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ESCUELA POLITÉCNICA NACIONAL

FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA Y AGROINDUSTRIA

DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE ÁCIDO ASCÓRBICO Y LA PRESENCIA DE TERPENOS EN UN GRUPO DE BRIÓFITAS,

PROPIAS DE LA ZONA AMAZÓNICA NORTE DEL ECUADOR, EXPUESTAS A LA ACCIÓN DE UNA DOSIS DE GLIFOSATO

PROYECTO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENI ERA AGROINDUSTRIAL

EVELYN NATALIA PACHECO JIMÉNEZ [email protected]

DIRECTORA: ING. FLORINELLA MUÑOZ BISESTI, PhD. [email protected]

Quito, junio 2012

© Escuela Politécnica Nacional (2012)

Reservados todos los derechos de reproducción

DECLARACIÓN

Yo, Evelyn Natalia Pacheco Jiménez, declaro que el trabajo aquí descrito es de mi autoría; que no ha sido previamente presentado para ningún grado o calificación profesional; y, que he consultado las referencias bibliográficas que se incluyen en este documento.

La Escuela Politécnica Nacional puede hacer uso de los derechos correspondientes a este trabajo, según lo establecido por la Ley de Propiedad Intelectual, por su Reglamento y por la normativa institucional vigente.

__________________________

Evelyn Natalia Pacheco Jiménez

CERTIFICACIÓN

Certifico que el presente trabajo fue desarrollado por Evelyn Natalia Pacheco Jiménez, bajo mi supervisión.

_________________________ Ing. Florinella Muñoz B. PhD. DIRECTOR DE PROYECTO

AUSPICIO

La presente investigación contó con el auspicio financiero del proyecto PIS-022-2009 “Estudios preliminares sobre la acción del glifosato en plantas briófitas”, que se ejecuta en el Departamento de Ciencias Nucleares, Laboratorio de Investigaciones Aplicadas.

AGRADECIMIENTOS

Agradezco a mis padres Huguito y Marthita por su apoyo incondicional, por todos

los esfuerzos que han realizado día a día, por sus abrazos calurosos y sus sabios

consejos.

A mis hermanas Yessy, Churitos y Mary que han sido, junto a mis padres los

mejores ejemplos de mi vida, gracias por su apoyo, por ser mis grandes amigas

incondicionales que me han escuchado y aconsejado siempre.

A mis queridos cuñados Marito, Richi y Dave, que se han convertido en mis

hermanos gracias por siempre estar pendientes de mi.

A Gabrielito Alejandro, Ismael Arturito, Miguelito Emilio y Camilita Victoria, mis

amados sobrinitos, gracias por existir, llenar de alegría mi vida y ayudarme a

llegar a culminar esta meta alentándome a no desfallecer.

Agradezco a Santi por su apoyo, comprensión y la fortaleza que me entrega día a

día para seguir adelante superando cada obstáculo, gracias por ser parte de mi

vida y hacer que cada día sea especial para mí.

Jime te agradezco por tu amistad sincera, por estar allí en los buenos y malos

momentos, por tu apoyo incondicional durante estos seis años; Marit te agradezco

por tu amistad, sinceridad, cariño, hospitalidad y por todo el apoyo que me has

brindado.

Agradezco a Cata por haberme brindado además de sus conocimientos su gran

amistad y confianza.

A Paito, Mari, Roque, Glorita, Mercedes y Jenny gracias por brindarme su apoyo y

amistad en estos dos años. A la Doctora Florinella Muñoz gracias por permitirme

formar parte del laboratorio y desarrollar este proyecto de titulación, gracias por

brindarme su tiempo y conocimiento.

Agradezco a la Ingeniera Lucía Toledo por su apoyo incondicional, por sus

palabras de fortaleza y cariño que me han enseñado mucho.

Gracias también a mis amigos de la Dirección de Relaciones Institucionales y del

Departamento de Servicios Generales de la EPN, que han estado pendientes de

mi siempre, me han aconsejado y me han brindado un espacio de trabajo muy

acogedor; gracias Ivo, Pathito, Luchito, Loly, Marthita, Gonza, Elsita, Wily, Ela,

Vero y Antoñito. Además agradezco al Ingeniero Pablo Angulo por su

comprensión, consejos y apoyo.

DEDICATORIA

A Dios, a mi hermosa familia y a Santi

i

ÍNDICE DE CONTENIDOS

PÁGINA

NOMENCLATURA XI GLOSARIO XII RESUMEN XIII INTRODUCCIÓN XV

1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 1

1.1. Plantas briófitas 1

1.1.1. Taxonomía y distribución 1

1.1.2. Morfología general 2

1.1.3. Importancia de las briófitas 3

1.1.3.1. Importancia ecológica 3

1.1.3.2. Importancia cultural 4

1.1.3.3. Importancia fitoquímica 5

1.1.4. Usos de las plantas briófitas 5

1.2. Terpenos 6

1.2.1. Descripción 6

1.2.2. Clasificación de los terpenos 7

1.2.2.1. Monoterpenos 8

1.2.2.2. Sesquiterpenos 8

1.2.2.3. Diterpenos 9

1.2.2.4. Triterpenos 10

1.2.2.5. Tetraterpenos 10

1.2.3. Biosíntesis de terpenos 11

1.2.4. Identificación y extracción de terpenos 13

1.3. Antioxidantes 14

1.3.1. Generalidades 14

1.3.2. El Ácido ascórbico 15

1.3.2.1. Estructura 16

1.3.2.2. Propiedades 16

ii

1.3.2.3. Determinación 17

1.3.2.4. Usos del ácido ascórbico 17

1.4. Glifosato 18

1.4.1. Características generales 18

1.4.2. Mecanismo de acción del glifosato 19

1.4.3. Comportamiento del glifosato en el suelo 21

1.4.4. Efectos del glifosato sobre el medio ambiente y la salud humana 21

2. PARTE EXPERIMENTAL 23

2.1. Obtención de extractos vegetales 24

2.1.1. Recolección y acondicionamiento de plantas briófitas 24

2.1.2. Métodos utilizados para la obtención de extractos de plantas briófitas

para la determinación de la presencia de terpenos 25

2.1.2.1. Método de extracción soxhlet con metanol 26

2.1.2.2. Método de extracción con metanol asistida con ultrasonido 27

2.1.2.3. Método de extracción y maceración con metanol 30

2.2. Determinación de la presencia de terpenos en extractos vegetales 32

2.3. Determinación del contenido de ácido ascórbico en extractos vegetales 33

2.4. Evaluación del contenido de ácido ascórbico en briófitas expuestas a una

dosis de glifosato 34

2.4.1. Aplicación de una dosis de glifosato a las plantas briófitas 34

2.4.2. Distribución de las muestras de plantas briófitas para la evaluación del

contenido de ácido ascórbico 35

2.5. Evaluación de la presencia de terpenos en briófitas expuestas a una dosis de

glifosato 36

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 39

3.1. Establecimiento de un método de obtención de extractos orgánicos de plantas

briófitas para la determinación de la presencia de terpenos 39

3.1.1. Obtención de extractos de plantas briófitas por el método de extracción

soxhlet con metanol 39

3.1.2. Obtención de extractos de plantas briófitas por el método de extracción

con metanol asistida con ultrasonido 41

iii

3.1.3. Obtención de extractos de plantas briófitas por el método de extracción y

maceración con metanol 43

3.2. Determinación de la presencia de terpenos en los extractos orgánicos de plantas

briófitas 46

3.3. Presencia de terpenos en los extractos orgánicos de plantas briófitas expuestas

a la acción de una dosis de glifosato 49

3.4. Contenido de ácido ascórbico en las plantas briófitas expuestas a la acción de

una dosis de glifosato 60

4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 63

4.1. Conclusiones 63

4.2. Recomendaciones 64

BIBLIOGRAFÍA 65

ANEXOS 73

iv

ÍNDICE DE TABLAS

PÁGINA

Tabla 1.1. Propiedades físico-químicas del ácido ascórbico 16

Tabla 1.2. Propiedades físico-químicas del glifosato 19

Tabla 2.1. Enumeración de los métodos utilizados para la obtención de

extractos de plantas briófitas y la codificación de cada extracto 25

Tabla 2.2. Condiciones del CG CLARUS 500 para la determinación de

terpenos 32

Tabla 2.3. Condiciones que se utilizaron en el HPLC para la

determinación del contenido de ácido ascórbico en las

muestra de plantas briófitas 34

Tabla 2.4. Codificación y tiempo de recolección de los extractos

expuestos a la acción de una dosis glifosato, para la

evaluación del contenido de ácido ascórbico 35

Tabla 2.5. Codificación de los extractos de las tres muestras sin la

exposición a la acción del glifosato 36

Tabla 2.6. Codificación de las muestras testigo y las tres repeticiones

expuestas a la acción del glifosato 37

Tabla 2.7. Codificación de los valores promedios de áreas calculados

de los extractos para la evaluación de terpenos 38

Tabla 3.1. Identificación de los picos enumerados en el cromatograma

del extracto M2c 44

Tabla 3.2. Identificación de los picos presentes en el cromatograma

del extracto M1 46

Tabla 3.3. Áreas de los picos correspondientes a los terpenos encontrados

en los extractos de plantas briófitas expuestas a la acción de

una dosis de glifosato 58

Tabla 3.4. Contenido de ácido ascórbico en muestras de plantas briófitas

expuestas a la aplicación de 20,2 % de glifosato 61

Tabla A.1. Usos registrados de glifosato en SENASA 74

v

Tabla B.1. Reporte de la librería NIST del espectrograma de masas

indicado en la Figura B.1 75

Tabla B.2. Nombre del compuesto correspondiente al pico del

cromatograma del extracto obtenido con 57 g de plantas

briófitas y 1 h en el ultrasonido (extracto U5) 76

Tabla C.1. Compuesto correspondiente al pico que se presentó a los

20,39 min en el cromatograma del extracto 1MT0 77





Tabla D.1. Compuesto correspondiente al pico que se presentó a los
















vi

ÍNDICE DE FIGURAS

PÁGINA

Figura 1.1. División de briófitas: a) Musgos, b) Antoceros, c) Hepáticas 1

Figura 1.2. Esquema de las partes de un musgo 3

Figura 1.3. Musgo Sphagnum sp. también llamado musgo de turbera 4

Figura 1.4. Estructura del isopreno 7

Figura 1.5. Estructuras químicas de tres monoterpenos: a) Mentol,

b) Geraniol, c) Limoneno 8

Figura 1.6. Estructuras químicas de dos sesquiterpenos: a) Farnesol,

b) Ácido abscísico 9

Figura 1.7. Estructuras químicas de dos diterpenos: a)Ácido abiético,

b) Retinol 9

Figura 1.8. Estructuras químicas de dos triterpenos: a) Escualeno,

b) Lanosterol 10

Figura 1.9. Estructura química del licopeno 10

Figura 1.10. Origen de algunos metabolitos secundarios en el

metabolismo primario de las plantas 11

Figura 1.11. Síntesis de terpenos y su clasificación según las unidades de

isopreno que contienen 13

Figura 1.12. Estructura del ácido ascórbico 16

Figura 1.13. Estructura química del glifosato 18

Figura 1.14. Mecanismo de inhibición de la ruta metabólica del ácido

shiquímico por el glifosato 20

Figura 2.1. Diagrama del proceso para la obtención de extractos de plantas

briófitas en un equipo soxhlet con metanol 27


briófitas con metanol y ultrasonido 28


briófitas mediante maceración con metanol, grado HPLC 30

Figura 2.4. Perfil de temperatura del horno utilizado para el análisis de

terpenos en el GC/MS Claurus 500 33

vii

Figura 3.1. Cromatograma del extracto obtenido con metanol, 5,0 g

de plantas briófitas y 5 h en el soxhlet (extracto S1c) 39

Figura 3.2. Cromatograma del extracto obtenido con metanol, 5,0 g

de plantas briófitas y 10 h en el soxhlet (extracto S2c) 40

Figura 3.3. Cromatograma del extracto obtenido con metanol, 57 g de

plantas briófitas y 1 h en el ultrasonido (extracto U3) 42

Figura 3.4. Cromatograma del extracto M1c 43

Figura 3.5. Cromatograma del extracto M1 45

Figura 3.6. Cromatograma del extracto 1MT0 47

Figura 3.7. Espectrograma de masas del pico que se presentó a los

20,39 min, identificado como gama-muuroleno del extracto

1MT0 47




2MT0 48




3MT0 49



20,33 min, identificado como copaeno del extracto 1MT1 50



20,34 min, identificado como alfa cubebeno del extracto

2MT1 51



20,36 min, identificado como muurolanodieno del extracto

1MT2 53



viii


2MT2 53




3MT2 54




1MT3 55



20,38 min, identificado como copaeno del extracto 2MT3 56



20,36 min, identificado como alfa cubebeno del extracto

3MT3 57

Figura 3.28. Valores promedios de las áreas teóricas de los extractos

de plantas briófitas expuestos a una dosis de glifosato,

evaluados según la semana de análisis 60

Figura 3.29. Contenido de ácido ascórbico en las muestras de

plantas briófitas expuestas a la acción del glifosato

durante tres semanas 61

Figura B.1. Espectrograma de masas del cromatograma de los extractos

S1c, S2c, U1, U2c, U3, U4c, U6c, M3, M4c 75

Figura B.2. Espectrograma de masas del cromatograma del extracto U5 75

Figura E.1. Informe del contenido de ácido ascórbico de la muestra de

plantas briófitas sin la exposición a la acción del glifosato

(TAA0) 81


plantas briófitas expuesta a la acción del glifosato después

de una semana de la fumigación (MAA1) 82

ix



de dos semanas de la fumigación (MAA2) 83



de tres semanas de la fumigación (MAA3) 84

x

ÍNDICE DE ANEXOS

PÁGINA

ANEXO A

Datos de dosis de fumigación con glifosato en cultivos lícitos 73

ANEXO B

Reportes de la librería de espectros de masas NIST, registrados en aaaaaaaaa aaaaaaaaa aaaaaaaa

los métodos de obtención de extractos vegetales de plantas briófitas aaaaaaaaa aaaaaaaaa aaaaa

para la determinación de la presencia de terpenos 74

ANEXO C

Reportes de la librería de espectros de masas NIST, registrados en la aaaaaaaaa aaaaaaaaa

determinación de la presencia de terpenos en extractos orgánicos de aaaaaaaaa aaaaaaaaa a

plantas briófitas. 76

ANEXO D

Reportes de la librería NIST de la sección Evaluación de la presencia aaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaa

de terpenos en los extractos orgánicos de plantas briófitas expuestas a a a aa a a aa aaa a a a aaaaa

a la acción de una dosis de glifosato 77

ANEXO E

Informes del contenido de ácido ascórbico en las muestras de plantas aa aa aaa aa aa aa

briófitas, realizado en el laboratorio Labolab 80

xi

NOMENCLATURA

EPSP: 5-enolpiruvil shiquimato-3 fosfato

EPSPS: 5-enolpiruvil shiquimato-3 fosfato sintetasa

GC/MS: Cromatografía de gases – espectrometría de masas; Cromatógrafo

de gases- espectrómetro de masas

HPLC: Cromatografía líquida de alta eficiencia

HR: Humedad relativa

PEP: Fosfoenolpiruvato

S3P: Shiquimato-3-fosfato

T: Temperatura

xii

GLOSARIO

Ácidos resínicos: Compuestos diterpenóicos propios de las resinas provenientes

de los árboles de la familia Pinácea (Samuelsson y Bohlin, 2009).

Adyuvantes: Compuestos químicos que optimizan el efecto de un herbicida

(Eslava et al., 2007).

Caulidios : Estructuras presentes en las plantas briófitas que son similares a tallos

(Cubas, 2008).

Clado: Conjunto de especies que tienen un antepasado común (De Haro, 2005).

Ectohídricas: Briófitas que son capaces de absorber agua por toda su superficie

(Delgadillo y Cárdenas, 1990).

Epífitas: Plantas que viven una sobre la otra sin afectar su alimentación (RAE,

2011).

Filoide: Órgano similar a una hoja, presente en las briófitas (Cubas, 2008).

Phylum: (plural phyla), categoría taxonómica ubicada entre el Reino y la Clase

(Martínez et al., 2007).

Poiquilohídrico: Planta que puede resistir a temporadas de sequía, sin alterar su

metabolismo (Cubas, 2008).

Surfactantes: Sustancias que modifican la tensión superficial y que pueden

actuar como humectantes o detergentes y en aplicaciones específicas mejorar la

acción de ciertos químicos, como los herbicidas en plantas (Eslava et al., 2007).

xiii

RESUMEN

En la frontera norte de Ecuador con Colombia, especialmente hacia la región

amazónica, se han dado grandes fumigaciones con glifosato para el control de

los cultivos ilícitos de coca. En esta región crecen plantas únicas del

ecosistema, como son las briófitas. En este estudio se espera determinar los

cambios producidos por la acción del glifosato sobre la presencia de terpenos y

ácido ascórbico en estas plantas

Las plantas briófitas fueron recogidas de una colección de cacao ubicada en la

Estación Central de la Amazonía del INIAP de forma manual. Estas plantas

fueron trasladadas a la ciudad de Quito y ubicadas en invernaderos, bajo

condiciones controladas de temperatura y humedad (25 ºC y una HR de 75 %).

Se probaron varios métodos para la obtención de extractos vegetales de las

plantas briófitas con el objeto de identificar aquel que permitiera la

determinación de la presencia de terpenos. De los métodos utilizados se

encontró que el único que permitió observar la presencia de terpenos en las

plantas briófitas de estudio fue un método de extracción y maceración, en el

cual se utilizaron 220 g de plantas briófitas, metanol grado HPLC como

solvente y un tiempo de maceración de cuatro semanas.

En los extractos vegetales de las plantas briófitas se identificó la presencia de

algunos sesquiterpenos como copaeno, gama muuroleno y alfa cubebeno.

Además de la identificación de terpenos se encontraron algunos ácidos grasos

y cumarinas.

Se realizaron fumigaciones en las plantas briófitas recolectadas y

acondicionadas, con una dosis del 20,2 % de glifosato, marca Ranger 480. Se

hizo una sola aplicación de la dosis de glifosato y se realizaron evaluaciones

semanales durante tres semanas. Los parámetros analizados para esta

evaluación fueron la presencia de terpenos y el contenido de ácido ascórbico.

xiv

La presencia de terpenos disminuyó respecto a la réplica sin aplicación de

glifosato (MT0p), durante las 3 semanas de evaluación. Después de la primera

semana de fumigación el contenido disminuye un 29,3 %, transcurrida la

segunda semana de fumigación, disminuye en un 64,9 % y finalmente, a la

tercera semana de fumigación, disminuye un 70,3 %

El contenido de ácido ascórbico muestra una disminución respecto a la muestra

sin aplicación de glifosato (TAA0), durante las tres semanas de evaluación.

Después de la primera semana de fumigación el contenido de ácido ascórbico

disminuye en un 7,5 %, transcurrida la segunda semana de evaluación se

evidencia una disminución del 35,6 %; y finalizada la tercera semana el

contenido de ácido ascórbico disminuye en un 36,5 %.

xv

INTRODUCCIÓN

Las plantas briófitas son plantas primitivas que han habitado el planeta desde

el período Devónico (Camacho, 2007; Ramírez, 2007) En general, son plantas

pequeñas y pueden habitar en variados ambientes y poseen una particularidad

única del Reino vegetal, ya que en su ciclo de vida la generación dominante es

el gametofito (Gradstein et al., 2001).

La importancia de estas plantas está relacionada con sus usos en diferentes

aplicaciones, los mismos que aprovechan ciertas características químicas

como la presencia de flavonoides, aminoácidos, terpenos, entre otros

(Morantes et al., 2007; Glime, 2007). Por tradición, algunas de estas plantas se

han utilizado para el tratamiento de ciertas afecciones. Sus características

químicas permiten su uso como bioindicadores ambientales de contaminación

de metales pesados y, además, se aprovechan en usos hortícolas para

producir fertilizantes naturales (Glime, 2007)

En la región amazónica del Ecuador existe gran cantidad de plantas briófitas,

puesto que las condiciones climáticas de la zona son óptimas para el

crecimiento y desarrollo de las mismas (León-Yánez y Gradstein, 2006).

La zona amazónica norte del Ecuador ha sido afectada por las fumigaciones

aéreas de glifosato, puesto que en la frontera colombo-ecuatoriana, desde el

año 2000, se han realizado controles constantes sobre los cultivos ilícitos de

coca. Debido a la ubicación de la zona seleccionada para la fumigación, parte

del herbicida ha afectado a la zona fronteriza del Ecuador con Colombia y ha

provocado la pérdida de cultivos agrícolas y de la flora nativa del lugar.

La presencia de glifosato podría haber afectado también a las plantas briófitas

que crecen en la zona y que forman parte del ecosistema amazónico y además

producido cambios en el metabolismo y composición de estas plantas que

redunden en cambios en el delicado equilibrio, que se establece entre las

especies en la zona (Ávila et al., 2007).

xvi

Hasta la fecha no se han realizado en Ecuador, estudios sobre los efectos

metabólicos de la acción de glifosato sobre plantas briófitas. Por esta razón, se

formuló el Proyecto Semilla PIS-022: “Estudios preliminares sobre la acción del

glifosato en plantas briófitas”, el cual, en su primera etapa, estuvo enfocada al

análisis de los efectos del glifosato sobre la morfología y la actividad

peroxidásica en las plantas briófitas (Sánchez, 2011).

El presente trabajo constituye una segunda etapa del proyecto, en el cual se

propone establecer los efectos de la acción de una dosis de 20,2% de glifosato

sobre el contenido de ácido ascórbico y la presencia de terpenos en un grupo

de briófitas que crecen en la zona amazónica norte del Ecuador.

1

1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

1.1. PLANTAS BRIÓFITAS

1.1.1. TAXONOMÍA Y DISTRIBUCIÓN

La división briófita del reino vegetal corresponde a la denominación de tres clases

de plantas, los musgos (Phylum Briophyta), las hepáticas (Phylum Hepatophyta) y

los antoceros (Phylum Anthocerotophyta) (Ramírez, 2007). Estas tres clases de

plantas, a pesar de no formar un clado, comparten entre ellas la presencia de un

ciclo de vida, en el cual el gametofito es la generación dominante (Cubas, 2008).

Algunos ejemplos de cada uno de estos phyla se muestran en la Figura 1.1.

Figura 1.1. División de briófitas: a) Musgos, b) Antoceros, c) Hepáticas (Ardiles et al., 2008)

Existen aproximadamente 15 000 especies de plantas briófitas en el mundo, de

las cuales los musgos se encuentran en mayor proporción, con alrededor de

12 800 especies; las hepáticas son aproximadamente 5 000 especies; y, en

menor cantidad, los antoceros con 100 especies (Gradstein et al., 2001).

Las investigaciones de campo realizadas por León-Yánez y Gradstein (2006), en

2

Ecuador, revelan que existen cerca de 900 especies que corresponden a musgos,

700 a hepáticas y 15 especies se han identificado como antoceros. Además, los

autores comentan que, debido a la poca explotación de los bosques de la región

amazónica, respecto a los bosques de la región costa y sierra del país, existe

mayor cantidad de especies de briófitas en la Amazonía, a lo que se añade

también, que las condiciones ambientales de la zona son propicias para el

desarrollo de estas especies (León-Yánez y Gradstein, 2006).

1.1.2. MORFOLOGÍA GENERAL

Las briófitas son consideradas como plantas primitivas que carecen de tejidos de

conducción, son fotoautótrofas y se dispersan por esporas (Ardiles et al., 2008).

Estas plantas han habitado el planeta durante 365 millones de años y su origen se

remonta al período Devónico, al igual que los primeros moluscos y algunos

artrópodos (Camacho, 2007; Ramírez, 2007).

En el ciclo de vida de las briófitas, el gametofito es la generación dominante y el

esporofito vive en dependencia del gametofito, a diferencia de las plantas

vasculares (Gradstein et al., 2001).

El gametofito de las plantas briófitas consta de rizoides, los cuales no son

verdaderas raíces y sirven para sujetarse al sustrato; lo que significa que, las

plantas briófitas no tienen un sistema radicular de absorción y almacenamiento de

agua desde el sustrato (Cubas, 2008). Los caulidios son las estructuras

equivalentes al tallo en las plantas vasculares, pero carecen de tejido vascular,

por lo que no cumplen la función de transporte de líquidos de una parte a otra

(Cubas, 2008). Los filoides u hojillas, al igual que los caulidios, no poseen cutícula

cerosa (Cubas, 2008). Debido a la carencia de cutícula, la absorción de nutrientes

se da en toda la superficie, por lo que se denominan plantas ectohídricas

(Delgadillo y Cárdenas, 1990). Las partes principales del esporofito son: el pie,

que es la conexión de las dos generaciones; y, la cápsula, que es el lugar donde

se producen las esporas (Gradstein et al., 2001).

3

En la Figura 1.2 se muestran las partes del gametofito y del esporofito.

Figura 1.2. Esquema de las partes de un musgo (Ardiles et al., 2008)

La mayoría de briófitas son organismos poiquilohídricos, por lo que pueden resistir

períodos prolongados de sequía y, una vez que terminan los períodos secos,

pueden regresar a su metabolismo normal (Gradstein et al., 2001).

1.1.3. IMPORTANCIA DE LAS BRIÓFITAS

Según Ardiles et al. (2008), las briófitas tienen importancia ecológica y cultural.

Además se conoce la importancia fitoquímica de estas plantas, debido a la

presencia de compuestos con actividad biológica (Asakawa, 2007).

1.1.3.1. Importancia ecológica

Las plantas briófitas se establecen sobre sustratos pobres, troncos caídos,

árboles e incluso sobre animales. Se convierten, así, en el hogar de animales

4

invertebrados (insectos, artrópodos, gusanos, etc.), vertebrados (aves y pequeños

mamíferos) y además actúan como sustrato para algunas plantas vasculares

(plantas epífitas) (Ardiles et al., 2008).

El musgo Sphagnum sp. forma parte del ecosistema llamado turbera, uno de

cuyos ejemplares se muestra en la Figura 1.3. Su principal característica es la

capacidad de reservar agua. Ardiles et al. escriben que: “… aproximadamente,

entre el 20 y el 30% de todo el carbono y nitrógeno orgánico de los suelos del

mundo está contenido en las enormes turberas árticas” (Ardiles et al., 2008).

Figura 1.3. Musgo Sphagnum sp. también llamado musgo de turbera (Ardiles et al., 2008)

Las briófitas son catalogadas como excelentes bioindicadores ambientales,

debido a que al carecer de tejidos de conducción, la absorción de nutrientes se

produce a través de toda la superficie de la planta y, a su vez, absorben los

contaminantes presentes en el ambiente (Ardiles et al., 2008).

Glime (2007), en su recopilación bibliográfica sobre la utilidad económica y étnica

de las briófitas, describe varios estudios en los cuales se han utilizado plantas

briófitas como bioindicadores ambientales, por ejemplo para evaluar la presencia

de dióxido de azufre y lluvia ácida; metales pesados en el aire; y, floruros y ozono,

en el aire.

1.1.3.2. Importancia cultural

En los países de la región Escandinava y España, las briófitas, junto con otras

5

plantas, son protegidas por la ley, puesto que forman parte de las leyendas y

tradiciones de sus pueblos. En Japón, son parte importante de la cultura

decorativa de jardines. Algunos pueblos de Chile utilizan las briófitas como

materia prima para cojines y colchones. En el Ecuador, existe la costumbre de

utilizar las plantas briófitas para decorar los pesebres y otros adornos en la

celebración de la Navidad (Ardiles et al., 2008; Larraín, 2010).

1.1.3.3. Importancia fitoquímica

Esta importancia fue investigada debido a la presencia de olores y sabores

fuertes, además que no es común que las briófitas sean atacadas por animales

menores, todas estas características despertaron el interés de estas plantas en el

ámbito fitoquímico (Asakawa, 2007).

Los compuestos ya identificados en las plantas briófitas son: monoterpenos,

sesquiterpenos, compuestos aromáticos, cinamatos, fenoles, naftalenos,

cumarinas, aminoácidos, ácidos grasos, etc. (Asakawa, 2007; Morantes et al.,

2007; Glime, 2007). Estos compuestos de las plantas briófitas se han aislado en

laboratorio y se determinaron algunas de sus características, por ejemplo la

acritud y amargura, la dermatitis de contacto que pueden producir, la acción

antimicrobiana, la actividad antifúngica, su actividad neurotrófica, entre otras

(Asakawa, 2007).

1.1.4. USOS DE LAS PLANTAS BRIÓFITAS

Las briófitas han sido poco estudiadas, si se comparan con las plantas

vasculares, debido a su tamaño y diversidad (Larraín, 2010). Las plantas briófitas

ofrecen varias utilidades, las cuales se describen a continuación:

• El musgo Sphagnum sp., antes mencionado, es el principal elemento utilizado

para la elaboración de pañales, toallas higiénicas, material de empaque, etc.

6

(Larraín, 2010).

• Las briófitas son utilizadas en horticultura para el mejoramiento de suelos, por

ejemplo para el cultivo de orquídeas, bromelias, helechos y champiñones.

Además, son utilizadas para la elaboración de semilleros para diversas plantas

vasculares y como principal componente de jardines orientales y arreglos de

floristería (Larraín, 2010; Glime, 2007).

• Los musgos tienen diversas aplicaciones farmacéuticas debido a la presencia

de flavonoides, terpenos, esteroides, compuestos fenólicos, cumarinas,

oligosacáridos, polisacáridos, polialcoholes, aminoácidos, ácidos grasos, entre

otros. Además, se utilizan algunas briófitas como pesticidas naturales

(Morantes et al., 2007; Glime, 2007).

1.2. TERPENOS

1.2.1. DESCRIPCIÓN

El término terpeno proviene de la palabra trementina, que corresponde a una

resina viscosa de aroma agradable, propia de los árboles de la familia de las

Pináceas. La trementina contiene ácidos resínicos y terpenos (Breitmaier, 2006).

Algunos terpenos son conocidos por ciertas propiedades como su olor agradable,

el sabor picante o definidas características farmacológicas. Se encuentran

presentes en partes específicas de las plantas; por ejemplo, en las frutas cítricas,

se mencionan al limón y la mandarina; en las hojas de especias, pueden

nombrarse al tomillo y el romero; y, en las flores se señalan a los claveles y las

violetas (Breitmaier, 2006).

La estructura básica de los terpenos sigue un principio general, que es la unión de

una o más unidades de isopreno, un hidrocarburo de 5 carbonos (C5H8), que se

ilustra en la Figura 1.4. Estas unidades se encuentran ensambladas y modificadas

7

de maneras diferentes. La mayoría de los terpenos tienen estructuras que difieren

entre sí, no solo en el grupo funcional sino, también, en su esqueleto básico de

carbono (Samuelsson y Bohlin, 2009).

C CH

CH2

CH3

H2C

ISOPRENO

Figura 1.4. Estructura del isopreno (Samuelsson y Bohlin, 2009)

Los terpenos son utilizados en varias industrias: la de perfumería, en la

fabricación de finos perfumes; en la industria alimenticia, para dar olor y sabor a

comidas y bebidas; en la industria farmacéutica, para mejorar las características

organolépticas de los medicamentos; y, en la agricultura, para la elaboración de

anti alimentarios para plagas y feromonas para trampas de insectos (Breitmaier,

2006).

1.2.2. CLASIFICACIÓN DE LOS TERPENOS

Los terpenos son metabolitos secundarios, abundantes en las plantas. Su

clasificación se determina según el número de unidades de isopreno, que

contiene su estructura (Breitmaier, 2006; Samuelsson y Bohlin, 2009).

Se nombra a los terpenos de acuerdo con el número de carbonos presentes

asociados al número de unidades de isopreno, que se repiten y se utilizan los

siguientes prefijos: hemi (cinco carbonos “isopreno”), mono (diez carbonos),

sesqui (quince carbonos), di (veinte carbonos), tri (treinta carbonos), tetra

(cuarenta carbonos) y poli (cuando son más de cuarenta carbonos) (Breitmaier,

2006; Samuelsson y Bohlin, 2009). A continuación se mencionan ejemplos y

utilidades de cada uno de estos terpenos.

8

1.2.2.1. Monoterpenos

Son conocidos como los constituyentes de los aceites esenciales. Son utilizados

en la farmacéutica para dar olor y sabor a los medicamentos y también son

utilizados en la elaboración de especerías y son parte de los ingredientes en la

perfumería. Además, algunos son utilizados como agentes antibacterianos, en

este caso se menciona al timol (Samuelsson y Bohlin, 2009; Crozier et al., 2008).

En la Figura 1.5 se muestran las estructuras de tres monoterpenos.

OH

MENTOL

a)

OH

GERANIOL

b)

LIMONENO

c)

Figura 1.5. Estructuras químicas de tres monoterpenos: a) Mentol, b) Geraniol, c) Limoneno

(Samuelsson y Bohlin, 2009; Fenaroli, 1968)

1.2.2.2. Sesquiterpenos

Estos terpenos son poco utilizados en la industria farmacéutica, algunos son

tónicos muy amargos. Las mayores aplicaciones están orientadas por sus

propiedades antiinflamatorias, además se los puede utilizar en la elaboración de

trampas para insectos (Samuelsson y Bohlin, 2009; Crozier et al., 2008; Fenaroli,

1968). En la Figura 1.6 se muestran las estructuras de dos sesquiterpenos,

además se pueden mencionar otros ejemplos como son el copaeno, el gama

muuroleno, alfa cubebeno, entre otros (Ordaz et al., 2011).

9

OH

FARNESOL ÁCIDO ABSCÍSICO

OOH

COOHa) b)

Figura 1.6. Estructuras químicas de dos sesquiterpenos: a) Farnesol, b) Ácido abscísico (Samuelsson y Bohlin, 2009; Fenaroli, 1968)

1.2.2.3. Diterpenos

Dentro de este grupo de terpenos, se encuentran las giberilinas, conocidas como

reguladores del crecimiento de las plantas y pueden tener aplicaciones en el

cultivo de flores u otros productos agrícolas, para mejorar rendimientos o

cualidades específicas. Otros representantes de este grupo son el ácido abiético,

el retinol y el esteviol, responsable, este último, del sabor dulce de la estevia,

además del toxol que es utilizado en algunos tratamientos contra el cáncer

(Samuelsson y Bohlin, 2009; Crozier et al., 2008). En la Figura 1.7, se muestran

las estructuras de dos diterpenos.

a) b)

H

HHOOC

ÁCIDO ABIÉTICO

OH

RETINOL VITAMINA A

Figura 1.7. Estructuras químicas de dos diterpenos: a)Ácido abiético, b) Retinol (Samuelsson y Bohlin, 2009; Crozier et al., 2008)

10

1.2.2.4. Triterpenos

Existen triterpenos en la naturaleza, por ejemplo, el ácido fusídico (antibiótico), las

saponinas, el escualeno y el lanosterol (Samuelsson y Bohlin, 2009; Crozier et al.,

2008). En la Figura 1.8 se muestran las estructuras de dos de triterpenos.

a)

b)

ESCUALENO

H

HHO

H

LANOSTEROL

Figura 1.8. Estructuras químicas de dos triterpenos: a) Escualeno, b) Lanosterol (Samuelsson y Bohlin, 2009; Fenaroli, 1968)

1.2.2.5. Tetraterpenos

Los más importantes de estos terpenos son los carotenoides, los cuales son los

pigmentos amarillos y rojos de algunos alimentos, entre ellos, la yema del huevo y

la zanahoria (Samuelsson y Bohlin, 2009; Fenaroli, 1968). En la Figura 1.9 se

muestra la estructura del licopeno, que es el pigmento de los tomates.

LICOPENO

Figura 1.9. Estructura química del licopeno (Samuelsson y Bohlin, 2009)

11

1.2.3. BIOSÍNTESIS DE TERPENOS

Como muestra la Figura 1.10, el proceso de fotosíntesis en las plantas genera

glucosa. Este compuesto se oxida en un proceso de glicólisis y da lugar a la

formación de fosfoenolpiruvato (PEP), a partir del cual se genera la acetil-

coenzima A (acetil-CoA), precursora de los terpenos, por otro lado el PEP

participa también en la ruta metabólica del ácido shiquímico, en la cual se forman

los aminoácidos fenilalanina, tirosina y triptófano (Ávalos y Pérez-Urria, 2009).

O

OH

H

H

OH

OH

HH

CH2OH

H

OH

CH2

C

COOH

OP

Glucosa

Fosfoenolpiruvato (PEP)

Acetil-CoA

O

C SCoAH3C

COOH

OH

OH

HO

Ác. shiquímico

Fotosíntesis

H2O

CO2

Glicólisis

TerpenosCarotenoidesEsteroides

FenilalaninaTirosinaTriptófano

O2 (Oxígeno)

Figura 1.10. Origen de algunos metabolitos secundarios en el metabolismo primario de las plantas

(Ávalos y Pérez-Urria, 2009)

12

Dos moléculas de acetil-CoA se acoplan, mediante una reacción similar a una

condensación de Claisen, es decir las dos moléculas se conectan por un enlace

sencillo carbono-carbono y dan lugar al aceto-acetil-CoA (Breitmaier, 2006).

Una vez obtenido el aceto-acetil-CoA, este se une a otra molécula de acetil-CoA,

mediante una reacción aldólica que une las dos moléculas debido a la formación

de un enlace carbono-carbono y se obtiene el β-hidroxi-β-metilglutaril-CoA. Sobre

el β-hidroxi-β-metilglutaril-CoA actúa una reducción enzimática con

dihidronicotinamida adenina dinucleótido (NADPH+H+) para obtener ácido

mevalónico (Breitmaier, 2006).

Después se presenta el proceso de fosforilación con adenosín trifosfato (ATP),

para formar difosfato de ácido mevalónico, el cual se descarboxila y da como

resultado el isopentildifostato (IPP). El IPP después de la isomerización da lugar

al dimetilalil-pirofosfato (DMAPP) (Breitmaier, 2006).

La Figura 1.11 describe un ejemplo de la secuencia de formación de terpenos,

donde la unión del IPP y su isómero DMAPP da lugar a la formación de geranil-

difosfato (GPP), que es un monoterpeno. Al GPP se une un isopentildifosfato y

forma un farnesildifosfato (FPP), el cual es un sesquiterpeno (Breitmaier, 2006).

13

CH3

CCH2H2C

CH2 O PP

CH3

CCHH3C

CH2 O PP

P O P OH

OHOH

O O

PP=

CH3

CCH

CH2CH2

C

CH3

CHCH2 O PP

H3C

CH3

CCH

CH2CH2

C

CH3

CHCH2

CH2C

CH3

CHCH2 O PP

H3C

CH3

CCH

CH2CH2

C

CH3

CHCH2

CH2C

CH3

CHCH2

CH2C

CH3

CHCH2 O PP

H3C

CH3

CCH2H2C

CH2 O PP

CH3

CCH2H2C

CH2 O PP

Isopeltildifosfato (IPP) Dimetilalil pirofosfato (DMAPP)

Isopreno (C5)

Monoterpenos (C10)

Geranildifosfato (GPP)

IPP

Farnesildifosfato (FPP)

Sesquiterpenos

IPP

Geranilgeranildifosfato (GGPP)

Politerpenos

Diterpenos

Tetraterpenos

(C20)

(C40)

+

Triterpenos (C15)

(C30)

+ FPP

+GGPP

Figura 1.11. Síntesis de terpenos y su clasificación según las unidades de isopreno que contienen

(Ávalos y Pérez-Urria, 2009)

1.2.4. IDENTIFICACIÓN Y EXTRACCIÓN DE TERPENOS

Los terpenos son metabolitos secundarios presentes en las plantas en bajas

concentraciones. Para determinar su presencia y aprovechar sus propiedades, es

necesario realizar procesos de extracción.

Existen algunos métodos para obtener extractos vegetales: extracción por

solventes, extracción asistida con ultrasonido, extracción asistida con soxhlet, etc.

(Núñez, 2008; Azuola y Vargas, 2007; Rios y Aguilar-Guadarrama, 2006). Una

vez obtenido el extracto, es necesario realizar un estudio de los analitos de

14

interés. La cromatografía de gases son espectrometría de masas (GC/MS) es una

técnica que se utiliza para la identificación de terpenos en extractos vegetales

(Arraiza, 2005).

La cromatografía de gases es una técnica ampliamente utilizada para la

separación y análisis cualitativo y cuantitativo de muestras gaseosas, soluciones

líquidas y sólidos volátiles. La muestra es separada entre dos fases, la una

llamada fase estacionaria (columna) y la otra fase móvil (gas inerte, ejemplo:

helio) que está en contacto con la muestra (Gutiérrez y Droguet, 2002; Grob y

Barry, 2004). Existen varios sistemas de detección de las señales de respuestas

de los compuestos químicos separados por esta técnica, por ejemplo, el detector

de fotoionización; detector de conductividad térmica; detector de espectrometría

de masas; entre otros, los cuales son seleccionados según la industria en la que

se empleará esta técnica (Grob y Barry, 2004).

En la GC/MS, los compuestos volatilizados de la muestra salen de la columna y

se transfieren a la trampa de iones, donde se aplica la técnica de MS, la cual se

basa en la naturaleza y distribución de los fragmentos moleculares, lo que se

consigue al bombardear la muestra con electrones de alta velocidad. Estos

fragmentos se ionizan y se detectan mediante un filtro de masas (Grob y Barry,

2004).

1.3. ANTIOXIDANTES

1.3.1. GENERALIDADES

La etimología de la palabra antioxidante viene del término griego anti que significa

opuesto o con propiedades contrarias y de la palabra oxidante cuyo significado

químico es que oxida (RAE, 2011). Los antioxidantes son sustancias que impiden

o neutralizan cualquier reacción de oxidación (Venereo, 2002; Avello y Suwalsky,

2006). En los seres vivos, los antioxidantes actúan sobre la producción de

radicales libres, los cuales son generados en los procesos de obtención de

15

energía (García et al., 2001).

Según González et al. (2000), los antioxidantes pueden ser clasificados como

antioxidantes enzimáticos y antioxidantes no enzimáticos. Dentro de los

antioxidantes no enzimáticos se encuentran el alfa tocoferol, los beta carotenos, el

ácido ascórbico, los flavonoides, entre otros.

Los beta carotenos se encuentran en plantas como la zanahoria, la calabaza y

otras verduras amarillas. El alfa tocoferol se considera un importante agente

antioxidante, que se puede encontrar en los aceites de soya, algodón, maíz y

palma real, en el germen de trigo y en frutos secos como las almendras y las

avellanas. El ácido ascórbico está presente en naranjas, toronjas, guayabas,

mangos, fresas, papayas, kiwis, entre otras. Las fuentes alimenticias ricas en

flavonoides son el café, las aceitunas, las cebollas y algunas briófitas (García et

al., 2001; Avello y Suwalsky, 2006; Aubad et al., 2007).

1.3.2. EL ÁCIDO ASCÓRBICO

El ácido ascórbico es reconocido por su acción antioxidante, se lo puede

encontrar en varias frutas y vegetales, ya que este puede ser sintetizado a partir

de glucosa y galactosa en las plantas. La deficiencia de esta sustancia en el

organismo de los seres vivos causa el escorbuto. La dosis diaria de ácido

ascórbico recomendada para prevenir el escorbuto es de 60 mg (Ledezma-

Gairaud, 2005).

Además, ácido ascórbico actúa directamente con varias especies reactivas del

oxígeno, además regenera a otros antioxidantes, por ejemplo a la vitamina E

(García et al., 2001).

González et al. (2000) afirman que el ácido ascórbico es la defensa más

importante de los antioxidantes contra los radicales libres. Adicionalmente, se

16

conoce que el ácido ascórbico puede absorber la radiación ultravioleta y proteger

así a las plantas de dicha radiación (Serra y Cafaro, 2007).

1.3.2.1. Estructura

La estructura del ácido ascórbico corresponde a una lactona de seis carbonos

como se muestra en la Figura 1.12 (Oro y Donnamaría, 2006).

HO

HO O O

HO OH

Figura 1.12. Estructura del ácido ascórbico

(NIST, 2011)

El ácido ascórbico es un ácido ligeramente más fuerte que el ácido acético,

puesto que su pKa es de 4,2, frente a 4,8 del ácido acético (Oro y Donnamaría,

2006; Hartigan-Go, 1996); al mismo tiempo, se lo considera como un reductor

fuerte. Dicha propiedad se debe a la presencia de un enediol y además a que el

grupo hidroxi, presente en el carbono 3, puede ceder su protón (Oro y

Donnamaría, 2006; Serra y Cafaro, 2007).

1.3.2.2. Propiedades

La Tabla 1.1 muestra algunas propiedades físico-químicas del ácido ascórbico.

Tabla 1.1. Propiedades físico-químicas del ácido ascórbico

Propiedad Descripción

Fórmula molecular C6H8O6

Masa molecular 176,12 g/mol

17

Tabla 1.1. Propiedades físico-químicas del ácido ascórbico (Continuación...)

Propiedad Descripción

Apariencia y olor Sólido blanco o amarillo, inodoro

Densidad 1,65 g/cm³

Punto de fusión 190 - 192 °C

Solubilidad en agua 80%, a 100 ºC; 40%, a 45 ºC Fuente: ACHS, 2007; NIST, 2011

1.3.2.3. Determinación

El contenido de ácido ascórbico de una solución puede ser determinado por

varios métodos, entre los cuales se pueden mencionar: el método volumétrico con

2,6-diclorofenolindofenol, el método microfluorométrico y el método fluorométrico

semiautomático (AOAC, 2007).

Otra forma para determinar la concentración de una solución de ácido ascórbico

es la técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Este método

comienza con la extracción del ácido ascórbico en condiciones que eviten al

máximo su deterioro (4 ºC y cubierto de la luz). Un medio que permite mantener

las propiedades del ácido ascórbico es el ácido metafosfórico. El análisis por

HLPC se realiza con fase reversa, mediante la utilización de una columna LC-18,

una fase móvil de agua acidificada y un detector UV a 264 nm. (Ledezma-

Gairaud, 2005; Serra y Cafaro, 2007).

1.3.2.4. Usos del ácido ascórbico

Según Ledezma-Gairaud (2005), el ácido ascórbico es utilizado como un

indicador de la calidad nutricional de los alimentos procesados, esto se debe a su

fácil degradación, por lo que se entiende que si en un alimento procesado existe

la presencia de ácido ascórbico, todos los demás nutrientes estarán en buen

estado.

El ácido ascórbico es un aditivo ampliamente utilizado en la industria alimenticia

por ejemplo, se añade a las conservas de frutas para que estas no se oscurezcan,

además que evita la corrosión de los envases metál

También es utilizado en suplementos vitamínicos distribuidos por la industria

farmacéutica (Oro y Donnamaría, 2006).

1.4. GLIFOSATO

El glifosato es un herbicida que

cultivos ilícitos de coca

causado una serie de efectos ambientales, socioeconómicos y de salud en la

frontera norte ecuatoriana (Ávila

El uso de este herbicida en las fumigaciones aéreas ha sido

puesto que en su hoja técnica

directa al follaje de las plantaciones

plantas nativas (Ávila et al

1.4.1. CARACTERÍSTICAS GENE

La DNE (2000) señala que el

sistémica, de amplio espectro”, que es utilizado para eliminar varias especie

malezas o para la eliminación de plantas vasculares de una zona determinada

fórmula molecular es C

química se presenta en la Figura. 1.13.

Figura 1.13.

El ácido ascórbico es un aditivo ampliamente utilizado en la industria alimenticia

se añade a las conservas de frutas para que estas no se oscurezcan,

además que evita la corrosión de los envases metálicos (Ibáñez


farmacéutica (Oro y Donnamaría, 2006).

es un herbicida que ha sido utilizado, para el control aéreo de los

de coca, en el Plan Colombia desde el año 2000, lo cual ha


ontera norte ecuatoriana (Ávila et al., 2007).

El uso de este herbicida en las fumigaciones aéreas ha sido muy

que en su hoja técnica se especifica que se debe utiliza

directa al follaje de las plantaciones, para evitar la contaminación de cultivos y

et al., 2007).

CARACTERÍSTICAS GENE RALES

señala que el “glifosato es un herbicida no selectivo de acción

sistémica, de amplio espectro”, que es utilizado para eliminar varias especie

malezas o para la eliminación de plantas vasculares de una zona determinada

fórmula molecular es C3H8NO5P (Burger y Fernández, 2004) y su estructura

química se presenta en la Figura. 1.13.

Figura 1.13. Estructura química del glifosato (Solomon et al., 2005)

18

El ácido ascórbico es un aditivo ampliamente utilizado en la industria alimenticia,

se añade a las conservas de frutas para que estas no se oscurezcan,

icos (Ibáñez et al., 2003).


para el control aéreo de los

en el Plan Colombia desde el año 2000, lo cual ha


muy cuestionado,

utilizar en aplicación

la contaminación de cultivos y

“glifosato es un herbicida no selectivo de acción

sistémica, de amplio espectro”, que es utilizado para eliminar varias especies de

malezas o para la eliminación de plantas vasculares de una zona determinada. Su

(Burger y Fernández, 2004) y su estructura

19

En la Tabla.1.2 se mencionan las propiedades físico-químicas más importantes

del glifosato.

Tabla 1.2. Propiedades físico-químicas del glifosato

Propiedad Valor Unidad

Peso Molecular 169,1 g/mol

Olor Inodoro -

Densidad 0,5 g/mL

Punto de fusión 184, 5 ºC

Presión de vapor 1,84 x 10-7 mm de Hg a 45 °C

Solubilidad en agua 1,05 g/mL, a 25 ºC

Estabilidad 32 días, a 25 ºC y pH= 5, 7 ó 9 Fuente: Barpen, 2009 y DNE, 2000

En general, el glifosato comercial contiene surfactantes que ayudan a mejorar la

estabilidad de la formulación, además de incrementar la eficiencia del herbicida.

Eslava et al. (2007) apuntan que “los surfactantes son un tipo de adyuvantes;

sustancias adicionadas a una formulación herbicida para facilitar y/o mejorar la

mezcla, aplicación o efectividad biológica de los mismos, por interacciones

básicas químicas o físicas con el herbicida y el blanco al que va dirigido”.

En la actualidad se utiliza el surfactante Cosmo-Flux. Eslava et al. (2007)

mencionan que “mejora la adherencia y la uniformidad de las preparaciones

agroquímicas (...). Las dosis recomendadas oscilan entre 0,1 y 1% del volumen

de la mezcla a asperjar”.

1.4.2. MECANISMO DE ACCIÓN DEL GLIFOSATO

El glifosato interfiere en la síntesis de aminoácidos debido a la inhibición de la

enzima 5-enolpiruvil-shiquimato-3-fosfato sintetasa (EPSPS), que actúa en la ruta

metabólica del ácido shiquímico. Villalba (2009) afirma que la EPSPS “está

asociada a la síntesis de tres aminoácidos aromáticos: fenilalanina, tirosina y

20

triptófano”; estos aminoácidos intervienen en la síntesis de otros compuestos

como los flavonoides, alcaloides, etc., por lo que estos compuestos también se

ven afectados por la acción del glifosato. Además, la inhibición de la EPSPS

disminuye la síntesis de proteínas, el ácido indol acético y la clorofila, por esta

razón la muerte de la planta es lenta y el primer efecto notorio de la acción del

glifosato en la planta es la interrupción del crecimiento; después se evidenciará la

clorosis y, finalmente, la necrosis de la planta (Solomon et al., 2005).

En la Figura 1.14 se muestra el mecanismo de acción del glifosato en la ruta

metabólica del ácido shiquímico.

CO2

O

OH

=O3POH

N+ H

CO2

PO3=

CO2

OH

O=O3PO CO2

OPO3=

CH3

CO2

OH

O=O3PO

CH2

CO2

+ HPO42-

=O3PO

CH2

CO2

=O3P N+ CO2HH

Complejo EPSPS - S3P

Fosfoenol piruvato (PEP)Glifosato

Tetraedro intermedioComplejo glifosato/Shiquimato-3-fosfato

Fosfato

5-Enolpiruvilshiquimato-3-fosfato(EPSP)

+ +

H

Figura 1.14. Mecanismo de inhibición de la ruta metabólica del ácido shiquímico por el glifosato

21

(Eslava et al., 2007) La EPSPS, inicialmente, se une al shiquimato-3-fosfato (S3P). Después, una

molécula de fosfoelnolpiruvato (PEP) se une al sitio activo de la enzima y se

produce el 5-enolpiruvil-shiquimato-3-fosfato (EPSP).

Villalba (2009) menciona que la estructura del PEP y del glifosato son similares,

por lo que el glifosato actúa como un inhibidor competitivo, el cual se une al

complejo formado por S3P y EPSPS, que da como resultado la acumulación de

shiquimato y el bloqueo de la síntesis de los aminoácidos aromáticos.

1.4.3. COMPORTAMIENTO DEL GLIFOSATO EN EL SUELO

El glifosato es adsorbido en el suelo, como consecuencia de la fijación del fosfato,

que existe en el suelo. Existen varios factores que intervienen en este proceso,

por ejemplo la presencia de materia orgánica, el tipo de suelo y el pH del mismo

(DNE, 2000).

Esto permite sugerir que la movilidad del glifosato en el suelo es mínima.

También, se puede mencionar que, según la DNE (2000), la vida media típica del

glifosato en el suelo es de 42 días.

1.4.4. EFECTOS DEL GLIFOSATO SOBRE EL MEDIO AMBIENTE Y LA

SALUD HUMANA

La utilización del herbicida glifosato en forma indiscriminada en las fumigaciones

aéreas, para erradicar los cultivos ilícitos, produce varios efectos en el medio

ambiente. Ávila et al. (2007) mencionan que afecta a las cadenas alimentarias,

agrícolas y acuáticas, puesto que disminuyen las fuentes alimenticias de los seres

vivos, elimina especies medicinales y altera los hábitats de muchas especies de

mamíferos, aves, reptiles, anfibios, peces e invertebrados, debido a la acción del

glifosato sobre las plantas.

22

La población de las zonas cercanas, en donde las fumigaciones aéreas son

constantes, se ha visto obligada a migrar a otros lugares, lo que la expone,

además, a una agresión psicológica-social continua (Ávila et al., 2007).

Los efectos más comunes de las fumigaciones aéreas de glifosato son las

afecciones en la dermis y en los ojos. Si una persona se encuentra expuesta a las

aspersiones de este herbicida presentará fuertes irritaciones dérmicas, oculares y

de las membranas mucosas, que pueden ocasionar incluso reacciones alérgicas

graves (Kaczewer, 2002; EPA, 1993).

La intoxicación aguda, debida a la ingesta del glifosato, produce efectos que

dependen de la cantidad ingerida, los cuales pueden variar desde una condición

leve, en la que se manifiestan el vómito y la diarrea, hasta condiciones de mayor

intoxicación y, que por ejemplo, pueden darse esofagitis, hemorragias intestinales,

disfunción respiratoria, fallas de los diferentes órganos y finalmente la muerte del

individuo (Varona et al., 2009).

23

2. PARTE EXPERIMENTAL

Para el desarrollo de la parte experimental se utilizaron los siguientes materiales,

equipos y reactivos:

a) Materiales

• Glifosato Ranger 480

• Aspersores de 250 mL con boquilla plástica

• Gavetas plásticas, para recolección y transporte de las plantas (70 x 40 cm)

• Mortero de porcelana con pistilo

• Matraces aforados de 25 y 50 mL

• Embudos de vidrio

• Papel filtro

• Viales ámbar de 2 mL

• Soxhlet

• Manta de calentamiento

• Balón de fondo plano de 250 mL

• Vasos de precipitación de 50, 100 y 250 mL

• Kitasatos de 500 y 1000 mL

• Embudos Büchner

• Frascos ámbar de 250 y 750 mL

• Frascos plásticos estériles de recolección de muestras biológicas de 100 mL

• Filtros Millipore de 0,45 µm

• Jeringas plásticas desechables de 5 mL

b) Equipos

• Rotavapor-R, marca Büchi, modelo KRvr 65/45

• Cromatógrafo de gases/espectrómetro de masas (GC/MS), marca Perkin

Elmer, modelo CLARUS 500

• Baño maría, marca Buchler Instruments, modelo Thermo Lift

24

• Baño ultrasónico, marca Branson, modelo 1510

• Bomba de vacío, presión 0 – 14 psi, 1/3 HP, marca ACR source, modelo AVP

501

• Balanza analítica, precisión 0,1 mg, marca Denver Instruments, modelo TP-

214

c) Reactivos

El reactivo que se utilizó para la obtención de extractos vegetales de plantas

briófitas y la determinación de la presencia de terpenos fue el metanol (CH3OH),

grado HPLC, 99,99%, J.T. Baker.

2.1. OBTENCIÓN DE EXTRACTOS VEGETALES

2.1.1. RECOLECCIÓN Y ACONDICIONAMIENTO DE PLANTAS BRIÓFITA S

Las plantas briófitas fueron recolectadas de un ensayo de cultivares de cacao de

la Estación Central de la Amazonía del INIAP. La Estación Experimental Central

de la Amazonía se encuentra ubicada en la vía Sacha s/n, San Carlos a 3 km de

la entrada a la Parker, cantón La Joya de los Sachas, Provincia de Orellana.

Las plantas briófitas fueron recolectadas de forma manual. Estas plantas se

colocaron en gavetas plásticas y se trasladaron a la ciudad de Quito (Sánchez,

2011).

En la ciudad de Quito, las plantas fueron ubicadas a manera de alfombra de 1 cm

de espesor, sobre una capa de sustrato, compuesto por hojarasca y troncos en

descomposición. Posteriormente, se colocaron las muestras en invernaderos de

madera con tapa de vidrio, los cuales estuvieron provistos de un foco de 15 W,

para que se mantuviera una temperatura promedio de 25 ºC.

Además, se aplicaron, semanalmente, 26 mL de agua por cada 100 cm2 de área

25

de plantas briófitas, con el fin de obtener la humedad relativa promedio de 75

%HR (Sánchez, 2011).

2.1.2. MÉTODOS UTILIZADOS PARA LA OBTENCIÓN DE EXTRACTOS D E

PLANTAS BRIÓFITAS PARA LA DETERMINACIÓN DE LA PRESE NCIA

DE TERPENOS

Para la obtención de los extractos vegetales de las plantas briófitas, se probaron

tres métodos, entre los cuales fue seleccionado aquel que permitiera la

identificación de la presencia de terpenos, en la Tabla 2.1 se indican los métodos

utilizados y además los extractos obtenidos con cada método.

Tabla 2.1. Enumeración de los métodos utilizados para la obtención de extractos de plantas briófitas y la codificación de cada extracto

Método Extracto Código

Extracción soxhlet con metanol

Extracto concentrado soxhlet 1 S1c

Extracto concentrado soxhlet 2 S2c

Extracción con metanol asistida con ultrasonido

Extracto ultrasonicado 1 U1

Extracto ultrasonicado 1 concentrado U1c





Extracción y maceración con metanol

Extracto macerado 1 M1

Extracto macerado 1 concentrado M1c

Tabla 2.1. Enumeración de los métodos utilizados para la obtención de extractos de plantas briófitas y la codificación de cada extracto (Continuación...)

Método Extracto Código

Extracción y maceración con metanol

Extracto macerado 2 M2

Extracto macerado 2 concentrado M2c

Para el análisis de los extractos obtenidos con los tres métodos, se procedió a

inyectar al GC/MS primero los extractos concentrados, ya que al eliminar el

26

solvente los extractos podrían contener mayor cantidad de los compuestos de

interés. Después, se inyectaron los extractos no concentrados, para verificar si al

no estar concentrados los extractos también presentan los analitos de interés.

2.1.2.1. Método de extracción soxhlet con metanol

El primer método utilizado para obtener los extractos vegetales de plantas

briófitas consistió en la utilización de un equipo soxhlet y metanol. El metanol

utilizado fue de grado HPLC (Núñez, 2008).

• Se pesaron 5 g de plantas briófitas, que se empacaron en un cartucho de

papel filtro que se colocó en el soxhlet.

• Se añadieron 75 mL de metanol, grado HPLC, al balón conectado al soxhlet.

Este volumen permitió cubrir el cartucho y garantizar que el balón no quedara

seco. La extracción se realizó durante 5 h, con una manta de calentamiento a

60 ºC. Esta temperatura aseguró que el metanol llegara a su temperatura de

ebullición, la cual fue calculada según la ecuación de Sidney Young y que en

la ciudad de Quito es de 56 ºC (Dimas, 2008).

• Después de este tiempo, se concentró la muestra hasta 30 mL en un

rotavapor, a una temperatura de 60 ºC y se verificó que el extracto (S1c) no

presentara ningún residuo sólido.

• Se colocó el extracto S1c en un vial, color ámbar, para inyectarlo al GC/MS

donde se comprobó la presencia/ausencia de terpenos. El diagrama de flujo

de este método se observa en la Figura 2.1.

Este mismo método fue modificado con la aplicación de un tiempo de extracción

de 10 h y se obtuvo un segundo extracto concentrado (S2c) que también fue

analizado.

27

Figura 2.1. Diagrama del proceso para la obtención de extractos de plantas briófitas en un equipo soxhlet con metanol

2.1.2.2. Método de extracción con metanol asistida con ultrasonido

El segundo método utilizado para obtener los extractos vegetales de plantas

briófitas correspondió a una extracción con metanol, grado HPLC, asistida con

ultrasonido (Azuola y Vargas, 2007).

• Se pesaron 5 g de plantas briófitas y se colocaron en un vaso de precipitación.

Se agregaron 60 mL de metanol, grado HPLC, y la mezcla se colocó dentro

del baño ultrasónico durante 1 h.

• Después de este tiempo, el extracto (U1) se filtró al vacío y se verificó que el

filtrado no presentara ningún residuo sólido. Se tomaron 15 mL del extracto

U1 filtrado y fueron concentrados en un rotavapor, a una temperatura de 60

ºC, para obtener el extracto U1c.

28

• Se colocaron los extractos U1 y U1c en viales para inyectarlos al GC/MS,

donde se comprobó la presencia/ausencia de terpenos, se inyectó primero el

extracto U1c y posteriormente el extracto U1. El diagrama de flujo de este

método se observa en la Figura 2.2.

Figura 2.2. Diagrama del proceso para la obtención de extractos de plantas briófitas con metanol y ultrasonido

Se realizaron dos modificaciones del método de extracción asistida con

ultrasonido. En la primera modificación, se incrementó la cantidad de plantas

briófitas y se las sometió a un proceso de molienda, con el volumen adecuado

para cubrir la mezcla. En la segunda modificación, se incrementó la cantidad de

plantas briófitas molidas y, finalmente, se realizó una maceración durante cuatro

semanas.

Estos procesos modificados se describen a continuación:

a) Primera modificación del método de extracción asistida con ultrasonido

• Se pesaron 30,5 g de plantas briófitas, las mismas que fueron molidas en un

mortero. Las plantas molidas se colocaron en un vaso de precipitación.

29

• A estas plantas fueron agregados 50 mL de metanol grado HPLC. La mezcla

se sometió al ultrasonido durante 1h.

• El extracto (U2) se filtró al vacío y se verificó que el filtrado no presentara

ningún residuo sólido; se tomó 15 mL del extracto U2 para concentrarlo en un

rotavapor y se obtuvo un extracto concentrado (U2c).

• Los extractos U2 y U2c se colocaron en sus respectivos viales para,

posteriormente, inyectarlos al GC/MS, donde se comprobó la

presencia/ausencia de terpenos, se inyectó primero el extracto U2c y

finalmente el extracto U2.

b) Segunda modificación del método de extracción asistida con ultrasonido

• Se pesaron 57,0 g de plantas briófitas. Estas plantas fueron molidas en un

mortero.

• Las plantas molidas se colocaron en un vaso de precipitación y se agregaron

100 mL de metanol grado HPLC.

• Esta mezcla fue sometida al ultrasonido durante 1 h. Después de este tiempo,

la mezcla se colocó en un frasco de 250 mL, color ámbar, para dejarlo

macerar durante 4 semanas a temperatura ambiente.

• Se filtró al vacío el extracto macerado de plantas briófitas (U3) y se verificó

que el filtrado no presentara ningún residuo sólido. Se tomaron 15 mL del

extracto U3, ya filtrado, se concentraron en un rotavapor y se obtuvo un

extracto concentrado (U3c).

• Se colocaron los extractos U3 y U3c en viales, para inyectarlos al GC/MS,

donde se comprobó la presencia/ausencia de terpenos. Primero se inyectó el

extracto U3c y posteriormente el extracto U3.

30

2.1.2.3. Método de extracción y maceración con metanol

El tercer método utilizado para la obtención de extractos vegetales de plantas

briófitas consistió en un proceso de extracción y maceración con metanol

(Asakawa et al., 1987). El diagrama de flujo de este método se observa en la

Figura 2.3.

Figura 2.3. Diagrama del proceso para la obtención de extractos de plantas briófitas mediante maceración con metanol, grado HPLC

• Se pesaron 220 g de plantas briófitas, que fueron secadas a temperatura

ambiente.

• Las plantas fueron colocadas en una botella de 750 mL, color ámbar y se

añadieron 350 mL de metanol.

• La mezcla se dejó macerar durante 4 semanas en un lugar oscuro a

temperatura ambiente.

31

• Al término de este tiempo, se filtró al vacío el extracto macerado de plantas

briófitas (M1). Además, se tomaron 15 mL del extracto M1 filtrado y se

concentraron en un rotavapor, a una temperatura de 60 ºC, para obtener un

extracto concentrado (M1c).

• Los extractos M1 y M1c fueron filtrados en Millipore de 0,45 µm. Se verificó

que los filtrados no presentaran ningún residuo sólido.

• Se colocaron los extractos filtrados M1 y M1c en viales para, posteriormente,

inyectarlos al GC/MS, donde se comprobó la presencia/ausencia de terpenos.

El primer extracto inyectado fue el M1c y después el extracto M1.

Se realizó una variación de este método para determinar si con una masa menor

de plantas briófitas se logra obtener los mismos resultados, según la siguiente

descripción:

• Se pesaron 50 g de plantas briófitas, las mismas que fueron molidas en un

mortero y se colocaron en una botella color ámbar de 250 mL.

• Se añadieron 100 mL de metanol, grado HPLC y se dejó macerar la mezcla,

durante 4 semanas, en un lugar oscuro, a temperatura ambiente.

• Al término de este tiempo, el extracto macerado de plantas briófitas (M2) se

filtró al vacío. Se tomaron 15 mL del extracto filtrado para concentrarlos en un

rotavapor y se obtuvo un extracto concentrado (M2c).

• Los extractos M2 y M2c fueron filtrados a través de un Millipore de 0,45 µm y

se verificó que los extractos no presentaran ningún residuo sólido.

• Se colocaron los extractos M2 y M2c en viales para, posteriormente,

inyectarlos al GC/MS, donde se comprobó la presencia/ausencia de terpenos.

Se inyectó primero el extracto M2c y finalmente el extracto M2.

32

2.2. DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE TERPENOS EN

EXTRACTOS VEGETALES

Para determinar la presencia de terpenos en los extractos vegetales de plantas

briófitas se utilizó la técnica de GC/MS, bajo las condiciones que se presentan en

la Tabla 2.2, que corresponden al método descrito por Pendergrass (1996). Se

realizó una modificación del método antes mencionado ya que la columna

utilizada en el presente estudio fue ZB-5ms (30 m; 0,25 mm; 0,25 µm).

Tabla 2.2. Condiciones del GC/MS CLARUS 500 para la determinación de terpenos

Condiciones del equipo Valor Unidad

Volumen de inyección 1 µL

Temperatura de inyección 250 ºC

Temperatura del detector 300 ºC

Gas transportador, helio (He) 30 mL/min

Tiempo de corrida 36 min Fuente: Pendergrass (1996)

La programación de temperatura del horno del GC/MS, que se utilizó en este

método fue una variación de lo descrito por Pendergrass (1996), debido a el quipo

y la columna utilizados y se detalla en forma gráfica, en la Figura 2.4.

0

50

100

150

200

250

300

0 10 20 30 40

Tem

pe

ratu

ra (

°C

)

Tiempo (min)

33

Figura 2.4. Perfil de temperatura del horno utilizado para el análisis de terpenos en el GC/MS Clarus 500

Todos los extractos elaborados fueron inyectados 2 veces al GC/MS. De los

cromatogramas obtenidos se seleccionó el cromatograma con picos

cromatográficos simétricos y bien resueltos.

En el programa Turbo-mass se analizaron todos los picos presentes en los

cromatogramas, una vez obtenido el espectro de cada uno de ellos, se los

comparó con la base de datos de los compuestos de la librería NIST (Instituto

Nacional de Estándares y Tecnología), para identificarlo y establecer una

probabilidad de correspondencia y verificar así la presencia/ausencia de terpenos.

2.3. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE ÁCIDO

ASCÓRBICO EN EXTRACTOS VEGETALES

Para la determinación del contenido de ácido ascórbico, las muestras fueron

enviadas al laboratorio Labolab, que utilizó la técnica de cromatografía líquida de

alta resolución (Labolab, 2009).

• Para determinar el contenido de ácido ascórbico en las plantas briófitas se

pesó, exactamente, 1 g de las mismas.

• Las plantas pesadas se colocaron en un mortero y se agregó ácido

metafosfórico al 6%, para obtener una muestra homogénea.

• Se colocó la mezcla en un balón de 100 mL y se aforó con el mismo ácido. Se

dejó en reposo media hora en la oscuridad.

• Luego se filtró en papel libre de cenizas, a temperatura ambiente, y se inyectó

al equipo HPLC a las condiciones presentadas en la Tabla 2.3. La columna

utilizada en el presente estudio fue 6x139 mm packing L39 y la fase móvil fue

fostafo monosódico al 1% (Labolab, 2009).

34

Tabla 2.3. Condiciones que se utilizaron en el HPLC para la determinación del contenido de ácido ascórbico en las muestra de plantas briófitas

Condiciones del equipo Valor Unidades

Longitud de onda 264 Nm

Temperatura 20 – 25 ± 1 ºC

Flujo 0,6 mL/min

Volumen de inyección 4 µL

Fuente: Labolab (2009).

2.4. EVALUACIÓN DEL CONTENIDO DE ÁCIDO ASCÓRBICO EN

BRIÓFITAS EXPUESTAS A UNA DOSIS DE GLIFOSATO

2.4.1. APLICACIÓN DE UNA DOSIS DE GLIFOSATO A LAS PLANTAS

BRIÓFITAS

El área de cada muestra de plantas briófitas utilizada para la aplicación del

glifosato fue de 2 925 cm2, las mismas que no eran exactamente iguales ni

homogéneas, puesto que no se trataba de una sola especie de plantas.

El establecimiento de la concentración del 20,2 % de glifosato, que se aplicó a las

plantas briófitas en esta investigación, se basó en lo reportado por Sánchez

(2011). Esta dosis de glifosato se utilizó debido a que causó deterioro evidente,

pero paulatino en las plantas briófitas.

Para la aplicación del glifosato, se utilizó la fórmula comercial Ranger 480, la cual

se preparó en una solución al 20,2 %. El volumen necesario para fumigar los

2 925 cm2 de cada unidad experimental fue de 1 462,5 mL (Sánchez, 2011).

Se realizó una sola aplicación de la solución de glifosato mediante la utilización de

aspersores plásticos de 250 mL. La fumigación de las diferentes muestras se

35

ejecutó de tal manera, que la distribución del herbicida fuera homogénea en toda

el área.

2.4.2. DISTRIBUCIÓN DE LAS MUESTRAS DE PLANTAS BRIÓFITAS P ARA

LA EVALUACIÓN DEL CONTENIDO DE ÁCIDO ASCÓRBICO

Se prepararon 4 muestras de plantas briófitas, cada una de un área de 2 925 cm2,

las cuales fueron fumigadas una sola vez, como se indicó en el acápite 2.4.1. Se

evaluaron las muestras semanalmente, como se indica en la Tabla 2.4.

Tabla 2.4. Codificación y tiempo de recolección de los extractos expuestos a la acción de una dosis glifosato, para la evaluación del contenido de ácido ascórbico

Muestra Código de la muestra

Tiempo de recolección (semana)

Testigo TAA0 0

Muestra para evaluación de ácido ascórbico (1) MAA1 1



La muestra testigo (TAA0) se envío al laboratorio Labolab antes de aplicar la

fumigación con glifosato.

Las muestras MAA1, MAA2 y MAA3 fueron fumigadas con 1 462,5 mL, de una

solución de glifosato al 20,2 %. Las muestras fueron enviadas a los laboratorios

de Labolab, inmediatamente después de su recolección para determinar el

contenido de ácido ascórbico mediante HPLC, según se detalló en el acápite 2.3.

Se tomó a la muestra TAA0 como referencia para determinar el porcentaje de

disminución del contenido de ácido ascórbico de las demás muestras, según el

tiempo de recolección.

36

2.5. EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE TERPENOS EN

BRIÓFITAS EXPUESTAS A UNA DOSIS DE GLIFOSATO

Se prepararon 3 muestras de plantas briófitas, cada una de un área de 9 180 cm2.

El área de las muestras fue cuatro veces el área indicada en el acápite 2.4.1, ya

que para cada semana de evaluación se tomaron 2 295 cm2 de muestra.

El área de las 3 muestras después de retirar los 2 295 cm2, que se utilizaron para

realizar los extractos respectivos y determinar la presencia de terpenos sin la

exposición a una dosis de glifosato, modificó el área de las muestras a 6 885 cm2.

Estos extractos fueron codificados según se detalla en la Tabla 2.5 y cuyos

resultados se muestran en el acápite 3.2.

Tabla 2.5. Codificación de los extractos de las tres muestras sin la exposición a la acción del glifosato

Extractos sin la aplicación de glifosato Código del extracto

Tiempo de recolección (semanas)

Réplica 1 sin aplicación de glifosato 1MT0 0



Las 3 muestras de 6 885 cm2 fueron fumigadas con 4 387,5 mL, con una solución

de glifosato al 20,2 %. Después de una semana de la fumigación se recolectaron,

de cada muestra 2 295 cm2, lo que corresponde a la cantidad necesaria para la

realización del extracto. De igual manera, se recolectaron 2 295 cm2 de cada

muestra, a la segunda y tercera semana de fumigación. Estas muestras fueron

codificadas como se muestra en la Tabla 2.6.

Tabla 2.6. Codificación de las muestras testigo y las tres repeticiones expuestas a la acción del glifosato

Muestras con aplicación de una dosis única de

glifosato Código del extracto

Tiempo de recolección (semanas)

Réplica 1 con aplicación de glifosato, semana 1 1MT1 1


37








Todas las muestras fueron utilizadas para realizar los respectivos extractos de

plantas briófitas con el método seleccionado, de acuerdo con los resultados del

acápite 2.1.

Cuando se determinó la presencia de terpenos en todos los extractos, se evaluó

el área de cada uno de los picos de los cromatogramas en los que se identificaron

estos compuestos. Estas áreas fueron relacionadas con el volumen extraído y

fueron normalizadas a un solo volumen, correspondiente al obtenido con una

muestra preliminar de 78,5 mL. Esta relación permitió obtener un área

normalizada, para realizar comparaciones. El cálculo se realizó con el uso de la

ecuación (1), que se presenta a continuación:

��

�

[1]

Donde:

An: área normalizada

A1: área del pico de un terpeno que se reporta en el cromatograma de un

extracto de plantas briófitas

V1: volumen del extracto inicial de plantas briófitas analizado en el GC/MS, en

mL.

Vo: volumen referencial del extracto de plantas briófitas = 78,5 mL.

Con la información de las áreas normalizadas de los picos, correspondientes a

terpenos de cada extracto, se realizaron los promedios de las réplicas en las 3

semanas de evaluación, como se muestra en la Tabla 2.7 y se estableció si

38

existía variación de la áreas normalizadas de los picos cromatográficos de cada

replica de las plantas expuestas a la acción de una dosis de glifosato, respecto a

las plantas que no fueron fumigadas.

Tabla 2.7. Codificación de los valores promedios de áreas calculados de los extractos para la evaluación de terpenos

Nombre Código Tiempo de recolección (semanas)

Promedio de las replicas: 1MT0, 2MT0 y 3MT0 MT0p 0




Finalmente, se tomó el valor del promedio MT0p como referencia para determinar

el porcentaje de disminución de cada promedio según su tiempo de recolección.

39

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1. ESTABLECIMIENTO DE UN MÉTODO DE OBTENCIÓN DE

EXTRACTOS ORGÁNICOS DE PLANTAS BRIÓFITAS PARA

LA DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE TERPENOS

Todos los extractos de plantas briófitas, obtenidos para la identificación de la

presencia de terpenos, fueron inyectados en el equipo GC/MS. Este análisis

permitió seleccionar el método para determinar la presencia de terpenos.

3.1.1. OBTENCIÓN DE EXTRACTOS DE PLANTAS BRIÓFITAS POR EL

MÉTODO DE EXTRACCIÓN SOXHLET CON METANOL

En este caso, se obtuvieron dos extractos de plantas briófitas, S1c y S2c, los

cuales se diferenciaron por el tiempo de extracción en el soxhlet. Estos dos

extractos fueron evaluados según la presencia/ausencia de terpenos.

El cromatograma obtenido del análisis del extracto S1c, que se muestra en la

Figura 3.1, el espectro de masas y el reporte de la librería NIST se observan en el

Anexo B.

Figura 3.1. Cromatograma del extracto obtenido con metanol, 5,0 g de plantas briófitas y 5

h en el soxhlet (extracto S1c)

2.50 4.50 6.50 8.50 10.50 12.50 14.50 16.50 18.50 20.50 22.50 24.50 26.50 28.50 30.50 32.50 34.50 36.50 38.500

100

%

090902 muestra evep soxleth1 Scan EI+ 1.78

Tiempo

(min)

40

El extracto S1c mostró únicamente la presencia del solvente, lo que podría

deberse a que el tiempo de extracción utilizado no fue el suficiente, ya que

pudieron extraerse de la muestra de plantas briófitas solo las fracciones de fácil

separación. Por esta razón, se decidió incrementar el tiempo de extracción para

incrementar el número de sifoneadas que realiza el equipo soxhlet y una mayor

extracción.

Al incrementar el tiempo de extracción en el soxhlet a 10 h, se obtuvo el extracto

S2c, el cual, después de ser analizado, también mostró únicamente la presencia

del solvente. El cromatograma del extracto S2c se muestra en la Figura 3.2 y su

espectrograma de masas y respectivo reporte de la librería NIST se observa en el

Anexo B.

Figura 3.2. Cromatograma del extracto obtenido con metanol, 5,0 g de plantas briófitas y

10 h en el soxhlet (extracto S2c)

Los resultados obtenidos con el método de extracción soxhlet, al utilizar 5 g de

plantas briófitas y metanol, grado HPLC, como solvente, no mostraron la

presencia de terpenos, por lo que se descartó este método.

2.50 4.50 6.50 8.50 10.50 12.50 14.50 16.50 18.50 20.50 22.50 24.50 26.50 28.50 30.50 32.50 34.50 36.50 38.500

100

%

1.78

Tiempo

(min)

41


MÉTODO DE EXTRACCIÓN CON METANOL ASISTIDA CON

ULTRASONIDO

Para aplicar este método se utilizaron 3 cantidades de plantas briófitas, los

mismos que fueron evaluados según la presencia/ausencia de terpenos. Los

pesos utilizados fueron 5,0; 30,5 y 57,0 g de plantas briófitas, cantidades

establecidas por la disponibilidad de la muestra.

Una fracción de cada extracto obtenido con los pesos antes mencionados, fue

concentrada y otra no. En total, se obtuvieron seis extractos de plantas briófitas a

ser analizados.

Los 2 cromatogramas correspondientes al análisis de los extractos de plantas

briófitas U1 y U1c se presentaron similares al cromatograma del solvente. El

espectrograma de masas y el reporte de la librería NIST se muestra en el Anexo

B.

Estos resultados pueden tener relación con la pequeña cantidad de plantas

utilizada que, probablemente, no permitió identificar los analitos de interés. Por

esta razón, se decidió incrementar la masa de la muestra.

Se incrementó el peso de las plantas briófitas a 30,5 g, para obtener un nuevo

extracto U2. En este caso, se molieron previamente las plantas, con la ayuda de

un mortero para incrementar el área de contacto con el solvente.

Los dos extractos U2 y U2c mostraron cromatogramas similares al del solvente.

El espectrograma de masas y el reporte de la librería NIST se observa en el

Anexo B.

Se decidió, entonces, realizar otra prueba con un peso de la muestra de 57 g

(extracto U3). En la Figura 3.3 se muestra el cromatograma del extracto U3.

42

3.00 5.00 7.00 9.00 11.00 13.00 15.00 17.00 19.00 21.00 23.00 25.00 27.00 29.00 31.00 33.00 35.000

100

%

091026 br6 b1.43

1.52

1.75

30.59

Figura 3.3. Cromatograma del extracto obtenido con metanol, 57 g de plantas briófitas y 1

h en el ultrasonido (extracto U3)

Como se puede observar en la Figura 3.3, el cromatograma presentó un pico a los

30,59 min. El espectrograma de masas de este pico fue analizado con la librería

NIST, la cual lo identificó como un éster metílico del ácido 10, 13 dimetil

tetradecanoico. El reporte de la librería NIST de este pico y su espectrograma de

masas se pueden observar en el Anexo B.

De acuerdo con la información presentada por Morantes et al. (2007) y Glime

(2007), el resultado obtenido podría atribuirse a la presencia de ácidos grasos en

las plantas briófitas.

En el caso del extracto concentrado (U3c) el cromatograma mostró solamente la

presencia del solvente, este comportamiento podría deberse a que el éster que se

presentó en el extracto U3 se degradó debido a la interacción con los demás

compuestos presentes en el extracto, los cuales pudieron otorgar las condiciones

necesarias para que el éster se degradara (Caglieri y Macaño, 2009). El espectro

y el reporte de la librería NIST del extracto U3c se muestra en el Anexo B

Tiempo (min)

43

La utilización de este método se descartó para la obtención de extractos

vegetales de plantas briófitas, puesto que no se detectó la presencia de terpenos.


MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y MACERACIÓN CON METANOL

En este método se utilizaron 50,0 y 220,0 g de plantas briófitas. El extracto

realizado con 50,0 g de plantas briófitas (M2) y su muestra concentrada (M2c)

fueron inyectados en el GC. Los cromatogramas de cada uno de los extractos M2

y M2c no evidenciaron la presencia de terpenos, sino solamente la del solvente

utilizado.

Estos resultados coinciden con los obtenidos al utilizar las otras metodologías, en

las que se pesaron cantidades menores a 50 g de plantas briófitas, para la

obtención de los extractos.

El extracto concentrado, obtenido con 220 g de plantas briófitas (M1c), presentó

un cromatograma con varios picos, como se muestra en la Figura 3.4.

Figura 3.4. Cromatograma del extracto M1c

26.94 27.44 27.94 28.44 28.94 29.44 29.94 30.44 30.94 31.44 31.94 32.44 32.94 33.44 33.94 34.44 34.94 35.44 35.940

100

%

091026 br1 a30.59

30.30

34.08

32.55

32.48

31.69

31.02

31.39

31.8732.01

33.70

32.66

32.92

33.15

34.53

34.31

35.16

34.84

35.52

35.93

1

2

3 5

4

8

7

6 10

9

Tiempo (min)

44

Se evaluaron los espectros de los picos predominantes, con la librería de

espectros de masas NIST. La Tabla 3.1 muestra los nombres de los compuestos

identificados y su correspondencia o no con la estructura de un terpeno.

Tabla 3.1. Identificación de los picos enumerados en el cromatograma del extracto M2c

Probabilidad Nº del pico

Tiempo de retención

(min) Nombre del compuesto Terpeno

907 1 30,59 Éster metílico del ácido 10, 13 dimetil

tetradecanoico No

790 2 31,02 Ácido eicosanoico No

831 3 31,69 Furanocumarinas No

759 4 32,55 Ácido 11,14,17 eicosatrienoico No

750 5 32,66 Isofitol No


796 7 34,08 Ácido 5, 8, 11, 14 eicosatetraenoico No

781 8 34,53 Sigmasterol No



Como se puede observar en la Tabla 3.1, los compuestos identificados con la

librería de espectros de masas no corresponden a terpenos.

Los picos 2, 4 y 7 corresponden a ácidos grasos y el pico 1 es un éster metílico de

ácido graso; estos resultados coinciden con lo descrito por Morantes et al. (2007)

y Glime (2007), quienes identificaron la presencia de ácidos grasos en plantas

briófitas.

Los picos 3, 6, 9 y 10 fueron identificados como furanocumarinas, cumarinas que

se pueden encontrar en plantas briófitas, según lo reportado por Morantes et al.

(2007) y Glime (2007). Las cumarinas son metabolitos secundarios y su

determinación se puede realizar mediante la utilización de la técnica GC/MS

(Bogdal, 1998).

EL pico 5 corresponde al isofitol, un alcohol sintetizado en las plantas, al igual que

45

otros compuestos como los terpenos que se pueden determinar con la técnica de

GC/MS (Ordaz et al., 2011).

El pico 8 fue identificado como sigmasterol que es un fitoesterol. Los fitoesteroles

son esteroles de origen vegetal que tienen amplia distribución en la naturaleza y

su estructura es similar a la del colesterol (Valenzuela y Ronco, 2004).

Una vez evidenciada la ausencia de terpenos en el cromatograma del extracto

M1c, se procedió a inyectar el extracto no concentrado (M1), de la misma

muestra, al GC/MS.

En la Figura 3.5 se muestra el cromatograma del extracto M1.

10.50 15.50 20.50 25.50 30.50 35.50 40.50 45.500

100

%

20100831 repeteticion t01a24.82

18.12

11.47

24.4420.39

23.42

27.27

27.17

25.63

29.32

27.39

27.61 29.38

Figura 3.5. Cromatograma del extracto M1

En la Figura 3.5, se observa que se presentaron 5 picos predominantes. Los

espectrogramas de masas de estos picos fueron analizados con la librería de

espectros de masas NIST. En la Tabla 3.2 se muestran los nombres de los

compuestos identificados.

1

2

3

5

4

Tiempo (min)

46

Tabla 3.2. Identificación de los picos presentes en el cromatograma del extracto M1

Probabilidad Nº del pico

Tiempo de retención

(min) Nombre del compuesto Terpeno

843 1 18,12 Ciclopentanona No

759 2 20,39 Gama muuroleno Si

944 3 24,82 Éster metílico del ácido 10, 13 dimetil

tetradecanoico No

897 4 27,17 Ácido 9,12 Octadecadienoico No

853 5 27,27 Ácido 9,12,15 Octadecatrienoico No

El pico 1 corresponde a la ciclopentanona, la cual es un derivado de los ácidos

grasos y participa en la biosíntesis de los jasmonatos (García, 2008).

El pico 2 fue identificado como gama muuroleno, un sesquiterpeno presente en

plantas, según lo reportado por Ordaz et al. (2011).

Los picos 3, 4 y 5 corresponden a ácidos grasos o sus derivados (García, 2008).

Por este resultado, se escogió como método de obtención de extractos vegetales

de plantas briófitas, para la determinación de la presencia de terpenos, al

tratamiento de 220 g de plantas briófitas con 350 mL de metanol, grado HPLC

como solvente, durante 4 semanas de maceración.

3.2. DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE TERPENOS EN LOS

EXTRACTOS ORGÁNICOS DE PLANTAS BRIÓFITAS

Los resultados de la presencia de terpenos en los extractos 1MT1, 2MT1, 3MT1,

1MT2, 2MT2, 3MT2, 1MT3, 2MT3, 3MT3 se mostrarán en el acápite 3.3, donde se

evaluará la presencia de terpenos al estar sometidos a la acción de una dosis de

glifosato.

En los extractos 1MT0, 2MT0, 3MT0, se determinó la presencia de terpenos, y los

47

resultados se muestran a continuación.

En la Figura 3.6, se observa el cromatograma de la muestra denominada 1MT0.

11.00 13.00 15.00 17.00 19.00 21.00 23.00 25.00 27.00 29.00 31.00 33.00 35.000

100

%

20100831 repeteticion t01b24.82

18.13

11.47

24.45

20.3923.42

27.28

27.18

25.64

29.33

27.40

27.61 29.38

Figura 3.6. Cromatograma del extracto 1MT0

El pico de interés se presentó a los 20,39 min. El espectrograma de masas de

este pico fue analizado con la librería NIST, la cual lo identificó como gama

muuroleno, con una probabilidad de 75,9 %, el cual se observa en la Figura 3.7.

El reporte de la librería NIST para este pico se muestra en el Anexo C.

Figura 3.7. Espectrograma de masas del pico que se presentó a los 20,39 min, identificado como gama-muuroleno del extracto 1MT0

El cromatograma del extracto 2MT0 se presenta en la Figura 3.8. El pico de

interés del cromatograma de la Figura 3.8 fue el que se presentó a los 20,41 min.

49 59 69 79 89 99 109 119 129 139 149 159 169 179 189 199 209m/z0

100

%

6.70e5161

119

10595

795553 6958 67 71

77

9381

91109

121

133 136204

162189

Tiempo (min)

Gama muuroleno

48

Según el reporte de la librería NIST, que se muestra en el Anexo C, este pico fue

identificado como gama muuroleno, con una probabilidad de 85 %. Su

espectrograma de masas se muestra en la Figura 3.9.

11.00 13.00 15.00 17.00 19.00 21.00 23.00 25.00 27.00 29.00 31.00 33.00 35.000

100

%

20100831 repeteticion t02c27.32

24.85

20.41

18.11

24.46

23.4322.6721.24

27.21

25.40

29.36

27.43

27.62

29.42

29.56



El cromatograma del extracto 3MT0 se muestra en la Figura 3.10. El pico de

interés se presentó a los 20,40 min. Su espectro fue analizado en la librería NIST

y se muestra en el Anexo C. El pico fue identificado como gama muuroleno, con

una probabilidad de 80,7 % y su espectrograma de masas se muestra en la

Figura 3.11.

El gama muuroleno es un sesquiterpeno, el cual es un componente presente en

plantas, según lo reportado por Ordaz et al. (2011). La presencia de terpenos en

estos extractos coincide con los resultados obtenidos por Morantes et al. (2007)

49 59 69 79 89 99 109 119 129 139 149 159 169 179 189 199 209m/z0

100

%

2.08e6161

119

1059593

795553 6958 67 71

77

81

82 96 109 117

121

133122 136147 160

204162

189 205

Tiempo (min)

Gama muuroleno

49

que encontraron estos metabolitos secundarios en el musgo Polytrichum

juniperinum.

11.00 13.00 15.00 17.00 19.00 21.00 23.00 25.00 27.00 29.00 31.00 33.00 35.000

100

%

29.3927.32

24.84

20.40

18.1115.71

24.45

27.20

25.46

27.43

29.44

29.57



3.3. PRESENCIA DE TERPENOS EN LOS EXTRACTOS

ORGÁNICOS DE PLANTAS BRIÓFITAS EXPUESTAS A LA

ACCIÓN DE UNA DOSIS DE GLIFOSATO

Después de transcurrida una semana de la aplicación de la dosis de glifosato, se

obtuvieron los cromatogramas de los extractos 1MT1, 2MT1 y 3MT1, a partir de las

muestras tratadas con glifosato. En la Figura 3.12 se observa el cromatograma

del extracto 1MT1.

49 59 69 79 89 99 109 119 129 139 149 159 169 179 189 199 209m/z0

100

%

1.09e6161

119

1059593

795553 6958 67 71

77

81

96 109

121

133122 136204

162189 205

Tiempo (min)

Gama muuroleno

50

11.00 13.00 15.00 17.00 19.00 21.00 23.00 25.00 27.00 29.00 31.00 33.00 35.000

100

%

24.77

24.39

20.3316.45

11.06 19.3118.04

23.3622.72

22.30

29.95

27.22

27.11

25.38 26.66

27.3429.26

27.55

32.82

32.34

31.20


Se evaluó el espectrograma de masas del pico que se presentó a los 20,33 min

con la librería NIST, el cual se identificó como copaeno, con una probabilidad de

81,6 % y se observa en la Figura 3.13. El reporte de la librería se muestra en el

Anexo D.

Figura 3.13. Espectrograma de masas del pico que se presentó a los 20,33 min, identificado como copaeno del extracto 1MT1

El cromatograma del extracto 2MT1 se observa en la Figura 3.14. En el Anexo D,

se muestra el reporte de la librería NIST que identificó al pico que se presentó a

los 20,34 min como alfa cubebeno, con una probabilidad de 75 %. El

50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210m/z0

100

%

1.05e6161

119

10595

9381796955

5358 67

7177

91

8396 109

121

133122 136147

204162

189 205

Tiempo (min)

Copaeno

51

espectrograma de masas del pico mencionado que se indica en la Figura 3.15.

11.00 13.00 15.00 17.00 19.00 21.00 23.00 25.00 27.00 29.00 31.00 33.00 35.000

100

%

29.99

24.75

22.74

19.33

12.92

10.24

11.6410.80

15.8315.08

18.2717.06

22.44

19.54

20.3421.37

22.89

23.09

23.36

27.22

27.12

26.91

27.29

27.56

29.2528.55

32.94

32.54

31.21

30.82


Figura 3.15. Espectrograma de masas del pico que se presentó a los 20,34 min, identificado como alfa cubebeno del extracto 2MT1

En el cromatograma del extracto 3MT1 no se identificaron terpenos, esto

corresponde a un valor atípico, el cual es aceptable ya que se trabajó una

muestra de plantas que tuvieron edades diferentes, estados diferentes e incluso

49 59 69 79 89 99 109 119 129 139 149 159 169 179 189 199 209m/z0

100

%

280910 1 semana r2a 2057 (20.340) Cm (2050:2064-(2064:2103+2017:2050)) Scan EI+ 6.73e5161

11910595

81795855

53

69

6759 65

71

77

9388

83 9197 109

121

133 136 204162

Tiempo (min)

Alfa cubebeno

52

de concentraciones del compuesto de interés diferentes.

Al cabo de la segunda semana, después de la fumigación se procesaron los

extractos de plantas briófitas, expuestas a la acción del glifosato, y se obtuvieron

los siguientes cromatogramas:

a) En la Figura 3.16 se muestra el cromatograma del extracto 1MT2.

b) En la Figura 3.18 se muestra el cromatograma del extracto 2MT2.

c) En la Figura 3.20 se muestra el cromatograma del extracto 3MT2.

19.65 19.85 20.05 20.25 20.45 20.65 20.85 21.05 21.25 21.45 21.650

100

%

280910 2 semana r1b Scan EI+

7.31e619.73;55

19.5655

19.6588

20.888820.36

58

20.7788

20.5288

21.0588 21.60

5821.25

8821.43

88


En la Figura 3.17 se muestra el espectrograma de masas del pico que se

presentó a los 20,36 min.

Tiempo (min)

Muurolanodieno

53

Figura 3.17. Espectrograma de masas del pico que se presentó a los 20,36 min,

identificado como muurolanodieno del extracto 1MT2

18.27 18.77 19.27 19.77 20.27 20.77 21.27 21.77 22.27 22.77 23.27 23.77 24.270

100

%

280910 2 semana r2b Scan EI+

2.07e722.70;55

19.3188

18.0088

19.5255

22.605522.41

55

22.305519.73

88

20.3588

22.8755

23.0755

23.3488

24.595824.37

8824.14100

23.7388


En la Figura 3.19 se observa el espectrograma de masas del pico que se presentó

a los 20,35 min.

Figura 3.19. Espectrograma de masas del pico que se presentó a los 20,35 min, identificado como muurolanodieno del extracto 2MT2

53 73 93 113 133 153 173 193 213 233 253 273 293m/z0

100

%

7.02e4161

119

58

55

53

1059579

716759 938199 109

121

136127 152147 207162

195187172 179 285271243234222 263258292

50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210m/z0

100

%

2.11e5161

119

10595

795855 6967 71 77 9381 91

8796 100 109 117

121133124

147136 204162

173

Tiempo (min)

Muurolanodieno

54

16.95 17.95 18.95 19.95 20.95 21.95 22.95 23.95 24.95 25.95 26.950

100

%

280910 2 semana r3a Scan EI+

2.10e722.70;55

19.668819.32

5519.0288

18.0358

19.7288

22.4155

22.3058

20.3558 21.62

58

24.7274

22.8755

23.0755

24.1410023.35

58 23.6658

24.3858 26.73

19324.9958


El espectrograma de masas del pico que se presentó a los 20,35 min se muestra

en la Figura 3.21.


En la segunda semana de fumigación, los 3 extractos evaluados presentaron el

pico de interés que, en cada caso, fue analizado con la librería NIST, la cual los

identificó como muurolanodieno. Las probabilidades de los 3 picos analizados

fueron de 63,9%, 66,3% y 61,3%, respectivamente, para los espectrogramas de

masas de los cromatogramas presentados en las Figuras 3.17, 3.19 y 3.21. Los

reportes de la librería para cada uno de los picos se indican en el Anexo D.

Finalmente, al cabo de las 3 semanas después de la fumigación se evaluaron los

51 61 71 81 91 101 111 121 131 141 151 161 171 181 191 201 211 221 231 241 251 261 271 281 291m/z0

100

%

280910 2 semana r3a 2059 (20.349) Cm (2054:2064-(2064:2126+2007:2054)) Scan EI+ 1.69e5161

119

105955855 8179

706793 96

109

121

133 149 204 285

Tiempo (min)

Muurolanodieno

55

extractos 1MT3, 2MT3 y 3MT3.

En la Figura 3.22, se presenta el cromatograma del extracto 1MT3.

18.47 18.97 19.47 19.97 20.47 20.97 21.47 21.97 22.47 22.97 23.47Time0

100

%


3.45e722.70;55

19.3257

18.2588

19.5258

22.3055

19.7258

20.3688

21.1688

22.4188

22.5988

23.3595

22.8755

23.0788

23.7288

23.4558


Se analizó el espectrograma de masas del pico que se presentó a los 30,36 min

con la librería NIST, el cual se observa en la Figura 3.23. Con una probabilidad

del 72 %, la librería NIST identificó al compuesto como muurolanodieno. El

reporte de la librería se muestra en el Anexo D.


El cromatograma del extracto 2MT3 se observa en la Figura 3.24.

47 57 67 77 87 97 107 117 127 137 147 157 167 177 187 197 207 217 227 237 247 257 267 277 287m/z0

100

%

2.66e5161

119

10595

795855 696771

819391 96

109

121

133122 136 207164 190

186281

Tiempo (min)

Muurolanodieno

56

11.00 13.00 15.00 17.00 19.00 21.00 23.00 25.00 27.00 29.00 31.00 33.00 35.000

100

%

280910 3 semana r2b Scan EI+ 30.01

24.74

22.70

19.31

18.0514.6122.31

20.3821.17

22.87

24.38

27.20

29.6427.57

33.02

32.56

31.25


En este caso, el pico fue identificado como copaeno con una probabilidad de 78,4

% y el espectrograma de masas del pico se indica en la Figura 3.25. El reporte de

la Librería NIST se encuentra en el Anexo D.

Figura 3.25. Espectrograma de masas del pico que se presentó a los 20,38 min, identificado como copaeno del extracto 2MT3

La Figura 3.26 presenta el cromatograma del extracto 3MT3.

47 57 67 77 87 97 107 117 127 137 147 157 167 177 187 197 207 217 227 237 247 257 267 277 287m/z0

100

%

7.26e5161

119

10595

938179

69555358

6791

82 96 109

121

133122147

204162

189 207 281

Tiempo (min)

Copaeno

57

18.83 19.33 19.83 20.33 20.83 21.33 21.83 22.33 22.83 23.33 23.830

100

%


3.52e722.69

19.31

22.40

22.29

19.51

19.71

20.36

23.34

22.86

23.06

24.00

23.72

23.44

Figura 3.26.Cromatograma del extracto 3MT3

El pico analizado fue el que se presentó a los 20,36 min y su espectrograma de

masas se muestra en la Figura 2.27, este fue identificado como alfa cubebeno,

con una probabilidad de 72 %.

Figura 3.27. Espectrograma de masas del pico que se presentó a los 20,36 min, identificado como alfa cubebeno del extracto 3MT3

Es importante mencionar que existen varias opciones de terpenos identificados

con valores bajos del % de probabilidad, esto puede deberse a que el tamaño de

la muestra es grande y alberga gran cantidad de especies de plantas briófitas.

Además la identificación de un compuesto desconocido mediante la utilización de

una librería computacional depende directamente de la calidad y comprensibilidad

de la base de datos utilizada. Sin embargo, debemos tomar en cuenta el hecho de

que a menudo existen isómeros que tienen idénticos espectros de masa, y que

50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210m/z0

100

%

3.44e5161

119

95

81585553

79

6967 7177

939187

105

96 100 109121

133124136

148204162

191207

Tiempo (min)

Alfa cubebeno

58

algunas veces un espectro de masas similar corresponde a un compuesto

diferente. (De Hoffmann y Stroobant, 2002).

La Tabla 3.3 indica las áreas de los picos identificados como terpenos para

evaluar el comportamiento de los extractos de plantas briófitas a la acción de una

dosis de glifosato y de las muestras que no estuvieron expuestas al glifosato. El

área teórica calculada se determinó con la ecuación (1) del acápite 2.5. Además,

en la Tabla 3.3 se observan los promedios de las áreas normalizadas de los

extractos, según la semana de análisis.

Tabla 3.3. Áreas de los picos correspondientes a los terpenos encontrados en los extractos de plantas briófitas expuestas a la acción de una dosis de glifosato

Nombre de la muestra Código de la muestra

Terpeno identificado

Área (Unidades de área)

Volumen (mL)

Área normalizada (Unidades de

área)

Réplica 1 sin aplicación de glifosato

1MT0 Gama muuroleno 226 094 57,0 164 170


2MT0 Gama muuroleno 1’188 494 51,0 772 143


3MT0 Gama muuroleno 488 957 73,0 454 699

Réplica 1 con aplicación de glifosato,

semana 1 1MT1 Copaeno 588 384 82,0 614 618


semana 1 2MT1 Alfa cubebeno 329 212 88,0 369 053


semana 1 3MT1 - 0 127,0 0,000


semana 2 1MT2 Muurolanodieno 47 089 316,0 189 556





59

Tabla 3.3. Áreas de los picos correspondientes a los terpenos encontrados en los extractos de plantas briófitas expuestas a la acción de una dosis de glifosato (Continuación...)

Nombre de la muestra Código de la muestra

Terpeno identificado

Área (Unidades de área)

Volumen (mL)

Área normalizada (Unidades de

área)




semana 3 2MT3 Copaeno 231 004 50,5 148 608


semana 3 3MT3 Alfa cubebeno 107 287 132,0 180 406

Promedio de las muestras 1MT0 , 2MT0

y 3MT0 MT0p - - - 463 671

Promedio de las repeticiones: 1MT1,

2MT1 y 3MT1 MT1p - - - 327 890


2MT2 y 3MT2 MT2p - - - 162 666


2MT3 y 3MT3 MT3p - - 137 847

La Figura 3.28 muestra la gráfica del comportamiento de los valores promedios de

las áreas normalizadas de los picos evaluados, durante las 3 semanas de

fumigación.

Estos valores indican que existe una tendencia de disminución de las áreas

normalizadas de los picos identificados, a medida que transcurre el tiempo de

exposición al glifosato. Transcurrida la primera semana de fumigación, el

promedio del área normalizada disminuye en un 29,3 % respecto al valor de

MT0p. A la segunda semana de la fumigación, el promedio del área normalizada

disminuye en un 64,9 % respecto al valor de MT0p. Finalmente, el valor del

promedio del área normalizada a la tercera semana de fumigación, disminuye en

un 70,3 % respecto al valor de MT0p.

60

Figura 3.28. Valores promedios de las áreas teóricas de los extractos de plantas briófitas

expuestos a una dosis de glifosato, evaluados según la semana de análisis

Esta tendencia podría estar relacionada con la acción del glifosato, el cual tiene

una estructura similar al fosfoelnolpiruvato (PEP) (Villalba, 2009), lo que podría

interferir en la formación de la acetil-coenzima A, precursora de la biosíntesis de

los terpenos (Ávalos y Pérez-Urria, 2009). Por otra parte, en las plantas briófitas

expuestas a la acción de una dosis de glifosato, la presencia de cloroplastos

respecto al tiempo tiene una tendencia decreciente (Sánchez, 2011). Los

cloroplastos son los encargados de realizar el proceso de fotosíntesis que finaliza

en la producción de glucosa (Ávalos y Pérez-Urria, 2009), entonces la disminución

de cloroplastos podría afectar la producción de PEP, el cual se produce a partir de

la glucosa y por lo tanto interferir en la formación de terpenos.

3.4. CONTENIDO DE ÁCIDO ASCÓRBICO EN LAS PLANTAS

BRIÓFITAS EXPUESTAS A LA ACCIÓN DE UNA DOSIS DE

GLIFOSATO

El contenido de ácido ascórbico de cada una de las muestras de plantas briófitas

se indican en la Tabla 3.4, los cuales fueron determinados en el laboratorio

Labolab, mediante la técnica de HPLC y se presentan en la Figura 3.29. Los

informes entregados por el laboratorio Labolab se observan en el Anexo E.

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

500000

0 1 2 3

Áre

a (

un

idad

es

de

áre

a)

Tiempo (semanas)

61

Tabla 3.4. Contenido de ácido ascórbico en muestras de plantas briófitas expuestas a la aplicación de 20,2 % de glifosato

Muestra Tiempo (semanas)

Contenido de ácido ascórbico (mg/100 g)

TAA 0 0 89,96

MAA 1 1 83,17

MAA 2 2 57,91

MAA 3 3 57,08

Figura 3.29. Contenido de ácido ascórbico en las muestras de plantas briófitas expuestas a

la acción del glifosato durante tres semanas

Como se observa en la Figura 3.29, existe una tendencia de disminución del

contenido de ácido ascórbico presente en la muestra de plantas briófitas

expuestas a la acción del glifosato. Después de la primera semana de fumigación

el contenido de ácido ascórbico disminuye en un 7,5 % respecto a la muestra

TAA0, transcurrida la segunda semana de evaluación se evidencia una

disminución del contenido de ácido ascórbico en un 35,6 % respecto al valor de la

muestra TAA0; y, finalizada la tercera semana, el contenido de ácido ascórbico

disminuye en un 36,5 % respecto a la muestra TAA0.

Este comportamiento podría estar relacionado con que el ácido ascórbico, puede

sintetizarse a partir de glucosa (Ledezma-Gairaud, 2005) cuya formación es

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4

Can

tid

ad d

e á

cid

o a

scó

rbic

o (

mg/

10

0g)

Tiempo (semanas)

62

afectada con la presencia del glifosato ya que disminuye en el tiempo la cantidad

de cloroplastos presentes en la células de las plantas briófitas (Sanchez, 2011),

los mismos que son los responsables de la producción de glucosa de las plantas

ya que dentro de ellos se realiza la fotosíntesis. Además, otra razón que aportaría

con la disminución del ácido ascórbico, es que este actúa como un reductor de los

radicales libres que se forman debido a estrés que produce la presencia de una

sustancia extraña en la planta, que en este caso es el glifosato (Miranda-Ham y

Castro-Concha, 2010; García et al, 2004).

63

4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

4.1. CONCLUSIONES

1. Se determinó la presencia de terpenos en los extractos vegetales de plantas

briófitas con el método de extracción y maceración con metanol, grado HPLC,

que utilizó 220 g de plantas briófitas secas, proceso que se llevó a cabo a

temperatura ambiente, con un tiempo de maceración de 4 semanas.

2. Los terpenos identificados en los extractos de las plantas briófitas

corresponden a los sesquiterpenos: copaeno, gama muuroleno,

muurolanodieno y alfa cubebeno.

3. Los extractos realizados con plantas briófitas, expuestas a la acción de una

dosis del 20,2 % de glifosato, muestran una disminución del contenido de

terpenos respecto a la réplica sin aplicación de glifosato (MT0p), durante las 3

semanas de evaluación. Después de la primera semana de fumigación el

contenido disminuye un 29,3 %, transcurrida la segunda semana de

fumigación, disminuye en un 64,9 % y finalmente, a la tercera semana de

fumigación, disminuye un 70,3 %

4. Los extractos realizados con plantas briófitas, expuestas a la acción de una

dosis del 20,2 % de glifosato, muestran una disminución del contenido de

ácido ascórbico respecto a la muestra sin aplicación de glifosato (TAA0),

durante las tres semanas de evaluación. Después de la primera semana de

fumigación el contenido de ácido ascórbico disminuye en un 7,5 %,

transcurrida la segunda semana de evaluación se evidencia una disminución

del 35,6 %; y finalizada la tercera semana el contenido de ácido ascórbico

disminuye en un 36,5 %.

64

4.2. RECOMENDACIONES

1. Realizar este estudio con plantas briófitas de una sola especie, por ejemplo la

Marchantia polymorpha, que sean cultivadas y monitoreadas desde sus inicios

por el investigador, para establecer parámetros como edad, modo de

crecimiento, condiciones atmosféricas, plagas, entre otros, puesto que los

mencionados factores influyen directamente en el metabolismo de estas

plantas.

2. Realizar un análisis estructural de los terpenos identificados en este estudio,

mediante la aplicación de las técnicas de resonancia magnética nuclear y

espectrometría infrarroja, para determinar la estructura de los analitos

identificados y corroborar el nombre establecido.

3. Realizar un estudio comparativo de los efectos del glifosato sobre las plantas

briófitas y una planta vascular, la cual puede ser propia de la zona amazónica

norte del Ecuador.

4. Complementar esta investigación con el estudio del contenido de cumarinas y

ácidos grasos, ya que son compuestos que se encuentran presentes en las

plantas briófitas y, a su vez, son compuestos de interés farmacéutico e

industrial.

5. En próximos estudios, incrementar la cantidad de plantas briófitas utilizada

para la obtención y análisis de extractos, ya que incrementaría la

concentración de los compuestos de interés en los extractos.

6. Realizar un estudio en el cual las aplicaciones de glifosato sean in situ, ya que

se evaluarían las plantas briófitas sin exponerlas a condiciones adicionales de

estrés.

65

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esteroles y flavonoides de las hojas de Hamelia patens Jacquin (Rubiaceae)",

http://scielo.sld.cu/pdf/pla/v11n1/pla06106.pdf, (Agosto, 2011).

56. Samuelsson, G. y Bohlin, L., 2009, “Drugs of natural origin a treatise of

farmacognosy”,6ta edición, Apotekarsocieteten, Estocolmo, Suecia, pp. 366 -

483, 672.

57. Sánchez, M., 2011, “Determinación de la acción del glifosato en la morfología

y actividad peroxidásica de un grupo de plantas briófitas de la Amazonía

ecuatoriana”, Proyecto de titulación previo a la obtención del título de Ingeniera

Agroindustrial, EPN, Quito, pp. 30 - 43.

58. Serra, H. y Cafaro, T., 2007, “Ácido ascórbico: desde la química hasta su

crucial función protectiva en ojo”, http://redalyc.uaemex.mx/

pdf/535/53541410.pdf, (Noviembre, 2010).

72

59. Solomon, K., Anadón, A., Cerdeira, A., Marshall, J. y Sanín, L., 2005, “Estudio

de los efectos del Programa de Erradicación de Cultivos Ilícitos mediante la

aspersión aérea con el herbicida Glifosato (PECIG) y de los cultivos ilícitos en

la salud humana y en el medio ambiente”,

http://www.cicad.oas.org/es/glisfosatoinformefinal.pdf, (Abril, 2010).

60. Valenzuela, A. y Ronco, A., 2004, “Fitoesteroles y fitoestanoles: aliados

naturales para la protección de la salud cardiovascular”, http://www.scielo.cl/

scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0717-75182004031100003&lng=es&nrm=i

so&tlng=es, (Diciembre, 2010).

61. Varona, M., Henao, G., Díaz, S., Lancheros, A., Murcia, A., Rodríguez, N. y

Álvarez, V., 2009, "Evaluación de los efectos del glifosato y otros plaguicidas

en la salud humana en zonas objeto del programa de erradicación de cultivos

ilícitos", http://redalyc.uaemex.mx/pdf/843/84311689014.pdf, (Septiembre,

2010).

62. Venereo, J., 2002, “Daño oxidativo, radicales libres y antioxidantes”,

http://bvs.sld.cu/revistas/mil/vol31_2_02/MIL09202.pdf, (Octubre, 2010).

63. Villalba, A., 2009, “Resistencia a herbicidas. Glifosato”, http://www.scielo.org.ar

/pdf/cdyt/n39/n39a10.pdf, (Septiembre, 2010).

73

ANEXOS

74

ANEXO A

Datos de dosis de fumigación con glifosato en cultivos lícitos

Tabla A.1. Usos registrados de glifosato en SENASA

Cultivos Dosis (L o Kg/ha)

Cítricos 2,5 a 4

Frutales de pepita y vid 1,5 a 4,5

Barbechos de cultivos anuales 2 a 4

Soja RR 1,5 a 2,5

Maíz RR 1,8 a 3,5

Algodón RR 1,1 a 2,5

Fuente: (Arregui et al., 2010)

75

ANEXO B

Reportes de la librería de espectros de masas NIST, registrados en los

métodos de obtención de extractos vegetales de plantas briófitas para la

determinación de la presencia de terpenos

Figura B.1. Espectrograma de masas del cromatograma de los extractos S1c, S2c, U1, U2c, U3, U4c, U6c, M3, M4c

Tabla B.1. Reporte de la librería NIST del espectrograma de masas indicado en la Figura B.1

Nº Probabilidad Nombre del compuesto MW Fórmula CAS

1 923 Metanol 32 CH4O 67-56-1

Figura B.2. Espectrograma de masas del cromatograma del extracto U5

(mainlib) Methyl Alcohol0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

0

50

100

14

15

28

29

30

31

32

33

H

H

H

O

H

36 46 56 66 76 86 96 106 116 126 136 146 156 166 176 186 196 206 216 226 236 246 256 266 276m/z0

100

%

1.02e674

43

42

55

44

576967

87

7583

1439788 129101

115 227171157 185 199 270239

%

m/z

76

Tabla B.2. Nombre del compuesto correspondiente al pico del cromatograma del extracto obtenido con 57 g de plantas briófitas y 1 h en el ultrasonido (extracto U5)

Nº Probabilidad Nombre del compuesto MW Fórmula CAS

1 907 Éster metílico del ácido 10, 13

dimetil tetradecanoico 270 C17H34O2 267650-23-7

2 834 Éster metílico del ácido

tridecanoico 228 C14H28O2 1731-88-0

3 830 Éster metílico del ácido 12 metil

tetradecanoico 256 C16H32O2 62691-05-8

77

ANEXO C

Reportes de la librería de espectros de masas NIST, registrados en la

determinación de la presencia de terpenos en extractos orgánicos de

plantas briófitas.

Tabla C.1. Compuesto correspondiente al pico que se presentó a los 20,39 min en el cromatograma del extracto 1MT0

Probabilidad Nombre del compuesto MW Fórmula CAS

759 Gama muuroleno 204 C15H24 30021-74-0







78

ANEXO D

Reportes de la librería NIST de la sección Evaluación de la presencia de

terpenos en los extractos orgánicos de plantas briófitas expuestas a la

acción de una dosis de glifosato

Tabla D.1. Compuesto correspondiente al pico que se presentó a los 20,33 min en el cromatograma del extracto 1MT1


816 Copaeno 204 C15H24 3856-25-5


798 Alfa cubebeno 204 C15H24 17699-14-8



749 Alfa cubebeno 204 C15H24 17699-14-8

741 Copaeno 204 C15H24 3856-25-5

736 Muurolonodieno 204 C15H24 54324-03-7



639 Muurolanodieno 204 C15H24 54324-03-7

629 Alfa cubebeno 204 C15H24 17699-14-8

612 Copaeno 204 C15H24 3856-25-5

79




633 Copaeno 204 C15H24 3856-25-5

625 Alfacubebeno 204 C15H24 17699-14-8




597 Alfacubebeno 204 C15H24 17699-14-8

584 Copaeno 204 C15H24 3856-25-5




684 Copaeno 204 C15H24 3856-25-5




784 Copaeno 204 C15H24 3856-25-5


776 Alfa cubebeno 204 C15H24 17699-14-8

80


Nombre del compuesto MW Fórmula CAS

720 Alfa cubebeno 204 C15H24 17699-14-8


712 Copaeno 204 C15H24 3856-25-5

81

ANEXO E

Informes del contenido de ácido ascórbico en las muestras de plantas

briófitas, realizado en el laboratorio Labolab

Figura E.1. Informe del contenido de ácido ascórbico de la muestra de plantas briófitas sin la exposición a la acción del glifosato (TAA0)

82

Figura E.2. Informe del contenido de ácido ascórbico de la muestra de plantas briófitas expuesta a la acción del glifosato después de una semana de la fumigación (MAA1)

83

Figura E.3. Informe del contenido de ácido ascórbico de la muestra de plantas briófitas expuesta a la acción del glifosato después de dos semanas de la fumigación (MAA2)

84

Figura E.4. Informe del contenido de ácido ascórbico de la muestra de plantas briófitas expuesta a la acción del glifosato después de tres semanas de la fumigación (MAA3)

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