ESCALAMIENTO PARA LA PRODUCCIÓN DE UN BIOPESTICIDA A …
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ESCALAMIENTO PARA LA PRODUCCIÓN DE UN BIOPESTICIDA A PARTIR DE Bacillus thuringuiensis subesp. kurstaki EN FERMENTADORES DE 14 Y 250L CON BASE EN LA TRANSFERENCIA DE OXÍGENO. ISABEL CRISTINA JIMÉNEZ USECHE CAROLINA ROJAS DEVIA UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERÍA DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUÍMICA BOGOTÁ, 2003.
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ESCALAMIENTO PARA LA PRODUCCIÓN DE UN BIOPESTICIDA A
PARTIR DE Bacillus thuringuiensis subesp. kurstaki EN FERMENTADORES DE
14 Y 250L CON BASE EN LA TRANSFERENCIA DE OXÍGENO.
ISABEL CRISTINA JIMÉNEZ USECHE
CAROLINA ROJAS DEVIA
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUÍMICA
BOGOTÁ, 2003.
ESCALAMIENTO PARA LA PRODUCCIÓN DE UN BIOPESTICIDA A
PARTIR DE Bacillus thuringuiensis subesp. kurstaki EN FERMENTADORES DE
14 Y 250L CON BASE EN LA TRANSFERENCIA DE OXÍGENO.
ISABEL CRISTINA JIMÉNEZ USECHE
CAROLINA ROJAS DEVIA
Tesis de grado para optar por el título de
Ingeniero químico
Asesor
ANDRÉS F GONZÁLEZ
Ingeniero Químico
Coasesor
OSCAR ÁLVAREZ
Ingeniero Químico
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUÍMICA
BOGOTÁ, 2003.
Nota de Aceptación
Asesor
Coasesor
Jurado
Jurado
Bogotá 20 de Enero de 2003
AGRADECIMIENTOS
Queremos aprovechar esta oportunidad para agradecer a todos los miembros de la
Empresa Colombiana de Productos Veterinarios (VECOL), quienes de una u otra forma
nos brindaron su colaboración para la elaboración de este maravilloso proyecto.
Especialmente, damos las gracias al Doctor Nelson Mora, Director de Investigación, por
permitirnos trabajar en la empresa, a la Doctora Amparo Forero, Coordinadora del
Proyecto de Biopesticidas, por su constante apoyo y consejo y a Alexander Yanguas por
tantas horas de ayuda desinteresada.
Igualmente, queremos manifestar nuestros agradecimientos a Andrés González, nuestro
asesor a lo largo de este trabajo, por tomarse el tiempo necesario para supervisar nuestra
labor, auxiliándonos en tantos momentos difíciles que se nos presentaron durante el
desarrollo de la investigación.
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN.......................................................................................................... 14
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA........................................................... 16
2. JUSTIFICACIÓN................. .............................................................................. 19
3. OBJETIVOS........................................................................................................22
4. ANTECEDENTES............... .............................................................................. 23
5. MARCO TEÓRICO............. .............................................................................. 25
5.1. BACILLUS THURINGIENSIS ............................................................................ 25
5.2. TRANSFERENCIA DE MASA......................................................................... 29
5.3. ESCALAMIENTO................... .......................................................................... 38
6. DISEÑO EXPERIMENTAL.............................................................................. 43
7. MATERIALES Y MÉTODOS........................................................................... 46
7.1 CARACTERIZACIÓN DE LA TRANSFERENCIA DE OXÍGENO EN LOS
FERMENTADORES DE 14 Y 250L................................................................. 46
7.2 MICROORGANISMO Y MEDIO DE CULTIVO............................................ 47
7.3 PREPARACIÓN DEL INÓCULO Y CONDICIONES DE LAS
FERMENTACIONES A 14L............................................................................. 48
7.4 PREPARACIÓN DEL INÓCULO Y CONDICIONES DE LAS
FERMENTACIONES A 250L........................................................................... 48
7.5 MÉTODOS ANALÍTICOS........ ........................................................................ 50
8. RESULTADOS......................... ......................................................................... 51
8.1 CARACTERIZACIÓN DE LA TRANSFERENCIA DE OXÍGENO EN EL
FERMENTADOR DE 14L........... ..................................................................... 51
8.2 CARACTERIZACIÓN DE LA TRANSFERENCIA DE OXÍGENO EN EL
FERMENTADOR DE 250L. ............................................................................. 53
8.3 ESTIMACIÓN DE LA TASA DE TRANSFERENCIA MÁXIMA (TTM) DE
OXÍGENO EN EL FERMENTADOR DE 14L................................................. 55
8.4 FERMENTADOR DE 14L....... ......................................................................... 57
8.4.1 BIOMASA.......................................................................................................... 58
8.4.2 RECUENTO DE ESPORAS.............................................................................. 60
8.4.3 PROTEÍNA TOTAL Y PROTEÍNAS ESPECÍFICAS...................................... 61
8.4.4 GLUCOSA................................. ........................................................................ 63
8.5 FERMENTADOR DE 250L...............................................................................65
8.5.1 BIOMASA.......................................................................................................... 68
8.5.2 CONTEO DE ESPORAS.............. ..................................................................... 69
8.5.3 GLUCOSA............................ ............................................................................. 70
8.5.4 PROTEÍNA TOTAL Y ESPECÍFICAS............................................................. 71
9. ANÁLISIS DE RESULTADOS......................................................................... 73
9.1 CARACTERIZACIÓN DE LA TRANSFERENCIA DE OXÍGENO EN LOS
FERMENTADORES DE 14 Y 250L................................................................. 73
9.2 FERMENTACIONES A 14L............................................................................. 76
9.2.1 BIOMASA.......................................................................................................... 77
9.2.2 UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS Y PROTEÍNAS..................... 78
9.2.3 GLUCOSA............................ ............................................................................. 78
9.3 ESCALAMIENTO................. ............................................................................ 79
9.4 FERMENTADOR DE 250L.... .......................................................................... 81
10 CONCLUSIONES.............................................................................................. 85
11 RECOMENDACIONES........... ......................................................................... 87
BIBLIOGRAFÍA............................................................................................................ 89
REFERNCIAS DE INTERNET..................................................................................... 92
ANEXOS........................................................................................................................ 93
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ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Acción de Bacillus thuringiensis subesp. kurstaki en gusanos ....................... 28
Figura 2. Resistencias a la transferencia de oxígeno de la burbuja de aire a la célula. .. 32
Figura 3. Escalamiento ................................................................................................... 42
Figura 4. Cálculo de kLa. (a): Perfil de concentración de oxígeno disuelto en el tiempo.
(b): linealización para hallar kLa...................................................................... 47
Figura 5. Efecto de la agitación y la aireación, sobre el kLa en el fermentador de 14L . 52
Figura 6. Efecto de la presión y la agitación sobre el kLa en el fermentador de 14L..... 53
Figura 7. Efecto de la aireación y la agitación en el kLa en el fermentador de 250L..... 54
Figura 8. Efecto de la presión y la agitación en el kLa en el fermentador de 250L........ 55
Figura 9. Efecto de la tasa de transferencia máxima de oxígeno (TTM) sobre la
biomasa............................................................................................................ 59
Figura 10. Efecto de la tasa de transferencia máxima de oxígeno (TTM) sobre la
velocidad de crecimiento. ................................................................................ 59
Figura 11. Efecto de la TTM en el número de unidades formadoras de colonias. ......... 61
Figura 12. Efectos de la TTM en la cantidad de proteínas total y producción de proteínas
tóxicas.............................................................................................................. 62
Figura 13. Efecto de la TTM en el rendimiento global y específico de las
fermentaciones en 14L..................................................................................... 64
Figura 14. Efecto de la TTM en la velocidad de consumo de glucosa en las
fermentaciones en 14L..................................................................................... 65
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Figura 15. Velocidad de crecimiento en las fermentaciones a 14L y 250L .................. 68
Figura 16. Biomasa de las fermentaciones a 14L y 250L .............................................. 69
Figura 17. Unidades formadoras de colonias para las fermentaciones a 14L y 250L.... 70
Figura 18. Rendimiento global para las fermentaciones a 14L y 250L.......................... 70
Figura 19. Escalamiento a partir de la producción de proteína tóxica ........................... 80
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ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Diseño experimental para la caracterización de la transferencia de oxígeno en
el fermentador de 14L...................................................................................... 43
Tabla 2. Diseño experimental para la caracterización de la transferencia de oxígeno en
el fermentador de 250L.................................................................................... 44
Tabla 3. Factores y niveles utilizados para las fermentaciones a14L...................... 44
Tabla 4. Diseño experimental para las fermentaciones a 14L........................................ 45
Tabla 5. Concentraciones de oxígeno en el equilibrio................................................... 56
Tabla 6. Valores de TTM para el fermentador de 14L.................................................. 57
Tabla 7. Fermentaciones realizadas en el fermentador de 14L ...................................... 57
Tabla 8. Resultados de Biomasa y Velocidad de crecimiento........................................ 58
Tabla 9. Resultados de recuento de esporas para las fermentaciones a 14L. ................ 60
Tabla 10. Resultados del análisis de proteína total y específicas para las fermentaciones
a 14L................................................................................................................ 62
Tabla 11. Efectos de la TTM en los rendimientos y la velocidad de consumo de
glucosa. ............................................................................................................ 63
Tabla 12. Resultados de biomasa para los cultivos en el fermentador de 250L............. 68
Tabla 13. Unidades formadoras de colonias para el cultivo a 250L............................... 69
Tabla 14. Resultados de proteína para la fermentación A (No. 791102) ....................... 71
Tabla 15. Resultados de proteína para la fermentación B (No. 801102)....................... 71
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INDICE DE ANEXOS
ANEXO 1. PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DEL COEFICIENTE
VOLUMÉTRICO DE TRANSFERENCIA DE MASA, kLa, EN LOS
FERMENTADORES DE 14L Y 250 L ....................................................... 93
ANEXO 2. DATOS PARA CARACTERIZAR LA TRANSFERENCIA DE OXÍGENO
EN EL FERMENTADOR DE 14L .............................................................. 94
ANEXO 3. DATOS PARA CARACTERIZAR LA TRANSFERENCIA DE OXÍGENO
EN EL FERMENTADOR DE 250L ............................................................ 96
ANEXO 4. FORMATOS DE CONTROL DE LAS FERMENTACIONES EN LOS
FERMENTADORES DE 14 Y 250L........................................................... 97
ANEXO 5. PRETRATAMIENTO PARA REALIZAR LA DETERMINACIÓN DE LA
BIOMASA POR EL MÉTODO DEL PESO SECO .................................. 105
ANEXO 6. RESULTADOS DE BIOMASA PARA LAS FERMENTACIONES A
14L.............................................................................................................. 106
ANEXO 7. RESULTADOS DE BIOMASA PARA LAS FERMENTACIONES A
250L............................................................................................................ 114
ANEXO 8. PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR EL NÚMERO DE
UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS POR MILILITRO. ........ 118
ANEXO 9. RESULTADOS DEL CONTEO DE ESPORAS PARA LAS
FERMENTACIONES A 14 Y 250L.......................................................... 119
ANEXO 10. RESULTADOS DE GLUCOSA PARA LAS FERMENTACIONES EN
EL FERMENTADOR DE 14L................................................................... 124
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ANEXO 11. RESULTADOS DE GLUCOSA PARA LAS FERMENTACIONES A
250L............................................................................................................ 128
ANEXO 12. PRETRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS PARA LA
DETERMINACIÓN DE LA PROTEÍNA TOTAL Y LAS PROTEÍNAS
TÓXICAS................................................................................................... 131
ANEXO 13. PROTOCOLO DE INOCULACIÓN PARA EL FERMENTADOR DE
250L............................................................................................................ 132
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INTRODUCCIÓN
Para el desarrollo de la industria agrícola es importante contar con un control de plagas
efectivo y que no tenga efectos negativos sobre el medio ambiente y su entorno. Los
insecticidas químicos han proporcionado un control eficaz pero son perjudiciales para la
salud humana y el ecosistema, por lo tanto a nivel mundial se han buscado otras
alternativas que suplan el uso de pesticidas químicos. Actualmente los biopesticidas
constituyen una alternativa viable en el control de plagas a partir de formulaciones
comerciales de microorganismos.
Bacillus thuringiensis (Bt) representa el mayor volumen de los bioinsecticidas
producidos a nivel mundial, el cual en la fase de esporulación, produce δ-endotoxinas
que son tóxicas para plagas de insectos en su estado larval, tales como lepidópteros,
dípteros y coleópteros. El complejo de esporas y δ-endotoxinas se utiliza como
ingrediente activo en la formulación de los biopesticidas.
La Empresa Colombiana de Productos Veterinarios (VECOL S.A.) está interesada en el
desarrollo de esta tecnología para la producción a gran escala del ingrediente activo, ya
que la producción de éste en Colombia es baja. Para la producción a gran escala se
deben seguir varios pasos: el primero, es realizar ensayos a nivel de laboratorio, una vez
obtenidos estos resultados se comienza a trabajar a escala piloto en la cual se estudian
efectos de aireación, temperatura y control de pH. Finalmente estos resultados son
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utilizados para determinar condiciones de operación a escala industrial. El
procedimiento descrito anteriormente se denomina escalamiento.
El proyecto que se realizó con la empresa VECOL S.A. como trabajo de grado,
consistió en llevar a cabo el escalamiento de la producción de un biopesticida a partir de
Bacillus thuringiensis subs. kurstaki, basados en la Tasa de Transferencia Máxima
(TTM) de oxígeno. Para hacer el escalamiento se realizaron experimentos a escala
piloto (14L) y a partir de los resultados se obtuvieron las condiciones de operación a
escala industrial (250L).
Con este estudio se obtuvieron las condiciones de trabajo a gran escala que satisfacen
las necesidades de oxígeno para producir el ingrediente activo y finalmente realizar la
formulación del biopesticida.
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1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Con el alto crecimiento de la industria agrícola y la búsqueda del aumento de la
productividad de los cultivos, se vió la necesidad de encontrar una solución para los
problemas asociados al control de plagas y el suministro de nutrientes que satisficiera
las necesidades de las plantas. Esta solución la brindó, en su momento, la industria
química con el desarrollo de pesticidas y fertilizantes a partir de síntesis química.
Estudios han estimado que a pesar del gran uso de pesticidas químicos en todo el mundo
para el control de pestes, cerca del 50% de la comida en el mundo, se pierde por
insectos, enfermedades, maleza, microorganismos, pájaros y roedores; lo cual no
justifica el uso de estos productos químicos como medio para garantizar la calidad de
los alimentos agrícolas (Maramorosch,1991, prefacio).
Por las razones anteriormente expuestas surgió la necesidad de buscar una alternativa
que permitiera el control de plagas sin deteriorar el medio ambiente. Esta alternativa la
brindó el desarrollo de la biotecnología, la cual, al utilizar los microorganismos para
obtener productos útiles, encontró una respuesta que satisficiera las nuevas expectativas
de los agentes controladores de plagas; la cual fue la producción de biopesticidas.
Dentro de la gama de biopesticidas se encuentran los producidos por las bacterias
entomopatógenas especialmente Bacillus thuringiensis y Bacillus sphaericus que son
de especial interés dado que se pueden producir industrialmente(Maramorosch, 1991,
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prefacio). B. thuringiensis es una bacteria que en la fase de esporulación produce uno o
más cristales de proteína (δ-endotoxinas) tóxicas para larvas de dípteros, lepidópteros y
algunas especies de coleópteros(Caballero, Ferre, 2001, p.9). Desde 1961 se
comenzaron a registrar los productos basados en B. thuringiensis como biopesticidas en
los Estados Unidos. Inicialmente las primeras cepas de B. thuringiensis eran tóxicas
contra lepidópteros, pero con el descubrimiento progresivo de nuevas cepas se amplió el
espectro de huéspedes lo cual llevó a aumentar considerablemente la producción de
estos biopesticidas(Maramorosch, 1991, prefacio).
En los países desarrollados ha sido prohibido el uso de ciertos insecticidas químicos lo
que los ha llevado a desarrollar la tecnología para la producción a gran escala de
biopesticidas. En Colombia se utilizan más de cien plaguicidas de alto riesgo los cuales
han sido prohibidos en la mayoría de los países desarrollados y muchos de ellos
incluidos en la lista de prohibiciones publicadas por la ONU en 1983. En nuestro país
sólo 17 han sido restringidos a usos específicos y no propiamente su restricción es la
más indicada (Mejía, 1995, p.1). Debido a que el uso de pesticidas químicos no tiene
restricciones estrictas en Colombia, no se ha visto la necesidad imperativa de producir
biopesticidas industrialmente. Sin embargo, la tendencia global en el control de plagas
está cada vez más encaminada hacia el uso de biopesticidas. En el mundo,
aproximadamente el 90% de los formulados comerciales de biopesticidas utilizan como
ingrediente activo el complejo espora-cristal de B. thuringiensis (Caballero, Ferre, 2001,
p.9). Actualmente en Colombia es posible conseguir productos insecticidas basados en
B. thuringiensis cuya formulación se realiza en el país y consiste en la mezcla del
ingrediente activo con algunos aditivos como emulsionantes, protectores a la luz
ultravioleta, fago-estimulantes, etc. La producción de este ingrediente activo en
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Colombia es muy baja, por lo tanto su obtención a escala industrial es de gran interés
para el desarrollo tecnológico y agrícola del país.
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2. JUSTIFICACIÓN
Existen distintos tipos de fermentadores para llegar a producir a escala industrial
productos a partir de microorganismos los cuales pueden ser continuos, fed-batch,
batch, entre otros. Los que se utilizan tradicionalmente para este tipo de operaciones son
los reactores batch y aunque otras metodologías han presentado mejores eficiencias no
han sido desarrolladas.
Las ventajas de la metodología batch según Winkler son:
1. Disminuye la probabilidad de contaminación, debido a que el sistema se
encuentra cerrado durante todo el tiempo de proceso.
2. El tiempo de proceso es relativamente corto con respecto a otras estrategias.
3. Permite que el proceso se lleve a cabo completamente en una sola etapa en
contraste con estrategias alternativas de producción, como en cultivo continuo,
en donde es necesario separar el proceso en dos etapas donde se desarrollan
fenómenos diferentes (crecimiento y esporulación) (González, Restrepo, Orduz,
2001, p.118).
Sin embargo, la metodología batch también presenta algunos inconvenientes que se
deben tener presentes. Por ejemplo:
1. La velocidad de crecimiento en estos cultivos es muy alta, situación que implica el
desarrollo de un metabolismo desordenado y la formación de sustancias que pueden
inhibir el crecimiento del microorganismo o su esporulación.
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2. B. thuringiensis es una bacteria que tiene una alta demanda de oxígeno que, junto
con la alta velocidad de crecimiento, genera un efecto sinérgico que exige una
eficiente transferencia de oxígeno para lograr satisfacer la demanda de éste en
comparación con otras estrategias de producción llevando a un aumento de costos.
De todas formas, las ventajas del proceso batch lo hacen deseable para llevar acabo la
producción del complejo espora-cristal como ingrediente activo de los biopesticidas,
siempre y cuando se tengan presentes las desventajas que el proceso presenta y la
relación costo beneficio sea satisfactoria.
Para realizar el escalamiento de un proceso se pueden utilizar distintos métodos que
incluyen el uso de: ecuaciones de microbalances de transferencia de momento, masa y
calor (métodos fundamentales), ecuaciones de transporte simplificadas (métodos semi-
fundamentales), análisis dimensional (donde el valor de los grupos adimensionales se
mantiene constante), reglas de dedo (involucran “ecuaciones de translación” que en
realidad son un índice de desempeño del proceso como la potencia por unidad de
volumen o el kLa) y finalmente el método de prueba y error (Mavituna, 1991, p.1117).
En el caso del escalamiento de B. thuringiensis estudios previos han mostrado que la
transferencia de oxígeno es un parámetro limitante para la obtención del ingrediente
activo (espora-cristal) debido a que esta bacteria en la fase vegetativa (crecimiento
exponencial) se multiplica activamente en condiciones aeróbias y la esporulación puede
llegar a inhibirse en condiciones de bajas concentraciones de oxígeno. En un punto
crítico de la fermentación la demanda de oxígeno por parte de los microorganismos
iguala la velocidad de transferencia de oxígeno al medio y por lo tanto el oxígeno
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disuelto es cero. Bajo estas condiciones la tasa de transferencia de oxígeno es máxima
(TTM), y éste es el parámetro que se mantiene constante al realizar el escalamiento.
Esta tasa de transferencia máxima es igual al producto del coeficiente volumétrico de
transferencia de oxígeno, kLa, y la concentración de oxígeno en el equilibrio, C*.
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3. OBJETIVOS
Objetivo General
• Realizar el escalamiento para la producción de un biopesticida a partir de B.
thuringuiensis subesp. kurstaki, en fermentadores de 14L y 250L con base en la
transferencia de oxígeno.
Objetivos específicos
• Encontrar un modelo matemático que relacione el coeficiente volumétrico de
transferencia máxima de oxígeno para los dos fermentadores (14L y 250L),
variando las condiciones de presión y agitación.
• Realizar las fermentaciones bajo distintas condiciones de agitación y presión en
el reactor de 14L, y a partir de los datos obtenidos evaluar la influencia de la tasa
de transferencia de oxígeno máxima en las variables de interés.
• Encontrar las condiciones de agitación y presión requeridas en el fermentador de
250L a partir de los resultados obtenidos en el fermentador de 14L.
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4. ANTECEDENTES
Varios trabajos de investigación se han realizado en el tema del escalamiento de B.
thuringiensis. Entre ellos se encuentra el trabajo de Paige y Cooper quienes reportan el
escalamiento de B. thuringiensis en fed-batch para producir β-exotoxina limitando el
suministro de la fuente de carbono en cierta fase del proceso. Gandman et al.
propusieron que los termogramas de bioactividad se podían aplicar para el escalamiento
industrial de las fermentaciones especialmente aquellas que involucraban B.
thuringiensis. Posteriormente, Wecht-Lifshift et al. basados en los termogramas
obtenidos por el método calorimétrico realizaron el escalamiento de una fermentación
con B. thuringiensis y determinaron el calor producido y la demanda de oxígeno(Flores,
Pérez, De la Torre, 1997, p.561). Sin embargo ninguna de estas investigaciones, estaban
enfocadas hacia la utilización de la transferencia de oxígeno como parámetro de
escalamiento.
Las investigaciones realizadas por varios autores han mostrado que la esporulación se
relaciona con el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno kLa. Entre estos
estudios se encuentra el de Arcas (1985) quien determinó que el porcentaje de
esporulación aumenta desde 70 hasta el 100% cuando el kLa se aumenta desde 88 hasta
220 h-1. Por otra parte, Muñoz y Quintero, encontraron una reducción en la producción
de proteína total del 50% en condiciones de limitación de oxígeno(Aguilar, 2000).
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Se han reportado estudios de escalamiento de B thuringiensis basados en el coeficiente
de transferencia de oxígeno variando la velocidad de agitación y el flujo de suministro
de aire. Flores et al. realizaron el escalamiento de B. thuringiensis basados en la
transferencia de oxígeno y su influencia en la producción de esporas, obteniendo
resultados satisfactorios al utilizar este coeficiente como parámetro de escalamiento.
González et al., realizaron el escalamiento basados correlacionando la producción de δ-
endotoxina con el kLa. Estos trabajos corrigen el kLa por la desviación de la presión, sin
embargo, ningún estudio sobre el efecto de la presión sobre la velocidad de
transferencia de oxígeno en estas fermentaciones ha sido reportado.
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5. MARCO TEÓRICO
5.1. Bacillus thuringiensis
Es una bacteria que mide entre 1.0 y 1.2 mm de ancho por 3.5 mm de largo la cual
pertenece a la familia Bacillaceae, es un organismo anaerobio facultativo (pueden
crecer en presencia o ausencia de oxígeno) y es Gram positivo. Este bacilo en
condiciones de estrés forma endoesporas acompañadas de cristales paraesporales como
mecanismo de defensa. La presencia de cristales ligada a la formación de endoesporas,
es la principal característica que lo diferencia de otros bacilos. Algunos de estos
cristales paraesporales son tóxicos a un rango de insectos, razón por la cual es un
organismo de gran interés para la producción de bio-insecticidas.
Ciclo de vida de B.t
El ciclo de vida de B. thuringiensis, comienza con la etapa de la germinación de la
espora de resistencia, en la cual aparece la célula vegetativa, que se multiplica
activamente en condiciones aeróbicas, con una temperatura óptima de crecimiento entre
26 y 30°C. Aunque el pH no es un factor crítico en el crecimiento, crece adecuadamente
entre valores de pH de 5.5 - 8.5, pero el rango óptimo se encuentra entre 6.5-7.5.
Durante la fase exponencial, las bacterias presentan una mayor demanda de oxígeno, y
al mismo tiempo comienzan a acumular ácidos debido a la inhibición del ciclo del ácido
tricarboxílico. Esta acumulación de ácidos se ve reflejada en la disminución del pH
durante el cultivo. Una vez se ha multiplicado, entra a la a la formación de la espora,
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esta última fase coincide con el cambio de crecimiento exponencial a la fase
estacionaria, en la cual además de formarse la endoespora se forma el cristal
paraesporal, en la cual es de gran importancia la presencia de oligoelementos en el
medio de cultivo como sales de magnesio, zinc, manganeso, calcio y hierro. Cuando se
encuentran bajas concentraciones de oxígeno o altos niveles de nitrógeno orgánico en el
medio de cultivo, la esporulación puede llegar a inhibirse completamente (Iriarte, 2001,
p19-23.).
Simultáneamente a la formación de la espora se sintetiza uno o varios cristales
paraesporales, que pueden representar entre un 20 a 30 % del peso seco del esporangio.
Con frecuencia se ha establecido una correspondencia entre la forma del cristal y su
espectro de actividad insecticida. Cuando se concluye la fase de la esporulación se da
comienzo a la lisis de la pared del esporangio, liberándose así la espora y el cristal
paraesporal, el cual es de gran interés. El ciclo vuelve a comenzar si se encuentran las
condiciones favorables para este.
Patogenicidad
Muchos grupos taxonómicos de invertebrados son susceptibles a la acción tóxica del
cristal praesporal de B.thuringiensis, dentro del grupo Lepidóptera, son susceptibles la
mayoría de las familias pertenecientes como Cossidae, Gelechiidae, Lymnatriidae entre
otras, en el grupo Díptera el espectro de actividad es menor y en el de Coleóptero es
muy reducido. Dependiendo de la subespecie, el espectro de actividad tóxica varía.
Existen subespecies que producen toxinas no sólo contra insectos sino contra
nemátodos, protozoos, tramatodos y ácaros (Iriarte, 2001, p26).
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La proteína toxica actúa en el insecto una vez ésta ha sido ingerida por el mismo.
Cuando las toxinas llegan al intestino del insecto, se unen específicamente a receptores
de membrana de naturaleza glicoproteica y con pesos entre 120 y180 kDa, situados en
las células columnares del epitelio del intestino de los insectos. La teoría más aceptada
con respecto al mecanismo de acción de la proteína, es que la inserción de varias hélices
α� de la toxina en torno a un punto concreto, da lugar a la aparición de una estructura
que actúa como un poro de un radio de unos 0.6nm en la membrana celular. La apertura
del poro hace que las células columnares se hinchen rápidamente perdiendo
funcionalidad, con lo que se inicia un intercambio de fluidos y se genera un choque
osmótico. Después las células se lisan, desorganizándose el tejido epitelial del
mesenterón (Iriarte, 2001, p33). La acción del complejo espora cristal sobre los insectos
se muestra en la figura.
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Figura 1. Acción de Bacillus thuringiensis subesp. kurstaki en gusanos1
Algunos bacilos en su ciclo de vida sintetizan una proteína β-galactosidasa, la cual es
tóxica para los mamíferos y por ende para el hombre. Este no es el caso de la variedad
con la cual se han desarrollado los biopesticidas ya que no sería un producto viable para
el uso en el control de plagas.
1 Tomado de Biological Control: A Guide to Natural Enemies in North America. Cornell University.
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29
5.2. TRANSFERENCIA DE MASA
En las fermentaciones con B. thuringiensis muchos autores han señalado que el oxígeno
juega un papel importante en la esporulación y producción de la δ-endotoxina.
Dulmage, Luthy y Ebersold notaron que el crecimiento y esporulación de B.
thuringiensis podía ser optimizado mediante el uso de altas velocidades de aireación.
Foda et al. reportaron una variación en el conteo de células, unidades formadoras de
colonias y toxicidad de la δ-endotoxina, con la variación del nivel de aireación en
cultivos con B.thuringiensis var. entomocidus (Flores, et al, 1997, p.561-564).
Finalmente, Avignone-Rossa et al, concluyeron que el suministro de oxigeno era un
factor critico para la producción de la δ-endotoxina(González, et al, por publicar).
Es por esta razón, que es importante estudiar el fenómeno de transferencia de oxígeno
que se lleva a cabo durante la fermentación a la luz de los procesos de transferencia de
masa y todos los elementos que en esta influyen, desde las características
termodinámicas del sistema, pasando por las variables que la afectan (aireación,
agitación, etc.) hasta la misma geometría del fermentador en el cual se lleva a cabo el
proceso.
Equilibrio
En una fermentación con aireación básicamente lo que se tiene es un sistema de dos
fases, gas y líquido, similar a una columna de burbujeo. Un sparger inyecta aire por la
parte inferior del fermentador y las burbujas ascienden a través de la columna de caldo
fermentativo hasta la superficie. En su travesía por la columna, se lleva a cabo la
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30
transferencia de oxígeno desde el seno de la burbuja hasta el seno del caldo
fermentativo.
El fenómeno de transferencia de masa depende principalmente de dos elementos: La
fuerza motriz y las resistencias a lo largo de la trayectoria de transferencia. En el caso
de la transferencia de masa interfacial, la fuerza motriz esta dada por una diferencia
entre la concentración en el seno de la fase de la especie que se difunde y su
concentración en la interfase, que es la misma concentración en el equilibrio entre las
fases, ya que se considera que en la interfase las dos fases líquidas y gaseosas se
encuentran en equilibrio. Por lo tanto, la difusión entre dos fases requiere de una
desviación del equilibrio que pueda existir entre las concentraciones promedio o
aparentes de cada fase. Es por esta razón, que es necesario considerar el equilibrio en la
interfase para describir la transferencia de masa en ésta(Welty, Wicks, & Wilson, 1999,
p.744).
El estudio de la termodinámica de los sistemas, lleva a obtener relaciones para el
equilibrio entre las fases. En el caso de soluciones gaseosas y líquidas no ideales, las
relaciones generalmente son complejas. Sin embargo, para los casos en los cuales se
tienen soluciones y gases ideales o diluidos, se conocen algunas relaciones
relativamente simples (Welty, et al, 1999, p.746). Este es el caso de la difusión de
oxígeno en soluciones acuosas, las cuales podemos clasificar como una solución diluida
ya que la solubilidad del oxígeno en soluciones acuosas es extremadamente baja, del
orden de 9 ppm de oxígeno en agua a una presión de 1 atm. y 20°C (Welty, et al, 1999,
p.748) (la solubilidad de los gases en los líquidos decrece al aumentar la temperatura),
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Debido a esto, el equilibrio oxígeno – agua, obedece la Ley de Henry, la cual está
expresada por:
22 OO Hcp =
donde:
pO2: Presión parcial del oxígeno en equilibrio en la fase gaseosa
H: Constante de Henry
cO2: Concentración molar en equilibrio en la fase líquida
La constante de Henry para oxígeno disuelto en agua es 4.01x104 atm/fracción mol a
20°C.
Los sistemas en equilibrio que obedecen la ley de Henry poseen una curva de equilibrio
con una pendiente constante, es decir, su curva de equilibrio es una línea recta. Esto
facilita el análisis posterior de las resistencias a la transferencia de masa que se muestra
a continuación.
Resistencias en la transferencia de oxígeno
Al evaluar la transferencia de oxígeno en la fermentación, se puede identificar
claramente las resistencias a la transferencia que encuentra el oxígeno antes de llegar a
la célula.
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Figura 2. Resistencias a la transferencia de oxígeno de la burbuja de aire a la
célula.
El mecanismo total de la transferencia se puede dividir en una serie de pasos de la
siguiente manera: transferencia del oxigeno a través de las películas de gas y líquido que
rodean las burbujas de aire (R1 y R2 respectivamente); su camino en el caldo
fermentativo (R3); a través de la película de líquido que rodea la célula (R4) y, la
reacción bioquímica intramolecular (R5)(Quintero, 1995, p.82) 2.
Se ha demostrado que la mayor resistencia la opone la película de líquido que rodea la
burbuja de aire(Quintero , 1995, p.82). Esto era de esperarse debido a la baja solubilidad
del oxígeno en el agua, lo que hace que el fenómeno este controlado por la fase líquida.
Esto quiere decir que, la transferencia de oxigeno esta dada por(Aiba, Humphrey &
Millis, 1973,p. 164):
)(
)(*
,*
222
222
OOLO
LOOLO
ppHkn
cckn
−=
−=
donde:
2 Esto solo ocurre en el caso de organismos unicelulares.
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H: Constante de Henry
kL: Coeficiente de transferencia de masa en el líquido
cO2.L: Concentración de oxígeno disuelto en el seno del líquido
pO2: Presión parcial de oxígeno en el seno del gas
c*O2: Concentración en equilibrio con pO2
p*O2: Presión parcial en equilibrio con cO2
La velocidad volumétrica de transferencia de oxígeno, OTR, esta dad entonces por
(Aiba, et al, 1973, p. 164):
)(
)(*
,*
22
22
OOL
LOOL
ppaHkOTR
ccakOTR
−=
−=
donde a es el área interfacial entre el gas y el líquido por unidad de volumen de líquido.
Limitaciones en la transferencia de oxígeno
En las fermentaciones con B. thuringiensis no se deben presentar limitaciones de
oxígeno si se quiere llegar a producir la δ-endotoxina. Para que no existan limitaciones
de transferencia de oxígeno, la velocidad de transferencia de oxigeno (OTR) siempre
debe ser mayor o en un caso crítico igual a la demanda de oxígeno (OUR) por parte del
los microorganismos . La demanda de oxígeno esta dada por:
XqOUR O2=
donde
qO2: Demanda específica de oxígeno
X: Concentración de biomasa.
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A su vez, la demanda específica de oxígeno esta dada por:
2
2O
O Yq µ=
En un proceso fermentativo por lotes la concentración de D.O. y la concentración de
biomasa cambian con el tiempo; sin embargo, es posible considerar la situación de
estado estable para un tiempo determinado, en la que la demanda de oxígeno (OUR) y la
velocidad de transferencia de oxígeno (OTR) sean iguales. Bajo estas circunstancias,
OTR y OUR son iguales como muestra la ecuación(Rios y Buitrago, 1999 , p.43-50):
2
222)( ,
*
OOLOOL Y
XXqccak µ==−
A bajas concentraciones celulares, la OUR es baja aún cuando las células pueden estar
respirando a su máxima velocidad de demanda específica de oxígeno (qO2max);
adicionalmente, la concentración de oxígeno en el medio (cO2.L) se incrementa y se
aproxima al valor de saturación (c*O2). Así, el oxígeno se presenta en una condición no
limitante para el crecimiento de los microorganismos. A medida que la concentración de
biomasa se incrementa, OUR se incrementa y como consecuencia la concentración de
oxígeno disuelto disminuye. A unas concentraciones de operación definidas, una alta
concentración celular hará que le valor de oxígeno disuelto alcance la concentración
crítica de oxígeno (ccrit.) cuyo valor depende de las características fisiológicas de los
microorganismos (Rios, 1999, p.43-50).
A ccrit. el cultivo aún cuenta con la cantidad de oxígeno demandada por la concentración
celular presente. A partir de este valor un incremento en la biomasa ya no dispone del
oxígeno que necesita para su desarrollo normal (Rios, 1999, p.43-50). Lo que se debe
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35
procurar en las fermentaciones con B. thuringiensis es trabajar siempre por encima de
ccrit., lo que implica aumentar la velocidad de transferencia de oxígeno (OTR).
La velocidad de transferencia de oxígeno se puede incrementar de dos formas:
incrementando el valor de kLa y aumentando la fuerza motriz. La fuerza motriz se puede
modificar mediante el aumento de la presión en el sistema ya que la solubilidad de los
gases en los líquidos aumenta al aumentar la presión. De esta forma, se estaría
aumentando el valor de oxígeno disuelto en la saturación (c*O2) y por lo tanto
aumentaría la fuerza motriz.
Por otro lado, se ha establecido que kLa depende entre otros, de variables de operación
como la aireación y la agitación. De esta forma, modificando estas variables se puede
modificar el valor de kLa y aumentarlo hasta donde sea necesario para que durante la
fermentación no se presenten limitaciones de oxígeno.
Coeficiente volumétrico de transferencia de masa
El coeficiente volumétrico de transferencia de masa depende tanto de variables de
operación como la agitación y la aireación, así como de las características físicas del
caldo fermentativo, tales como la composición del medio, la viscosidad, cantidad de
antiespumante presente, entre otros.
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Agitación, aireación y régimen hidráulico
Varios autores han establecido correlaciones experimentales para el valor de kLa como
función de la agitación, la aireación y la potencia por unidad de volumen. Generalmente
estas correlaciones son del tipo(Aiba, et al, 1973, p. 182-183):
γβα sL VNak =
ó
κγβα )/( VPVNak gsL =
donde
N: Velocidad de agitación
Vs: Velocidad de aireación por sección transversal del fermentador.
Pg: Potencia de agitación
V: Volumen del fermentador.
α, β, γ, κ: Constantes estimadas de los modelos
Así, podemos observar la proporcionalidad directa que existe entre el coeficiente de
transferencia de masa y la agitación y la aireación: al aumentar cada una de estas
variables también aumenta el coeficiente de transferencia.
El propósito de la aireación es colocar en contacto el gas que contiene oxígeno con la
columna de caldo fermentativo. Por otra parte el burbujeo también sirve como medio de
agitación ( Treybal, 1988 ,p.158).
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El diámetro de las burbujas influye sobre el coeficiente volumétrico de transferencia de
masa ya que entre mas pequeñas son las burbujas, mayor es el área de contacto y esto
aumenta la transferencia.
El propósito de la agitación, por otro lado, es la dispersión de las burbujas de gas y la
disminución del tamaño de las mismas, provocar turbulencia y mantener el cultivo
homogéneo (McCabe, Smith & Harriot, 1991 ,p. 242).
Así, el conjunto de aireación y agitación también influye en la determinación del
régimen hidráulico que se presenta en el fermentador y que a su vez contribuye a
aumentar o disminuir la transferencia de masa.
Velocidades de agitación y de aireación pequeñas llevan a regímenes laminares donde la
transferencia de masa es muy pobre. Por otro lado, un régimen turbulento favorece la
transferencia de masa. Sin embrago, un régimen turbulento óptimo no se consigue
simplemente con altos flujos de aireación y agitación, ya que a altas velocidades de
agitación se pueden formar remolinos que no se mezclen con otros remolinos y no
favorezcan la homogeneidad del reactor y tampoco la transferencia de masa, o el caldo
fermentativo también puede comenzar a moverse junto con el agitador como una sola
masa sin estar mezclándose entre si. Estos fenómenos se pueden combatir mediante la
instalación de deflectores. Por otra parte, la combinación de altos flujos de aireación y
agitación puede llevar a la formación de colchones de aire alrededor de las paletas del
agitador y provocar que burbujas de mayor tamaño se desprendan del agitador. De esta
forma, el kLa también se ve disminuido.
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Dependiendo del tipo de agitador utilizado se pueden encontrar dos tipos de flujo, flujo
axial y flujo radial. En las fermentaciones se prefiere el flujo radial porque asegura un
mejor mezclado y como absorbe más energía, Pg/V es mayor y así también aumenta kLa
( Quintero, 1995. p.88).
Otros factores
- Viscosidad: Se ha demostrado que el aumento en la viscosidad del fluido
disminuye el valor del coeficiente de transferencia de masa (Quintero, 1995.
p.87).
- Electrolítos: La presencia de electrolitos aumenta el valor del kLa(Quintero,
1995. p.86).
- Sustancias Orgánicas: La presencia de sustancias organicas tales como
alcoholes, cetonas y esteres aumentan el valor de kLa (Aiba, et al, 1973. p. 184).
- Los agentes tensoactivos: La presencia de agentes tensoactivos disminuyen
dramáticamente el valor de kLa (Aiba, et al, 1973. p. 184).
5.3. ESCALAMIENTO
El escalamiento en bioreactores es una de las etapas más complejas en el desarrollo de
un nuevo producto, ya que en esta se debe realizar un análisis detallado de las variables
físicas, químicas y biológicas. Para entender el proceso de escalamiento se deben tener
en cuenta todos los fenómenos que ocurren en el bioreactor como lo son: la cinética de
las reacciones, termodinámica y los fenómenos de transferencia de masa calor y fluidos.
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Generalmente el escalado consta de tres etapas , la primera es el estudio de las
condiciones óptimas para el crecimiento de los microorganismos , tales como
temperatura, pH, medio de cultivo entre otros, el cual se realiza en matraces de 500 a
1000 mL. Una vez se a culminado esta etapa sigue la segunda fase del proceso, la planta
piloto, en la cual una vez se ha escogido el parámetro de escalamiento, se realizan los
estudios necesarios para pasar a la etapa final la cual es la puesta en marcha a escala
industrial, en esta fase se validan los resultados obtenidos en la planta piloto.
Dentro de los parámetros de escalamiento, los más utilizados son: (Mavituna,1991,
1116)
1) Métodos fundamentales, basados en balances diferenciales de momento, masa y
calor.
2) Métodos semifundamnetales, basados en balances de gradiente máximo y
macroscópico.
3) Análisis de régimen, análisis de proceso para encontrar las etapas limitantes
4) Análisis dimensional, basadas en analogías de las ecuaciones generadas de los
balances de momento, calor, masa.
5) Reglas empíricas, se basan en fijar algunas condiciones que, por la experiencia,
se sabe que son factores limitantes del proceso. Algunas de estas son:
Potencia por unidad de Volumen: consiste en suponer que al igualar la potencia
suministrada al sistema se van a conservar los resultados en ambas escalas (Aiba
et al, 1973).
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Velocidad de punta del agitador: se basa en la conservación de la velocidad de la
punta del agitador para igualar los esfuerzos hidrodinámicos en ambas escalas,
en caso de escalar microorganismos sensibles a los esfuerzos (Aiba et al, 1973).
Coeficiente volumétrico de transferencia de masa, kLa : una manera de
cuantificar la transferencia de oxígeno en un sistema consiste en estimar el
coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno kLa en fermentadores
convencionales de tanque agitado; el kLa depende de la velocidad de agitación y
del flujo de aire. En el caso de microorganismos con gran demanda de oxígeno,
igualar kLa puede ser una manera de reproducir los datos obtenidos en
laboratorio, en un fermentador industrial.(Flores et al.,1997)
En el caso del escalamiento de B. thuringiensis estudios previos (Avignone-Rossa et al.,
1992) han mostrado que la transferencia de oxígeno es un parámetro limitante para la
obtención del ingrediente activo (espora-cristal) debido a que esta bacteria en la fase
vegetativa (crecimiento exponencial) se multiplica activamente en condiciones aeróbias
y la esporulación puede llegar a inhibirse en condiciones de bajas concentraciones de
oxígeno. En un punto crítico de la fermentación, la demanda de oxígeno por parte de los
microorganismos iguala la velocidad de transferencia de oxígeno al medio y por lo tanto
el oxígeno disuelto es cero.
El primer paso para realizar el escalamiento es seleccionar uno de los métodos
mencionados anteriormente. En biotecnología es común el uso de las reglas empíricas
para realizar estos procedimientos, con muy buenos resultados. Unas de las más
utilizadas son el kLa, cuando la transferencia de oxígeno juega un papel fundamental en
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41
el proceso, y la velocidad en la punta del agitador cuando los microorganismos son
sensibles a esfuerzos cortantes.
Una vez seleccionada la metodología, se debe establecer la forma del escalamiento, es
decir, el procedimiento que se debe seguir para determinar, exitosamente, las
condiciones de operación del proceso a gran escala.
Si se utiliza la metodología de las reglas empíricas, el escalamiento se basa en mantener
constante el valor de un parámetro de operación en ambas escalas. Para esto se estudia
el efecto que presenta el parámetro de operación seleccionado sobre un parámetro de
rendimiento del producto final que se obtiene en la fermentación. El parámetro de
operación se elige de acuerdo a cada microorganismo, sus necesidades y las
limitaciones que se presentan en la fermentación. El valor en el cual se debe mantener
constante el parámetro de operación se selecciona cuando el valor del parámetro de
rendimiento se vuelve independiente del parámetro de operación o presenta un máximo,
como se muestra en la figura 3. En este caso, el parámetro de operación seleccionado a
partir de una regla empírica es el kLa. El parámetro de rendimiento de la fermentación
es la concentración relativa del producto final. En la figura se muestra la relación que
existe entre los dos parámetros. La región de escalamiento se selecciona, como se
mencionó anteriormente, cuando la concentración relativa del producto final es
independiente del kLa o cuando presenta un máximo.
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42
Figura 3. Escalamiento (QUINTERO, 1987, p. 99)
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43
6. DISEÑO EXPERIMENTAL
Para realizar el escalamiento es necesario contar con un parámetro de operación, que en
nuestro caso es el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno, y con un
parámetro de producción, obtenido a partir de las fermentaciones.
Para encontrar el parámetro de operación, es necesario caracterizar la transferencia de
oxígeno en los fermentadores de 14L y 250L respectivamente. Para realizar la
caracterización en el fermentador de 14L se trabajó un modelo que contaba con 3
factores: aireación, agitación y presión. Los factores trabajados y los valores de los
niveles de cada uno de ellos se resumen a continuación:
Tabla 1. Diseño experimental para la caracterización de la transferencia de
oxígeno en el fermentador de 14L
FACTORES NIVELESPresión (psi) 6 10 15Aireación (Lpm) 8 11 16Agitación (rpm) 350 400 500 600 700 800
Para realizar la caracterización de la transferencia de oxígeno en el fermentador de
250L, también se utilizó un modelo de tres factores, los mismos trabajados a pequeña
escala. Los niveles de los factores trabajados en este fermentador se muestran a
continuación:
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44
Tabla 2. Diseño experimental para la caracterización de la transferencia de
oxígeno en el fermentador de 250L
FACTORES NIVELESPresión (psi) 10 15Aireación (Lpm) 110 150Agitación (rpm) 300 400
Los factores se seleccionaron ya que se sabe que el coeficiente volumétrico de
transferencia de masa depende de estas variables principalmente. Los niveles en el
fermentador de 14L se escogieron buscando que se cubriera todo el rango de trabajo del
fermentador. En el fermentador de 250L, los niveles se escogieron de tal forma que el
rango de valores de kLa obtenidos en ambos fermentadores fueran similares.
También es necesario determinar un parámetro de producción, que se obtiene a partir de
las fermentaciones. Para esto, necesitamos trabajar a condiciones bajas, medias y altas
de transferencia de oxígeno. Para realizar las fermentaciones se escogió un modelo de
dos factores: presión y agitación, ya que estos factores influyen de manera sobresaliente
en el kLa, y se decidió dejar la aireación constante en un valor de 15 Lpm.
Los factores y los niveles utilizados se muestran a continuación:
Tabla 3. Factores y niveles utilizados para las fermentaciones a 14L.
FACTORES NIVELESPresión (psi) 6 10 15Agitación (rpm) 350 500 600 800
Las condiciones bajo las cuales se realizaron las fermentaciones se encuentran
resumidas en la siguiente tabla:
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45
Tabla 4. Diseño experimental para las fermentaciones a 14L
FERMENTACIÓN AGITACIÓN(rpm)
PRESIÓN(psi)
AIREACIÓN(Lpm)
CONDICION
1 800 15 15 ALTA2 600 10 15 ALTA3 500 6 15 MEDIA4 350 6 15 BAJA
Las fermentaciones 1, 2, y 3 se realizaron por duplicado. Las fermentaciones se
realizaron en orden aleatorio.
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7. MATERIALES Y MÉTODOS
7.1 Caracterización de la transferencia de oxígeno en los fermentadores de 14 y250L.
La caracterización de la transferencia de oxígeno en los fermentadores se realizó
mediante la medición del kLa bajo distintas condiciones de aireación, presión y
agitación de acuerdo al diseño experimental.
Para la medición del kLa se utilizó el método dinámico o técnica de eliminación de gas
por burbujeo de nitrógeno. El método consiste básicamente en burbujear nitrógeno a
través del reactor lleno con agua para así retirar todo el oxígeno presente en el líquido.
Cuando se haya retirado todo el oxígeno, se introduce aire y el valor del oxígeno
disuelto se monitorea en el tiempo hasta que la columna de líquido se sature. En este
caso, el proceso de transferencia de oxígeno del gas al líquido está determinado por:
)( *LL
L CCakdt
dC−=
La pendiente de una gráfica de Ln(C*-C) Vs. tiempo es el valor estimado de kLa.
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Figura 4. Cálculo de kLa. (a): Perfil de concentración de oxígeno disuelto en el
tiempo. (b): linealización para hallar kLa
Las medidas se tomaron utilizando agua, ya que estudios previos (Flores, 1997) han
demostrado que la transferencia de oxígeno en agua y en el medio de cultivo son muy
similares.
7.2 Microorganismo y Medio de Cultivo
La cepa B. thuringuiensis subsp. kurstaki CIB 172-0451 No. 62, fue utilizada en este
estudio para la producción a gran escala. La solución de esporas inicial se obtuvo de una
fermentación pasada con muy buena esporulación la cual fue concentrada y suspendida
en una solución de glicerol, y posteriormente almacenada en crioviales de 5ml en el
críostato a –70°C. El medio de cultivo utilizado para las fermentaciones ha sido
reportado anteriormente (vallejo et al, 1999), en el cual los principales componentes son
una fuente de nitrógeno, en este caso extracto de levadura, una fuente de carbono
(glucosa) y sales necesarias para el crecimiento del microorganismo, así como para
estabilizar el pH del medio.
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7.3 Preparación del inóculo y condiciones de las fermentaciones a 14L
Equipo F4 New Brunswick®, volumen total 14L, volumen de fermentación
11L.
Inóculo: El proceso se inicia con la preparación de la presemilla, la cual consta de
100 mL del medio de cultivo a los cuales se inocula 5 mL de la solución de esporas.
Esta presemilla se hace por duplicado para mayor seguridad. Una vez preparada, se
lleva al agitador a 300 rpm, el cual se encuentra en la incubadora que esta a 30°C.
La presemilla permanece a estas condiciones aproximadamente 16 horas.
Una vez se han cumplido las 16 horas se prepara la semilla, en la cual a tres
erlenmeyers de 1000 mL cada uno se le adiciona 455 mL de medio de cultivo y 45
mL de la presemilla y son llevados a la incubadora a las mismas condiciones por 5
horas (300 r.p.m. y 30°C).
La fermentación Batch, se lleva a cabo en el fermentador F4 de 14L, New
Brunswick®, en el cual a 10 L de medio de cultivo previamente inoculados, se
inocula un litro de la semilla. Las condiciones de la fermentación se muestran en el
diseño experimental. Todos los procesos nombrados anteriormente se deben realizar
en condiciones asépticas para prevenir una posible contaminación.
7.4 Preparación del inóculo y condiciones de las fermentaciones a 250L
Equipo F1 New Brunswick®, volumen total 250 L, volumen de fermentación
110L
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Inóculo: El proceso se inicia con la preparación de la presemilla, la cual consta de
445 mL del medio de cultivo a los cuales se inocula 25 mL de la solución de
esporas. Esta presemilla se hace por duplicado en erlenmeyers de 1000 mL. Una vez
se ha inoculado se lleva a la incubadora a 300 rpm y 30°C. La presemilla permanece
a estas condiciones aproximadamente 16 horas.
Una vez se han cumplido las 16 horas se prepara la semilla, en el fermentador F4,
New Brunswick®, en el cual a 10 L de medio de cultivo previamente inoculados, se
inocula un litro de la semilla y se lleva a 400rpm, 30°C, 12Lpm, 5psi por 5 horas.
Finalmente, la fermentación Batch se realiza en el fermentador F1 en el cual a 100L
de cultivo se inocula 11L de la semilla. Las condiciones de la fermentación
dependen del estudio realizado previamente en la primera etapa del escalamiento.
Todos los procesos nombrados anteriormente se deben realizar en condiciones
asépticas para prevenir una posible contaminación.
Todas las fermentaciones se deben realizar a 30°C y a un pH entre 6.2-7.8.Se debe
controlar durante el proceso el pH, el cual indica el crecimiento de la bacteria, ya
que a medida que se consume la glucosa, el pH del cultivo se va acidificando; para
evitar valores de pH menores a 6.0 se debe adicionar KOH periódicamente. Este
control del proceso se realiza manualmente en los dos fermentadores y el pH se
mide en un potenciómetro Corning® previamente calibrado. Por otra parte, se debe
controlar la espuma producida en la fermentación, para lo cual se adiciona
manualmente antiespumante a base de aceite mineral al 50%. Otra variable de gran
importancia, que indica el comportamiento de la fermentación, es el porcentaje de
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50
oxigeno disuelto, el cual es medido por un sensor que se debe calibrar previamente a
las condiciones de operación para obtener datos confiables.
7.5 Métodos Analíticos
Para realizar los análisis necesarios de las fermentaciones, se toman muestras del
cultivo cada hora durante las primeras ocho horas y después se toman cada dos
horas hasta que el cultivo haya esporulado. Con estas muestras se realizan
diferentes análisis los cuales son: medición de glucosa por el método DNS,
conteo de UFC en medio sólido de Luria Bertani (LB), proteína total por el
método de Bradford, proteína específica por el método de electroforesis en gel
de poliacrilimida y cuantificación de la proteína específica por densitometría y
por último biomasa por peso seco.
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8. RESULTADOS
A continuación se presentan los resultados de la caracterización de la transferencia de
oxígeno en los fermentadores de 14L y 250L y los resultados de las fermentaciones que
se realizaron.
8.1 Caracterización de la transferencia de oxígeno en el fermentador de 14L
De acuerdo con los datos obtenidos (Ver anexo 2) el valor de el coeficiente de
transferencia de oxígeno depende de la agitación, la aireación y la presión de acuerdo a
la siguiente expresión:
kL a = 2,42x10-4 P 0.22 N 1.10 Vs 0.36
Donde: kL a: Coeficiente volumétrico de transferencia de masa (h-1).
P: Presión manométrica (psi).
N: Agitación (rph).
Vs: Velocidad de aireación (m/h).
R2 = 0.840
Varianza explicada: 70.52%
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52
Como se muestra, la agitación es el factor que más influye sobre el coeficiente de
transferencia de masa. La presión y la aireación tienen un efecto similar aunque el de
ésta última es superior.
Figura 5. Efecto de la agitación y la aireación, sobre el kLa en el fermentador de
14L
La figura anterior muestra el efecto de la agitación y la aireación sobre el kLa. Se puede
ver que para niveles de agitación comprendidos entre 18000 y 42000 rph el valor de kLa
aumenta al aumentar la agitación. Sin embargo, a partir de los 42000 rph (aprox. 700
rpm) al aumentar la agitación, el efecto de ésta sobre el kLa disminuye, e inclusive se
alcanza a observar que el kLa decrece al tener altos valores de agitación.
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
53
Figura 6. Efecto de la presión y la agitación sobre el kLa en el fermentador de 14L
En la figura se puede observar el efecto de la presión sobre el kLa. Se ve que al
aumentar la presión, aumenta el valor de kLa. Se observa también que a presiones bajas
el efecto de disminución del kLa a altas velocidades de agitación es superior. Cuando se
trabaja a presiones altas, no se observa el decrecimiento del kLa a altas velocidades de
agitación.
8.2 Caracterización de la transferencia de oxígeno en el fermentador de 250L
De acuerdo con los datos obtenidos (Ver anexo 3) el valor del coeficiente de
transferencia de oxígeno en el fermentador de 250L depende de la agitación, la
aireación y la presión de acuerdo a la siguiente expresión:
kL a = 4x10-6 P 0.39 N 1.40 Vs 0.63
Donde: kL a: Coeficiente volumétrico de transferencia de masa (h-1).
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
54
P: Presión manométrica (psi).
N: Agitación (rph).
Vs: Velocidad de aireación (m/h).
R2 = 0.937
Varianza explicada: 87.76%
Se observa que en este caso, la agitación tiene una importancia superior que en el caso a
menor escala, y que la velocidad de aireación presenta una influencia superior sobre el
kLa que la influencia que tiene la presión.
Figura 7. Efecto de la aireación y la agitación en el kLa en el fermentador de 250L
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
55
Figura 8. Efecto de la presión y la agitación en el kLa en el fermentador de 250L
De las dos gráficas se puede observar que el kLa aumenta al aumentar cualquiera de las
variables, y que dentro del rango trabajado no se presenta el efecto de disminución del
kLa que se observó en el fermentador de 14L cuando se tenían altas velocidades de
agitación y presiones bajas.
8.3 Estimación de la tasa de transferencia máxima (TTM) de oxígeno en elfermentador de 14L
La solubilidad del oxígeno en el agua es de 7.43mg/L a una temperatura de 30°C y a
una presión de 1 atm. La tasa de transferencia de oxígeno esta dada por:
)( * CCakTT L −=
en la cual la tasa de transferencia máxima se obtiene cuando la concentración en el
medio es cero (C = 0) entonces la TTM sería:
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
56
*CakTTM L=
El valor de la concentración de saturación para cada una de las presiones se puede
estimar con la Ley de Henry ya que se esta trabajando a presiones bajas y la solubilidad
del oxígeno en agua también es muy baja.
De acuerdo a lo anterior, la concentración en el equilibrio para distintas presiones se
puede calcular de la siguiente forma:
psiaPCC psiaa 7.14
* *7.14=
Las concentraciones en el equilibrio, para las presiones a las cuales se trabajó son:
Tabla 5. Concentraciones de oxígeno en el equilibrio
Pmanométrica(psi)
P absoluta(psia)
C* oxígeno(mg/L)
0 14,7 7,436 16,83 8,5110 20,83 10,5315 25,83 13,06
Los valores de tasa máxima de transferencia de oxígeno correspondientes a las
condiciones de trabajo en el fermentador de 14L son:
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
57
Tabla 6. Valores de TTM para el fermentador de 14L
Presión(psi)
Agitación(rpm)
Aireación(Lpm)
kLa(h-1)
C* oxígeno(mg/L)
TTM(mg/Lh)
6 350 16 65 8,51 5556 350 16 65 8,51 5556 500 16 97 8,51 8216 500 16 97 8,51 82110 600 16 132 10,53 139010 600 16 132 10,53 139015 800 16 198 13,06 258615 800 16 198 13,06 2586
8.4 Fermentador de 14L
Se realizaron 7 fermentaciones, según el diseño experimental. Cada fermentación cuenta
con un número que la identifica. El número, orden y condiciones de trabajo para cada
fermentación realizada se muestra a continuación:
Tabla 7. Fermentaciones realizadas en el fermentador de 14L
No Fermentación Agitación(RPM)
Presión(psi)
Aireación(LPM)
710802 800 15 15720802 600 10 15730802 500 6 15740902 400 6 15750902 600 10 15760902 800 15 15781002 500 6 15
El volumen trabajado en este fermentador fue de 11L.
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
58
Los resultados de biomasa, consumo de glucosa, unidades formadoras de colonias,
cantidad de proteína total y cantidad de proteínas específicas en relación con la tasa de
transferencia máxima de oxigeno (TTM) para cada condición evaluada se presentan a
continuación.
8.4.1 Biomasa
El análisis de biomasa se realizó con el método del peso seco.
Tabla 8. Resultados de Biomasa y Velocidad de crecimiento.
No.Fermentación
Presión(psi)
Agitación(RPM)
Aireación(LPM)
kLa(h-1)
TTM(mg/Lh)
Biomasa(g/L)
µµµµ(h-1)
740902 6 350 16 65 555 11,60 0,2901730802 6 500 16 97 821 4,01 0,4874781002 6 500 16 97 821 9,42720802 10 600 16 132 1390750902 10 600 16 132 1390 6,47 0,9145710802 15 800 16 198 2586760902 15 800 16 198 2586 6,90 1,2211
Los datos de biomasa para las fermentaciones No.710802 y No.720802 no se pudieron
procesar a tiempo y por lo tanto no se tomaron en cuenta para el análisis. En la
fermentación No.781002 no se pudo obtener el valor de velocidad de crecimiento.
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
59
Biomasa Vs. TTM
02468
101214
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
TTM (mg/Lh)
Biom
asa
(g/L
)
Figura 9. Efecto de la tasa de transferencia máxima de oxígeno (TTM) sobre la
biomasa.
Se puede observar que al aumentar la TTM el valor de la biomasa no se ve afectado de
manera significativa y permanece aproximadamente constante aunque se observa un
ligero incremento. Se ve también, un valor inusualmente alto para condiciones de
transferencia de oxígeno bajas.
Velocidad crecimiento Vs. TTM
00,20,40,60,8
11,21,4
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
TTM (mg/Lh)
Vel.
crec
imie
nto,
µ (h
-1)
Figura 10. Efecto de la tasa de transferencia máxima de oxígeno (TTM) sobre la
velocidad de crecimiento.
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
60
Se observa que la velocidad de crecimiento aumenta constantemente al aumentar la tasa
de transferencia máxima de oxígeno.
Los resultados de biomasa para cada una de las fermentaciones se encuentran en el
Anexo 6.
8.4.2 Recuento de esporas
El recuento de esporas se realiza por medio de la determinación del número de
Unidades Formadoras de Colonias por mililitro (UFC/mL). Ver Anexo 8. Los resultados
se presentan a continuación:
Tabla 9. Resultados de recuento de esporas para las fermentaciones a 14L.
No.Fermentación
Presión(psi)
Agitación(RPM)
Aireación(LPM)
kLa(h-1)
TTM(mg/Lh) UFC/mL
740902 6 350 16 65 555 0730802 6 500 16 97 821 1,87x108
770802 6 500 16 97 821 5,50x108
720802 10 600 16 132 1390 1,50x109
750902 10 600 16 132 1390 1,33x108
710802 15 800 16 198 2586 6,35x107
760902 15 800 16 198 2586 6,33x107
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
61
Unidades Formadoras de Colonias Vs. TTM
1,00E+00
1,00E+02
1,00E+04
1,00E+06
1,00E+08
1,00E+10
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
TTM (mg/Lh)
UFC
/mL
Figura 11. Efecto de la TTM en el número de unidades formadoras de colonias.
En el número de unidades formadoras de colonias se puede observar un máximo
alrededor de una tasa de transferencia máxima de 1500 mg/Lh, a partir de este valor, las
UFC decrecen. También se observa que para TTM bajas no se observa formación de
esporas.
8.4.3 Proteína total y proteínas específicas.
El análisis de proteína total se realizó con el método de Bradford. La identificación de
las proteínas tóxicas específicas, de 60kDa y 130kDa, se realizó mediante el método de
electroforesis en gel de poliacrilamida y la cuantificación se realizó por densitometría.
Los resultados se presentan a continuación:
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
62
Tabla 10. Resultados del análisis de proteína total y específicas para las
fermentaciones a 14L
No.Fermentación
Presión(psi)
Agitación(rpm)
Aireación(Lpm)
kLa(h-1)
TTM(mg/Lh)
ProteínaTotal
(µµµµg/mL)
Proteína60kDa
(µµµµg/mL)
Proteína130 kDa(µµµµg/mL)
740902 6 350 16 65 555 287 28,7 0730802 6 500 16 97 821 1363 354 926770802 6 500 16 97 821 1181 0 0720802 10 600 16 132 1390750902 10 600 16 132 1390 1204 361 698710802 15 800 16 198 2586760902 15 800 16 198 2586 1912 268 1606
Los datos de proteínas para las fermentaciones No.710802 y No.720802 no se pudieron
procesar a tiempo y por lo tanto no se tomaron en cuenta para el análisis.
Proteina total, 60kDa y 130 kDa Vs. TTM
0
500
1000
1500
2000
0 500 1000 1500 2000 2500 3000TTM (mg/Lh)
Pro
tein
a (
g/m
L)
60kDa. 130kDa. Total
Figura 12. Efectos de la TTM en la cantidad de proteínas total y producción de
proteínas tóxicas.
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
63
Se observa que tanto la producción de proteína total como la producción de proteína
tóxica con peso molecular de 130kDa aumenta al aumentar la TTM. Por otro lado no se
observa un efecto significativo de la TTM en la producción de la proteína tóxica de
60kDa.
8.4.4 Glucosa
La cuantificación del contenido de glucosa se realizó utilizando el método de DNS
(Ácido Dinitrosalicilico).
Los resultados de rendimiento global y específico y de velocidad de consumo de
glucosa se muestran a continuación:
Tabla 11. Efectos de la TTM en los rendimientos y la velocidad de consumo deglucosa.
No.Fermentación
Presión(psi)
Agitación(RPH)
Aireación(LPM)
Rendimientoglobal
Rendimientoespecífico
Velocidadconsumo glucosa,
(g/hL)740902 6 350 16 48% 28% 2,12730802 6 500 16 17% 18% 2,32770802 6 500 16720802 10 600 16 3,88750902 10 600 16 27% 27% 3,74710802 15 800 16 4,18760902 15 800 16 29% 41% 4,39
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
64
Rendimiento global y específico de glucosa Vs. TMM
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
TTM (mg/Lh)
Rend
imie
nto
Global
Figura 13. Efecto de la TTM en el rendimiento global y específico de las
fermentaciones en 14L
El rendimiento específico de las fermentaciones aumenta al aumentarlos valores de
TTM; por otro lado, se ve que el rendimiento global se mantiene constante al variar los
valores de TTM. Además se observa el mismo punto inusualmente elevado que se
presentó en la biomasa a valores bajos de TTM.
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
65
Velocidad de consumo de glucosa y Velocidad de crecimiento Vs. TTM
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
TTM (mg/Lh)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
Vel. Glucosa Vel. crecim.
Figura 14. Efecto de la TTM en la velocidad de consumo de glucosa en las
fermentaciones en 14L
La velocidad de consumo de glucosa aumenta al aumentar la tasa de transferencia de
oxígeno de la misma forma en que aumenta la velocidad de crecimiento y con un patrón
similar.
Las gráficas de consumo de glucosa correspondientes a cada fermentación se
encuentran en el Anexo 10.
8.5 Fermentador de 250L
El volumen de trabajo en este fermentador fue de 110L. Se realizaron dos
fermentaciones en las siguientes condiciones:
Agitación: 400 rpm
Presión : 15 psi
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
66
Aireación: 150 Lpm (aprox.)
Temperatura: 30°C
kLa: 197h-1
TTM: 2573 mg/Lh
El procedimiento de inoculación en cada una de las fermentaciones se realizó de manera
distinta. En la primera fermentación el procedimiento que se siguió fue el siguiente:
! Fermentación A (No. 791102): Se preparó la presemilla, la cual consta de 100ml del
medio de cultivo a los cuales se inocula 5 ml de la solución de esporas. Esta
presemilla se hizo por duplicado para mayor seguridad. Una vez preparada se lleva
al agitador (shaker a 300 rpm), el cual se encuentra en la incubadora que está a
30°C. La presemilla permanece a estas condiciones aproximadamente 16 horas.
Posteriormente, a las 16 horas se preparó la semilla, en la cual a dos erlenmeyers de
1000mL cada uno se le adicionó 455ml de medio de cultivo y 45ml de la presemilla
y se llevaron a la incubadora a las mismas condiciones por 3 horas (300 r.p.m. y
30°C).
Después a 10 L de medio de cultivo previamente inoculados en el fermentador de
14L, se inocula un litro de la semilla. Se fijan condiciones de 400rpm, 5 psi, 12Lpm
y 30°C durante 5 horas.
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
67
Finalmente, los 11L de cultivo se inocularon en 100L de medio en el fermentador de
250L y se realizó la fermentación a las condiciones previamente establecidas
durante 63 horas.
! Fermentación B (No. 801102): Se preparó la presemilla, la cual consta de 445mL
del medio de cultivo a los cuales se inocula 25 ml de la solución de esporas. Esta
presemilla se hace por duplicado en erlenmeyers de 1000mL. Una vez se ha
inoculado se lleva a la incubadora a 300 rpm y 30°C. La presemilla permanece a
estas condiciones aproximadamente 16 horas.
Una vez cumplidas las 16 horas se prepara la semilla, en el fermentador de 14 L,
New Brunswick®, en el cual a 10 L de medio de cultivo previamente inoculados, se
inocula un litro de la semilla y se lleva a 400rpm, 30°C, 12Lpm, 5psi por 5 horas.
Finalmente, la fermentación Batch se realiza en el fermentador de 250 L en el cual a
100L de cultivo se inocula 11L de la semilla. Las condiciones de la fermentación
dependen del estudio realizado previamente en la primera etapa del escalamiento.
Por otro lado, la ubicación del impeller superior en cada una de las fermentaciones fue
diferente debido a motivos ajenos a nuestra voluntad. En la fermentación A, el impeller
superior no estuvo en contacto con el cultivo, mientras que en la segunda fermentación
esto se corrigió y el impeller estuvo en la posición adecuada, según las recomendaciones
de la literatura(Quintero, 1995, p. 93).
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
68
Los resultados de biomasa, consumo de glucosa, unidades formadoras de colonias,
cantidad de proteína total y cantidad de proteínas específicas, para estas dos
fermentaciones, en relación con la tasa de transferencia máxima de oxigeno (TTM), se
presentan junto con los resultados de los cultivos en el fermentador de 14L.
8.5.1 Biomasa
Tabla 12. Resultados de biomasa para los cultivos en el fermentador de 250L
Presión(psi)
Agitación(rpm)
Aireación(Lpm)
kLa(h-1)
TTM(mg/Lh)
m(h-1)
Biomasa(g/L)
15 400 150 197 2573 1,177 5,2515 400 150 197 2573 0,785 10,05
Constante de velocidad crecimiento Vs. TTM
00,20,40,60,8
11,21,4
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
TTM (mg/Lh)
Cte
. Vel
. cre
cim
ient
o, µ
(h-1
)
14L 250L
A
B
Figura 15. Velocidad de crecimiento en las fermentaciones a 14L y 250L
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
69
Biomasa Vs. TTM
02468
101214
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
TTM (mg/Lh)
Biom
asa
(g/L
)
14L 250L
B
A
Figura 16. Biomasa de las fermentaciones a 14L y 250L
La fermentación A tuvo un valor de constante de velocidad de crecimiento mayor pero
una biomasa total menor que la fermentación B
8.5.2 Conteo de esporas
Tabla 13. Unidades formadoras de colonias para el cultivo a 250L
Presión(psi)
Agitación(rpm)
Aireación(Lpm)
kLa(h-1)
TTM(mg/Lh) UFC/mL
15 400 150 197 2573 1,30E+0815 400 150 197 2573 1,30E+09
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
70
Unidades Formadoras de Colonias Vs. TTM
1,00E+00
1,00E+02
1,00E+04
1,00E+06
1,00E+08
1,00E+10
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
TTM (mg/Lh)
UFC
/mL
14L 250L
A
B
Figura 17. Unidades formadoras de colonias para las fermentaciones a 14L y 250L
La fermentación A presentó un conteo menor que la fermentación B pero se acerca a
los resultados obtenidos en el fermentador de 14L.
8.5.3 Glucosa
Rendimiento global Vs. TMM
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
TTM (mg/Lh)
Rend
imie
nto
14L 250L
B
A
Figura 18. Rendimiento global para las fermentaciones a 14L y 250L
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
71
El rendimiento global en la fermentación B fue mayor que el obtenido en la
fermentación A.
8.5.4 Proteína total y específicas
A continuación se muestran los resultados de los análisis de proteínas para el
fermentador de 250L
Tabla 14. Resultados de proteína para la fermentación A (No. 791102)
HORAProteína Total
(µµµµg/mL)Proteína 60kDa
(µµµµg/mL)Proteína 130 kDa
(µµµµg/mL)pH
38 1158 103 0 7.640 197 - - 7.843 934 - - 7.846 1718 - - 7.848 232 - - 7.863 207 - - 7.95
“Las muestras que tienen guión, no se procesaron por electroforesis debido a su baja
concentración de proteína. En las muestras que se reportan con cero para la proteína
tóxica de 130kDa, es debido a que no se aprecia la banda que corresponde a dicha
toxina”3.
Tabla 15. Resultados de proteína para la fermentación B (No. 801102)
HORAProteína Total
(µµµµg/mL)Proteína 60kDa
(µµµµg/mL)Proteína 130 kDa
(µµµµg/mL)pH
44 350 - - 8.0648 1358 240 49 8.3252 1246 180 0 8.46
66.5 1258 182 0 8.57
3 Laboratorio de Bioquímica. VECOL S.A.
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
72
“Las muestras que tienen guión, no se procesaron por electroforesis debido a su baja
concentración de proteína. En las muestras que se reportan con cero para la proteína
tóxica de 130kDa, es debido a que no se aprecia la banda que corresponde a dicha
toxina”4.
En el transcurso de la fermentación se observa un aumento en el pH y una disminución
en la proteína.
4 Laboratorio de Bioquímica. VECOL S.A.
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
73
9. ANÁLISIS DE RESULTADOS
9.1 Caracterización de la transferencia de oxígeno en los fermentadores de 14 y250L.
La caracterización de la transferencia de oxígeno de los fermentadores se realizó
utilizando el método dinámico o técnica de eliminación de gas por burbujeo de
nitrógeno en agua. Para esta caracterización lo óptimo es realizar las mediciones en el
medio de cultivo, sin embargo, Flores en su artículo (Flores et al, 1997) mostró que la
diferencia entre las mediciones realizadas en agua y en el medio era mínima, por esta
razón se decidió trabajar con agua. Por otra parte, el criterio más importante es que tanto
las mediciones en el fermentador de 14L como en el de 250L se realicen bajo las
mismas condiciones, para así poder comparar los datos obtenidos.
Como se observa en los resultados (Figura 5, 6, 7 y 8), a medida que se aumenta la
presión, la velocidad de aireación y la agitación, el valor del coeficiente de transferencia
de oxígeno, kLa, aumenta bajo ciertas condiciones.
La presión contribuye al aumento del valor del coeficiente de transferencia de oxígeno
ya que el cambio en la presión provoca el desplazamiento de las curvas de equilibrio de
los sistemas gas-líquido y por lo tanto favorece o no la solubilidad de los gases y
modifica su concentración en el equilibrio. De esta manera al aumentar la presión se
incrementa la transferencia de oxígeno de las burbujas de aire al medio.
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
74
Evidentemente la velocidad de aireación afecta la transferencia de oxígeno, ya que
dependiendo del flujo de aire va a existir una mayor o menor disposición de oxígeno
para transferir al medio. Además, al tener altos flujos de aire se aumenta la turbulencia.
La agitación es un factor que tiene una gran influencia en la transferencia ya que
aumenta la turbulencia y el área de contacto entre las dos fases. Las burbujas de aire
disminuyen su tamaño al chocar con las paletas del agitador, y por lo tanto el área de
contacto en la cual se realiza la transferencia aumenta. Por otra parte, al incrementar la
agitación se aumenta la turbulencia dentro del fermentador lo que favorece el fenómeno
de la transferencia.
Como se observa en las gráficas 5 y 6 de los resultados para el fermentador de 14L, el
kLa crece hasta un valor de aproximadamente 42000 rph (700 rpm). A partir de este
punto se observa un decrecimiento en el valor del coeficiente que se hace más evidente
a presiones bajas. Esto se puede explicar a partir de un fenómeno conocido como
inundación, en el cual a altas velocidades de agitación, la estela que se forma detrás de
una paleta del agitador no se alcanza a desvanecer y se encuentra con la otra paleta del
agitador formando un colchón de aire alrededor del agitador y causando un aumento en
el tamaño de las burbujas que se desprenden del agitador. Es muy probable que esto
haya sucedido ya que a valores superiores a 700 rpm son parámetros de operación muy
altos para este fermentador.
Por otra parte, a bajas revoluciones el efecto de la presión y de la velocidad de aireación
no es relevante frente al valor de kLa, mostrando así que la agitación es el factor que
presenta una mayor influencia en el coeficiente de transferencia.
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75
En el fermentador de 250L no se observa ningún decrecimiento en el valor de kLa, pero
si se observa que el efecto de la presión y la aireación son bajos a velocidades de
agitación bajas.
El valor del coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno en el fermentador se
modeló de acuerdo a lo reportado en la literatura (Aiba et al, 1973; Flores et al, 1997):
cbsL NVaak =
Asumiendo que la presión presentaba un comportamiento similar al de la velocidad de
aireación y agitación, se modeló el coeficiente de transferencia obteniendo una
correlación de la siguiente manera
dcbsL PNVaak =
con un coeficiente de determinación, R2, de 0,84 para el fermentador de 14L y 0.94 para
el fermentador de 250L. La diferencia entre la precisión de los modelos, se debe al
fenómeno de inundación que se presenta en el fermentador de 14L, sin embargo, es un
buen modelo ya que en el fermentador de 250L los resultados fueron satisfactorios.
Analizando las correlaciones que se muestran en los resultados, se observa que el
exponente correspondiente a la agitación es superior a los exponentes de la presión y la
aireación, corroborando que esta es el factor más significativo sobre el coeficiente de
transferencia de oxígeno. En el fermentador de 14L, los coeficientes de la aireación y la
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76
presión son más cercanos y por lo tanto su efecto sobre el coeficiente es similar. En
fermentador de 250L el efecto de cada uno de los factores es diferente, siendo el de
menor efecto la presión, y el de mayor efecto la agitación. Finalmente se puede concluir
que en las dos correlación el efecto relevante se debe a la agitación.
9.2 Fermentaciones a 14L
En las dos primeras fermentaciones (710802 y 720802) no se pudieron obtener datos de
biomasa y velocidad de crecimiento ya que las muestras no se procesaron a tiempo y
como se puede observar en el Anexo 6, se tienen datos incoherentes y por lo tanto
fueron eliminados. Sin embargo, a las condiciones de operación correspondientes a las
fermentaciones eliminadas se realizaron otras dos fermentaciones (760902 y 750902) de
duplicado. Los datos de glucosa y unidades formadoras de colonias de las dos primeras
fermentaciones si se tuvieron en cuenta en los resultados.
Se observó que en todas las fermentaciones se tuvo un tiempo de latencia de
aproximadamente tres horas. En la última fermentación (781002) se realizó una
variación ya que se utilizó un medio de cultivo en la presemilla y la semilla con una
concentración de glucosa menor. El resultado de esta variación fue que el tiempo de
latencia aumentó significativamente (aprox. 7 horas) lo cual impidió que se tomaran
datos en la fase de crecimiento y por lo tanto para esta fermentación no se pudo
determinar la velocidad de crecimiento ni la velocidad de consumo de glucosa.
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77
9.2.1 Biomasa
En estas fermentaciones se encontró que el crecimiento de las bacterias era de primer
orden, logrando encontrar los valores de la constante de velocidad de crecimiento
mediante una linealización logarítmica de los datos en la fase de crecimiento.
En la gráfica de los resultados ( Figura 10 ) se observa que la constante de velocidad de
crecimiento crece al aumentar la tasa de transferencia máxima (TTM). B. thuringiensis
es un microorganismo anaerobio facultativo, es decir que tiene la capacidad de crecer en
presencia o ausencia de oxígeno. Sin embargo, en presencia de oxígeno el metabolismo
es más eficiente y por esta razón, a mayor transferencia de oxígeno, la constante de
velocidad de crecimiento es mayor.
En cuanto a la biomasa ( Figura 9 ), se observa que en la fermentación 740802, la cual
se realizó a condiciones de transferencia bajas, se obtiene un valor de biomasa superior
a los valores obtenidos para el resto de las fermentaciones. Este resultado es inusual, ya
que se espera que cuando hay limitaciones de oxígeno los procesos de crecimiento sean
menos eficientes. Probablemente este valor elevado de biomasa se debe a que a estas
condiciones de operación, la velocidad de agitación es baja y por lo tanto no hay una
buena homogenización en el fermentador. Esto causa a su vez, que se presenten
estratificaciones y cúmulos de biomasa que pueden estar cerca del toma-muestras
(localizado en la parte inferior del fermentador). Por lo expuesto anteriormente, se
descarta este punto para el análisis. Descartando este puno, se puede observar que la
tasa de transferencia máxima no tiene un efecto significativo sobre la biomasa,
permaneciendo ésta aproximadamente constante.
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9.2.2 Unidades formadoras de colonias y proteínas
En la gráfica ( Figura 11 ), se muestra que a condiciones bajas de transferencia de
oxígeno no se presenta la formación de esporas y a medida que aumenta la tasa de
transferencia máxima, se observa la formación de esporas, las cuales presentan un
máximo alrededor de un valor de TTM de 1300mg/Lh. A partir de este valor, las
UFC/mL decrecen lentamente.
Por otra parte, se observa ( Figura 12 ) que a medida que aumenta la TTM, la cantidad
de proteína tóxica de 130kDa tiende a incrementarse mientras que la de 60kDa presenta
un ligero descenso.
Este resultado muestra que no existe una relación directa entre el número de unidades
formadoras de colonias y la cantidad de proteína tóxica de 130kDa producida. Por otra
parte, se observa que la proteína de 60kDa presenta un comportamiento similar al
observado en las esporas.
La cantidad de proteína total ( Figura 12 ) aumenta siguiendo la misma tendencia de
crecimiento que presentan las proteínas tóxicas, lo que muestra que el aumento de la
proteína total se debe efectivamente a la producción de las proteínas tóxicas.
9.2.3 Glucosa
El rendimiento global ( Figura 13 ) de las fermentaciones no se ve afectado por la TTM
y este permanece aproximadamente constante para todas las fermentaciones de la
misma forma que permanece constante la biomasa.
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79
A medida que aumenta la tasa de transferencia se obtiene más biomasa por unidad de
glucosa para el mismo tiempo en las distintas fermentaciones. Esto se observa ya que el
rendimiento específico crece al aumentar la TTM.
De la misma forma, la velocidad de consumo de glucosa ( Figura 14 ) se incrementa al
aumentar la TTM, ya que a condiciones altas de transferencia los procesos son más
eficientes y por lo tanto el crecimiento y el consumo de glucosa se llevan a cabo más
rápido. Esto se observa en la grafica de velocidad de consumo de glucosa y constante de
velocidad de crecimiento Vs. TTM ( Figura 14 y 10, respectivamente ) donde ambas
aumentan siguiendo la misma tendencia.
De lo anterior podemos concluir que el crecimiento y el consumo de glucosa se
encuentran estrechamente relacionados y por lo tanto la glucosa es un indicador del
crecimiento del cultivo.
9.3 Escalamiento
Como se mencionó anteriormente para realizar el escalamiento es necesario contar con
un parámetro de operación y un parámetro de rendimiento, que relacionados permitan
concluir cuales son las condiciones a las cuales se debe trabajar a gran escala. El
parámetro de rendimiento debe permanecer constante o presentar un máximo con
respecto al parámetro de operación, y es en este punto donde el parámetro de operación
debe ser el mismo en las dos escalas.
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80
En este caso, el parámetro de escalamiento (operación) es la tasa de transferencia
máxima. Para escoger el parámetro de rendimiento se obtuvieron dos alternativas: la
primera, las unidades formadoras de colonias; y la segunda, la cantidad de proteína
tóxica producida.
Es evidente que para la producción del biopesticida lo más importante es contar con una
buena cantidad de proteína tóxica, que es el ingrediente activo de la formulación y por
lo tanto éste es el parámetro de rendimiento que se escogió para realizar el
escalamiento. De acuerdo a esto, se observa que la mayor cantidad de proteína tóxica
de 130kDa se obtiene a altas TTM, produciendo 1606µg/mL de proteína tóxica a una
TTM de 2586 mg/Lh. Por otra parte, la proteína tóxica de 60kDa, a la misma TTM,
permanece aproximadamente constante en un valor de 270 µg/mL.
Figura 19. Escalamiento a partir de la producción de proteína tóxica
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81
Por lo expuesto anteriormente, se decidió que el valor de TTM que se debe mantener
constante al realizar el escalamiento debe estar alrededor de 2600mg/Lh
Una TTM cercana 2600mg/Lh se alcanza en el fermentador de 250L a las siguientes
condiciones:
! Presión manométrica: 15psi
! Flujo de aire: 150Lpm
! Agitación: 400 rpm
Estas son las condiciones en las cuales se realizaron las fermentaciones a 250L.
9.4 Fermentador de 250L
Un aspecto muy importante para mantener un régimen hidráulico similar en todas las
fermentaciones es que la geometría del fermentador sea la misma. Como describimos
anteriormente, el impeller superior cambio de posición debido a un mantenimiento
operativo en el equipo. Esto afectó aspectos como la homogenización del cultivo y la
transferencia de oxígeno a través del fermentador.
Se puede observar que en la fermentación A tuvo un valor de biomasa y un conteo de
esporas inferior a la fermentación B. Esto puede ser consecuencia de una transferencia
de oxígeno menor, ya que el impeller superior no estaba cumpliendo ninguna función
durante la fermentación A.
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82
El proceso de inoculación en las fermentaciones se realizó de manera diferente como se
describió en los resultados. Para que la bacteria se adapte adecuadamente desde la
solución de esporas hasta el volumen final de la fermentación, se recomienda inocular a
cada etapa el 10% del volumen de la etapa anterior. El cambio de etapa se debe realizar
cuando las bacterias se encuentran en una fase de crecimiento exponencial avanzada
para tener una buena concentración de biomasa y al mismo tiempo disminuir la fase de
latencia en la nueva etapa.
Analizando los procedimientos de inoculación realizados, y observando los resultados
de glucosa y biomasa en las semillas, se puede concluir que ninguno de los dos
procedimientos de inoculación se realizó de manera óptima.
En el procedimiento de inoculación de la fermentación A, se puede observar que aunque
el paso al fermentador de 250L se realizó cuando las bacterias se encontraban en fase
exponencial ( Anexo 7 ), era la parte inicial de la fase y por lo tanto no se tenía un valor
alto de biomasa. Además, la glucosa se consumió en una pequeña cantidad (30%)
(Anexo 11 ), lo que corrobora que el cambio de etapa se realizó muy rápido.
En el procedimiento de inoculación de la fermentación B, no se observa un crecimiento
exponencial en la semilla ( Anexo 7 ) y tampoco hay consumo de glucosa ( Anexo 11 )
en el momento en que se realiza el cambio al fermentador de 250L. Esto indica que el
cambio de volumen se realizó cuando las bacterias se encontraban en la fase de latencia.
Los efectos de los procedimientos de inoculación se ven reflejados en la fermentación
a 250L en el tiempo de duración de la fase de latencia. En la fermentación A, el tiempo
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83
de latencia fue de aproximadamente 7 horas, mientras que en la fermentación B el
tiempo de latencia fue aproximadamente de 15 horas ( Anexo 7 ). Estos tiempos son
extremadamente largos y hacen que el tiempo de fermentación, a su vez, también sea
mucho más largo. Como se mencionó anteriormente el inóculo de la fermentación A se
encontraba en fase de crecimiento exponencial por lo cual el tiempo de latencia en la
etapa de 250L fue menor a comparación de la fermentación B. Sin embrago, este tiempo
fue largo porque no se tenia una buena concentración de biomasa en el inoculo.
Por lo anterior, es necesario estandarizar el procedimiento de inoculación para mejorar
los tiempos de cultivo en el fermentador de 250L y tener un mejor aprovechamiento de
los recursos en cuanto a consumo de glucosa, energía, vapor, etc ( Anexo 13 ).
En el caso de las fermentaciones a 250L se encontró que el modelo de biomasa era de
orden cero y por lo tanto la fase de crecimiento no era exponencial sino lineal.
En la fermentación B el valor de biomasa ( Figura 16 ) obtenido fue del doble que en la
fermentación A. De la misma forma, la fermentación B tuvo un conteo de esporas
(Figura 17 ) mayor que la fermentación A. Estas diferencias pueden estar asociadas a la
ausencia del impeller superior, en la fermentación A, que provoca que la transferencia
de oxígeno en el fermentador no sea homogénea ni eficiente ya que a media que las
burbujas suben por la columna de cultivo van aumentando su tamaño y al no estar
presente el impeller, las burbujas no chocan con este para disminuir de nuevo su tamaño
y aumentar el área de contacto para la transferencia.
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84
Otra diferencia entre estas dos fermentaciones se observa en el valor de la constante de
velocidad de crecimiento ( Figura 15 ) ya que en la fermentación A, se obtuvo un valor
mayor que en la fermentación B. Esto se debe a que el procedimiento de inoculación no
se realizó en la fase exponencial en esta última.
En cuanto a los resultados de proteína obtenidos ( Tabla 14 ), se puede observar que en
la primera fermentación no se realizaron los análisis de proteína específica aunque si se
observa presencia de proteína total. En la segunda fermentación ( Tabla 15 ) se puede
ver que en el transcurso de la fermentación aumenta el pH y disminuye la concentración
de proteínas tóxicas. Estos dos hechos están directamente relacionados, ya que a medida
que aumenta el valor del pH las proteínas tóxicas comienzan a solubilizarse en el medio
y una vez solubilizadas las proteínas, no es posible volver a formar el cristal, aun
cuando el valor del pH disminuya, ya que el proceso es irreversible.
Por otra parte cuando las proteínas están disueltas, se facilita la acción de las proteasas
sobre ellas, fraccionándolas y de esta forma cambiando el peso molecular. Esto afecta el
análisis, ya que cuando se realiza la identificación en el gel, no se observa la presencia
de las bandas características de las toxinas de interés.
Finalmente, si las proteínas se encuentran solubles en el medio, al realizar el
pretratamiento para el análisis de las proteínas, las proteínas tóxicas se eliminarían junto
con el sobrenadante, lo cual explica la ausencia de las bandas de interés en el gel de
electroforesis.
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10 CONCLUSIONES
• El parámetro de rendimiento que se seleccionó para realizar el escalamiento fue la
proteína tóxica de 130kDa, sobre la cual se observó una mayor influencia de la
transferencia de oxigeno, obteniéndose valores de 1606µg/mL a una TTM de
2586 mg/Lh, en el fermentador de 14L.
• De acuerdo a los resultados obtenidos en las fermentaciones realizadas a un
volumen de 14L, se determinó que las condiciones a las cuales se debe operar el
fermentador de 250L son: 400rpm,150Lpm y 5psi, que corresponden a una TTM
de 2573 mg/Lh.
• El escalamiento fue satisfactorio con respecto al número de unidades formadoras
de colonia, ya que los valores obtenidos en las dos escalas fueron similares. En
cuanto a la biomasa se obtuvo un valor mayor al esperado según el escalamiento.
Esto último se ha observado en otros trabajos de escalamiento basados en
transferencia de oxigeno, en los cuales al aumentar el volumen mejora la
transferencia debido a el aumento de la cabeza hidrostática.
• Se observó que la producción de proteína de 130kDa no estaba acoplada a la
producción de esporas, ya que al aumentar la transferencia de oxigeno crecía la
concentración de la proteína de 130kDa, mientras que las unidades formadoras de
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colonias presentaban un máximo y permanecían constantes, al igual que las
proteína de 60kDa.
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11 RECOMENDACIONES
• Para guardar las proporciones entre los dos fermentadores con respecto al
volumen de trabajo y la capacidad del fermentador, se sugiere aumentar el
volumen de trabajo en el fermentador de 250L a un volumen de aproximadamente
de 200L.
• Se debe establecer un protocolo de inoculación eficiente en el fermentador de
250L, para minimizar los costos energéticos y optimizar el proceso de
fermentación a gran escala. Una sugerencia para dicho protocolo se presenta en el
Anexo 13.
• Los tiempos de la semilla y de la presemilla deben ser suficientes para que el
cambio de etapa se realice cuando las bacterias se encuentren en la fase de
crecimiento exponencial avanzada, y así optimizar el consumo de glucosa y los
tiempos de fase de latencia de cada etapa.
• En el fermentador de 250L se debe buscar una alternativa que facilite el control
del pH durante las fermentaciones, para evitar posibles riesgos de contaminación
o valores de pH altos (aprox. 8.0) que permitan la solubilización de las proteínas
tóxicas.
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• Las condiciones de trabajo que se proponen para el fermentador de 250L, son las
máximas permitidas en este fermentador. Por lo tanto, si se desea mejorar la
transferencia de oxigeno, se recomienda modificar la geometría del fermentador.
En caso de realizar cambios en la geometría de este o en el volumen de trabajo, se
debe caracterizar el kLa en el equipo nuevamente.
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ANEXOSANEXO 1. PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DEL
COEFICIENTE VOLUMÉTRICO DE TRANSFERENCIA DE MASA, kLa, ENLOS FERMENTADORES DE 14L Y 250 L
INICIO
Llenar el fermentador con agua hasta unvolúmen igual al volumen de trabajo
Suspender el burbujeo de nitrogeno
Calibrar el sensor de oxígeno disuelto encero
Burbujear nitrogeno a través delfermentador por aproximadamente 15
minutos, con agitación fuerte
Burbujear aire durante aproximadamente15 minutos manteniendo la agitación
Calibrar el sensor de oxígeno disuelto en100% de DO
Burbujera nuevamente nitrogeno hasta quele sensor marque un valor cercano a cero
FIN
Burbujear oxigeno a las condiciones deairecaión, agitación y presión para las
cuales se desea encontrar el valor de kLa
Inmediatamete se comienza a burbujearaire, tomar los valores de DO en intervalosde tiempo definidos hasta alcanzar un valor
de DO de 100%
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ANEXO 2. DATOS PARA CARACTERIZAR LA TRANSFERENCIA DEOXÍGENO EN EL FERMENTADOR DE 14L
Presión(psi)
Agitacion(rpm)
Aireación(Lpm)
kLa (s-1)
kLa(h-1)
Agitación(rph)
Vs(m/h)
6 350 15 0,0138 50 21000 23,686 350 15 0,0141 51 21000 23,686 400 8 0,0179 64 24000 12,636 400 16 0,0261 94 24000 25,256 500 8 0,0195 70 30000 12,636 500 8 0,0193 69 30000 12,636 500 11 0,0222 80 30000 17,366 500 11 0,0224 81 30000 17,366 500 16 0,0260 94 30000 25,256 500 16 0,0266 96 30000 25,256 600 8 0,0313 113 36000 12,636 600 8 0,0385 139 36000 12,636 600 11 0,043 155 36000 17,366 600 11 0,0429 154 36000 17,366 600 11 0,0366 132 36000 17,366 600 16 0,0519 187 36000 25,256 600 16 0,0383 138 36000 25,256 700 8 0,0298 107 42000 12,636 700 8 0,0309 111 42000 12,636 700 11 0,033 119 42000 17,366 700 11 0,0349 126 42000 17,366 700 16 0,0357 129 42000 25,256 700 16 0,0343 123 42000 25,256 800 8 0,0305 110 48000 12,636 800 8 0,0294 106 48000 12,636 800 11 0,0318 114 48000 17,366 800 11 0,0323 116 48000 17,366 800 16 0,033 119 48000 25,256 800 16 0,0323 116 48000 25,2510 400 8 0,0143 52 24000 12,6310 400 8 0,0147 53 24000 12,6310 400 11 0,0168 60 24000 17,3610 400 11 0,0171 61 24000 17,3610 400 16 0,0188 68 24000 25,2510 400 16 0,0232 84 24000 25,2510 500 8 0,0220 79 30000 12,6310 500 8 0,0218 78 30000 12,6310 500 11 0,0227 82 30000 17,3610 500 11 0,0224 81 30000 17,3610 500 16 0,0261 94 30000 25,2510 500 16 0,0260 94 30000 25,2510 600 8 0,0342 123 36000 12,63
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
95
10 600 8 0,0387 139 36000 12,6310 600 11 0,0382 138 36000 17,3610 600 11 0,0386 139 36000 17,3610 600 16 0,0505 182 36000 25,2510 600 16 0,0476 171 36000 25,2510 700 8 0,0358 129 42000 12,6310 700 8 0,0338 122 42000 12,6310 700 11 0,0406 146 42000 17,3610 700 11 0,0349 126 42000 17,3610 700 16 0,0412 148 42000 25,2510 700 16 0,0351 126 42000 25,2510 800 8 0,0363 131 48000 12,6310 800 8 0,0408 147 48000 12,6310 800 11 0,0453 163 48000 17,3610 800 11 0,0390 141 48000 17,3610 800 16 0,0481 173 48000 25,2510 800 16 0,0483 174 48000 25,2515 400 8 0,0122 44 24000 12,6315 400 8 0,0133 48 24000 12,6315 400 11 0,0171 62 24000 17,3615 400 16 0,0204 73 24000 25,2515 400 16 0,0175 63 24000 25,2515 500 8 0,0211 76 30000 12,6315 500 8 0,0196 71 30000 12,6315 500 11 0,0225 81 30000 17,3615 500 11 0,0225 81 30000 17,3615 500 16 0,0269 97 30000 25,2515 500 16 0,0264 95 30000 25,2515 600 8 0,0351 126 36000 12,6315 600 8 0,0319 115 36000 12,6315 600 11 0,0471 169 36000 17,3615 600 11 0,0411 148 36000 17,3615 600 16 0,0475 171 36000 25,2515 600 16 0,0491 177 36000 25,2515 700 8 0,0367 132 42000 12,6315 700 8 0,0340 123 42000 12,6315 700 11 0,0424 153 42000 17,3615 700 11 0,0418 151 42000 17,3615 700 16 0,0486 175 42000 25,2515 700 16 0,0538 194 42000 25,2515 800 8 0,0380 137 48000 12,6315 800 8 0,0400 144 48000 12,6315 800 11 0,0477 172 48000 17,3615 800 11 0,0511 184 48000 17,3615 800 16 0,0538 194 48000 25,2515 800 16 0,0569 205 48000 25,25
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
96
ANEXO 3. DATOS PARA CARACTERIZAR LA TRANSFERENCIA DEOXÍGENO EN EL FERMENTADOR DE 250L
Presión(psi)
Agitación(rpm)
Aireación(Lpm)
kLa(s-1)
kLa(h-1)
Agitación(rph)
Vs(m/h)
10 300 110 0,0259 93 18000 29,9210 300 110 0,0307 111 18000 29,9210 300 150 0,0274 99 18000 40,7910 300 150 0,0309 111 18000 40,7910 400 110 0,0331 119 24000 29,9210 400 110 0,0353 127 24000 29,9210 400 150 0,0461 166 24000 40,7910 400 150 0,0402 145 24000 40,7915 300 110 0,0292 105 18000 29,9215 300 110 0,0300 108 18000 29,9215 300 150 0,0288 104 18000 40,7915 300 150 0,0319 115 18000 40,7915 400 150 0,0561 202 24000 40,7915 400 150 0,0533 192 24000 40,7915 400 110 0,0410 148 24000 29,9215 400 110 0,0402 145 24000 29,92
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
97
ANEXO 4. FORMATOS DE CONTROL DE LAS FERMENTACIONES EN LOS FERMENTADORES DE 14 Y 250L.
No Fermentación 710802Condiciones de operación
T 30°CP 15psi
Agitación 800rpmAireación 16LpmVolumen 11L
Hora T(°C) Agitación Presión Aireación D.O pH Observaciones
0 30,3 800 15 16 94 6,83 Se agregaron 150 ml de KOH y antiespumante1 31,3 800 15 16 100 7,362 31,3 800 15 16 100 7,063 31,7 800 15 16 89 6,584 30 800 15 16 81 6,29 Se agrego 150 ml de KOH5 30,2 800 15 16 80 6,56 32 800 15 16 60 6,11 Se agregaron 100 ml de KOH y antiespumante7 29,3 800 15 16 76 6,458 29 800 15 16 62 6,32
18 29,2 800 15 16 81 6,4 Se observan esporos color verde . Se retiro el aire20 29,8 800 8 0 0 6,724 31,2 800 6 0 0 6,628 29,7 800 6 5 86 7
PROM 30,4
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
98
No Fermentación 720802 Condiciones de operación T 30°C P 10psi Agitación 600rpm Aireación 15Lpm Volumen 11L
Hora T(°C) Agitación Presión Aireación D.O pH Observaciones
0 29,4 600 10 15 6,97 Se agregaron 60 ml de KOH y antiespumante1 27,4 600 11 15 8,35 2 31,6 600 9 15 8,2 3 30,9 600 10 15 7,6 4 30,8 600 11 15 7,1 5 30,8 600 10 15 6,6 6 30,5 600 10 15 6,54 Se agregaron 100 ml de KOH7 30,2 600 10 15 6,16 8 30,6 600 10 15 6
21 30,9 600 10 15 6,9 23 30,7 600 10 15 7,2 26 30 600 11 15 7,56 29 29,2 600 11 15 7,75 Se observan esporos verdes dentro de la bacteria
31 29,2 600 10 15 7,77Se observan esporos verdes dentro de la bacteria yalgunos (1%) afuera
42 29,5 600 5 15 7,3 35% de esporulación44,5 30 600 12 15 7,26 50% de esporulación.
PROM 30,1
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
99
No Fermentación 730802 Condiciones de operación T 30°C P 6psi Agitación 500rpm Aireación 15Lpm Volumen 11L
Hora T(°C) Agitación Presión Aireación D.O pH Observaciones
0 30,1 500 6 15 100 8,3 Se agregaron 200 ml de KOH y 50 antiespumante2 29,9 500 7 15 82 7,7 3 29,9 500 5 15 56 7,26 4 29,3 500 5 15 34 6,73 5 29,3 500 6 15 34 6,31 6 29,5 500 6 15 32 5,88 Se agrego 100 ml de KOH7 30 500 6 15 30 6,17 Se agregaron 150 ml de KOH y antiespumante
19,5 29,9 500 6 15 38 Se agrego antiespumante20 30 500 6 15 32 6,71 22 30 500 6 15 48 6,88 24 31 500 6 15 48 7,18 Se agrego antiespumante32 30,7 500 6 15 14 7,6 Se observa menos de 5 L de cultivo en el fermentador y por lo tanto se detiene la fermentación Se observan esporos dentro de la bacteria
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
100
No Fermentación 740802 Condiciones de operación T 30°C P 4psi Agitación 400rpm Aireación 15Lpm Volumen 11L
Hora T(°C) Agitación Presión Aireación D.O pH Observaciones
0 30,9 400 4 15 90 7,02 Se adicionó antiespumante2 32,8 400 4 15 46 6,62 3 30,7 400 4,5 15 29 6,38 4 30,1 400 4 15 30 6,01 Se agrego 150 ml de KOH5 30,1 400 4 15 24 3,36 6 30 400 4,5 15 38 6,06 Se agrego 100 ml de KOH7 30 400 4 15 26 6,23
20 30,1 400 5 15 32 6,78 Se adicionó antiespumante22 30,2 400 5 15 28 7,06 Se adicionó antiespumante24 31 400 7 15 26 7,3 Se adicionó antiespumante25 32,1 400 10 a 4 15 a 5 12 Se adicionó antiespumante31 30 400 4 5 14 6,61 No se observan esporos46 28,6 400 4 5 10 6,85 No se observan esporos
PROM 30,5
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
101
No Fermentación 750802 Condiciones de operación T 30°C P 10psi Agitación 600rpm Aireación 15Lpm Volumen 11L
Hora T(°C) Agitación Presión Aireación D.O pH Observaciones
0 30,8 600 10 15 90 6,97 Se adicionó antiespumante2 28,6 600 9 15 94 6,79 3 28,5 600 9 15 91 6,7 4 29,2 600 10 15 88 6,54 5 30,2 600 10 15 74 6,43 Se adicionó 100ml de KOH y antiespumante6 30,7 600 10 15 62 6,64 Se agrego antiespumante7 30,3 600 10 15 76 6,37 Se agregaron 150 ml de KOH y antiespumante
20 30 600 10 15 88 7,2 Se agrego antiespumante22 30 600 10 15 84 7,3 Se adicionó antiespumante, se observan esporos dentro de la bacteria23 30 600 10 15 Se agrego antiespumante24 30 600 10 15 86 Se ven esporos dentro del bacilo25 30,6 600 10 15 Se adicionó antiespumante.31 30,3 600 9 15 55 7,37 Se ven esporos dentro del bacilo y algunos afuera. 20%44 29,4 600 10 15 42 7,73 Esporulación mayor al 90%
Prom 29,9
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
102
No Fermentación 760802 Condiciones de operación T 30°C P 15psi Agitación 800rpm Aireación 15Lpm Volumen 11L
Hora T(°C) Agitación Presión Aireación D.O pH Observaciones
0 31 800 15 16 100 6,78 Se adicionó antiespumante2 32,6 800 15 16 100 6,9 3 32,2 800 15 16 100 6,56 4 27 800 15 16 82 6,33 5 30 800 15 16 86 6,2 Se adicionó 100ml de KOH y antiespumante6 29,7 800 15 16 74 6,6 Se agrego antiespumante7 30,4 800 15 16 70 6,6 Se agregaron 150 ml de KOH y antiespumante
20 29,5 800 16 16 85 7,23 Se agrego antiespumante22 30,9 800 16 16 86 7,44 Se adicionó antiespumante, se observan esporos dentro de la bacteria23 30,5 800 16 16 38 7,28 Se agrego antiespumante24 33,5 800 16 16 2 7,3 Se ven esporos dentro del bacilo25 30,2 800 15 16 28 7,38 Se adicionó antiespumante.31 28,7 800 15 16 64 7,45 Se ven esporos dentro del bacilo y algunos afuera. 20%44 25,1 800 15 16 66 7,78 Esporulación mayor al 90%
Prom 30,0928571
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
103
No Fermentación 791102 Condiciones de operación T 30°C P 15psi Aireación 150Lpm Agitación 400rpm Volumen 110L
Hora T(°C) Agitación Presión Aireación D.O pH Observaciones
0 30,2 400 15 150 100 6,86 Problemas con la espuma se eliminaron 6L de cultivo y se adicionó antiespumante1 30,3 400 15 150 100 6,72 3 30,5 400 15 155 100 6,64 5 30,4 400 15 150 97,6 6,47 6 400 15 150 6 Se adicionó de KOH7 30,6 400 15 150 84,5 3,8 Se agrego antiespumante8 30,5 400 15 140 81 6,6 Buen crecimiento de las bacterias9 30,5 400 16 155 87,5 6,38
10 30,7 400 16 140 79,5 6,45 Se adicionó antiespumante11 30,5 400 16 140 89,4 6,25 Se agrego KOH y antiespumante12 30,6 400 16 150 89,6 6,4 Se agrego KOH y antiespumante14 30,2 400 15 140 94,5 6,8 15 30,3 400 15 145 100 6,77 Se agregó antiespumante
18,5 30,5 400 15 140 100 5,8 Se agrego KOH y antiespumante.
23 30,5 400 15,0 150 100 6,84 Se agrego antiespumante y se bajaron las condiciones a 300rpm,110Lpm y 10psi.38 29,9 280 8 170 100 7,6 Se observan esporos dentro de la bacteria.40 30,2 280 10 105 100 42 30,1 280 10 110 100 7,8 46 30,3 280 10 100 100 48 30,2 280 10 110 100 7,8 63 30,3 280 10 95 100 7,95 Esporulación mayor al 70%
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
104
No Fermentación 801102 Condiciones de operación T 30°C P 15psi Agitación 400rpm Aireación 150Lpm Volumen 110L
Hora T(°C) Agitación Presión Aireación D.O pH Observaciones
0 30,4 400 15 150 100 6,8 Se adicionó antiespumante2 30,5 400 15 140 100 6,65 4 30,4 400 15 140 100 6,62 5 30,5 400 15 140 100 6,6 Se adicionó antiespumante7 30,5 400 15 145 99 6,55 8 30,5 400 15 145 96,8 6,5 Se adicionó antiespumante9 30,6 400 15 135 94,2 6,45 Se agregó KOH
20 30,8 400 15 160 76,9 6,74 Se agregó KOH22 31,1 400 16 140 75,5 6,51 26 30,9 400 14,3 150 83,9 6,83 Se ven esporos dentro del bacilo44 30,7 400 17 105 100 8,06 48 30,6 400 15 155 100 8,32 Se ven esporos dentro del bacilo, 70% de esporulación.52 30,5 400 17 110 100 8,46
66,5 30,4 400 17 100 100 8,57 Esporulación mayor al 80%Prom 30,6
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
105
ANEXO 5. PRETRATAMIENTO PARA REALIZAR LA DETERMINACIÓNDE LA BIOMASA POR EL MÉTODO DEL PESO SECO
INICIO
Colocar 10mL de la muestra en un tubo deensayo
Agregar 30mL de agua destilada
Eliminar el sobrenadante
Centrifugar durante 40 minutos a 4500rpmy 4°C
Reconstituir y homogenizar
Centrifugar durante 40 minutos a 4500rpmy 4°C
Agregar 40mL de agua destilada
FIN
Reconstituir y homogenizar
Servir en crisoles previamente tarados ycontinuar con el procedimiento de
determinación de biomasa por peso seco
Repetir4 veces
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
106
ANEXO 6. RESULTADOS DE BIOMASA PARA LAS FERMENTACIONES A14L
Fermentación No. 710802
Biomasa: 4.62 g/L
HORA Peso crisol Crisol + muestra Biomasa (g/L) Ln(X)0 48,8281 48,8289 0,08 1 46,1570 46,1735 1,65 2 55,5332 55,5380 0,48 3 48,3310 48,3313 0,03 -3,5064 54,1392 54,1416 0,24 -1,4275 49,0819 49,0879 0,6 -0,5116 51,5820 51,6288 4,68 7 41,5687 41,5881 1,94 0,6638 40,1168 40,2109 9,41 18 40,1152 40,1414 2,62 20 52,2403 52,2626 2,23 24 41,5670 41,6132 4,62 28 54,4856 54,5279 4,23 67 53,2408 53,2866 4,58
Biomasa F#: 710802
0
2
4
6
8
10
0 20 40 60 80Tiempo (h)
Bio
mas
a (g
/L
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
107
Fermentación No. 720802
Biomasa: 7.98 g/L
HORA Peso crisol Crisol + muestra Biomasa (g/L) Ln(X)1 57,0504 57,0519 0,15 2 54,4863 54,5066 2,03 3 53,2410 53,2629 2,19 4 57,0504 57,0519 0,15 -1,8975 57,0502 57,0652 1,5 0,4056 49,0810 49,1160 3,5 1,2537 51,5894 51,6214 3,2 1,1638 48,3301 48,3344 0,43 19 46,1566 46,2052 4,86 23 48,8275 48,9033 7,58 26 48,1318 48,2116 7,98 31 47,1833 47,2393 5,6 29 49,2261 49,2887 6,26
44,5 47,0453 47,1059 6,06
Biomasa F#: 720802
012345678
0 10 20 30 40 50Tiempo (h)
Bio
mas
a (g
/L)
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
108
Fermentación No. 730802
Biomasa: 4.01 g/L
Velocidad de crecimiento: 0.487h-1 R2: 0.9061
HORA Peso crisol Crisol + muestra Biomasa (g/L) Ln(X)0 0 2 48,1320 48,1495 1,75 3 47,0490 47,0513 0,23 -1,4694 52,2408 52,2481 0,73 -0,3155 49,2279 49,2362 0,83 -0,1866 54,1398 54,1538 1,4 0,3367 47,1851 47,2041 1,9 0,64220 40,1155 40,1556 4,01 22 52,2404 52,2721 3,17
Biomasa F#: 730802
0
1
2
3
4
5
0 5 10 15 20 25Tiempo (h)
Bio
mas
a (g
/L)
Ln(X) Vs. Tiempo y = 0,4874x - 2,6356R2 = 0,9061
-3
-2
-1
0
1
0 2 4 6
Tiempo (horas)
Ln(X
)
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
110
Fermentación No. 740902
Biomasa: 11.6 g/LVelocidad de crecimiento: 0.290h-1 R2: 0.9397
HORA Peso crisol Crisol + muestra Biomasa (g/L) Ln(X)0 54,1397 54,1418 0,21 2 41,5680 41,5828 1,48 3 51,5830 51,5946 1,16 0,1484 55,5336 55,5481 1,45 0,3715 54,4859 54,5096 2,37 0,8636 53,2411 53,2670 2,59 0,9527 57,0512 57,0651 1,39 20 48,3304 48,4063 7,59 22 48,8278 48,9138 8,6 24 49,0817 49,1933 11,16 31 46,1569 46,2729 11,6 46 48,1333 48,2357 10,24
Biomasa F#: 740902
0
2
4
6
8
10
12
14
0 10 20 30 40 50Tiempo (h)
Bio
mas
a (g
/L)
Ln(X) Vs. Tiempo y = 0,2901x - 0,7218R2 = 0,9397
-1
-0,5
0
0,5
1
1,5
0 2 4 6
Tiempo (horas)
Ln(X
)
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
111
Fermentación No. 750902
Biomasa: 6.47 g/LVelocidad de crecimiento: 0.914h-1 R2: 0.9596
HORA Peso crisol Crisol + muestra Biomasa (g/L) Ln(X)0 51,5815 51,5901 0,86 2 40,1145 40,1267 1,22 3 54,1401 54,1446 0,45 4 52,2408 52,2428 0,2 -1,6095 41,5679 41,5761 0,82 -0,1986 55,5335 55,5514 1,79 0,5827 54,4875 54,5200 3,25 1,17920 53,2420 53,3067 6,47 22 57,0509 57,1119 6,1 24 48,3293 48,3831 5,38 31 49,0806 49,1171 3,65 46 46,1573 46,2126 5,53
Biomasa F#: 750902
01234567
0 10 20 30 40 50Tiempo (h)
Bio
mas
a (g
/L)
Ln(X) Vs. Tiempo y = 0,9145x - 5,0415R2 = 0,9596
-6
-4
-2
0
2
0 2 4 6
Tiempo (horas)
Ln(X
)
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
112
Fermentación No. 760902
Biomasa: 6.90 g/LVelocidad de crecimiento: 1.221 h-1 R2:0.9752
HORA Peso crisol Crisol + muestra Biomasa (g/L) Ln(X)0 40,1156 40,1201 0,45 2 51,5827 51,5930 1,03 3 41,5684 41,5715 0,31 4 52,2415 52,2429 0,14 -1,9665 48,1324 48,1399 0,75 -0,2886 54,4861 54,5107 2,46 0,9007 54,1400 54,1952 5,52 1,70820 47,1859 47,2925 10,66 24 57,0514 57,1204 6,9 28 55,5342 55,5997 6,55 31 53,2416 53,3135 7,19 45 49,0818 49,1639 8,21
Biomasa F#: 760902
0
2
4
6
8
10
12
0 10 20 30 40 50Tiempo (h)
Bio
mas
a (g
/L)
Ln(X) Vs. Tiempo y = 1,2211x - 6,6275R2 = 0,9752
-8
-6
-4
-2
0
2
4
0 2 4 6
Tiempo (horas)
Ln(X
)
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
113
Fermentación No. 781002
Biomasa: 9.42 g/L
HORA Peso crisol Crisol + muestra Biomasa (g/L) Ln(X)0 51,5830 51,5904 0,74 -0,3012 40,1192 40,1210 0,18 -1,7153 54,1412 54,1441 0,29 -1,2384 52,2418 52,2441 0,23 -1,4705 41,5705 41,5747 0,42 -0,8686 55,5345 55,5379 0,34 -1,0797 54,4866 54,4920 0,54 -0,61620 53,2424 53,3155 7,31 22 57,0526 57,1447 9,21 24 48,3321 48,4263 9,42 27 49,0827 49,1574 7,47 30 48,8285 48,8955 6,7 44 46,1581 46,2141 5,6
Biomasa F#: 781002
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40 50Tiempo (h)
Bio
mas
a (g
/L)
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
114
ANEXO 7. RESULTADOS DE BIOMASA PARA LAS FERMENTACIONES A250L
Fermentación No. 791102
Biomasa: 5.57 g/LVelocidad de crecimiento: 1.177 h-1 R2: 0.9665
HORA Peso crisol Crisol + muestra Biomasa (g/L)1 51,582 51,6259 4,393 47,0462 47,0594 1,325 46,1581 46,2116 5,356 40,1164 40,1278 1,147 47,1844 47,2074 2,38 48,83 48,8509 2,099 55,5335 55,5521 1,8610 54,4862 54,5175 3,1311 41,5701 41,6174 4,7312 57,0585 57,111 5,2514 52,2423 52,2906 4,8315 53,2438 53,2943 5,05
18,5 48,3312 48,3869 5,5723 47,1838 47,2307 4,6938 47,0458 47,114 6,8240 49,2254 49,2632 3,7843 48,1315 48,169 3,7546 46,1606 46,1925 3,1948 48,8282 48,8594 3,1263 49,0812 49,1096 2,84
Biomasa F#: 791102 - F1
012345678
0 10 20 30 40 50 60
Tiempo (h)
Bio
mas
a (g
/L)
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
115
Cálculo de la velocidad de crecimiento:
Biomasa Vs. tiempo y = 1,177x - 8,616R2 = 0,9665
0123456
8 9 10 11 12 13
Tiempo (horas)
Bio
mas
a (g
/L)
Semilla en el fermentador de 14L
HORA Peso crisol Crisol + muestra Biomasa (g/L)1 48,1321 48,1371 0,53 49,0832 49,0866 0,344 49,2258 49,2345 0,875 54,1398 54,1512 1,14
Biomasa Semilla F#791102 - F4
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 1 2 3 4 5 6
Tiempo (h)
Bio
mas
a (g
/L)
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
116
Fermentación No. 801102
Biomasa: 10.05 g/LVelocidad de crecimiento: 0.785h-1 R2: 0.994
HORA Peso crisol Crisol + muestra Biomasa (g/L)0 47,0459 47,0602 1,432 48,132 48,1839 5,194 51,5815 51,6063 2,485 40,1152 40,1582 4,37 54,1389 54,1908 5,198 52,2404 52,2875 4,719 41,5683 41,5957 2,7420 55,533 55,5857 5,2722 54,4853 54,5571 7,1826 53,2407 53,3412 10,0544 48,3299 48,4288 9,8948 57,0497 57,1404 9,0752 49,0848 49,1652 8,04
66,5 46,1632 46,2426 7,94
Biomasa F#: 801102 - F1
02468
10
12
0 10 20 30 40 50 60 70Tiempo (h)
Bio
mas
a (g
/L
Cálculo de la constante de velocidad de crecimiento
Biomasa Vs. tiempo y = 0,7854x - 10,301R2 = 0,9944
02468
1012
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (horas)
Bio
mas
a
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
117
Semilla
Hora Peso crisol Crisol + muestra Biomasa (g/L)2 47,1841 47,1903 0,62
4,5 49,2256 49,2297 0,41
Biomasa F#801102 - F4
0
0,5
1
1,5
2
0 1 2 3 4 5
Tiempo (h)
Bio
mas
a (g
/L)
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
118
ANEXO 8. PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR EL NÚMERO DEUNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS POR MILILITRO.
INICIO
Determinar las muestras a sembrar y lasdiluciones pertinentes de acuerdo a laconcentración de esporas estimada.
Colocar las diluciones a sembrar por 10minutos en el baño de maría
Preparar un baño de maria a 80°C
Realizar las diluciones en tubos de ensayo(9mL de PBS y 1mL de la dilución anterior
para cada muestra)
Agitar y sembrar 100µL de cada dilución encajas de petri con agar LB. Hacer cada
siembra por triplicado.
Incubar las cajas de petri a 30°C por 24horas
Realizar el conteo de esporas a las 17 y alas 24 horas
FIN
Calcular el número de unidadesformadoras de colonias de acuerdo a:
UFC/mL = conteo/(dilución * 0.1)
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
119
ANEXO 9. RESULTADOS DEL CONTEO DE ESPORAS PARA LASFERMENTACIONES A 14 Y 250L
Fermentación No. 710802
UFC/mL: 6.4x107
Hora DilucionResultados 17
horasResultados 24
horas Promedio Resultado1,00E-05 - - - 80 45 46 5,7,E+071,00E-06 - - - 5 6 10 7,0,E+07671,00E-07 - - - 0 0 0 0,0,E+00
6,4,E+07
1,00E-04 - - - 0 0 2 6,7,E+041,00E-05 - - - 0 0 1 3,3,E+05281,00E-06 - - - 0 0 0 0,0,E+00
2,0,E+05
1,00E-04 - - - 4 4 0 2,7,E+051,00E-05 - - - 0 0 0 0,0,E+00201,00E-06 - - - 0 0 0 0,0,E+00
2,7,E+05
1,00E-03 - - - 0 0 0 0,0,E+001,00E-04 - - - 0 0 0 0,0,E+0081,00E-05 - - - 0 0 0 0,0,E+00
0,0,E+00
Fermentación No. 720802
UFC/mL: 1.5x109
Hora DilucionResultados 17
horasResultados 24
horas Promedio Resultado1,00E-06 30 31 37 33 43 33 3,6,E+081,00E-07 7 9 12 9 9 12 1,0,E+09441,00E-08 2 1 0 2 1 3 2,0,E+09
1,5,E+09
1,00E-06 71 88 63 71 80 98 8,3,E+081,00E-07 3 5 5 3 5 6 4,7,E+08421,00E-08 2 0 5 3 1 5 3,0,E+09
1,4,E+09
1,00E-05 I I I I I I I1,00E-06 51 39 61 66 45 65 5,9,E+08311,00E-07 4 5 6 6 7 7 6,7,E+08
6,3,E+08
1,00E-04 I I I I I I I1,00E-05 80 87 98 81 88 101 9,0,E+07261,00E-06 8 13 11 11 14 10 1,2,E+08
1,0,E+08
1,00E-04 0 0 0 0 0 0 0,0,E+001,00E-05 1 0 1 1 0 1 6,7,E+05191,00E-06 0 0 0 0 0 0 0,0,E+00
0,0,E+00
I: Incontables
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
120
Fermentación No. 730802
UFC/mL: 1.9x108
Hora DilucionResultados 17
horasResultados 24
horas Promedio Resultado1,00E-03 4 6 6 4 6 6 5,3,E+041,00E-04 0 0 0 0 0 0 0,0,E+00201,00E-05 0 0 0 0 0 0 0,0,E+00
0,0,E+00
1,00E-03 12 14 9 12 14 9 1,2,E+051,00E-04 2 2 1 2 2 1 1,7,E+05221,00E-05 1 0 0 1 0 0 3,3,E+05
2,1,E+05
1,00E-04 1 3 1 1 3 1 I1,00E-05 1 0 0 1 0 0 3,3,E+05241,00E-06 1 0 0 1 0 0 3,3,E+06
1,8,E+06
1,00E-05 I I I I I I I1,00E-06 29 28 25 29 28 25 2,7,E+0831,51,00E-07 1 1 1 1 1 1 1,0,E+08
1,9,E+08
Fermentación No. 740902
UFC/mL: 0.00
Hora DilucionResultados 17
horasResultados 24
horas Promedio Resultado1,00E-05 0 0 0 0 0 0 0,0,E+001,00E-06 0 0 0 0 0 0 0,0,E+00461,00E-07 0 0 0 0 0 0 0,0,E+00
0,0,E+00
1,00E-05 0 0 0 0 0 0 0,0,E+001,00E-06 0 0 0 0 0 0 0,0,E+00311,00E-07 0 0 0 0 0 0 0,0,E+00
0,0,E+00
1,00E-04 0 0 1 0 0 1 I1,00E-05 0 0 1 0 0 2 6,7,E+05241,00E-06 0 0 0 0 0 0 0,0,E+00
3,3,E+05
1,00E-03 79 143 104 79 143 104 I1,00E-04 0 0 0 0 0 0 0,0,E+00221,00E-05 0 0 0 0 0 0 0,0,E+00
0,0,E+00
1,00E-03 0 1 1 0 1 1 6,7,E+031,00E-04 0 0 0 0 0 0 0,0,E+00201,00E-05 2 1 1 2 1 1 1,3,E+06
6,7,E+05
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
121
Fermentación No. 750902
UFC/mL: 1.3x108
Hora DilucionResultados 17
horasResultados 24
horas Promedio Resultado1,00E-06 17 9 20 19 11 20 1,7,E+081,00E-07 2 0 1 2 0 1 1,0,E+08441,00E-08 0 2 0 0 2 0 6,7,E+08
1,3,E+08
1,00E-05 I I I I I I I1,00E-06 16 20 18 20 22 22 2,1,E+08311,00E-07 0 0 1 0 0 1 3,3,E+07
1,2,E+08
1,00E-04 I I I I I I I1,00E-05 39 39 50 42 40 53 4,5,E+07241,00E-06 9 7 5 9 7 5 7,0,E+07
5,8,E+07
1,00E-04 50 54 45 51 58 48 5,2,E+061,00E-05 8 8 5 9 8 5 7,3,E+06221,00E-06 0 0 1 0 0 1 3,3,E+06
5,3,E+06
1,00E-03 0 6 4 0 6 4 3,3,E+041,00E-04 0 2 0 0 2 0 6,7,E+04201,00E-05 0 0 0 0 0 0 0,0,E+00
5,0,E+04
Fermentación No. 760902
UFC/mL: 6.3x107
Hora DilucionResultados 17
horas Resultados 24 horas Promedio Resultado1,00E-06 - - - 13 1 5 6,3,E+071,00E-07 - - - 1 0 0 3,3,E+07451,00E-08 - - - 0 0 0 0,0,E+00
6,3,E+07
1,00E-05 - - - 24 31 32 2,9,E+071,00E-06 - - - 7 6 14 9,0,E+07311,00E-07 - - - 1 1 0 6,7,E+07
6,2,E+07
1,00E-05 - - - 120 I 96 1,1,E+081,00E-06 - - - 4 1 4 3,0,E+07281,00E-07 - - - 0 0 0 0,0,E+00
6,9,E+07
1,00E-04 - - - I I I I1,00E-05 - - - 43 40 50 4,4,E+07241,00E-06 - - - 3 2 1 2,0,E+07
3,2,E+07
1,00E-03 - - - I I I I1,00E-04 - - - I I I I201,00E-05 - - - I 20 24 2,2,E+07
2,2,E+07
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
122
Fermentación No. 781002
UFC/mL: 5.5x108
Hora DilucionResultados 17
horasResultados 24
horas Promedio Resultado1,00E-05 - - - I I I i1,00E-06 - - - 50 - - 5,0,E+08441,00E-07 - - - 35 3 9 6,0,E+08
5,5,E+08
1,00E-04 - - - I I I I1,00E-05 - - - I I I I301,00E-06 - - - 28 I I I
I
1,00E-04 - - - I I I I1,00E-05 - - - 97 81 100 9,3,E+07241,00E-06 - - - 20 17 22 2,0,E+08
1,4,E+08
1,00E-03 - - - I I I I1,00E-04 - - - I I I I221,00E-05 - - - 76 57 99 7,7,E+07
7,7,E+07
1,00E-03 - - - I I I I1,00E-04 - - - 7 135 152 1,4,E+07201,00E-05 - - - 14 18 23 1,8,E+07
1,6,E+07
Fermentación No. 791102
UFC/mL: 1.3x108
Hora DilucionResultados 17
horas Resultados 24 horas Promedio Resultado1,00E-07 - - - 2 2 0 1,3,E+081,00E-08 - - - 0 0 0 0,0,E+00631,00E-09 - - - 0 0 0 0,0,E+00
1,3,E+08
1,00E-06 - - - 20 17 7 1,5,E+081,00E-07 - - - 0 1 2 1,0,E+08481,00E-08 - - - 1 0 0 3,3,E+08
1,2,E+08
1,00E-06 - - - 20 29 36 2,8,E+081,00E-07 - - - 7 3 3 4,3,E+08461,00E-08 - - - 0 0 0 0,0,E+00
3,6,E+08
1,00E-06 - - - 16 16 22 1,8,E+081,00E-07 - - - 2 1 0 1,0,E+08401,00E-08 - - - 0 0 0 0,0,E+00
1,4,E+08
1,00E-06 - - - 0 0 3 1,0,E+071,00E-07 - - - 0 0 0 0,0,E+00381,00E-08 - - - 0 0 0 0,0,E+00
0,0,E+00
1,00E-04 - - - 0 0 0 0,0,E+001,00E-05 - - - 0 0 0 0,0,E+00231,00E-06 - - - 0 0 0 0,0,E+00
0,0,E+00
1,00E-04 - - - 0 0 0 0,0,E+001,00E-05 - - - 0 0 0 0,0,E+00181,00E-06 - - - 0 0 0 0,0,E+00
0,0,E+00
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
123
Fermentación No. 801102
UFC/mL: 1.3x109
Hora DilucionResultados 17
horas Resultados 24 horas Promedio Resultado1,00E-06 - - - 15 13 14 1,4,E+081,00E-07 - - - 4 2 5 3,7,E+0866,51,00E-08 - - - 9 6 3 6,0,E+09
1,3,E+09
1,00E-06 - - - 3 7 7 5,7,E+071,00E-07 - - - 4 1 9 4,7,E+08521,00E-08 - - - 2 2 2 2,0,E+09
8,4,E+08
1,00E-06 - - - 47 67 62 5,9,E+081,00E-07 - - - 12 11 13 1,2,E+09481,00E-08 - - - 1 0 0 3,3,E+08
7,1,E+08
1,00E-06 - - - 42 48 51 4,7,E+081,00E-07 - - - 5 13 4 7,3,E+08441,00E-08 - - - 1 0 0 3,3,E+08
5,1,E+08
1,00E-04 - - - 0 0 1 3,3,E+041,00E-05 - - - 0 0 1 3,3,E+05261,00E-06 - - - 0 0 0 0,0,E+00
0,0,E+00
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
124
ANEXO 10. RESULTADOS DE GLUCOSA PARA LAS FERMENTACIONESEN EL FERMENTADOR DE 14L
Fermentación No. 710802
HoraGlucosa
(g/L)0 24,51 23,62 22,93 18,94 14,45 10,06 6,07 2,2
Glucosa F#710802
0
5
10
15
20
25
30
0 2 4 6 8Tiempo (h)
Glu
cosa
(g/
L)
Fermentación No. 720802
HoraGlucosa
(g/L)0 23,121 18,293 20,76 7,677 5,72
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
125
Glucosa F#720802
0
5
10
15
20
25
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Tiempo (h)
Glu
cosa
(g/L
)
Fermentación No. 730802
Hora Glucosa (g/L)0 22,52 19,23 16,65 13,46 10,97 7,0
Glucosa y Biomasa Vs. Tiempo
0
5
10
15
20
25
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Tiempo (h)
0
1
2
3
4
5
6
Glucosa Biomasa
Fermentación No. 740902
HoraGlucosa
(g/L)0 21,32 21,843 17,944 18,045 13,866 13,647 9,5475
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
126
Glucosa y Biomasa Vs. Tiempo
0
5
10
15
20
25
0 2 4 6 8Tiempo (h)
Glu
cosa
(g/L
)
0
1
2
3
4
5
6
Biom
asa
(g/L
)
Glucosa Biomasa
Fermentación No. 750902
HoraGlucosa
(g/L)0 20,62 17,13 23,04 22,15 19,16 15,27 11,0
Glucosa y biomasa Vs. Tiempo
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
0 2 4 6 8
Tiempo (h)
Glu
cosa
(g/L
)
0
1
2
3
4
5
6
Biom
asa
(g/L
)
Glucosa Biomasa
Fermentación No. 760902
HoraGlucosa
(g/L)0 26,32 27,43 26,7
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
127
4 24,25 22,36 16,77 11,4
Glucosa y Biomasa Vs. Tiempo
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
0 2 4 6 8Tiempo (h)
Glu
cosa
(g/L
)
0
1
2
3
4
5
6
Biom
asa
(g/L
)
Glucosa Biomasa
Fermentación No. 781002
HoraGlucosa
(g/L)0 24,92 23,53 19,84 18,95 18,26 18,97 16,8
Glucosa y Biomasa Vs. Tiempo
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
0 2 4 6Tiempo (h)
Glu
cosa
(g/L
)
0
1
2
3
4
5
6
Biom
asa
(g/L
)
Glucosa Biomasa
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
128
ANEXO 11. RESULTADOS DE GLUCOSA PARA LAS FERMENTACIONES A250L
Fermentación No. 791102
Semilla: Fermentador de 14L
Hora Glucosa (g/L)1 20,13 20,74 18,95 17,6
Semilla Glucosa y Biomasa Vs. Tiempo
05
10152025
0 2 4 6
Tiempo (h)
Glu
cosa
(g/L
)
0123456
Biom
asa
(g/L
)
Glucosa Biomasa
Fermentador de 250L
HoraGlucosa
(g/L)0 19,91 23,83 23,55 23,86 20,27 18,08 15,39 10,3
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
129
Glucosa y Biomasa Vs. Tiempo
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
0 2 4 6 8 10
Tiempo (h)
Glu
cosa
(g/L
)
0
1
2
3
4
5
6
Biom
asa
(g/L
)
Glucosa Biomasa
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
130
Fermentación No. 801102
Semilla: Fermentador de 14L
HoraGlucosa
(g/L)2 21,3
4,5 22,01
Glucosa - Semilla
05
101520
0 1 2 3 4 5
Tiempo (h)
Glu
cosa
(g/
L)
Fermentador de 250L
HoraGlucosa
(g/L)0 24,92 27,74 27,75 28,47 24,98 27,79 25,5
Glucosa y Biomasa Vs. Tiempo
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
0 2 4 6 8 10Tiempo (h)
Glu
cosa
(g/
L)
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
131
ANEXO 12. PRETRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS PARA LADETERMINACIÓN DE LA PROTEÍNA TOTAL Y LAS PROTEÍNAS
TÓXICAS.
INICIO
Colocar 3mL de la muestra en un tubo deensayo
Agregar 5mL de agua ácida pH 2.5
Eliminar el sobrenadante
Centrifugar durante 40 minutos a 4500rpmy 4°C
Reconstituir y homogenizar
Envasar en crioviales de 5mL
Colocar parafilm alrededor
FIN
Sonicar las muestras durante 10 minutos a°C.
Almacenar a 4°C y posteriormente realizarlos análisis de Bradford y electroforesis.
Repetir4 veces
IQ-2002-2-09IQ-2002-2-18
132
ANEXO 13. PROTOCOLO DE INOCULACIÓN PARA EL FERMENTADORDE 250L
INICIO
Presemilla I: En 2 erlenmeyers de 500mL,colocar 100 mL de medio de cultivo y 5mLde solución de esporas, a 30°C y 300rpm,
durante 16 horas.
Fermentación: en el fermentador de 250L,colocar 100L de medio de cultivo y 11 L desemilla a 30°C, 400rpm, 150Lpm y 15psi.
Semilla: en el fermentador de 14L colocar10 L de medio de cultivo y 1L de
presemilla ll a 30°C, 350rpm, 15 Lpm y 6psi, durante 17 horas.
Presemilla ll: En tres erlenmeyers de 1L,colocar 455 mL de medio de cultivo y 45
ml de Presemilla l, a 30°C, 300rpm,durante 6 horas.
FIN
Este protocolo se debe evaluar para garantizar que el cambio a cada etapa del proceso
se realice cuando la bacteria se encuentre en fase de crecimiento exponencial avanzado,
para lo cual, se deben tomar muestras del cultivo en la semilla cada hora y realizar las
pruebas de biomasa para construir la cinética de crecimiento y corroborar los tiempos de
cultivo en cada etapa.
