ENZIMOLOGÍA CLÍNICA

DRA. ALICIA FERNÁNDEZ GIUSTI

AGOSTO 2012

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Las enzimas son biocatalizadores de naturaleza proteica

Todas las reacciones químicas del metabolismo celular se realizan gracias a la acción de catalizadores o enzimas

La sustancia sobre la que actúa una enzima se denomina sustrato

No todas las enzimas son proteínas; existen moléculas de RNA con actividad catalítica, las llamadas ribozimas

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DEFINICIÓN

IMPORTANCIA BIOMÉDICA DE LAS ENZIMAS

Son indispensables para la desintegración de los nutrientes con el fin de proporcionar energía para la contracción muscular y la unión de las unidades de construcción en proteínas, DNA, membranas, células y tejidos

La deficiencia en la cantidad o de la actividad catalítica de las enzimas se debe a defectos genéticos, deficiencia de nutrientes o toxinas

La sustancia sobre la que actúa la enzima se llama sustrato.

El sustrato se une a una región concreta del enzima, llamada centro activo.

El centro activo comprende :(1) un sitio de unión formado por los aminoácidos que están en contacto directo con el sustrato y (2) un sitio catalítico, formado por los aminoácidos directamente implicados en el mecanismo de la reacción .

Una vez formados el producto la enzima puede comenzar un nuevo ciclo de reacción

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MECANISMO DE ACCIÓN

Holoenzima = Apoenzima + Cofactor

1.- El enzima y su sustrato

2.- Unión al centro activo

3.- Formación del producto

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Hexokinasa (Glucokinasa en hígado y células B del páncreas)

Las enzimas eran nombradas atendiendo al sustrato sobre el que actuaban, añadiéndole el sufijo -asa o haciendo referencia a la reacción catalizada

Unión Internacional de Bioquímica (IUB) ha elaborado un sistema en el que cada enzima tiene un nombre único y un número de código

Las enzimas se agrupan en seis clases, cada una con varias subclases.

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NOMENCLATURA

CLASIFICACIÓN

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ATP: hexosa fosfotransferasa

Nombre sistemático:

Donador Aceptor

Grupo transferido

EC 2.7.1.1

Número sistemático

EnzymeComission

GrupoSubgrupo

Sub-subgrupo

Enzima

Nombre común: Hexokinasa

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1. Oxido-reductasas(Catalizan reacciones de oxidorreducción)

Ared + Box Aox + Bred

A : es el reductor o dador electrónico; en el curso de la reacción se oxida (pierde electrones o hidrógenos)

B : es el oxidante o aceptor electrónico; en el curso de la reacción se reduce (gana electrones o hidrógenos)

Glucosa : O2 oxidorreductasa

Dador Aceptor

EC 1.1.3.4

Nombre común:Glucosa oxidasa

1.- Deshidrogenasas u oxidoreductasas

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2: Transferasas (mutasas) Catalizan reacciones de transferencia de grupo :

2.1.-.- Grupos monocarbonados 2.2.-.- Grupos aldehido o ceto 2.3.-.- Aciltransferasas 2.4.-.- Glicosiltransferasas 2.5.-.- Alquil- o Ariltransferasas 2.6.-.- Grupos nitrogenados 2.7.-.- Grupos fosfato 2.8.-.- Grupos sulfato

Dador: Aceptor - Grupo transferido - transferasa

ATP: D-Hexosa Fosfotransferasa

Ejemplo:EC 2.7.1.1

Nombre común: hexokinasa

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3: HidrolasasCatalizan reacciones de hidrólisis

A-B + H2O A-OH + H-B

Clasificación de las hidrolasas :3.1.-.- Esterasas (carboxilesterasas, fosfoesterasas, sulfoesterasas) fosfatasas3.2.-.- Glicosidasas: amilasa3.3.-.- Éter hidrolasas3.4.-.- Péptido hidrolasas3.5.-.- Acil anhídrido hidrolasas,etc

.-No se suelen utilizar nombres sistemáticos en las hidrolasas .-Muchas de ellas conservan el nombre primitivo: Tripsina, Pepsina, Papaína,

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4: Liasas

Catalizan reacciones reversibles de adición de un grupo aun doble enlace:Entre C y C ;C y O ;C y N

A=B + X AXB

COO-

CH

CH

COO-

H2O COO-

CH

CH2

COO-

HO

Fumarato(trans-)

L-Malato

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5: IsomerasasCatalizan reacciones de isomerización

Algunas reacciones isomerásicas:

- Racemasas- Oxidorreductasas intramoleculares- Mutasas o transferasas intramoleculares

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6: LigasasCatalizan la unión de dos grupos químicos a expensas

de la hidrólisis de un enlace de alta energía :ATP

A + B + ATP A-B + ADP + PiO bien

C + D + ATP C-D + AMP + PPi

Tienen distinta estructura molecular aunque su función es similar. Se llaman isozimas o isoenzimas, podemos observar la existencia de isoenzimas en función de:

tipo de tejido: Por ejm., la LDH presenta isozimas distintos en músculo y corazón

el compartimento celular donde actúan por ejemplo, la malato deshidrogenasa del citoplasma es distinta a la de mitocondria

el momento concreto del desarrollo del individuo: Por ejemplo, algunos enzimas de la glicólisis del feto son diferentes de los mismos enzimas en el adulto. Un ejemplo de isoenzima la hexokinasa: presenta, al menos, cuatro formas distintas : Hepática, Cerebral, Muscular, Eritrocitaria

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ISOENZIMAS

Renovación tisular Actividad

muscular

Enzimas plasmáticas Órganos secretores

específicas

Actividad enzimática fisiológica

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Enzimas plasmáticas funcionales

Es la aplicación del conocimiento de las enzimas en el diagnóstico, tratamiento, evolución y pronóstico de las enfermedades.

Se utilizan como marcadores de ciertas patologías

En el diagnóstico de enfermedades genéticas

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ENZIMOLOGÍA CLÍNICA

Las enzimas cumplen su actividad en el interior celular, pero también se les puede encontrar en los líquidos biológicos

Algunas enzimas ejercen su función en el plasma o suero, ej. LCAT, o los factores de coagulación

Las enzimas plasmáticas, del LCR., líquido ascítico o pleural se encuentran en bajos niveles de concentración

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LAS ENZIMAS COMO MARCADORES DE LESIÓN TISULAR

ENZIMAS PLASMÁTICAS

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Alteraciones de la concentración enzimática en suero :

1. Aumento de la actividad enzimática

(a). Incremento patológico de la permeabilidad de membrana

(b). Muerte y destrucción celular

(c). Inducción enzimática

(d). Proliferación celular

2. Disminución de la actividad enzimática:

(a). Intoxicaciones(b). Enfermedades crónicas(c). Alteraciones del estado nutritivo(d) Falta de cofactores

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Enzimas con interés diagnóstico

1. Aminotransferasas2. Creatin kinasa3. Fosfatasa alcalina4. α-Amilasa5. Fosfatasa ácida6. Lactato deshidrogenasa (LDH)7. γ-Glutamil transferasa (GGT)8. Lipasa

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COOH

CHH2N

R1

+

COOH

C O

R2

COOH

CHH2N

R2

COOH

C O

R1

+

Aminotransferasas (Transaminasas)

Catalizan la interconversión reversible de aminoácidosy cetoácidos. Utilizan piridoxal fosfato como cofactor

Su papel es importantísimo en el metabolismo deaminoácidos. En clínica se determinan las siguientes:

EC 2.6.1.1, Aspartato aminotransferasa (AST, TGO)EC 2.6.1.2, Alanina aminotransferasa ( ALT, TGP)

B6

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COO-

CH+H3N

CH2

COO-

+

COO-

C O

CH2

CH2

COO-

COO-

C

CH2

COO-

O

COO-

CH

CH2

CH2

COO-

+H3N

+

Aspartato -Cetoglutarato Oxalacetato Glutamato

Aspartato aminotransferasa EC 2.6.1.1 (AST, TGO)

Aparece en citosol y mitocondrias de tejidos metabólicamente muy activos La TGO se libera de células enfermas en el suero. Su nivel se eleva en el suero

ante afecciones hepáticas y después del infarto al miocardio.

B6

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Alanina aminotransferasa EC 2.6.1.2 (ALT, TGP)

Enzima citosólica, de elevada concentración en el parénquima hepático. La TGP también puede estar elevada después del infarto al miocardio.Se considera casi específica de lesión hepática.

B6

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CH3

N CH2 COOHCHN

NH2

ATP ADP CH3

N CH2 COCHN

NH2

O P O-

O-

O

Creatina Creatin fosfato

Creatino kinasa, EC 2.7.3.2 (CK, CPK)

Creatin fosfato es una transferasa que cataliza la formación de ATP requerido por los sistemas contráctiles o de transporte. Es el prototipo de los compuestos conocidos como fosfágenos.La CPK es importante en el metabolismo energético, se encuentra en el corazón, el músculo esquelético y el cerebro.

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+

-

MM

MB

BB

La CK se presenta en forma de tres isoenzimasespecíficas de tejido:

- Forma MM (músculo esquelético)- Forma MB (músculo miocárdico)- Forma BB (cerebro)Las isoenzimas se distinguen electroforéticamenteo por métodos inmunológicosLa isoenzima MB es un marcador precoz deinfarto de miocardio. En el infarto al miocardio, puede ocurrir elevaciones de STGO ,LDH y beta hidroxibutirato dehidrogenasa y de CPK., en el infarto pulmonar sólo de las tres primeras.

Isoenzimas de la CPK

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R O P

O

O-

O-

+ H2O R OH + HO P O-

O

O-

Fosfatasa alcalina, EC 3.1.3.1

Hidroliza con baja especificidad fosfomonoésteres, a un pHalto (8 -9 de ahí el nombre) Aparece en gran cantidad de tejidos como óseo, hígado, intestino y placenta

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La fosfatasa alcalina presenta varias isoenzimas:

- Ósea- Hepática- Intestinal- Placentaria

Las más importantes son las dos primeras. Se pueden distinguirpor su termoestabilidad, siendo la ósea más termolábil.

Ósea: Propia del tejido óseo en crecimiento: elevación fisiológica en la adolescencia.Se encuentra elevada en muchas enfermedades óseas, como osteomalacia o por invasión ósea por cáncer localizado en mamas, pulmones o próstata.Hepática: Propia de las células del árbol biliar: se eleva en lascolestasis (obstrucciones biliares)

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Fosfatasa ácida, EC 3.1.3.2

R O P

O

O-

O-

+ H2O R OH + HO P O-

O

O-

Hidroliza fosfomonoésteres con baja especificidad. Presentavarias isoenzimas, una de las cuales (Fosfatasa ácida prostática)es un marcador muy fiable del cáncer de próstata y se empleaen el diagnóstico precoz

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Alfa-Amilasa, EC 3.2.1.1

Enzimas digestivas producidas por las glándulas salivales, el páncreas y la pared intestinal para facilitar la digestión del almidón, rompen las uniones de polisacáridos alfa 1-4, dando lugar a dextrano, maltosa y algunas moléculas de glucosa

Es un marcador muy importante de afecciones pancreáticas agudas (pancreatitis). Puede incluso aparecer en la orina, debido a su bajo peso molecular (amilasuria)

Lipasa EC 3.2.1.2

Hidrolasa que actúa sobre los TAG hasta sus constituyentes ácidos grasos y glicerol, lipólisis que se efectúa en el tejido adiposo con producción de ácidos grasos libres en el plasma.

La lipasa pancreática, permite la digestión y absorción de los lípidos

Aumenta en el suero en pancreatitis aguda

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Cataliza la reacción reversible de lactato a piruvato

La LDH está constituida por cuatros subunidades.

Existen dos tipos de subunidades diferentes, lo que explica la existencia de 5 isoformas distintas que poseen una movilidad electroforética diferente que permite distinguirlas.

Puede estar elevada después de infarto al miocardio y durante muchas enfermedades del hígado.

También puede estar elevada en anemia hemolítica.

Deshidrogenasa láctica LDH(EC 1.1.1.27)

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LDH5

LDH 1

Patrón isoenzimático de la LDH de suero en infarto de miocardio y en hepatitis aguda

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g-Glutamil transferasa, EC 2.3.2.2 (GGT)

GSH + aa -Glu-aa + Cys-Gly

Cataliza una reacción entre un tripéptido: el glutation y un aminoácido para formar un gama-glutamil aminoácido y cisteinil glicina.Tiene un importante papel en el transporte de aminoácidos a través de membranas. Es un indicador sensible de enfermedades del hígado.Es una enzima inducible, y su concentración en suero aumentacon xenobióticos (alcohol, drogas, etc.)

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•Aspartato aminotransferasa (AST/TGO) •Valores normales: < 40U/ml •Aumento importante: Infarto de miocardio, hepatitis, traumatismos •Alanina aminotransferasa (ALT/TGP) •Valores normales: < 50 U/ml •Aumento importante: Hepatitis

• Alfa-amilasa • Valores normales: <50U/ml

•Aumento importante: pancreatitis aguda, cáncer de páncreas

Lipasa Valores normales: 20-140 U/ml Aumento importante: pancreatitis aguda y en el cáncer de

páncreas

Enzimas séricas de importancia clínica

Gamaglutamil transpeptidasa (GGT)

•Valores normales: < 35U/ml en varones y <25U/ml en mujeres •Aumento importante: Hepatitis vírica, obstrucción biliar, metástasis hepáticas, enf. alcohólica

Deshidrogenasa láctica (LDH)

• Valores normales: < 120-230 U/ml • Aumento importante: infarto de miocardio (LDH1), hepatitis víricas (LDH4, LDH5)

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Enzimas séricas de importancia clínica

Causas mas frecuentes de elevación de transaminasas

Causas hepáticas Causas extrahepáticas

Consumo excesivo de alcohol Enfermedad celiaca

Medicamentos Miopatías hereditarias o adquiridas

Hepatitis viral Ejercicio intenso

Hígado graso Sarcoidosis

Hepatitis autoinmune Patología de vías biliares

Hemocromatosis Neoplasias con metástasis

Enzimas séricos en la enfermedad cardiaca

Creatín fosfoquinasa (CPK) < 160 U/L (isoenzima “mb”)

Láctico deshidrogenasa (LDH)< 120-230 U/L; isoenzima1 (15-25%)

Aspartato aminotransferasa (AST;TGO) < 40 U/L

Tras el infarto, hay una liberación de proteínas

intracelulares de las células dañadas.

La primera en ser detectada es la troponina (5-10 h post infarto), seguida de la CPK-MB (pico a 1 día), y finalmente la LDH 1, cuyo máximo se alcanza a los 2-3 días post infarto

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CPK-MB

LDH 1

TGO

Troponinas en IMA

ENZIMA SÉRICA PRINCIPAL USO DIAGNÓSTICO

Aminotransferasas Aspartato aminotransferasa (TGO)

Alanina aminotransferasa (TGP)

Infarto de miocardio

Hepatitis viral

Amilasa y lipasa Pancreatitis aguda

Creatina kinasa (CPK) Trastornos musculares e infarto de miocardio

Gama glutamil transpeptidasa (GGT) Enfermedades hepáticasAlcoholismo

Deshidrogenasa láctica (LDH) (isoenzimas)

Infarto de miocardio

Fosfatasa ácida Carcinoma metastásico de próstata

Fosfatasa alcalina (isoenzimas)

Trastornos óseos y enfermedades hepáticas obstructivas

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PRINCIPALES ENZIMAS SÉRICAS EN EL DIAGNÓSTICO CLÍNICO

ENZIMAS EN EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES GENÉTICAS

Gracias a técnicas basadas en el rendimiento catalítico y la especificidad de la catálisis enzimática, se pueden detectar las mutaciones genéticas:

PCR (reacción en cadena de la polimerasa), analiza el DNA en muestras biológicas y forenses

RFLP (polimorfismo de longitud del fragmento de restricción), facilita la detección prenatal de trastornos hereditarios como rasgo drepanocítico, talasemia B, fenilcetonuria infantil y enfermedad de Huntington

ENZIMAS EN EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADESINFECCIOSAS

Ensayo inmunoenzimático (ELISA, Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).

Esta técnica detecta una amplia variedad de agentes infecciosos. El método se utiliza en la detección de virus sincial respiratorio. Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, rotavirus, adenovirus, virus hepatitis, virus varicela-zoster y HIV (Virus de Inmunodeficiencia Humana).

CONCLUSIONES

Las enzimas son catalizadores biológicos eficaces y altamente específicos

El análisis de las enzimas plasmáticas ayudan al diagnóstico, pronóstico y evolución de las enfermedades

A través de la terapia génica se logra subsanar las deficiencias o los defectos en la función de las enzimas

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FIN