ENZIMOLOGÍA I

MARÍA CRISTINA LUNA LÓPEZ (1541236)

DIANA YURLEY BRAVO LÓPEZ (1543171)

LUISA FERNANDA RIVERA FORERO (1543556)

ANGÉLICA MARÍA ROJAS MAYOR (1543378)

PRESENTADO A:

ÁNGELA MARÍA ESCUDERO R. MD.

FACULTAD DE SALUD

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS FISIOLÓGICAS

PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA Y LABORATORIO CLÍNICO

METABOLISMO

SANTIAGO DE CALI, VALLE.

MAYO 19 DE 2016

Resumen. En esta práctica realizamos procedimientos experimentales para la determinación del efecto sobre la actividad

enzimática en la variación del pH y la temperatura en la enzima fosfatasa, utilizando el sustrato p-nitro-fenilfosfato (PNFP),

obteniendo la mayor absorbancia para una temperatura de 37 °C y pH de 9.6.Además se utilizó la ley de Beer-Lambert para

establecer la concentración de una muestra realizando una curva de calibración con un resultado de 0.11 mM en la muestra

problema.

Palabras clave: Enzimas, fosfatasas, pH, temperatura, tiempo.

INTRODUCCIÓN

Las fosfatasas son un conjunto de enzimas capaces de

hidrolizar los esteres fosfato de diversos fosfolípidos. Si

son activadas a un nivel de pH inferior a 7 se denominan

fosfatasas ácidas mientras que si son activadas a un pH

superior a 7 se denominan fosfatasas alcalinas. Son

enzimas con actividad fosfomonoesterasa que se

encuentra en las membranas celulares de diferentes

órganos, entre ellos, en el hueso, placenta, intestino,

leucocitos y otros [1]. En el proceso de clasificación de las

fosfatasas se han señalado cuatro diferentes tipos de esta

enzima:

Fosfomonoesterasas: catalizan la hidrólisis de

monoesteres de ácido fosfórico.

Fosfoesterasas: que tienen acción sobre diésteres del

mismo ácido.

Pirofosfatasas: las cuales hidrolizan esteres de ácido

pirofosfotico

Metafosfatasas: quienes hidrolizan esteres de ácido

metafosfórico y (HPO3)n [2]

Existen diferentes factores que influyen en la

determinación de la actividad enzimática entre ellos

encontramos:

La Temperatura: que en general aumenta la velocidad

de la reacción del mismo modo que la actividad enzimática

aumenta sin embargo al alcanzar determinadas

temperaturas aparecen fenómenos de desnaturalización de

la proteína enzimática y la enzima se inactiva.

Tampón y pH: existe el valor de ‘’pH optimo’’ que es

cuando la efectividad de la enzima es máxima.

Presencia de cofactores: las coenzimas son sustancias

que aumentan la actividad de la enzima y por tanto la

sensibilidad del método analítico.

Concentración del substrato: si se mantienen constantes

el resto de las variables, la velocidad de la reacción

enzimática aumentará hasta un punto determinado con

concentraciones crecientes del substrato. [1]

OBJETIVOS

Conocer y adquirir experiencia en el manejo de

los instrumentos empleados en el laboratorio, en

especial el espectrofotómetro.

Conocer la naturaleza, características generales y

mecanismos de la regulación de las enzimas para

entender su gran incidencia en los procesos

metabólicos que tienen lugar en el organismo.

Determinar el efecto sobre la actividad

enzimática de la variación del tiempo, pH,

temperatura, en la enzima fosfatasa, utilizando el

sustrato sintético p-nitro-fenilfosfato.

Observar el comportamiento de la enzima

fosfatasa que es tan abundante en animales,

vegetales y microorganismos.

Identificar cual es la temperatura y PH óptimo

para la fosfatasa alcalina.

PROCEDIMIENTO

1. Curva de calibración de p-nitrofenol

Con una longitud de onda de 405 se determinó la

relación entre absorbancia y concentración y

entre transmitancia y concentración.

En cinco tubos de ensayo se realizaron las

siguientes soluciones y se obtuvieron los

resultados contenidos en la Tabla 1.

Solución TUBO (mL)

blanco 1 2 3 4 5

Agua 1.5 1.47 1.44 1.41 1.35

Buffer

pH 9.6

Barbital

1.5 1.5 1.5 1.5 1.5

Soluc

ión

Probl

ema PNFP 2.0

nM

-------- 0.03 0.06 0.09 0.15

Absorba

ncia

0 0.25 0.66 1.2 1.27 0.83

Transmit

ancia

0 0.04 0.08 0.12 0.2 26.6

Tabla 1. Datos para la curva de calibración de p-

nitrofenol.

Concentración de la muestra problema:

𝑨 = 𝜺 ∗ 𝒍 ∗ 𝒄

Donde:

A= Absorbancia 𝜺= Coeficiente de extinción molar c= Concentración

𝒄 =𝑨

𝜺∗𝒍 [1]

Fig 1. Absorbancia vs concentración

2. Efecto de la temperatura.

Se prepararon las siguientes soluciones

realizando una preincubación de cada tubo de

ensayo durante tres minutos. Cumplidos los tres

minutos de preincubación con diferencias de 1

minuto entre tubo y tubo se agregó 0.1 ml de la

enzima FAL, se dejó incubar nuevamente por tres

minutos, los datos obtenidos se muestran en la

Tabla 2.

Solución TUBO (mL)

blanco 1 2 3 4 5

Agua 2.7 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4

Buffer

pH 9.6

0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3

PNFP 2.0

nM

-------- 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3

Tempera

tura

25°C 4°C 30°C 37°C 50°C 100°C

Ex.

Enzima

FAL

0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

Absorba

ncia

405nm

--- 0.08 0.204 0.279 0.189 0.112

Tabla 2. Datos obtenidos sobre el efecto de la

Temperatura.

Fig 1. Grafica de A Vs Temperatura

3. Efecto del pH

Se prepararon las soluciones indicadas realizando

preincubación a cada tubo durante tres minutos

a 37°C. Cumplidos los tres minutos con una

diferencia de tiempo de un minuto entre cada

tubo se agregó 0.1 mL de la enzima FAL y se dejó

incubando por otros tres minutos, Seguidamente

se anexaron los datos obtenidos en la Tabla 3.

Solució

n

TUBO (mL)

blanc

o

1 2 3 4 5 6

Agua 2.7 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4

Buffer

0.3 mL

0.3 pH

3.4

pH

8.8

pH

9.2

pH

9.6

pH

10.4

pH

10.8

PNFP

2.0 nM

-------- 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3

Enzima

FAL

0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

Absorb

ancia

--- 0.16

5

0.32

1

0.32

8

0.43

8

0.23

9

0.12

5

Tabla 3. Datos del efecto del pH.

Fig 2. Grafica de A vs pH

RESULTADOS

Tomando los valores obtenidos para la curva de

calibración del p-nitrofenol (Tab. 1) y la ec. 1. se obtienen

los siguientes valores para la concentración:

CONCENTRACIÓN ABSORBANCIA

BLANCO 0 0

1 0.04 0.25

2 0.08 0.66

3 0.12 1.2

4 0.2 1.27

Tabla 4. Concentración de las muestras según

absorbancia.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

ABSO

RBANCIA

CONCENTRACIÓN

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0 50 100 150

ABSO

RBANCIA

TEMPERATURA

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0 5 10 15

ABSO

RBANCIA

pH

Para la Muestra Problema, se obtuvo una absorbancia de

0.83. Calculando con la le Beer-Lambert, se obtiene una

concentración aproximada de 0.11 mM.

Para determinar la máxima actividad con variaciones del

pH, se midió la absorbancia de cada tubo con pH distintos,

consignados en la siguiente tabla.

ABSORBANCIA pH

BLANCO 0 0,3

1 0,165 3,4

2 0,321 8,8

3 0,328 9,2

4 0,438 9,6

5 0,239 10,4

6 0,125 10,8

Tab 5. Absorbancia de p-nitrofenol en diferentes pH.

Se concluye que el pH óptimo para la fosfatasa es de 9.6,

evidenciando la actividad alcalina de la enzima.

Al evaluar la actividad enzimática al variar la temperatura,

se obtuvo una máxima absorbancia de 0.279 a una

temperatura de 37 °C, valor aproximado a la temperatura

corporal normal.

ABSORBANCIA TEMPERATURA

BLANCO 0 25

1 0,08 4

2 0,204 30

3 0,279 37

4 0,189 50

5 0,112 100

Tab 6. Absorbancia de p-nitrofenol en diferentes

temperaturas.

CONCLUSIÓN

Con los resultados obtenidos durante la práctica, se

observa que son satisfactorios al cumplir parcialmente con

los valores aceptados de absorbancia para cada

concentración de p-nitrofenol, y por variar al cambio de

pH al reflejar una máxima absorbancia en un pH de 9.6.

Los valores de temperatura del medio en el que se

encuentra la enzima y la absorbancia reflejan una

actividad enzimática alta a los 37 °C, valor cercano a la

temperatura corporal.

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Los resultados de la práctica experimental pese a que

fueron precisos, son susceptibles a errores; esto se debe

principalmente a errores humanos, dados por un inexperto

manejo de los equipos y mala calibración de los mismos

por parte de los estudiantes, posibles fallas en el

espectrofotómetro debido a su tiempo de uso, posibles

errores debido a la pérdida de calor al llevar el tubo del

baño de maría al instrumento y la falta de control sobre el

tiempo que pasaron las soluciones expuestas al calor. No

obstante, la práctica fue considerada como satisfactoria, ya

que permitió relacionar el pH y la temperatura con la

actividad de la fosfatasa alcalina, así como relacionarlo

con su efecto en el cuerpo humano.

En el cuerpo humano, la fosfatasa alcalina está presente

principalmente en las membranas plasmáticas de

osteoblastos, células del hígado, riñón, bazo y placenta y

su papel principal está asociado a la desfosforilación de

nucleótidos y proteínas. Mediante la práctica experimental

su pudo determinar que la temperatura óptima para la

fosfatasa alcalina corresponde a 37° C, lo que en el

organismo del hombre se considera la temperatura normal.

Cuando dicha temperatura aumenta los niveles de esta

enzima aumentan y con ello su actividad, lo que a largo

plazo puede indicar infección de la vía biliar, neoplasia

hepática, tuberculosis miliar, linfoma, hipernefroma,

mononucleosis o citomagalovirus.

El pH óptimo para la fosfatasa alcalina es de 9.6, ya que es

el punto donde existe la mayor absorbancia esto debido a

que la enzima funciona mejor en medios alcalinos, esto se

debe a la influencia del pH en el estado de ionización de

los grupos funcionales en la molécula de enzima y el

sustrato. El pH tiene una relación intrínseca con el lugar

donde se encuentra la fosfatasa alcalina en el cuerpo ya

que como su nombre lo dice actúa en un medio alcalino

(pH óptimo 8,6 a 9,1), está normalmente presente en la

sangre y los tejidos con cantidades más altas de FA

abarcan el hígado, las vías biliares y los huesos.

REFERENCIAS

[1] J. Diaz, Portillo. M.T, Fernandez del barrio. F. P,

Salido.Aspectos básicos de bioquímica clínica. Madrid

Estaña. 1997.

[2] Solórzano Martha. Prácticas de laboratorio

Metabolismo. Universidad del Valle. Facultad de salud.

Departamento de Ciencias fisiológicas. Cali, 2016.

[3] Lehninger,A. Principios de bioquimica- Enzimas.

Ediciones Omega, S.L., 2014