Epidemiología y diagnóstico de la tuberculosis bovinade la tuberculosis bovina

ÁJ. Álvarez, L. de Juan, B. Romero, E. Castellanos, J. Bezos, S. Rodríguez, A. Aranaz, A. Mateos, L. Domínguez

Laboratorio Vigilancia Sanitaria (VISAVET)Laboratorio Vigilancia Sanitaria (VISAVET)Departamento de Sanidad Animal

Facultad de VeterinariaUniversidad Complutense de Madridp

•Género Mycobacterium

• > 50 especies bacterianas

M.a.p

A bi t l ( l )- Ambientales (suelo, agua)

- Patógenas: ↑ rango de hospedadoresPatógenas: ↑ rango de hospedadores

Animales homeotermos y poiquilotermos

Tuberculosis, lepra, paratuberculosis,

t t i t tpeces, tortugas, serpientes, etc.

M bovisComplejo Mycobacterium tuberculosis:

Tuberculosis bovinaM. bovisM. capraeM tuberculosis “Enfermedad en los M. tuberculosisM. africanumM. pinnipedii

bovinos causada por cualquiera de las especies incluidas M. pinnipedii

M. MicrotiM. bovis BCG

pdentro del complejo

M. tuberculosis”

Complejo Mycobacterium avium (MAC):M a paratuberculosis ParatuberculosisM. a. paratuberculosisM. a. aviumM. a. silvaticum

ParatuberculosisTuberculosis aviar

M. a. silvaticum M. a. hominissuisM. intracellulare

Tuberculosis y Paratuberculosisy

- Enfermedades de curso crónicoParásitos intracelulares- Parásitos intracelulares

- Transmisión:-Fecal-oral (PTB) / Aerógena (TBC)Fecal oral (PTB) / Aerógena (TBC)-Otras: leche, semen, vertical, ambiente

Diagnóstico:Diagnóstico:1. Clínico 2. Inmunológico2. Inmunológico

- Base celular: IDTB, γ-IFN- Base humoral: serología

3. Anatomopatológico (matadero)4. Microbiológico

1) Diagnóstico clínico

Enfermedad consuntivaE i ióEmaciaciónDiarrea (variable)

Lesiones Tuberculosis (granulomas)

Lesiones Paratuberculosis

Hipertrofia linfonodos

LinfangiectasiaGranulomas caseosos/calcificados LinfangiectasiaGranulomas caseosos/calcificados

2) Diagnóstico inmunológico

une Inmunidad

celular

acilo

s

acilo

s

ta in

mu

I id d Ba Ba

espu

est Inmunidad

humoral

Re

Tiempo

- Inmunidad de base celular- Intradermotuberculinización (IDTB): simple / comparada

- Inmunidad de base humoral: Detección de anticuerpos- Técnica de gamma-interferon

2 1 IDTB i l 2.1. IDTB simple • Calidad de la tuberculina –

t t ió• Buena praxis contrastación

• ↓ sensibilidad individual

•Interpretación standard →

Resultado Medida (mm) Signos clínicos

Negativo ≤ 2 NO

Dudoso >2 y <4 NO•Interpretación standard →

• Imprescindible para l ifi b ñ

Dudoso >2 y <4 NO

Positivo ≥ 4 SÍy/o

En ciertas circunstancias los animalesdudosos se consideran positivosclasificar rebaños

• Especificidad → falsos positivos → exposición a

dudosos se consideran positivos

micobacterias no tuberculosas (ej. Complejo M.avium). Solución → IDTB comparada

2.2. IDTB comparada p- Técnica de aplicación- Lectura

ó- Interpretación standard:Resultado Interpretación

Reacción negativa a la tuberculina bovina o reacción positiva o dudosa aNegativo

Reacción negativa a la tuberculina bovina o reacción positiva o dudosa ala tuberculina bovina pero igual o inferior a una reacción positiva odudosa a la tuberculina aviar, con ausencia de signos clínicos.

Dudoso Reacción a la tuberculina bovina positiva o dudosa y superior en 1 a 4 mml ió l t b li i i d i lí iDudoso a la reacción a la tuberculina aviar, con ausencia de signos clínicos.

Positivo Reacción a la tuberculina bovina superior en más de 4 mm a la reacción ala tuberculina aviar o presencia de signos clínicos.

En ciertas circunstancias los animales dudosos se consideran positivos

- Permite discriminar paratuberculosis u otras micobacteriasen rebaños sin tuberculosis

En ciertas circunstancias los animales dudosos se consideran positivos

en rebaños sin tuberculosis- Ojo! En rebaños con infección mixta → disminuye lasensibilidad

Factores que interfieren en la detección de animales enfermos:

1. Mala realización de la prueba:- incorrecta dosis de inoculación- errores en medida de piel pre y post-inyección- fallos en identificación de animales- tuberculinas en mal estado- repeticiones del test )- repeticiones del test, …)

2. Animales en estado “prealérgico”.

3 Animales en estado de anergia3. Animales en estado de anergia.

4. Coinfecciones con otras enfermedades que depriman

el sistema inmune.

5. Tratamientos con inmunosupresores.

6. Vacunación frente a la paratuberculosis.

7. Infección con micobacterias del complejo M. avium.

Tuberculosis + Paratuberculosis

(M. bovis + M.a.paratuberculosis)

↓ respuesta inmune → anergia inmunitariap g

Interferencia en el rendimiento de la IDTB comparada

(no reacción más intensa con la PPD aviar)(no reacción más intensa con la PPD aviar)

2.3. Técnica de gamma-interferongcn

ica

Plasma

e la

téc

GIFN

* EIA

ento

de

macrófagolinfocito T

ndam

e

g

Cultivo in vitro de la sangreFun

Dispensar sangre γ-IFN: Bovigam

Estimular sangre

PPDaviar

PPDbov Incubar sangre

R PBS PBS Recoger plasma

Positivo: (PPD bov – PBS) ≥ 0,05; PPD bov > PPD aviarPPD bov > PPD aviar

Reactor aviar: PPD av – PBS) ≥ 0,100; PPD

i > PPD b iaviar > PPD bovina

- Prueba complementaria

γ-IFN: Bovigam

p

- Recomendado por la Task Force en situaciones de alta prevalenciaprevalencia

Ventajas de la técnica:

- Detecta animales en una fase de infección más temprana → detecta una mayor proporción de temprana → detecta una mayor proporción de animales.

ó- Interpretación menos subjetiva e influenciable por causas que interfieren con la IDTB.

- Obtención de valor numérico (definición de punto de corte).

γ-IFN: Bovigam

Puntos críticos de γ-interferon

- Efecto de la potencia de las PPDs

- Calidad de la sangre

- Transporte de la sangrep g

- Tiempo entre extracción y estimulación

Duplicados - Duplicados

- Mitógenos

ú ó- Tiempo transcurrido desde la última tuberculinización

- Estado fisiológico de los animales

- FenolHay que estandarizar la técnica!!!

6. Detección de anticuerpos

LISA

ca d

e EL

Técn

ic

3) Diagnóstico postmortem en matadero3) Diagnóstico postmortem en matadero

- En algunas CCAA ∼ 50% de casos nuevos se detectan en matadero

4) Diagnóstico microbiológico4) Diagnóstico microbiológico- Imprescindible confirmar la infección mediante cultivo

- Cultivo más sensible que lesiones (lesión-, cultivo+)

- Permite estudios epidemiológicosPermite estudios epidemiológicos

Ziehl-NeelsenAuramina

- Homogeneización de la muestraCultivo

Homogeneización de la muestra

- Medios de cultivo:TBC: Coletsos, Löwenstein-Jensen

PTB: HEYM Middlebrook 7H11 LJ- Descontaminación HPC PTB: HEYM, Middlebrook 7H11, LJTBC 0,75% 1h / PTB 1,5% 18h (+ micobactina)

PCR Múlti l

M. bovis M.a.p

IdentificaciónPCR Múltiple

Gé M b t iGénero Mycobacterium

Complejo Mycobacterium tuberculosisp j yMycobacterium avium subsp. paratuberculosis

spb-4

M. bovisCaracterización molecular: DVR-spoligotyping

spb-13

spb-23

M. tuberculosisspt-1

3M. caprae

spc-3

spc-2

spc-3

EpidemiologíaóInvestigación tradicional+

tipificación molecularp

Tbc

Spc

Spc Spb SpbSpbSpc Spb

SpbSpbp

Convenio de colaboraciónConvenio de colaboración

Estudio y aplicación de nuevas técnicas de Estudio y aplicación de nuevas técnicas de diagnóstico como apoyo a los programas

nacionales de erradicación de nacionales de erradicación de enfermedades de los animales y su estudio y

caracterización en fauna silvestrecaracterización en fauna silvestre

Ministerio de Agricultura, Pesca gy Alimentación

Dirección General de GanaderíaSubdirección General de

Sanidad Animal

Universidad Complutense de Madrid

Laboratorio de Vigilancia Sanitaria

Junta de Castilla y LeónConsejería de Agricultura y

GanaderíaS

Convenio MAPYA-UCM

Desarrollo convenioDesarrollo convenio

Asesoría científica y técnicay

•Asesoramiento Ministerio & CCAA.F ió d l•Formación de personal.

•Conferencias de formación.•Asesoría a explotaciones ganaderas bovinas y p g ycaprinas.•Envío de cepas de micobacterias para la puesta a punto de la técnica de PCR/DVR spoligotyping punto de la técnica de PCR/DVR-spoligotyping. •Interpretación de resultados obtenidos mediante pruebas inmunológicas.•Recogida de muestras biológicas en mataderos autorizados.

Evolución Castilla y Leóno

(%)

reba

ñoen

cia

rre

vale

P

8

Incidencia en animales Prevalencia en rebaño

5,357Campaña de saneamiento

↓4,57

5

6 ↓↓ falsos negativos

↓3,44

2,49 2,814

↑ sensibilidad de pruebas

1 38 1 26

2,11,

2,242,14 1,8 1,52

1,782

3

1,38 1,260,89 0,75 0,66 0,58 0,52 0,47 0,4 0,31

0,42

0

1

01996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006

Diagnóstico en 4 situaciones posibles:

1 Explotación con tuberculosis y paratuberculosisTBC1. Explotación con tuberculosis y paratuberculosis.

2. Explotación con paratuberculosis y sin

PTB

2. Explotación con paratuberculosis y sintuberculosis.PTB

3. Explotación con tuberculosis y sinparatuberculosis.

TBC

4. Explotación sin tuberculosisy sin paratuberculosis.y p

Tuberculosis y paratuberculosisTBCPTB

TuberculosisIDTB comparada •17+

•201-

•Pruebas diagnósticas in-vivo

Detección de IFN-γ •118+•100-

102in vivoParatuberculosis Parachek •102+

•116-

n= 218

•Análisis post-mortemInspección macroscópica •32+

•186-

n= 218

pCultivo microbiológico de M. bovis •48+

•170-

TBCPTB

Sensibilidad y especificidad de las pruebas diagnósticas:

IDTB comp. Sensibilidad = 18,7% (9/48)Especificidad = 95,3%

IFN-γ (0,05) Sensibilidad = 77,1% (85,4% sin aviar)Especificidad = 67 1% (54 7% sin aviar)γ ( , ) Especificidad = 67,1% (54,7% sin aviar)

IDTB comp + IFN-γ Sensibilidad = 81,2% (87,5% )Especificidad = 64,7% (52,4%)(0,05)

Interpretación severa IDTB

Animales TBC+/PTB (n=30) Animales TBC+/PTB+ (n=18)

TBCPTB

Animales TBC+/PTB- (n=30) Animales TBC+/PTB+ (n=18)•IDTB comp. S = 26,7%•IFN-γ S = 90% (93,3%)

•IDTB comp. S = 5,5%•IFN-γ S = 55,6% (72,2%)γ ( , )

•IDTB comp+IFN-γ S=96,7%γ , ( , )

•IDTB comp+IFN-γ S=55,6%(96,7%) (72,2%)

→ En zonas endémicas de tuberculosis yparatuberculosis la aplicación de pruebas

d di i l ibilid d d l bcomparadas disminuye la sensibilidad de las pruebas.

→ Progreso lento de erradicación de la tuberculosis→ Progreso lento de erradicación de la tuberculosis.

→ Calificación de rebaños infectados – fuente deinfección.

2 saneamientos separados por 6 meses (IDTBs y IFN-γ)Paratuberculosis sin tuberculosisPTB

2 saneamientos separados por 6 meses (IDTBs y IFN γ)

Primer saneamiento: 627 animales analizados

Interpretación IDTB Positivo Dudoso Negativo• IDTB:

p g

Standard Simple 4 17 606Comparada 1 16 610

SeveraSimple 21 606Comparada 17 610

21 animales sacrificados C tbc: Neg!

• IFN-γ: 66+ (121+ sin PPD aviar)

•Cultivo: 21 animales sacrificados C.tbc: Neg!C.ptb: 1+

•Cultivo:

2 saneamientos separados por 6 meses (IDTBs y IFN-γ)Paratuberculosis sin tuberculosisPTB

2 saneamientos separados por 6 meses (IDTBs y IFN γ)

Segundo saneamiento: 555 animales analizadosg

• IDTB: IDTB simple: 3+

• IFN-γ: 47+ (137+ sin PPD aviar)

IDTB comp: 1d

10 animales sacrificados C.tbc: Neg!C.ptb: Neg•Cultivo:

Imprescindible realizar técnicas comparadas y cultivo!!!

Diagnóstico en un rebaño con una infección mixta Diagnóstico en un rebaño con una infección mixta de tuberculosis y paratuberculosis

R lt d d

Tabla 1. Resultados de cultivo (n=163)

Resultados de cultivo Map + Map - Total

M caprae + 24 107 131M. caprae + 24 107 131

M. caprae - 6 26 32

Total 30 133 163

IDTB simple Vs. IDTB comparada

Animales con tuberculosis (n=131)

IDTB COMP+ IDTB COMP - TotalIDTB COMP+ IDTB COMP TotalIDBT SIMPLE+ 50 32 82 (S=82.6%)IDTB SIMPLE- 0 49 49

Total 50 (S=38.2%) 81 N=131

•Animales TBC+/PTB- (n=61)

IDTB COMP+ IDTB COMP - TotalIDBT SIMPLE+ 27 17 44 (S=72.1%)IDTB SIMPLE- 0 17 17( )

Total 27 (S=44.2%) 34 N=61

IDTB COMP+ IDTB COMP - TotalIDTB COMP IDTB COMP TotalIDBT SIMPLE+ 6 5 11 (S=45.8%)IDTB SIMPLE- 0 13 13

T t l 6 (S 25%) 18 N 24

•Animales TBC+/PTB+ (n=24)

Total 6 (S=25%) 18 N=24

IDTB simple Vs. IDTB comparada

Animales con tuberculosis (n=131)

16

18

Dif. Bov.

12

14

16Dif. Bov.¡¡¡No

detectados mediante IDTB

6

8

10mediante IDTB comparada!!!

2

4

6

¡¡¡Detectados por IDTB simple!!!

0 2 4 6 8 10 12 14 16

0

Dif A i

simple!!!Detectados

por IDTB simple + IFNγ Dif. Aviar.simple + IFNγ

Tabla 2. Sensibilidad de las pruebas y falsos positivos (n=163)

Prueba diagnóstica Positivos Sensibillidad Falsos positivosTP a % FP b %

IDTB simple (interpretación severa) 105 82 62 6 23 71 9

Tabla 2. Sensibilidad de las pruebas y falsos positivos (n 163)

IDTB simple (interpretación severa) 105 82 62.6 23 71,9IDTB comparada (interpretaciónsevera) 63 50 38.2 13 40,6IDTB comparada (interpretación 92 72 55 0 20 62 5IDTB comparada (interpretaciónultra-severa) 92 72 55,0 20 62,5Standard IFN-γ (punto corte: 0,1) 86 76 58 10 31,2Standard IFN-γ (no avian PPD)c 90 79 60 3 11 34 4Standard IFN-γ (no avian PPD) 90 79 60,3 11 34,4Severa IFN-γ (punto corte: 0,05) 109 93 71 16 50Severa IFN-γ (no avian PPD) c 114 96 73,3 18 56,2γ ( ) , ,Parachek d 75 24 e 70,6 51f 53,1

a Animales cultivo positivo de M. caprae.b Animales cultivo negativo de M. caprae.g pc Resultados obtenidos sin tener en cuenta los resultados de la estimulación con PPD aviar.d Valores calculados sin incluir los animales con cultivo contaminado.e Animales cultivo positivo de M.a.p.f Animales cultivo negativo de M.a.p.

Falsos Table 3. Sensibilidad y falsos positivos combinando las pruebas diagnósticas

Pruebas diagnósticas en paralelo Positivos Sensibilidad Falsos positivos

TP a % FP b %IDTB simple severa + Standard IFN-γ 138 113 86,2 25 78,1IDTB simple severa + Standard IFN-γ (no av PPD) c 140 114 87 26 81,2IDTB simple severa + Severa IFN-γ 145 117 89,3 28 87,0IDTB simple severa + Severa IFN-γ (no av PPD) c 147 118 90,1 29 90,6IDTB comparada severa + Standard IFN-γ 117 98 74 8 19 59 4IDTB comparada severa + Standard IFN-γ 117 98 74,8 19 59,4IDTB comparada severa + Standard IFN-γ (no av PPD) c 120 100 76,3 20 62,5

IDTB comparada severa + Severa IFN-γ 130 107 81,7 23 71,9IDTB comparada severa + Severa IFN-γ (no avian PPD) c 133 109 83,2 24 75

IDTB comparada ultra-severa + Standard IFN-γ 133 110 84 23 71,9IDTB comparada ultra-severa + Standard IFN-γIDTB comparada ultra-severa + Standard IFN-γ(no av PPD) c 135 111 84,7 24 75

IDTB comparada ultra-severa + Severa IFN-γ 143 116 88,5 27 84,4IDTB comparada ultra-severa + Severa IFN-γ (no 145 117 89 3 28 87 5av PPD) c 145 117 89,3 28 87,5a Animales cultivo positivo de M. caprae.b Animales cultivo negativo de M. caprae.c Resultados obtenidos sin tener en cuenta los resultados de la estimulación con PPD aviar.

Prueba diagnóstica Tbc+/Ptb- Tbc+/Ptb+ Tabla 4. Cultivo microbiológico: sensibilidad y falsos positivos.

Prueba diagnóstica (n=61) (n=24)IDTB simple severa S = 0,72 S = 0,46

IDTB d S 0 44 S 0 25IDTB comparada severa S = 0,44 S = 0,25

IDTB comparada ultra-severa S = 0,62 S = 0,42

Standard IFN (0 1) S = 0 47 S = 0 58Standard IFN-γ (0,1) S = 0,47 S = 0,58

Severa IFN-γ (0,05) S = 0,72 S = 0,67

IDTB simple severa + Standard IFN-γ S = 0 88 S = 0 75IDTB simple severa + Standard IFN-γ S = 0,88 S = 0,75

IDTB simple severa + Severa IFN-γ S = 0,93 S = 0,79

IDTB comparada severa + Standard IFN-γ S = 0 72 S = 0 71IDTB comparada severa + Standard IFN γ S 0,72 S 0,71

IDTB comparada severa + Severa IFN-γ S = 0,85 S = 0,75

IDTB comparada ultra-severa + Standard IFN-γ S = 0,85 S = 0,75IDTB comparada ultra severa Standard IFN γ S 0,85 S 0,75

IDTB comparada ultra-severa + Severa IFN-γ S = 0,93 S = 0,79

Parachek FP = 0,59 S = 0,71

Programa de control - Factores a tener en cuenta

-Estado de infección del rebaño

Técnicas sensibles de diagnóstico para detectar todos los -Técnicas sensibles de diagnóstico para detectar todos los animales infectados

- Animales salvajesAnimales salvajes.

- Otros reservorios

-Vacunación de paratuberculosis.

- Vías de transmisión de la enfermedad y etapa más susceptible.y p p

- Interferencia diagnóstica por otras micobacterias: infecciones mixtas.

- Características de la explotación

ó- Colaboración activa del ganadero/trabajadores.

Bases del programa de control en cabras

1. Instauración de pautas estrictas de control y manejo.

2. Análisis periódico de todo el rebaño mediante pruebas inmunológicas:

I t d t b li i ió· Intradermotuberculinización· gamma-interferon· serología paratuberculosisg p

3. Separación física de animales positivos y negativos.

4. Estudio microbiológico.

5. Separación de los animales recién nacidos.

Muchas graciasMuchas gracias

VISAVETFac. VeterinariaU.C.M.visavet@vet.ucm.es

℡ (+ 34) 913944083(+ 34) 913943795(+ 34) 913943795