ESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITOESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITO

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDADEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA

INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍAINGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

AISLAMIENTOAISLAMIENTO YY CARACTERIZACIÓNCARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICAMORFOLÓGICA YY ENZIMOENZIMO--

INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍAINGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

FUNCIONALFUNCIONAL DEDE HONGOSHONGOS LIGNINOLIGNINO--CELULOLÍTICOSCELULOLÍTICOS PROCEDENTESPROCEDENTESDEDE LALA CORTEZACORTEZA DEDE ALISOALISO ((AlnusAlnus acuminataacuminata),), ARRAYÁNARRAYÁN ((MyrcianthesMyrcianthes halliihallii)) YYPUMAMAQUIPUMAMAQUI ((OreopanaxOreopanax heterophyllusheterophyllus)) PRESENTESPRESENTES ENEN MANCHASMANCHAS DEDEPUMAMAQUIPUMAMAQUI ((OreopanaxOreopanax heterophyllusheterophyllus)) PRESENTESPRESENTES ENEN MANCHASMANCHAS DEDEBOSQUEBOSQUE NATIVONATIVO DELDEL PASOCHOA,PASOCHOA, BAJOBAJO CONDICIONESCONDICIONES DEDELABORATORIOLABORATORIO..

ÉRIKA CRISTINA CASTILLO TAMAYOÉRIKA CRISTINA CASTILLO TAMAYO

SangolquíSangolquí, marzo 2011 , marzo 2011

1. INTRODUCCIÓN2. MATERIALESY MÉTODOS3 RESULTADOSY DISCUSIÓN3. RESULTADOSY DISCUSIÓN4. CONCLUSIONES5. RECOMENDACIONES

manejo

Preocupación

j

reciclaje

utilizaciónbasura

utilización

biorremediación

• 2004……. Mundo……. 1.600 millones de ton.• 2005……. Ecuador……194.400 ton.• 2007 Quito 1 550 ton• 2007…….Quito……….1.550 ton.

Mi idegradarían basura-desechos opción AprovechamientoMicroorganismos

g basura desechos orgánicos

Aprovechamiento materiales

En el presente trabajo, desarrollado a escala de laboratorio, se plantea elaislamiento y la caracterización morfológica y enzimo-funcional de hongos lignino-celulolíticos

(Cardona et al., 2004; Torres, 2005; El Universo, 2007)

• Descomposición de materiales lignino-celulósicos.

• Estudios sobre hongos lignino-celulolíticos.

Gé T i h d Ph h A ill F i• Géneros Trichoderma, Phanerochaete, Aspergillus, Fusarium yPenicillium.

• Técnicas en la reducción biológica: Fermentación en estadosólido y aplicación de enzimas purificadas.

• El uso de microorganismos potenciales degradadores deresiduos lignino-celulósicos se convierte en una opción viable.

(Vilches, 2002; Diorio et al., 2003)

Ai l t i f ló i i f i l t l dAislar y caracterizar morfológica y enzimo-funcionalmente, a escala de

laboratorio, tres cepas eficientes de hongos lignino-celulolíticos

procedentes de las cortezas de los árboles de aliso (Alnus acuminata),

arrayán (Myrcianthes hallii) y pumamaqui (Oreopanax heterophyllus)

presentes en manchas de bosque nativo del Pasochoa.

•Recolectar las muestras de las cortezas de los árboles de aliso (Alnus•Recolectar las muestras de las cortezas de los árboles de aliso (Alnusacuminata), arrayán (Myrcianthes hallii) y pumamaqui (Oreopanaxheterophyllus).

•Desarrollar, propagar y aislar las cepas lignino-celulolíticas fúngicasnativas a partir de las cortezas.

•Evaluar la capacidad lignino-celulolítica de las cepas fúngicasencontradas.

•Seleccionar tres cepas eficientes en la capacidad lignino-celulolítica ycaracterizarlas morfológicamentecaracterizarlas morfológicamente.

Hongos lignino-celulolíticosg g

á Actividad enzimática

Caracterización morfológica

V l á P h Volcán Pasochoa

Basidiomycetes

• Son una división del

Hongos imperfectos

• Comprenden más

Ascomycetes

C dSon una división delreino Fungi, incluyea los hongos queproducen basidios.

Comprenden másde 15.000 especiesdiferentes que seclasifican juntas

• Comprendenaproximadamente28.500 especies, sumicelio es septado yp

• Contienen a lasclásicas setas y

porque no seconoce en ellas lafase sexual dereproducción

micelio es septado yproducen ascasunicelulares, queforman esporas de

hongos consombrero.

reproducción. origen sexual.

(Pontón et al., 2002; Blanco et al., 2008)

• Teather y Wood (1982).• Hidrólisis de polisacáridos.• Zonas de aclaramiento

Prueba del Rojo Congo Zonas de aclaramiento.

• Sumner (1921).( )• Técnica analítica cuantitativa de azúcares reductores• Ácido 3,5-dinitro-salicílico (DNS)• D.O es proporcional a la cantidad de glucosa

Actividad celulolítica p p g

presente.

L l d l l lA ti id d • Lignina catalizada por un complejo extracelular.• La LiP fue la primera en descubrirse.• Oxidación del alcohol veratrílico a veratraldehído.

Actividad lignino

peroxidásica

(Hendricks et al., 1995; Quintero et al., 2006; Gaitán y Pérez, 2007; Pedroza et al., 2007; Villa, 2007; Moreno y Ospina, 2008; Córdoba, 2009)

ÓÓCARACTERIZACIÓNCARACTERIZACIÓN

MacroscópicaMacroscópica MicroscópicaMicroscópica

) Ti d hif b) l i ió d lCada microorganismo crecede manera diferente.

a) Tipo de hifa; b) la posición del olos esporóforos; c) la presencia deesporangióforo o conidióforo; d) laforma, tamaño y distribución de las

a) color; b) forma; c) tamaño;d) textura; e) olor y, f) brillo.

, yesporas y, e) la presencia o no derizoides.

(Val, 2002; Harris, 2008)

100x40x

El volcán Pasochoa posee unode los últimos remanentes debosque andino.

•Ubicado al sureste de la hoya deGuayllabamba, tiene una extensiónde 500 hectáreasde 500 hectáreas.

•Fuente principal de muchosd

•Árboles como el pumamaqui,el polylepis, el laurel y la palma estudios.el polylepis, el laurel y la palmade ramos han sido de interéscientífico.

Aliso (Alnus acuminata) Pumamaqui (Oreopanax heterophyllus)Arrayán (Myrcianthes hallii)( )Fuente: Ulloa y Møller, 2008

Pumamaqui (Oreopanax heterophyllus)Fuente: Aguilar et al., 2009

Arrayán (Myrcianthes hallii)Fuente: Bustamante, 2010

(Ecuadoronline, 1999)

Identificadas las tres especies vegetalesnativas del Ecuador, se tomaron pedazos delas cortezas de los tallos de diez árboles.

Los pedazos de cortezas fueron recolectadosLos pedazos de cortezas fueron recolectadosmanualmente y depositados en fundas de papel. Lasfundas fueron mantenidas a temperatura ambiente.

30 ºC72 h

30 ºC72 h

PDA, MACorteza

72 h

PDA, MA

72 h

Cepas purasCorteza

vegetal,

Cepas fúngicas

p

macroscópica microscópica

KOH 0,1 M

30 ºC72 h72 h

10040x

PDA, MACepas 5 ºC

AlmacenamientoAlmacenamiento100x40x

puras

(Gilman,1957; Barnett y Hunter,1972; Carrillo, 2003; Sánchez, 2007)

30 ºC 5 mL Rojo congo 1%72 h

j g15 min

Agar CMCCepa fúngica

Pruebascuantitativas

12 h5 ºC

Refrigeración Refrigeración

5 mL NaCl 2M15 min

(Gaitán y Pérez, 2007; Valencia, 2009)

CMCasa

30 ºC

1.000 µL CMC al 1%tampón Act-Na 50mM

SiembraSiembra60 mL caldo

nutritivo Cepa pura

IncubaciónIncubación

30 ºC31 h

extractoenzimático

1.000 µL

CalentamientoCalentamientopH= 5

50 ºC30 min

Cepa pura

1.000 µL avicel al 1%

avicelasa

µtampón Act-Na 50mM

5 min

250 L DNS

EnfriamientoEnfriamiento5 min

EbulliciónEbullición CentrifugaciónCentrifugación5.000 rpm

250 µL sobrenadante

5 minRX

250 µL DNS 10 min

EnfriamientoEnfriamiento Medición D.O.Medición D.O.5 min 540 nm5 min

2.500 µL H2Od

540 nm

(Miller,1959; Pedroza et al., 2007

60 mL caldo nutritivo

SiembraSiembra IncubaciónIncubación

30 ºC72 h

250 µLextracto

9,6 mL tampóntartrato-Na 0,1 M100 µL Tween 8015 µL alcohol

+ 4 g aserrín

pH=3

SiembraSiembra

Cepa pura

IncubaciónIncubación extractoenzimático

15 µL alcoholveratrílico 2 mM20 µL peróxido dehidrógeno 4 mM

CalentamientoCalentamientoEnfriamientoEnfriamiento CalentamientoCalentamiento30 ºC1 h

EnfriamientoEnfriamientoRX

Medición D.O.Medición D.O.

(Tien y Kirk, 1984; Villa, 2007)

330 nm

• Caracterización morfológica macro y microscópica fue realizada con la

colaboración de la Lic.Verónica Luna, del laboratorio DISerLAB.

• Desarrollo de los microorganismos en medio papa dextrosa agar (PDA),

durante 5 días, seguida de la observación bajo el microscopio.

Tabla 1Tabla 1 Frecuencia y porcentaje de hongos d ll d ú l di d l idesarrollados según los medios de cultivo

Medio de cultivo Frecuencia Porcentaje

Malta agar 38 66,7

Papa dextrosa agar 19 33,3p g

Total 57 100,0

T blT bl 22 F i t j d lTablaTabla 22 Frecuencia y porcentaje delnúmero de las resiembras de purificación

Resiembras Frecuencia PorcentajeResiembras Frecuencia Porcentaje

H1 0 23 40,4

H2 1 19 33,3

H3 2 14 24,6

H4 3 1 1,8

T l 57 100 0Total 57 100,0

Tabla 2 Tabla 2 Frecuencia y porcentaje de las especies vegetales

Especie vegetal Frecuencia Porcentaje

Aliso 18 31,6

Tabla 4Tabla 4 División familia o géneros de

Arrayán 10 17,5

Pumamaqui 29 50,9 Tabla 4Tabla 4 División, familia o géneros de las cepas purificadas

División o género Frecuencia Porcentaje

Pumamaqui 29 50,9

Total 57 100,0

gdel hongo

j

Trichoderma 12 32,4Fusarium 10 27 0Fusarium 10 27,0Aspergillus 6 16,2Trichothecium 1 2,7V i illi 1 2 7Verticillium 1 2,7Zygomycete 3 8,1Diplodia 1 2,7Drechslera 1 2,7Sordaria 1 2,7Ascomycete 1 2,7Ascomycete 1 2,7Total 37 100,0

FiguraFigura 11 Resultados de la actividad enzimáticacualitativa positiva de una cepa de Fusarium a las 72h de incubación

FiguraFigura 22 Resultados de la actividad enzimáticacualitativa negativa de una cepa de Aspergillus a las72 h de incubación

8,00 7,92

6,286,62

ÓLI

SIS

Trichoderma Diplodia

5,46

4,695,35

DE

HID

RÓ

1,572,07

1,641,43

1,43 1,401,91

2,892,18

1,581,59

1,61

2,592,24 2,29

O D

E H

. D(c

m)

Pm V

t

m F

s 1

l Zg

1

l Zg

2

m F

s 2

Ap

1

Ap

2

r T

c 1

Ar

Tt

l Tc

2

Al A

s

r T

c 3

m T

c 4

l Tc

5

m F

s 3

r T

c 6

l Zg

3

m F

s 4

Al D

p

m F

s 5

m F

s 6

m F

s 7

m F

s 8

m F

s 9

Fs

10

0 0 0

ÁM

ET

RO

Figura 3Figura 3 Diámetro de los halos de hidrólisis

MP

PPm

MA

l

MA

l

PPm

MPm

MPm MA

r PA

MA

l

M

MA

r

PPm

PAl

MPm

MA

r

MA

l

MPm PA

MPm

MPm

MPm

MPm

MPm

MPm

DIÁ

183,09

126 47L EN

Z)

Fusarium

Diplodia

126,47114,36

101,11 101,11 104,85

asa

(U/L Fusarium

39,18

55,48

43,48 43,93 47,5641,44

37 70D C

MC

a

Aspergillus

19,81 17,78 17,78

0,68 8,38

31,70 24,2318,12

25,7037,70

8,6111,78

7,25

TIV

IDA

D

MPm

Vt

PPm

Fs

1

PPm

Fs

2

MPm

Ap

1

MPm

Ap

2

MA

r Tc

1

PAr T

t

MA

l Tc

2

MA

l As

MA

r Tc

3

PPm

Tc

4

PAl T

c 5

MPm

Fs

3

MA

r Tc

6

MPm

Fs

4

PAl D

p

MPm

Fs

5

MPm

Fs

6

MPm

Fs

7

MPm

Fs

8

MPm

Fs

9

MPm

Fs

10

MA

l Zg

1

MA

l Zg

2

MA

l Zg

3

AC

T

Figura 4Figura 4 Actividad celulolítica CMCasa

M M M

Cepa fúngica

Figura 4Figura 4 Actividad celulolítica CMCasa

Fusarium

722,05

598 29

Fusarium

598,29U

/LE

NZ)

icel

asa

(

Trichothecium

148,89

120,8193 07

160,33

77 79 80 16 78 13

126,70103,94 110,96

141,99105,41

137,23

DA

D a

vi TrichotheciumVerticillium

Diplodia

Vt 1 2 1 2 1 t 2 As 3 4 5 3 6 4

Dp 5 6 7 8 9 0 1 2 3

93,0771,45

53,44 28,4268,8477,79

60,3580,16

36,57

78,13

99,64 24,68 23,21 23,21

AC

TIV

ID

MPm

V

PPm

Fs

PPm

Fs

MPm

Ap

MPm

Ap

MA

r Tc

PAr T

t

MA

l Tc

MA

l A

MA

r Tc

PPm

Tc

PAl T

c

MPm

Fs

MA

r Tc

MPm

Fs

PAl D

MPm

Fs

MPm

Fs

MPm

Fs

MPm

Fs

MPm

Fs

MPm

Fs

1

MA

l Zg

MA

l Zg

MA

l Zg

Cepa fúngica

A

Figura 5Figura 5 Actividad celulolítica avicelasa

Cepa fúngica

gu a 5gu a 5 ct v a ce u o t ca av ce asa

A ill

16,30

14,23 14,46

U/L

EN

Z) Aspergillus

Fusarium

14,23

9,90ásic

a (U

6,787,17

4 48

5,965,61

6,12

8,77

4 41pero

xid

1,72 1,95

3,35 3,59

2,22 2,072,73

3,94

1,75

4,48

1,99

4,41

0,47 0,97 0,35 lign

ino

Zygomycete

MPm

Vt

PPm

Fs

1

PPm

Fs

2

Pm A

p 1

Pm A

p 2

MA

r Tc

1

PAr T

t

MA

l Tc

2

MA

l As

MA

r Tc

3

PPm

Tc

4

PAl T

c 5

MPm

Fs

3

MA

r Tc

6

MPm

Fs

4

PAl D

p

MPm

Fs

5

MPm

Fs

6

MPm

Fs

7

MPm

Fs

8

MPm

Fs

9

Pm F

s 10

MA

l Zg

1

MA

l Zg

2

MA

l Zg

3

VID

AD

P P M M M M M P M M M M M M M M MP M M M

Cepa fúngica

AC

TI

Figura 6Figura 6 Actividad lignino peroxidásica

Morfología macroscópica de la colonia

Morfología microscópicade la colonia

blanca algodonosa (torna decolor rosa-salmón).

Conidias septadas:17 a 28 x 2,5 a4 µm.

Micelio flocoso. Clamidosporas hialinas: 5 a 10 µm.

Mi idi 5 12 2 2 3 5

Fusarium 2Fusarium semitectum

blanca algodonosa (reversotinte púrpura).

Microconidias: 5 a 12 x 2,2 a 3,5µm.

Macroconidias septadas de 3 a 5Micelio aéreo flocoso.

Macroconidias septadas de 3 a 5septos fusiformes.

ill d ( C idióf hi liFusarium 1

amarilla verdosa (reversoamarillento.

verde oscura

Conidióforos hialinos.

Vesículas globosas a subglobosas:25 45 µm de diámetro

Fusarium oxysporum

verde oscura.

Aspecto polvoriento.

25-45 µm de diámetro.

Conidias: 3 a 6 µm, globosas asubglobosassubglobosas.

Aspergillus 1Aspergillus flavus

•De las cortezas de los árboles de aliso (Alnus acumicata), arrayán(Myrcianthes halii) y pumamaqui (Oreopanax heterophyllus) se obtuvieron 57cepas fúngicas.

•De las 37 cepas evaluadas semi-cuantitativamente, solamente 25 arrojaronresultados positivos Las cepas de Trichoderma presentaron los diámetros deresultados positivos. Las cepas de Trichoderma presentaron los diámetros dehalo de hidrólisis mayores.

•Las tres cepas que presentaron la mayor actividad carboximetilcelulasa•Las tres cepas que presentaron la mayor actividad carboximetilcelulasafueron Fusarium 2 (183,08 U/LENZ), Fusarium 7 (114,35 U/LENZ) y Diplodia(126,47 U/LENZ).

•La mayor actividad avicelasa la presentaron las cepas Fusarium 1 (722,04U/LENZ), Fusarium 2 (598,29 U/LENZ) y Trichothecium (160,32 U/LENZ).

•Las cepas con mayor actividad lignino peroxidásica fueron Aspergillus 1(16,29 U/LENZ), Aspergillus 2 (14,23 U/LENZ) y Fusarium 7 (14,46 U/LENZ).( , ENZ), spe g s ( , ENZ) y s ( , ENZ)

• Las cepas de Aspergillus 1 y Aspergillus 2 se mostraron como las más activasf t l CMC i lfrente al CMC y avicel.

• Fusarium semitectum (Fusarium 2) se presentó como un hongo blanco, contintes color durazno, actividad CMCasa de 183,08 U/LENZ; Fusariumoxysporum (Fusarium 1), hongo blanco con tintes rosados, actividad avicelasay p ( ) gde 722,04 U/LENZ y Aspergillus flavus (Aspergillus 1), hongo verde oliváceo averde amarillento, actividad lignino peroxidásica de 16,29 U/LENZ.

• Las cepas novedosas, en cuanto a la actividad enzimática, que se aislaron enesta investigación pertenecieron a los géneros Diplodia Verticillium yesta investigación pertenecieron a los géneros Diplodia, Verticillium yTrichothecium y constituyen fuentes promisorias de cepas fúngicas conpotencial capacidad degradadora de materiales lignino-celulósicos.

• Realizar la prueba de la actividad enzimática lignino• Realizar la prueba de la actividad enzimática ligninoperoxidásica, pasadas las 72 h de incubación.

• Complementar el estudio con la determinación de la cinética decrecimiento.

• Estudiar a géneros Diplodia, Trochothecium y Verticillium: hongos congran potencial lignino-celulolítico.

• Realizar la caracterización molecular de las cepas con mayorcapacidad enzimáticacapacidad enzimática.

•Diseñar un biorreactor: aplicación semi-industrial o industrial.

•Extender esta investigación con muestras vegetales de otrasmanchas de bosques nativos del área andinamanchas de bosques nativos del área andina,

ESCUELA POLITÉCNICA ESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITODEL EJÉRCITO

ESCUELA POLITÉCNICA ESCUELA POLITÉCNICA NACIONALNACIONAL

CARRERA DE ING. EN CARRERA DE ING. EN BIOTECNOLOGÍABIOTECNOLOGÍA