica generando una curva o espectro espacial que depende de la diferente intensidad con que absorbe la luz a diferentes longitudes de onda.

Esto quiere decir que cada sustancia de un espectro definido de absorción con la luz sea ultravioleta, visible o infrarrojo y gracias a este espectro específico puede ser identificada.

Viene a ser una herramienta especial de ayuda a la bioquímica ya que empleando muestra a concentraciones pequeñísimas (trazas) se puede fácilmente hacer análisis cuantitativo de sus constituyentes que se hallan en la muestra.

Permite también no solo identificar una sustancia y su concentración, sino también su estructura y configuración molecular atómica y nuclear (espectrómetros magnéticos de observancia nuclear, espectrómetrica infrarrojo inorgánico, etc). Sistema HPLC bucrotografía de grases).

En 1941 se usó el primer espectrofotometro del ultravioleta fue un modelo DU-BECKMANN.



ESQUEMA SIMPLE DE UN ESPECTROFOTOMETRO

En la figura se tiene un fotómetro de filtro de lectura directa y de luz simple.

Usa un filtro de absorción o interpretación y solo deja pasar la Longitud onda deseada, para el estudio de su margen varia de 20 a 30m u.

La luz que ha atravesado la muestra se mide como procedimiento por deflexión en un galvanómetro.

La escala del medidor esta en mitades de transmitancia 0 – 100%.

ESPECTROFOTOMETROS

COMPONENETES ESENCIALES DE UN ESPECTROFOTOMETRO .-

1. LÁMPARA

Es la fuente de luz de alta intensidad para efectuar la medición.En los espectrofotometros de absorción UV – visible se utilizará dos tipos de lámpara: halógenas y deuterio.

El 1º abarca la zona de luz visible 250 – 350 m u. la de deuterio de emplea para mediciones de la luz ultravioleta.

Rayo efectivo 200 – 375 m u


A B S O R B I D A(F O T O C E D U L A )

C U B E T A (M U E S T R A D E D IS O L U C I O N )

D IS F R A C T O R(P R IS M A )

S E L E C T O R D E (R E N D I J A )

M O N O C R O M A D O R

L E N T E C O L IM A D O R

F U E N T E L U M IN O S A

REGISTRADOR

DETECTOR

(FOTOCÉLULA)


Si se desea altos niveles de iluminación se empleará lámparas de XENON o vapor de Hg.

Debido al intenso calor que producen deben ser aislados terminantemente para no afectar la muestra Temp. de operación 6000º k

2. MEDIOS DE DISPERSIÓN

Cuando se restringe las longitudes de onda del espectro y se deja pasar solo lo que absorbe el material a medirse, se incrementa notablemente la posibilidad de medición del instrumento.

Para ello se utiliza los filtros.

- FILTROS

La selección apropiada de un filtro es de acuerdo a su pico de transmitancia y el ancho de banda de longitud de onda.

El pico debe de ser el más alto posible y el ancho de la banda que cubre el mas angosto posible.

100%Se tiene: Filtros de gelatina Filtros líquidos Filtros de vidrio coloreados

Debido a que la fuente de luz es de alta temperatura el uso de filtro de gelatina se ha descartado.

Clases de filtro:

a) Filtro de vidrio teñidoSon mejores que los de gelatina, alcanzan un ancho de banda de 35 – 50 m u y pico de trasnmitancia de solo 5-20% (bajo) su trabajo es absorber la longitud onda no deseada.

b) Filtro de Interferencia Se consigue anchos de banda mas estrechos.Consiste en una capa dieléctrica de bajo índice de refracción y transparente entre 2 capas de películas de plata semitransparentes.

La luz incidente ingresa, se refleja de regreso y vuelve entre las películas.


TR

AN

SM

ITA

NC

IA

m u

(Absorbe longitud onda no deseada)


Cuando la frecuencia guarda armonía cuando con T pasa la luz.

Ancho banda 10 – 17 m u Pico de transmitancia 40 – 60%

c) FILTROS DE MULTICAPAS DE INTERFERENCIA

Consta de 5 a 25 capas de lato y bajo índice de refracción dieléctrica obtenidas.

Ancho de banda de solo 8 m u

Pico de transmitancia 60 – 95%

Placa vidrio

Son los filtros mas eficientes y remueve la radiación no deseada por transmisión y reflexión en vez de absorción como las otras.

3. CELIMADOR Viene a ser un lente que convierte la radiación en la luz lo mas paralelo posible y lo enfoca en el monocromador.

4. MONOCROMADOR Las lámparas no emiten luz monocromática, o sea radiación de una única longitud onda.

Por lo tanto es necesario descomponer la luz policromática y seleccionar la longitud onda que interese utilizar.

Esto se logra aplicando un MONOCROMADOR y hay de 2 tipos.

1. Prisma de refracción:Usa un prisma en donde el rayo luminoso que incide sobre el prisma sufre 2 sucesivas refracciones sobre c/u de sus caras.La luz se descompone en sus diferentes longitudes de onda.

Para descomponer la luz visible los prismas de vidrio.


Luz blanca

Película metal


Los prismas de cuarzo o sílice fundido se aplican para la luz U.V.

Mediante una bacteria de giro se puede seleccionar la longitud de onda deseada.

SISTEMA DE MONTAJE EMPLEANDO PRISMAS

1.1 MONTAJE TIPO CORNO

1.2 USO ESPEJO DE LITTROW

i = < de incidencia < Apical = 30°

Rayo Incidente i 90° Superficie de Aluminio

Rojo r refacción

Azult = base del prisma

5.- RED DE DEFRACCIÓN O EMPARALLADO.


800

700

600

500

400

Luz blanca

Prisma Rendija

= < apical

m u

Violeta

Roa

Lente colimación

Prisma

Rendija

Lente Convergente

Fuente luz

ESPECTRO


La dispersión de la luz también puede ser obtenida por medio de una superficie estirada o escalonada.Consiste en un gran numero de estrías paralelas dispuestas en forma escalonada (15000 a 30000 por pulgada) en una superficie de aluminio altamente pálida.

Se prepara con resina epoxica y aluminio.

Esquema de acción de los rayos

i) = < incidencia

) = < reflexión

) = < de escalón

d) = Constante del calor o paso

R1 y R2 son 2 rayos de luz que forman el haz luminoso.

Cuando el rayo luminoso incide sobre la superficie escalonada se observa que el rayo R2 debe ocupar mayor long. que R1 (distancia d sen i)

En cambio a la salida R1 debe ocupar mayor distancia que R2 para una igual longitud d sen

Cuando los rayos están en pase actúan y se combinan en forma constructiva



o sea m / = d (Sen i Sen ) = O donde m = orden de interferencia Si la diferencia d Sen i – d Sen es igual a un múltiplo de m u los rayos están en pase.

Este sistema escalonado en conjunto actúa como un espejo plano (cero orden de interferencia).

Modificado el < pueden ser aplicados para una determinada longitud onda.

Tienen mayor poder de resolución que los prismas y pueden ser usados en todas las regiones del espectro.

Su poder de resolución esta dado por R = M x N

M = N° unidades de ondaN = N° total de escalona por unidad de longitud.

Ejemplo: Un emparedado graduado a 6000 líneas/mm y 15 mm ancho tiene el siguiente poder de relación

R = M x N = 15 cm x 6000 líneas = 9000 Línea cm

En la región del verde / = 5400 Å

Luego el intervalo de longitud onda mas pequeña (que se puede aplicar es:

R = / = 90000 / / = 5 400 = 0.06 Å

90000

Un prisma de vidrio para tener este poder de resolución debería de ser muy grande (base de 75cm No practico).

Antiguamente la mayoría de los monocromadores eran prismas

Actualmente casi todas las redes de reflexión son de emparrillado o gratings.

Ventajas: Son mas baratas de fabrica Se obtiene mayor separación de longitudes de onda Dispersan la radiación en forma lineal

6. RENDIJAS



Como su nombre lo dice se refiere en una pequeña abertura que restringe al haz de luz.Cumple doble función:a) Contribuye a que el haz de luz no diverja y se concentra sobre la

muestra.b) Selecciona una longitud onda de trabajo.

El monocromador descompone la radiación policromática en un continuo de ondas monocromáticas, y la rendija contribuye a que sobre la muestra iniciada solo un pequeño intervalo de frecuencias, lo que varia determinados por la ANCHURA DE LA RENDIJA.

7. RECIPIENTE PARA LA MUESTRA.-

Se utilizan cubetas de vidrio y para la región del U.V. el de cristal de cuarzo (Ojo: el vidrio absorbe la radiación U.V.).

Pueden ser de forma rectangular o cilíndrica

Vienen en tamaño: NORMAL SEMI MICROMICRO de acuerdo al volumen del micro

Se tiene también las CUBETAS DE FLUJO CONTINUO, técnica critica de entrada y de salida, permiten el paso continuado de la disolución, mientras hace la medida.

8. DETECTOR

El rayo transmitido incide en un fototubo. Es un tubo al vacío con 2 electrodos.

La superficie del electrodo negativo es fotosensible por la diferencia de potencial, los electrones se aceleran llegan al electrodo positivo y se establece una corriente en el circuito.

El N° de electrones emitidos por unidad de tiempo dependen de la energía radiante.

Son de mayor eficiencia los tubos fotomultiplicadores.

9. AMPLIFICADOR Y LECTURA

No se dará las características electrónicas de esta etapa de amplificación.

Opera como un medidor o instrumento de lectura.



Los primeros detectores son el ojo humano y las películas fotográficas, consisten en transductores que convierten la energía radiante de una señal eléctrica.

La señal eléctrica de respuesta del detector es directamente proporcional a la potencia radiante P.

Se tienen los detectores de fotones, se les llama detectores fotoeléctricos y los detectores calóricos (trabajan por el calor).

Como Ej. Del Detector de Fotones se tiene la célula fotoeléctrica tipo capa – barrera.

Consiste en un plato Fe(+) sobre el cual esta apoyado en peniconductor (Selenio) y sobre el una capa fría semi transparente de plata (signo)

La energía radiante sobre el semiconductor, excita los electrones en la interfase plata – selenio los cuales son liberados y pasan al electrodo colector (-).

Se genera una pequeña fuerza electromotriz la que puede ser registrada en su galvanómetro.

La muestra esta en solución (líquida).

Los cubitos de vidrio se emplean en la región de la luz visible las direcciones para la región ultravioleta, las de sal depondrá en la región del infrarrojo.



TIPOS DE ESPECTROFOTOMETROS

ESPECTROFOTOMETROS UV - VISIBLE ESPECTROFOTOMETRO DE ABSORCIÓN ATÓMICA ESPECTROFOTOMETRO INFRAROJO POR TRANSFORMADA DE

FOURIA. ESPECTROFOTOMETRO DE FLUORESCENCIA

ESPECTROFOTOMETRO DE ABSORCIÓN ATÓMICA (1957 EN AUSTRALIA)

Su funcionamiento al principio es semejante al espectrofotómetro de absorción de sustancia en disolución, excepto que la muestra a analizarse debe ser volatilizada por una llama.

Se relaciona mucho su función con el de los FOTOMETROS DE LLAMA, pero hay diferencias sustanciales.

Se explica a continuación:

Se suministra una llama de temperatura regulada para volatilizar la muestra, de acuerdo a la mezcla y combustible que se emplea (gas aluminizado, propano, butano, cuetileno).



Se consiguen temperaturas desde 1700 a 4550 ºC. La mezcla se posee generalmente en líquida mediante un atomizador en cantidad medida y constante.

La función del sistema óptico, es reunir la luz de la parte mas intensa de la llama (se ayuda con el espejo cóncavo). Se selecciona una determinada longitud, vida y se mide la intensidad de los átomos ACTIVADOS (ionizados).

b) ESPECTROFOTOMETRO DE ABSORCIÓN ATOMICA.A diferencia del anterior mide la absorción por medio de los átomos vaporizados NO IONIZADOS de parte la luz emitida por una lámpara catódica hueca.

En la sustancia vaporizada se encuentran ionizados sólo una pequeña fracción de los átomos. La mayor parte son los NO IONIZADOS, sobre estos efectúa la medición el instrumento, resultando por consiguiente mucho mas sensible que la FOTOMETRIA DE LLAMA.

Tiene asimismo ventajas que se reconocen lo siguiente:

b.1Su costo es relativamente bajo comparado a otros tipos de espectrofotómetros. Su costo es algo superior al de fotómetro de llama, que es un instrumento simple.

b.2 Las lecturas instrumentales son directamente proporcionales a la concentración.

b.3Analiza separadamente mediante su lámpara cataliza empiece un elemento, identificándolo y cuantificándolo.

b.4Es apreciable su análisis de productos alimenticios para la determinación de trazas de ciertos alimentos metálicos.

Nota: Estos instrumentos determinan la presencia de elementos metálicos, pero no como se encuentran combinados en la muestra.

Principio de funcionamiento.

El método se basa en la medición de la luz absorbida a longitud onda de una línea de resonancia dada por los átomos NO IONIZADOS o oxidados de una sustancia.

A la temperatura normal de una llama de O2 – acetileno y a la temperatura de 2 800º K solamente una fracción muy pequeña de todos los átomos es excitada (ionizada).

El 99% permanece no excitada.Se logra medir el nivel de concentración de los átomos de la llama.El instrumento puede ser de simple haz o de doble haz luminoso.Ejemplo: El espectrofotómetro de absorción atómica.PERKIN – ELMER Modelo 303 de doble haz luminoso.



FUNDAMENTOS.La espectrofotometría de absorción atómica se funda en el principio de KIRCHOFF, de absorción por resonancia, según el cual los átomos absorben radiaciones de la misma longitud de onda que puedan emitir.

En la absorción atómica se usan una fuente independiente de luz monocromática, específica para cada elemento a analizar y que se hace pasar a través de vapor de átomos midiéndose posteriormente la radiación absorbida.Se usa la alta temperatura de la llama como fuente de excitación en donde los espectros son sencillos y los resultados cuantitativos que se obtienen pueden ser reproducibles.Los espectros son sensibles por que el nivel de excitación (ionización) es bajo al emplearse un nivel bajo de energía de la llama.Esto da por ventaja que no hay interferencia de otras bondades de mayor nivel de energía.

El nivel bajo de la llama no es problema ya que su función es solamente atomizar la muestra y formar un vapor de átomos sin excitar.Por ello se puede aplicar a mayor número de elementos que la FOTOMETRÌA.

La lámpara catódica actúa como fuente de radiación



ESQUEMA DE INSTALACIÓN

a) ESPECTROFOTOMETRO DE EMISIÓN DE LLAMA. (FOTOMETRO DE LLAMA).



b) ESPECTROFOTOMETRO DE ABSORCIÓN ATÓMICA Se tiene en la figura 2 esquemas (a) y (b)Dada la estrecha relación entre ambos es necesario una comparación.La sensibilidad del espectrotol - de absorción atómica es del 99% y corresponde al número de átomos no excitados.

Ambos métodos son complementarios.

En el gráfico (b) se ha señalado una fuente de radiación.Esto elimina la señal de fotometría de llama y recoge solamente la de absorción, la que se modifica con su cátodo hueco (Chopple).

Funciones de la Ciama.1. Grafica la muestra que ingresa al estado líquido 2. Descompone los compuestos moleculares del elemento a analizar

las moléculas señaladas o átomo individuales.3. Ioniza o excita estos átomos o moléculas.

Espectrofotómetros de HAZ SIMPLEDE DOBLE HAZDE DIODOSDE DOBLE LONG. ONDA Mod. PERKIN-ELMER



ESPECTRO FOTÓMETRO DE LECTURA DIRECTA

APLICACIONES.

A. ESPECTROFOTOMÉTRO DE LUZ VISIBLE.

Análisis cuantitativo. Determinación de cantidades inferiores al 1% de cationes, de grupos funcionales.

Estudios de equilibrios, determinación de formulas complejas y de caracteres de equilibrio.

Estudios cinéticos Otros: Determinación del almidón, azúcares reactores, proteínas,

V, T, C, en alimentos.

B. DE ULTRAVIOLETA.

Determinación desustancias orgánicas (hidrocarburos, vitaminas, esteroides, etc). Proteínas (Biuret), ácidos nucleicos. Separación analítica son frecuentemente necesarios antes de la medida espectrofotométrica.

Identificación de moléculas orgánicas aromáticas como los aminoácidos (tirosina, fenilolanina)

Algunas sustancias inorgánicas así como el plomo en huesos, fluor en mezclas de fluor y oxigeno, etc.

Amplia apliación en el campo de la medicina, metabolitos de la sangre, tejidos, caña, etc.



ESPECTROFOTOMETRO DE DOBLE HAZ

Smith y J Feinbug. Cromatografía sobre papel y capa fina.Dana Abbott. Introducción a la cromatografía



CROMATOGRAFÍA

En 1906 el biólogo ruso TSWETT utilizó una columna de vidrio en forma de tubo relleno con sulfato de Ca, ese polar y con una valirida de salida en la parte superior.Usó como muestra una mezcla de pigmentos de plantas y por la parte superior iba agregando eter de petróleo.Observó la aparición de una serie de bandas horizontales de distintos colores que corresponden a los componentes de los pigmentos.A partir de esto se usó el termino CROMATROGRAFÍA.

Esta separación no tiene que ver nada con el calor de los compuestos sino con la diferente afinidad de ADSORCIÓN de los pigmentos hacia el material base y ESO.

CASO:Los de MENOR GRADO DE ADSORCIÓN avanzan mas rápido a lo largo de la columna.En 1 944 GORDON Y MARTÍN describieron los cromatógrafos de papel, se tiene:

De columna abierta (papel extendido) De capa fina (se tiene un soporte de placa de vidrio)

En 1952 se descubrió la cromatografía de gases.Un gas reemplaza al disolvente líquido, por lo que la separación se realiza en una columna cerrada.En química y Biología es frecuente separar, aislar, purificar e identificar los componentes de mezclas complejas. Ejemplo: Los amino ácidos de una pectina. Dado que algunos a. a. son muy parecidos entre sí, es muy difícil la separación por cristalización fraccionada o métodos químicos por lo que se usa la CROMATOGRAFÍA.

CROMATOGRAFÍA.Definición. Es una técnica de separación de una mezcla de solutos, basándose en la diferencia de velocidad con que se mueve cada uno de los solutos a través de un medio poroso, arrastrándose por un disolvente en movimiento.

La cromatografía hizo posible el análisis químico de materias orgánicas, complejas que por otros métodos era casi imposible.

La cromatografía en papel liso posible la separación e identificación de cantidades de un soluto del orden de 0.1 u g. (un microgramo es la millonésima parte del gramo), lo normal es de 1 a 50 u g.

CROMATOGRAFÍA EN PAPELEs la técnica de separación e identificación de sustancias químicas mediante un disolvente que se mueve sobre hojas o tiras de papel filtro.



Técnica:a) Cromatografía ascendenteb) Cromatografía descendentec) Separación sencilla

Cromatografía unidimensionalX OrigenSF Creato del disolvente.

Línea que alcanza al final del proceso.

Se tiene una tira de papel filtro En el origen se deposita una gota de laSolución a separar de deja secar la gotaQueda una mancha el extremo próximo de la Mancha en el papel se introduce en un disolvente(Sin tocar a la mancha) Ej. (a)Por capilaridad el disolvente va subiendo a través del papel al avanzar disuelve y arrastra las sustancias de la mancha que por lo general se mueve a distinta velocidad se deja actuar por un tiempo determinado se seca el papel.Se observan las sustancias separadas que tienen color.A esta técnica se le llama cromatografía MONODIMENSIONAL.



CLASE INSTRUMENTAL DE ANALISIS DE ALIMENTOS – TEORÍA

16/05/06

Pregunta

¿Por qué habiendo partido las sustancias desde un mismo punto aparecen

como manchas separadas y con distancias recorridas diferentes?

Explicación.

Cuando el disolvente se mueve sobre la mancha de las sustancias actúan 2

tipos de fuerzas opuestas:

a) Fuerzas propulsoras

b) Fuerzas retardantes

a) Fuerzas propulsoras, actúan apartando las sustancias de su punto de

origen y desplazándolas en la dirección del flujo de disolvente.

Se tiene 2 fuerzas:

a.1El flujo del disolvente.

Cuando fluye el disolvente arrastra con él todas las materias disueltas,

sino fuera por las fuerzas de retardo se podría lograr que el disolvente y

se una con él (esto cuando es soluble).

Si fuera insoluble se quedaría en el origen.

Ejemplo: azúcar y acetato de etilo.

a). Solubilidad

Viene a ser una fuerza diferencial ya que no todas las sustancias tienen

la misma solubilidad de cualquier disolvente.

En igualdad de condiciones cuanto mas soluble sea una sustancia con

mayor rapidez se moverá a lo largo del papel y por lo tanto se alejarían

mas de los menos solubles.



Se elige disolventes en base a conseguir los mejores efectos

diferenciadas en la solubilidad de las sustancias a separar.

Como ningún disolvente puede producir las diferencias mismas de

solubilidad, se acude al uso de 2 disolventes con diferentes propiedades.

El segundo se emplea al girar 90° el papel y se tiene la cromatografía

BIDIMENSIONAL.

b). Fuerzas retardantes. Son fuerzas que trata de impedir el movimiento de

las sustancias.

Se tiene:

b.1Adsorción.

Ejemplo: Una esferita de vidrio sobre una superficie abierta con melaza.

Retarda su avance, se tiene que se cubre con polvo adsorve muchos

gases. La celulosa también tiene propiedades adsorventes.

La adsorción es una propiedad reversible y la celulosa irá frenando

gradualmente la mayor parte de sustancias del disolvente a medida que

esta caída sobre la marcha.

La adsorción también es una fuerza diferencial, ya que hay sustancias

que son adsorvidas con mas fuerza que otros. La mas fuertemente

adsorvidas se irán quedando atrás.

b.2 Reparto

En y sobre el papel filtros de apariencia seca (6-12% humedad).

Definición

Adsorción: Adherencia a la superficie.

Absorción: Introducción de una sustancia en el cuerpo de otra.

Ejemplo: agua en esponja.

Se tiene el carácter del disolvente circulando por el papel filtro y la

celulosa contenida en el mismo papel filtro.

Si una sustancia es soluble a dos disolventes no mezclables y es

expuesto a ambos, se repartirá entre ellos.

La cantidad de sustancia que se cuente en cada disolvente dependerá

de la relativa solubilidad del soluto.



El grado de reparto una vez conseguido el equilibrio se le conoce como

coeficiente de reparto o razón de distribución.

El agua que forma parte del papel filtro esta firmemente adherido en las

fibras de la celulosa, el cual esta formado por un mismo es sustancia de

celdillas microscópicas.

El agua se halla estacionaria en estas celdillas y cada una puede ser

considerada como un diminuto “tubo”.

El disolvente avanza sobre estos “tubos”, recoge por reparto parte de la

sustancia disuelta en el agua del tubo y va depositando parte de ella y

por reparto en los siguientes tubos.

A medida que avanza el proceso se repite una y otra vez.

Como el soluto recogido por el disolvente en movimiento va siendo

disuelto continuamente al papel, se tiene que retardará su avance.

Este retardo esta en relación con el coeficiente de reparto de cada

soluto.

La constante R, esta dado por el movimiento relativo de una sustancia

con respecto al disolvente.

Como en algunos casos al frente del disolvente sale fuera del papel es

mas conveniente emplear el movimiento de la sustancia con respecto a

un estándar (similar químicamente).


Distancia recorrida por la sustanciaR = ___________________________________

Distancia recorrida por el disolvente

Distancia recorrida por la sustanciaRx = ___________________________________

Distancia recorrida por el estándar X


En la cromatrografía de reparto, separación de una mezcla entre la fase móvil

(disolvente) y la estacionaria (soporte), la celulosa y la del gel de sílice, actúan

como soporte del agua.

La celulosa es un polímero de glucosa, posee una gran cantidad de grupos:

hidróxido (-OH) y una microestructura muy complicada (2 clases: fibrosa y

microgranular).

Cuando se desea que no haya fenómeno de adsorción se emplea la celulosa

para la separación de las sustancias solubles de agua.



CLASES DE COMATROGRAFÍA .

1. Cromatrografía líquida – Liquido

Usa de base celulosa o gel de sílice en forma de tira de papel, capa fría o

columna.

2. Cromatrografía de gas – Liquido.

Si dispone un líquido sobre un sólido y hay flujo de gas en sistema.

3. Cromatrografía de filtración sobre el gel.

Ejemplo. Dextramo que usados en aleiado contenido de grupos de

hidróxido tiene mucha afinidad con el agua, por lo que se hincha en su

contacto, formando un gel semitransparente.

La sustancia de tamaño molecular menor. Se le usa en la determinación de

pesos moleculares.

4. Cromatrografía de adsorción. Se usa la diferencia de comportamiento

en la adsorción, deserción de sustancias contenidas en un disolvente

móvil sobre un sólido estacionario, para la separación de los

componentes de una mezcla.

5. Cromatografía gas – sólido.

El disolvente es un gas.

6. Cromatografía de intercambio ionico. Se emplea materiales

especiales de estructura, pesos e insolubles. Estos contienen: grupos

reactivos que están asociados a iones.

Se emplea en la separación de sustancias ionicas orgánicas o inorgánicas.

Se usa resinas, geles y celulosas de intercambio iónico.



I. CROMATOGRAFÍA DE PAPEL

Emplea tiras u hojas de papel WHATMAN N° 1 ó N° 3.

OPERACIÓN.

1.1Preparación de muestras.

Las muestras se aplican sobre el papel en forma de solución. Para ello los

sólidos han sido disueltos en una pequeña cantidad de disolvente

adecuado.

Las sustancias puras se aplican directamente.

En los tejidos biológicos es necesario hacer una purificación preliminar

debido al nivel de componentes; proteínas o sales e impurezas.

Las sustancias no deseadas se pueden superar por varios métodos.

Ejemplo: Los lípidos en los disolventes orgánicos.

Las proteínas con alcohol.

Las sales con reseñas de intercambio iónico o por electrolesis.

Al final se tiene muestras con tipos de moléculas mas homogéneas.

1.2Aplicación de muestras sobre el papel

Se traza con un lápiz una línea paralela al lado por donde se va

comenzar.

Se marca con pequeñas cruces a distancias iguales los lugares donde

se va aplicar las muestras.

Se identifica cada uno (A, B, C, D).

Se aplica las muestras con un tubo capilar o un hito de platino.

Las manchas tendrán un Ø máximo de 5 mm.

Sacar la mancha después de cada aplicación.

1.3Elección del disolvente.

Será de acuerdo a la sustancia que se ha desaparecer.

Se usa mucho el n-butanol.



Si se agrega el disolvente ácido acético y formic, piridina o solución de

amoniaco, ayudan a incorporar mas agua al disolvente cimentando la

solubilidad.

La técnica puede ser ascendente o descendente.

El papel (H colgado y colorado dentro de una cubeta ingresándose una

atmósfera saturada de vapor).

En la precedente el disolvente asciende hasta el extremo superior del papel,

cesando el flujo del líquido.

Los componentes permanecen sobre el papel y la distancia recorrida por el

disolvente es fija.

Esto es importante para la separación BIDIMENSIONAL.

Con la técnica dominante el disolvente corre a lo largo de papel debido a la

gravedad llegando fuera del papel.

Se puede aumentar la longitud del papel y obtener mejores resultados en la

separación.

1.4Secado de papel.

Cuando el disolvente ha recorrido la distancia requerida o transcurrido un

tiempo especificado, se saca los papeles de la cubeta.

Se saca el papel con ayuda de un ventilador. Estará listo para el revelado o

localizado.

3.1. Revelado.

Interesa al final localizar la posición de las sustancias en el papel si son

colocadas no hay dificultad.

Si son varios se puede visualizar por métodos físicos como la fluorescencia

y la radiactividad o por aquellos químicos.



II. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

En la cromatrografía de papel, la hoja de papel aparta su propia columna de

celulosa. No necesita un tubo de vidrio para sostenerla.

Para muchos compuestos orgánicos el uso del papel y celulosa no es

satisfactorio. Otros medios tales como alumina y gel de sílice no pueden

prepararse en forma de tiras, por lo que se accede a fabricar capas finas sobre

laminas de vidrio.

Se aplica una capa de un material pastoso sobre una lamina de vidrio. Espesar

material = 0.50 u o 0.250 m. m.

La ventaja de esta técnica aparte de separar compuestos tales como lípidos

que no se puede en la de papel, es que se puede usar una amplia variedad de

materiales bioquímicos pulverizados como capa fina tales como:

Gel de sólidos

Celita

Aliminez

Se elige la capa de acuerdo al material a usar.

Cromatografía de capa fina.

Definición. Es una técnica de separación e identificación de sustancias

químicas por medio de un disolvente que se mueve sobre una capa delgada de

un disolvente que se mueve sobre una capa delgada de un adsorvente idóneo

colocado sobre una hoja de vidrio.

Otras ventajas sobre la separación en papel es que requiere menos tiempo, se

obtiene mejor resolución y manchas mas compactas.

2.1. Preparación de las placas.

Se prepara la papilla disolviendo con agua llegando a una consistencia

apropiada, no debe tener grumos.

Se extiende haciendo uso de una varilla de vidrio o se puede usar en

extender o aplicador especial.

El espesor habitual es de 0.25 m.m.

Placas mas finas dan separaciones mas rápidas; pero menos eficaces.

Placas mas gruesas 0.5 a 1 m.m. se emplean en el trabajo microperativo.



2.2Alcado

Se calienta la placas en una estufa a 100 – 105° C por 2 horas por lo que se

activan.

Si se les deja luego a la atmósfera, se discurre (gran humedad).

Para medios tales como el gel, el secado es lento.

2.3Elección del medio.

Celulosa microeristalina (Clomatrografía de reparto)

Gel de sílice (Clomatrografía y reparto)

Alumina (para adsorción)

2.4Elección de disolvente.

Depende de la naturaleza del compuesto a separar.

Para sustancias solubles en agua se elige capas de celulosa o gel de sílice.

Para sustancias menos polares se elige capas de alivana o gel de sílice.

El disolvente apropiado se aplica en el centro de marcha mediante un

capilar muy fino o se evapora rápidamente.

Se cuenta con una variedad de segundos dizar ventas.

2.5Desarrollo de las placas.

Por el método ascendente se hace uso de cubeta.



MÉTODO.

Se coloca en el interior un papel filtro empapado de disolvente que cubra

las paredes exteriores de la cubeta para tener una atmósfera saturada.

El fondo tiene disoluto 0.5 a 1.0 cm.

Se introduce la placa.

Se puede hacer la prueba con una o varias placas.

Con varias placas es mejor ya que se puede tener una cubeta sanduaich

en el que hay mejor control de la atmósfera.

Se deja que ascienda el disolvente unos 10 cm. por encima del origen y se

saca la placa.

Se marca con lápiz el efecto del disolvente y se deja empezar.

2.6Revelado de placas.

A diferencia de la cromatografía de papel en la de capa fina es posible usar

en el revelado agentes corrosivos y alta temperatura, tales como ácidos

concentrados y compuestos oxidantes.

Se usa vapores de yodo (en cristal) al cabo de unos minutos el yodo tiende

a concentrarse donde están los compuestos.

Aparece una mancha marrón oscura sobre fondo amarillo que no es

destructivo.

Se puede emplear también la fluorescencia y la radioactividad (rayos

ultravioleta).

2.7Cromatrografía Acanlitatura.

Se puede emplear un mayor espesor de capa adsorvente.

Conociendo la posición de las barras que interesan se retiren de la placa

mediante una espátula, se extrae la sustancia de polvo usando un

disolvente.

Ejemplo: Extraer Soxhlet.

En la cromatografía de capa fina cuantitativa se conoce el volumen de la

muestra.

Se analiza el producto disuelto.



2.2. Conservación del cromatrograma.

La conservación del cromatrograma de capa fina es difícil e indeseable ya

que las placas se pierden muchas veces.

La capa es delicada.

Se puede fotografiar la posición de las manchas después del mezclado.

Otra técnica es pulsar polarizar la capa con una dispersión de un plástico

especial transparente, al enderezarse permite retirarlo de la placa de vidrio

manteniendo el cromatrograma.

De otra manera puede generarse indefinidamente.

CROMATROGRAFÍA EN COLUMNA

Son unos tubos o columnas de vidrio con una válvula de Sclich en la parte

superior.

En el mezclado se tiene gran variedad de tipos y tamaños

3.1. Llenados en la columna.

Se coloca el tubo en posición vertical se sostiene un sujetador que se

coloca en el fondo de la columna un disco de porcelana (filtro) y encima de



este un poco de lana de vidrio. Esto retardará el material sólido de la

columna mientras que el líquido eluyente puede circular libremente.

El material adsorbente puede introducirse un poco, peso diferente es

colocado en la prima de papilla con el eluyente.

Antes de introducir el adsorbente se ha h echado empiece de disolvente

puro 2 a 4 cm. por encima de la lana de vidrio.

Se elimina el aire que pueda quedar retenido agotado por medio de una

varilla larga de vidrio.

La papilla formada por el adsorbente y el disolvente se agrega lentamente

en porciones hasta llegar a la altura deseada, se golpea suavemente ...

La altura del disolvente no debe exceder 2 a 5 m. m. sobre el sellado, a

partir de esto la columna esta lista para recibir la muestra que se desea

separar.

3.2. Disolventes empleados

Según sea la preparación de reparto, adsorción o intercambio ionico se

aplican 3 tipos de disolventes.

Para los separadores por adsorción es fundamental que los disolventes

empleados sean puros ya que si hay impurezas pueden alterar el

desarrollo del proceso.

Empleando adsorventes tales como alumina y gel de sílice, la intensidad

de la adsorción aumenta al crear la naturaleza polar del material

adsobido. Por esto se emplea disolventes apolares con el eter de

petróleo.

Se emplea para la correcta elección de la columna, una serie de

disolventes en los que vaya aumentando la polaridad.

Ejemplo: la serie agua > metanol > etanol > acetina > acetato de etilo >

eter > cloeceperaco > buceno.

Para las separaciones basadas en el intercambio único, la solución

acuosa, sería pasar por una columna de resina de intercambio iónico.



3.3TÈCNICAS DE SEPARACIÒN

Guías de separación.

Columnas de reparto.

La mezcla a separa se disuelve en el disolvente apropiado vertiendo

una solución diluida que se introduce en la columna por medio de

una pipeta.

El disolvente elegido debe ser miscible con el empleado para llenar la

columna; la adición se ayuda empleando una varilla de vidrio

también.

Se abre una llave inferior y se deja salir el disolvente hasta que el

nivel de la muestra este 1 o 2 m. m. del adsorbente, a través del

adsorbible remplazando la llave.

El flujo se continua hasta que se han separado todos los

componentes.



b) Columnas de adsorción dibujo:

No naportucto

Disolvente A

Disolvente B

3.4Examen e identificación de los compuestos.

Cuando la muestra aplicada a la columna es colocada, se abrieron

fácilmente el proceso de separación. Embollo Metálico

Mediante un embolo o pistón

se emplea con cuidado el

adsorbente evitando que se

desmorone.

Se deja secar (evaporar). EXTRUCIÓN DEL RELLENO

Se corta en rodajas

Se extrae con disolvente cada rodaja

Se analiza el extracto.

II. CROMATOGRAFÌA DE GASES

Las 3 técnicas de separación ya descritas se vienen utilizando desde hace

mucho tiempo y son las mas apropiadas para separaciones de sólidos y

líquidos NO VOLATILES en solución.

La cromatografía de gases es particularmente apropiada para la separación

de gases y líquidos volátiles.


A B

COLUMNA

RELLENO DE COLUMNA


ESQUEMA DE INSTALACIÓN DE UN APARATO PARA

CROMATOGRAFÍA DE GASES.

A. Aire Fig. CROMATOGRAMA REPRESENTADO LA

SEPARACIÓN

B. Etano DE GASES DEL PETROLEO, SOBRE

ALUMINA, USAN-

C. Propano DO HIDROGENO COMO GAS PORTADOR.

D. Isobutano

E. n-butano

F. Isoperitano

G. N-pentano

La pequeña muestra de gas a separar se inyecta en la corriente de gas

inerte tal como N, H, dióxido carbónico, argón o helio que pare hasta una

columna que contiene un medio apropiado, capaz que irá retardando el

flujo, de manera gradual, de cada uno de los compuestos individuales de

la muestra que fluye a través de la columna.



Los compuestos separados margen a intervalos (de acuerdo a cada

componente) y pasan a través de un director.

Se hace posible la separación por las diferencias en la adsorverí en la

columna.

4. Los análisis de gases se llevan acabo en una columna de cada par

(gas - sólido).

Los líquidos y sólidos volátiles en canaletas de gas – líquido. Sobre el

gas partidor.

Se adquiere al estado puro en citados a presión o para resultados

óptimos se saca el gas antes de ser poco pasándose a través un tamiz

molecular (eliminan el vapor de agua).

El gas portador a emplear depende de la naturaleza de la muestra y del

tipo de detector instalado.

La velocidad del flujo del gas portador se controla con una medida de

caudal (rotavetro).

La colectora vertical del flotador indica continuamente la velocidad del

flujo.

4.1 Introducción de la muestra.

Se usa muestras pequeñas de 0.19 10 ul para gases y líquidos y

fracciones de mg. para sólidos.

Muestras mayores darán una mala separación.

Se hace uso de una micro-jeringa mediante una aguja que atraviesa el

tapón de goma.

La muestra aplicada debe evaporarse rápidamente a la entrada para ello

hay una resistencia eléctrica que calienta la entrada. Una buena

temperatura es 50°C.

Con gases o muestras muy pequeñas, la calefacción no es esencial.

4.2La columna.

Son de vidrio, plástico o metales. Se perfora los metales por ser inertes,

resistentes y tener buena transferencia de calor.

Tiene 1.5 a 4.5 m. de longitud y 2 a 20 mm O.



En el sistema de cromatrografía capilar de gases los tubos o en 1.3 a 3

m.m. de longitud y de 0.1 a 1 mm. de O de diámetro.

4.1Preparación de relleno.

a. Columnas de alumina

Los adsorventes mas empleados son alumina, carbón activo, gel de

sílice o trabajen bien a temperatura ambiental.

Para compuestos de elevado peso molecular se eleva la temperatura y

empleado adecuadamente en líquido no volátil para bloquear los cortes

activos y bajar el poder de adsorción.

b. Columnas de reparto.

El material de relleno viene a ser un soporte soluto finamente dividido,

que parte un líquido volátil.

III. SISTEMA HPLC

(HIGH PRESSURE LIQUID CHRDNATLLGRAPY).

CROMATROGRAFÍA DE LIQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN.

En cromatrografía de líquidos tiene lugar aveces usa ensanchamiento de

banda significativo fuera del relleno de la columna.

Se produce debido a la diferencia de hióabidad de flujo que hay entre las

capas de líquido coadyuvantes a las paredes del tubo y las del centro.

En la parte central el soluto se mueve con mayor rapidez que en la

peritica.

En el aparato HPLC, se hace uso de altas presiones y el equipo es mas

complejo, que un cromatografo común (ver Fig).

Tiene varias respuestas que pueden ser de vidrio o de accioina, cada

uno tiene 500 ml. de un disolvente.

Cuando hay formación de gases (O2, N) disueltos que pueden interferir

en la sustancias de detección se hace uso de un difusor que mediante

una sustancia de vacío arrastra los gases disueltos fuera de la solución

mediante finas burbujas de un gas fuerte y de baja solubilidad.

Esos procesos y instrumentos HPLC se puede introducir los disolventes

a través de 2 ó mas recipientes hacia una cámara de mercía.



5.1Sistema de bombas

Se usa presiones por encima de 600 psi, el flujo debe estar libre de

pulsaciones, el intervalo de calidad de 0.1 a 10 ml/min.

Componentes resistentes a la corrosión (se saca acero y teflón).

Se usan 3 tipos de bombas:

Bombas reciprocantes (produce pulsaciones) por cierta fusión.

Bombas de jeringa

Bombas neumáticas (presión constante).

Bombas de jeringa o de desplazamiento. Son cámaras como una jeringa y

un embolo.

Desventaja: Capacidad limitada de disolvente 250 ml, dificulta su cambio

de disolvente.

Ventaja: Flujo libre de pulsaciones.

Bombas neumáticas. Son mas simples. La fase móvil esta en un

ceritenedor plegada el que puede prescindirse mediante aire

comprimido, no provoca pulsaciones, son baratos pero de baja presión y

capacidad limitada.

Control del caudal de bombeo.

Tiene dispositivos controlados por ordenador. Cualquier diferencia entre

la señal y lo programado su fuerza abstractiva se aumenta o disminuye

la velocidad del motor de la bomba.

Sistema de inyección de muestra.

Un factor limitante en la presión de las medidas es la reproductibilidad en

introducir la muestra de la columna.

Por ello los volúmenes que se emplean deben ser muy reducidos. De

unas pocas decinas de microlitro a 500 u litro (1/2 ml) e introducir la

muestra sin despresurizar el sistema.

Adicionalmente se usa un mecanismo llamado bucle de muestra. Su

tamaño varía de acuerdo a la muestra, son intercambiables y van de 5 a

500 u l.

La ventaja es que puede introducir la muestra a presiones de hasta 7000

psi con una presión de unas décimas por ciento.



Columnas para cromatografía de líquidos. Se construye de acero

inoxidable, vienen empaquetados cientos de columnas de O variable.

Su longitud varía de 10 a 30 cm, son rectas y se pueden alargar

acoplando 2 o mas columnas.

El O entero varía de 4 a 10 mm y los tamaños de partículas de los

rellenos van de 3.59 a 10 u m.

Tipos de relleno de la columna

Los mas empleados son de 2 tipos:

a. Películas. Bolas de vidrio o de polmero, no perones, esféricas de O

30 a 40 u m.

Es la superficie las bocas tienen un ambiente de sílice o alumina o de

una resina de intercambio ionico.

b. De partícula porosa. O de 3 a 10 u m. material sílice, alumina o

resina de intercambio iónico.

Detectores.

En cronometría de líquidos se usan los detactores de ionización de llama y

de conducción térmica.

Se usan 2 tipos:

a. Detectores basados en una propiedad de la disolución.

Ejemplo: índice de refracción, la constante dielectica o la deusidad.

b. Detectores basados en una propiedad de soluto.

Ejemplo: absorvación UV, fluorescencia o intensidad de difección que no

son propias de esta fase móvil.

ESQUEMA DE UN APARATO HPLC (PERKIN-ELMER)


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