Epidemiología del daño foliar del pino (DFP) y ciclo biológico de P. pinifolia: bases para una estrategia de control integrado.

Proyecto:Epidemiología del daño foliar del pino (DFP) y ciclo biológico de P. pinifolia: bases para una estrategia de control integrado.

Cofinancia:Innova Bío-Bío.

Entidad Ejecutora:Universidad de Concepción Entidad Asociada:Controladora de Plagas Forestales (CPF).

Período de ejecución:Diciembre 2009 – Diciembre 2012

Equipo de trabajo:Director:Eugenio Sanfuentes VS. Dr. en Fitopatología.

Subdirectora:Angélica Casanova K. Dra. en Recursos Naturales.

Sofía Valenzuela A. Dra. en Recursos Naturales.

Gastón González. Ms. Sc. en Fitopatología.

Marco Sabag D. Ingeniero Forestal.

José Luis Ulloa F.Ingeniero en Biotecnología Vegetal.

Paula Oyarce S. Bioingeniero.

Rossana Cartagena H. Técnico en Biotecnología.

Felipe Acuña L. MsC en gestión de la innovación y emprendimiento.

Javier Estrada A.

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Desde el año 2004 comenzaron a observarse severas defoliaciones en plantaciones de Pinus radiata, en áreas costeras de la provincia de Arauco, que el 2006 alcanzaron las 60.000 ha afectadas. Este problema en follaje recibió la denominación del “daño foliar del pino” (DFP). Las defoliaciones ocurren en plantaciones de todas las edades, y en ataques severos, pueden causar reducción de crecimiento en árboles adultos y la muerte en plantas jóvenes. La sintomatología característica de la patología es una banda de color negro en acículas aún verdes, siguiendo la decoloración y muerte de las acículas que pueden mantenerse adheridas a las ramas y tallos por más de un año. También es común observar cancros en tallo y ramas, y necrosis en brotes aún no lignificados. A mediados del 2007, se propuso al oomiceto Phytophthora pinifolia como agente causal del DFP.

Las especies del género Phytophthora son patógenos altamente destructivos y claramente el DFP está entre las enfermedades más severas que ha ocurrido en pino en Chile. Considerando el valor económico de la actividad forestal en Chile, P, pinifolia podría tener efectos negativos tanto en la producción de madera como en las exportaciones, además de los elevados costos en los programas de control y el riesgo que la enfermedad se expanda a otras áreas.

Hasta la fecha no existen registros a nivel internacional sobre P. pinifolia, por lo que se planteó como objetivos del proyecto conocer aspectos de la biología del patógeno y epidemiología de la enfermedad (DFP), entre los que se cuentan a) metodologías de aislamiento, detección y cuantificación del patógeno, b) conocer ciclo de enfermedad y los factores ambientales que lo influencian y c) epidemiología del DFP, relacionados a la supervivencia del patógeno y la evolución temporal de la enfermedad. Las informaciones generadas, junto

con registros climáticos de las zonas en estudio, permitirán construir una base de datos para comenzar a implementar modelos predictivos, para pronosticar ataques del patógeno y, determinar áreas de riesgo potencial, además de elementos básicos para un manejo integrado de la enfermedad.

Los principales resultados del proyecto permitieron la generación de un paquete tecnológico que incluyó una serie productos específicos y además de conocimientos básicos de P. pinifolia y de la enfermedad, entre los que se encuentran: a) identificación y cuantificación de P. pinifolia mediante técnicas moleculares, b) técnicas histológicas para estudio de la patogénesis, c) metodologías de producción de inóculo (esporangios y zoosporas) y protocolo de inoculación de plantas, d) factores del patógeno y del ambiente que determinan la infección (cantidad de inóculo, mojamiento foliar, temperatura), e) aspectos básicos del patógeno (crecimiento y esporulación, tipo de reproducción, variabilidad en agresividad en P. radiata, f) supervivencia del patógeno y g) fluctuaciones del inóculo de P. pinifolia y dinámica temporal de la enfermedad en condiciones de campo.

Resumen del Proyecto

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En los últimos años se ha observado la presencia de síntomas severos en el follaje de plantaciones de pino radiata – Pinus radiata D. Don, problema que fue denominado “daño foliar del pino o DFP” (Figura 1). Las plantaciones afectadas se encuentran localizadas en el suroeste de la Región del Bío-Bío, principalmente en la Provincia de Arauco, en algunos sectores de la Región de la Araucanía, Provincia de Cautín, y en la Región de Los Ríos, zona costera de la Provincia de Valdivia.

Los síntomas comienzan con una banda de color negro en acículas aún verdes, seguido por una decoloración progresiva del follaje de los árboles, tornándose las acículas de una tonalidad amarillo - grisácea durante el invierno, hasta quedar de color rojizo al final de la primavera (Figura 2). La defoliación ocurrirá en las siguientes dos o más temporadas, con la consecuente disminución de productividad de las plantaciones afectadas, siendo posible que genere estrés en los árboles con un aumento en la susceptibilidad al ataque de plagas secundarias.

Origen delProblema

Figura 1. Plantaciones de Pinus radiata de diferentes edades presentando necrosis foliar atribuida a Phytophthora pinifolia. Plantación adulta (A), juvenil (B) y recién establecida (C)

A B C

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Figura 2. Síntomas causados por Phytophthora pinifolia en Pinus radiata. Banda negra y decoloración en acículas (A), necrosis en ápices (B) y cancros en tallos (C).

A B C

El agente causal del daño foliar del pino era desconocido, hasta el año 2007 donde se aisló una especie de Phytophthora, la cual fue denominada Phytophthora pinifolia nom. prov. Para este patógeno no existían registros a nivel mundial, por lo que se desconocían absolutamente aspectos relacionados a la biología del agente, así como del comportamiento de la enfermedad y de los factores ambientales que la influencian. Esta falta de antecedentes básicos hacía que las medidas de control no fuesen mejor orientadas.

Por la experiencia internacional, se sabe que los estudios sobre enfermedades provocadas por especies de Phytophthora requieren años de trabajo, en esfuerzo colaborativo entre diferentes grupos de investigación, como ha sido el caso de P. ramorum en bosques naturales en el oeste de USA.

Debido al efecto que ha provocado la enfermedad en las plantaciones de P. radiata, en las áreas más importantes para este recurso, el desconocimiento sobre esta patología y las posibles consecuencias sobre las exportaciones de productos de P. radiata, es que se planteó la necesidad de realizar el presente proyecto de investigación, con los siguientes objetivos;

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ObjetivoGeneral

Caracterizar el ciclo biológico y epidemiología de Phytophthora pinifolia, para establecer las bases para el manejo integrado del DFP en plantaciones de Pinus radiata, con el fin de reducir las pérdidas económicas para el sector forestal.

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Objetivos Específicos

Detectar y cuantificar P. pinifolia en diferentes tejidos vegetales y otros sustratos.

Caracterizar aspectos de ciclo de la enfermedad y biología del patógeno en condiciones controladas.

Caracterizar la dinámica del DFP en plantaciones de P. radiata.

Difusión y transferencia tecnológica.

1 2

3 4

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Productos y/o Resultados

Figura 3. Figura 3. Amplificación específica de partidores DFP2 mediante PCR utilizando especies de Phytophthora y diferentes aislamientos de P. pinifolia. De izquierda a derecha: P. pinifolia SAG (1, 2, 3 y 4), P. cactorum (5), P. capsici (6), P. cinnamomi (7), P. megasperma (8), P. nicotianae (9), P. pinifolia Bioforest (10 al 22), P. pinifolia UdeC (23 al 47), agua libre de nucleasas (48).

Tabla 1. Partidores diseñados para la detección y cuantificación de Phytophthora pinifolia.

1 Identificación y cuantificación de P. pinifolia mediante técnicas moleculares.

Se desarrolló un método específico de detección de P. pinifolia, utilizando un par de partidores (DFP2) para PCR convencional (Tabla1, Figura 3), capaz de detectar al patógeno a partir desde diversos tipos de muestras como acículas infectadas, cancros en tallo y agua lluvia. Además, se diseñó un partidor (Ypin3) para la cuantificación del patógeno en muestras de agua, mediante Real Time PCR, lo que permitirá monitorear las fluctuaciones del patógeno en agua lluvia o cursos de agua colectada desde terreno (Tabla1).

Denominación Primer Fordware Primer Reverse

DFP2 CGACCGTXXXXXXXXXXXX CCACGATXXXXXXXXXXXX

Ypin3 GACTTTGTGAGTATAGCGCG ACAATCTGGAGCTTGATGGT

Figura 4. Tinción de estructuras de Phytophthora pinifolia A) tinción de micelio con azul de tripan y B) tinción de micelio y esporangios con calcofuor.

2 Técnicas histológicas para estudios en patogénesis de P. pinifolia.

Las acículas con síntomas de banda negra y decoloración fueron fijadas en glutaraldehído al 2,5% y mantenidas a una temperatura de 4ºC. Las tinciones más efectivas para la detección de estructuras características de género de Phytophthora fueron azul de tripan 0,001% y calcofuor 0,001% (Figura 4).

A B

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Productos y/o Resultados

Figura 5. Método de producción de inoculo de Phytophthora pinifolia; A) acículas inoculadas en colonias de Phytophthora pinifolia, B) acículas inoculadas en Agua destilada estéril para estimular la producción de zoosporas y C) zoosporas de P. pinifolia.

Figura 6. Método de inoculación de Phytophthora pinifolia; A) inoculación de acículas de Pinus radiata con suspensión de zoosporas de Phytophthora pinifolia y B) síntomas asociados a P. pinifolia.

3 Metodologías de producción de inóculo de P. pinifolia y protocolo de inoculación de plantas.

Método de producción de inoculo de P. pinifoliaAcículas de P. radiata fueron desinfestadas con alcohol 70% y lavadas con agua destilada estéril (ADE) y dispuestas sobre colonias de P. pinifolia, que estaban creciendo en un medio agar zanahoria durante diez días, a 25°C. Después de incubar por siete días, las acículas infectadas son transferidas a ADE, incubadas a 5ºC, bajo luz, durante 48 horas, para luego cuantificar el número de zoosporas mediante hematocitometro (Figura 5).

Protocolo de inoculación de P. pinifoliaEn este método de inoculación, fascículos de P. radiata, son dispuestos en tubos Eppendorf de 2,0 ml, que contienen 1,5 ml de una suspensión de zoosporas de P. pinifolia, ajustada con hematocitometro a la densidad de inóculo requerida. Las acículas se mantienen durante 24 h en la suspensión de zoosporas bajo condiciones controladas de luz y temperatura, (fotoperiodo 12/12, a 10°C), para luego retirar el Eppendorf. A partir de ese momento las acículas podrán ser mantenidas en diferentes condiciones ambientales, presentando síntomas 7-14 d después de la inoculación (Figura 6).

A B C

A B

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Productos y/o Resultados

Figura 7. Temperatura y tiempo de mojamiento para causar infección con Phytophthora pinifolia (10.000 zoosporas/ml).en acículas de Pinus radiata.

Figura 8. Incidencia de Phytophthora pinifolia en acículas de Pinus radiata inoculadas con diferentes dosis de inóculo del patógeno.

4 Factores del patógeno y del ambiente que determinan la infección de P. pinifolia (cantidad de inóculo, mojamiento foliar, temperatura).

P. pinifolia es capaz de provocar infección a partir de 6 horas de mojamiento foliar independientemente de la temperatura de incubación, siendo mayor la infección a 10°C. A una misma temperatura de incubación, a medida que se incrementa el período de mojamiento se verificó aumento de la severidad de infección (Figura 7). La cantidad mínima de inóculo para causar infección de P. pinifolia en acículas de P. radiata fue de 100 zoosporas/ml, aumentando conforme se incrementó la dosis de inóculo (Figura 8). Los resultados mostraron que este oomicete posee un amplio rango de temperaturas para causar infección en plantas de P. radiata. Sin embargo, la mayor severidad de infección ocurre a bajas temperaturas, explicando el marcado comportamiento invernal de la patología.

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Productos y/o Resultados

Figura 9. Crecimiento de la colonia para diez cepas de Phytophthora pinifolia a las temperaturas de incubación de 5, 25 y 30oC. Barras indican desviación estándar para cada cepa por nivel de temperatura.

Figura 10. Promedio de crecimiento de la colonia para 10 cepas de Phytophthora pinifolia a diferentes temperaturas de incubación.

5 Aspectos básicos del patógeno (crecimiento y esporulación), tipo de reproducción, variabilidad en agresividad en P. radiata.

P. pinifolia posee un amplio rango de crecimiento y esporulación, variando entre 5-25oC, con un máximo para crecimiento micelial a 25oC y esporulación a 10oC, además existe variabilidad en el crecimiento vegetativo entre cepas del patógeno (Figuras 9 y 10).

Se realizaron pareamientos entre diez cepas de P. pinifolia (60, 63, 64, 75, 76, 78, 83, 492, 600, 601), provenientes de distintas localidades y con cepas de P. cinnamomi, P. cactorum, P. megasperma, P. capsici, P. nicotianae, donde el patógeno no produjo estructuras de reproducción sexual, indicando que se trataría de un oomicete heterotálico.

En el proceso de penetración del patógeno se determinó que las zoosporas se enquistan rápidamente en la superficie de la hoja, luego emiten tubo germinativo y penetran al mesófilo vía estomas de las acículas. No se detectó presencia de haustorios (Figura 11).

Las cepas de P. pinifolia colectadas desde árboles de P. radiata en diferentes localidades del país (Concepción a Valdivia), presentaron niveles de agresividad (virulencia) semejantes, cuando la inoculación se realizó con discos de micelio. (Figuras 12 y 13).

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Productos y/o Resultados

Figura 11. Fases del proceso de penetración de Phytopthora pinifolia en acículas de Pinus radiata; A) fase de enquistamiento de zoosporas en el estoma de la acícula, B) zoosporas germinando, en las primeras 6 h y C-D) formación de esporangios y liberación de zoosporas, 4-5 días después de la inoculación. Microscopía electrónico de barrido.

Figura 13. Largo de lesión en plantas de Pinus radiata inoculadas en el ápice con discos de micelio de Phytophthora pinifolia.

A

C

B

D

(mm

)

Figura 12. Longitud de lesión en plantas de Pinus radiata inoculadas con discos de micelio de diferentes aislamientos de Phytophthora pinifolia.

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Productos y/o Resultados

Figura 15. Promedio de esporangios (atribuidos a Phytopthora pinifolia) por acícula, en muestreos realizados litera para las temporadas 2010-2012.

Figura 14. Supervivencia de Phytophthora pinifolia en acículas necrosadas retenidas en las copas de árboles (A), en litera (B) y en árboles sin síntomas evidentes (C).

6 Formas de supervivencia del patógeno

No se detectaron estructuras especializadas de supervivencia (clamidosporas) de P. pinifolia. El patógeno puede sobrevivir durante la época estival infectando acículas de P. radiata durante toda la temporada, y también en acículas muertas en litera y también en aquellas acículas retenidas por una o más temporadas (Figuras 14 y 15) (Tabla 2).

Tabla 2. Acículas de Pinus radiata muestreadas y con síntomas de Phytophthora pinifolia, colectadas desde árboles del predio Llico, octubre 2011 a marzo 2012).

Fecha Número total de acículas Proporción de P. pinifolia (%)

26.10.1130.11.1128.12.1125.01.1229.02.1230.03.12

12.25014.00010.20016.45012.45010.500

0,410,120,040,0800

A B C

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Productos y/o Resultados

7 Fluctuaciones de P. pinifolia en el ambiente y dinámica temporal del DFP en plantaciones.

P. pinifolia fue detectado en agua de lluvia en los meses de otoño e invierno, indicando que su dispersión y con aumento de severidad está asociada a este evento (Figura 16). En las temporadas 2010 a 2012, la enfermedad (DFP) se inicia entre junio y agosto, alcanzando un máximo entre septiembre-octubre. La enfermedad tuvo diferentes comportamientos en los años de evaluación, tanto en el inicio de la epidemia como en la intensidad final.

El tiempo de mojamiento foliar en acículas estaría asociado al inicio de la enfermedad en el año y con la evolución de la severidad (Figura 16). Las plantas trampas también han sido un importante herramienta para determinar los periodos de infección de P. pinifolia, y sus resultados poseen una alta asociación con la evolución de la enfermedad en árboles (Figura 17). Actualmente, se evalúan efectos combinados con temperaturas mínimas, humedad relativa, mojamiento foliar y severidad del DFP. Figura 16.

Fascículos de Pinus radiata con síntomas de Phytophthora pinifolia (%) (PNFI/Predio) para los cuatro predios evaluados en temporada 2012. (Arriba). Mojamiento foliar por (h/día) en acículas de P. radiata en predio Llico, durante enero a noviembre del 2012 (Abajo).

Figura 17. Plantas trampas de Pinus radiata con infección de Phytophthora pinifolia en el predio Quidico temporada 2012, en plantas en altura (R2) y en litera (R1 y R3) (izquierda). Periodo mojamiento foliar (h/día) para acículas de P. radiata en predio Quidico, periodo 2012 (derecha).

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Productos y/o Resultados

8 Paquete tecnológico.

Entre los productos importantes del proyecto fue la generación de un paquete tecnológico que contempla una serie de protocolos de identificación y detección específicos del patógeno, además de otros protocolos de importancia para desarrollar estudios sobre la biología y epidemiología del patógeno y de la enfermedad respectivamente.

El listado de los protocolos contenidos en el paquete tecnológico es el siguiente:

Protocolo de extracción de ADN de P. pinifolia.

Protocolo de extracción de ADN de P. pinifolia desde acículas infectadas de P. radiata y agua.

Protocolo de procesamiento de muestras de agua de terreno para extracción de ADN de P. pinifolia (zoosporas).

Protocolo de PCR para identificación molecular de P. pinifolia con partidor DFP2.

Método de cuantificación de zoosporas de P. pinifolia mediante Real Time PCR con partidor Ypin3.

Protocolo de producción de esporangios y zoosporas de P. pinifolia.

Método de inoculación de plantas de P. radiata con zoosporas de P. pinifolia.

Protocolo de microscopía epifluorescencia.

Protocolo de cebos para la detección de P. pinifolia desde distintos substratos (suelo mineral, litera, etc.).

a)

b)

c)

d)

e)

f)

g)

h)

i)

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Laboratorio de Patología ForestalFacultad de Ciencias Forestales-Centro de Biotecnología

Universidad de Concepción

www.udec.cl/patfor

Contacto:Dr. Eugenio Sanfuentes VS.

esanfuen@udec.cl